PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR ESCUELA DE BIOANALISIS CARRERA DE MICROBIOLOGA MICROBIOLOGA 2 Lcda. Elena Granda M.

TEMA 7: Escala McFarland Objetivo: El estudiante aprenda a: Preparar estndares para su utilizacin a nivel del laboratorio Realizar comparaciones con cultivos inoculados con microorganismos Introduccin El patrn o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos hermticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad ptica diferente originada por la aparicin de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reaccin entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el cido sulfrico (H2SO4) al 1% (0,36N). Esta turbidez puede interpretarse pticamente o por mtodos espectrofotomtricos y cada una de ellas se corresponde a una concentracin conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (cl/ml) que genera una turbidez similar. Para asegurar la densidad del estndar de McFarland as preparado puede ser chequeado usando un espectrofotmetro con una celda de cuarzo de 1cm; para el estndar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estndar de McFarland puede ser verificado por ajuste de una suspensin de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensin as ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml. Materiales: Agar Plate count fundido Tubos con 5 ml de BHI Cajas petri estriles Caja petri con cepa ATCC pura E.coli Asas Puntas azules estriles Cloruro de Bario al 1% cido sulfrico al 1% Perillas de seguridad Pipetas serolgicas de 1ml Equipos Pipetas automticas (1ml) Incubadora 35-37C Turbidmetro Espectrofotmetro Mecheros Bao Mara

Procedimiento: Preparacin: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes segn corresponda) de BaCl2*2H2O al 1 % (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla para obtener la equivalencia deseada:

Primera parte: Para preparar la escala de McFarland 05, proceda de la siguiente manera: Tubo 0,5 Cl2Ba 1% 0,05 H2SO4 1% 9,95 UFC/ml 1,5 x 108

Segunda Parte: Leer en el turbidmetro la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala Leer en el espectrofotmetro en el filtro 546nm la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala Comparar las DO obtenidas en los dos equipos Tercera Parte: A partir del tubo que contiene caldo BHI realice una escala McFarland 0.5, con la cepa pura que se encuentra en la caja Lea en el turbidmetro la DO de su siembra y compare con la DO obtenida en la escala McFarland Si el resultado no es el esperado y est sobre el valor, aumente caldo BHI estril al tubo inoculado y vuelva a realizar las mediciones de DO, si al contrario est por debajo del valor esperado aumente colonias. Al obtener la DO esperada sta preparacin con una pipeta automtica colocar el 1 ml de caldo BHI inoculado a la caja petri estril y aadir 15 ml de medio de cultivo TSA fundido, realizar los movimientos respectivos (sentido de las manecillas de reloj, de arriba hacia abajo, en L y en contra de las manecillas del reloj)para homogenizar la muestra. Espere a que se solidifique el agar e incube a 37C por 48 horas

 Realice un recuento y compare si los resultados obtenidos concuerdan con lo esperado es decir 1.5 x 108 UFC/ml. Anexo: Conservacin: El estndar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad y a temperatura ambiente entre 22 a 25C. Sin embargo, se recomienda almacenarse a ser posibles en refrigeracin. Cuidados Descartar despus de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso, debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se haya disuelto en todo el medio.

Consulta: 1. Casos en los que se puede utilizar esta escala de turbidez. Fundamntelos

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