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    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
    Ebook92 pages42 minutes

    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA

    By VALENTINA ILARDI

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    About this ebook

    E' pervenuta, nel laboratorio dove ho svolto la mia attività di tesi,all'osservazione una donna con caratteristico quadro clinico di talassemia intermedia.L'analisi molecolare della mutazioni B-talassemiche più frequenti nel Meditarraneo ha evidenziato in eterozigosi la mutazione IVSI-6.
    (T->C).L'analisi di sequenziamento dei geni beta globinici ha evidenziato una nuova mutazione che cade in posizione -30 caratterizzata dalla sostituzione nucleotidica T->G nel TATA BOX e relative al sito cap del gene b-globinico.La TATA BOX è un elemento fondamentale per il corretto inizio della trascrizione genica e in letteratura sono state descritte finora 6 mutazioni che cadono in una regione compresa tra -31 a -28 bp prossimale alla TATA BOX e relative al sito cap del gene b-globinico.Queste mutazioni,la -31 A->G,la - 29A->G,le sostituzioni -28 A->G ed A->C,la -30 T->A e -30 T->C diminuiscono l'efficienza di trascrizione e portano alla comparsa di fenotipi beta talassemici di varia entità. Allo scopo di caratterizzare da un punto di vista funzionale il difetto molecolare individuato,si è clonato il frammento di DNA in cui cade la mutazione nel vettore plasmidico pGEM T-easy.Sono stati svolti esperimenti di mutagenesi sito specifica volti ad ottenere costrutti contenenti le altre mutazioni già note in letteratura e che cadono in questa regione del promotore.I frammenti ottenuti sono stati clonati nel vettore di espressione PGL4 allo scopo di effettuare saggi funzionali,utilizzando il gene reporter della luciferasi. I risultati ottenuti da questi esperimenti indicano che la nuova mutazione -30(T->G)determina una riduzione dell'attività trascrizionale del promotore b-globinico rispetto al promotore wild-type.Tale riduzione è ,inoltre, leggermente superiore a quella della altre due mutazioni finora riportate nella TATA BOX (-30T->A E -30 T->C) .Questi studi potrebbero contribuire a chiarire i meccanismi di regolazione dell'espressione dei geni globinici ,ai fini anche di un eventuale sviluppo di nuovi approcci terapeutici nel trattamento delle emoglobinopatie.
    LanguageItaliano
    PublisherValentina Ilardi
    Release dateMar 19, 2012
    ISBN9788863697025
    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA

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      IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA - VALENTINA ILARDI

      Bibliografia

      1.INTRODUZIONE

      1.1 STRUTTURA E FUNZIONE DELL’Hb

      L’emoglobina è una proteina globulare deputata al trasporto dell’O2 nel sangue dei vertebrati. Essa, infatti, è contenuta nei globuli rossi cui conferisce loro il caratteristico colore rosso. La sintesi dell’emoglobina, che avviene nel midollo osseo, inizia a livello dei proeritroblasti policromatofili e continua, in misura minore, anche nei reticolociti che conservano ancora ammassi ribosomici deputati alla sintesi della molecola (1).

      La produzione di questa cromoproteina necessita di tre eventi: la sintesi delle catene globiniche, la formazione di protoporfirina IX e la captazione del ferro.

      L’emoglobina, infatti, è un’emoproteina coniugata dal peso molecolare di 64 kDa, costituita da una frazione proteica ad alto peso molecolare, rappresentata da quattro catene globiniche, e da una frazione non proteica ovvero da quattro gruppi prostetici, detti eme, dal peso molecolare di 616 dalton e contenenti un atomo di ferro (2) (Fig.1).

      Nella globina vi sono due coppie di unità polipeptidiche, ciascuna formata da otto eliche (denominate da A a H) e assemblate in forma pressocchè sferica, in cui ogni catena è portatrice del gruppo prostetico eme contenente un atomo di ferro.

      L’eme è una ferro-protoporfirina 9 con un atomo di Fe bivalente (Fe++) che ha sei valenze di coordinazione, di cui quattro legano l’azoto dei quattro anelli pirrolici che costituiscono l’eme e le rimanenti due sono legate l’una al gruppo imidazolico di un residuo istaminico della globina, e l’altra è atta a legare l’ossigeno (Fig.2). In tal modo l’eme è sospeso in un interstizio di forze non polari (tasca) della globina e ciò rende possibile la formazione di un legame reversibile del ferro con l’ossigeno senza che esso venga ossidato alla forma ferrica (Fe+++).

      Fig.1: Struttura quaternaria dell’emoglobina

      Fig.2: Ferroprotoporfirina (EME)

      Le quattro catena globiniche si combinano nella struttura quaternaria della proteina in modo da formare un tetraedro regolare di circa 6,0 nm di diametro. Con l’inserimento e la cessione dell’ossigeno si determinano due strutture quaternarie: una per la forma ossigenata (forma T) e una per la forma deossigenata (forma R).

      La proprietà del tetrametro di passare dalla configurazione sterica T (tesa, cioè ove le quattro singole molecole sono strette tra loro) che possiede una bassa affinità per l’O2, alla configurazione rilasciata (R) avente forte affinità per l’O2, si chiama effetto cooperatore; questo permette una cessione di O2 adeguata alle necessità cellulari secondo la normale tensione di esso. L’effetto cooperatore, consistente nella capacità di passare dalla forma a scarsa affinità, man mano che l’O2 si lega all’eme, alla forma a forte affinità, agevola la saturazione in O2 a livello dei polmoni; viceversa nei tessuti, l’effetto cooperatore agevola la cessione dell’O2 alle cellule, man mano che l’Hb, persi i primi atomi di O2, prende la forma a bassa affinità (3).

      Il diverso pH tissutale e la presenza di 2,3-disfosfoglicerato (2-3-DPG) all’interno dell’eritrocita influenzano l’affinità per l’O2, cioè la fissazione e la liberazione di esso. Con l’aumento dell’acidità a livello dei tessuti per l’accumulo di anidride carbonica, il pH è più basso che nel sangue arterioso, e ciò facilita il trasferimento dell’O2. Anche il 2,3-DPG fa diminuire l’affinità per l’ossigeno dell’emoglobina, perché si lega ad essa solo quando è nello stato deossigenato. Ceduto l’O2 nei tessuti, l’Hb fissa la CO2 diventando solo per il 30% circa carbamino-Hb. Attraverso la parete alveolare ogni molecola di Hb fissa una molecola di O2, per ogni suo gruppo eme, e diventa ossiemoglobina (HbO2); questo avviene per diffusione attraverso l’epitelio dell’alveolo, l’endotelio del capillare, il plasma sanguigno e la membrana

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