PRACTICA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS El recuento diferencial de leucocitos es una parte rutinaria de la biomtrica hemtica que puede ser

til en la valoracin de una infeccin o inflamacin, en la determinacin de los defectos de intoxicacin posible por sustancias qumicas o drogas, en el monitoreo de trastornos sanguneos como la leucemia, y en los efectos secundarios de tratamientos como la quimioterapia El conteo de glbulos blancos puede indicar enfermedades infecciosas e inflamatorias, leucemia y trastornos de la medula sea. La clasificacin porcentual se hace en base a la afinidad de sus granulaciones a los colorantes y a sus cualidades morfolgicas. La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del nmero de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infeccin La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos: Neutrfilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene mltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lbulos nucleares. Eosinfilos: es redondo u ovalado, el ncleo posee no ms de tres lbulos y en el citoplasma se observa no ms de 20 granos color naranja. Basfilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos grnulos son hidrosolubles. Linfocitos: Su citoplasma es azul plido y la cromatina nuclear color prpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma. Monocitos: su ncleo suele ser arrionado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tie de un color azul grisceo y contiene finas granulaciones color rosa.

Valores de referencia:

LEUCOCITOS Neutrfilos Metamielocito Abastonado Segmentado

0-1 3-6 51-67

Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos

21-35 4-8 2-4 0-1

HEMOGRAMA DE SCHILLING El hemograma de Schilling es la clasificacin diferencial % de las distintas clulas blancas. EXTENSIONES O FROTIS SANGUNEO Una extensin o frotis sanguneo consiste en recubrir parcialmente un porta con una gota de sangre, de tal manera que las clulas de sta se dispongan formando una sola capa de ellas. Esto puede hacerse manual o automticamente. Lo ltimo se realiza mediante un aparato (spinner) que centrifuga rpidamente el porta con la sangre depositada en su centro. Con este aparato se obtienen unos frotis que presentan una distribucin celular muy homognea. 1. PARTES DE UNA EXTENSIN. 1.1. CABEZA.

Es la zona inicial de la extensin. Es la regin ms gruesa. En ella se encuentra una mayor proporcin de linfocitos, y los hemates forman aglomerados (pilas de monedas). Es la zona media del frotis. Su espesor es el apropiado. En ella existe una adecuada proporcin entre los distintos tipos de leucocitos. Contiene la "zona ideal" de observacin, que corresponde a la porcin que limita con la cola. Es la zona final de la extensin. Suele tener un aspecto redondeado. Es la regin ms fina. En ella se encuentra una mayor proporcin de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos), y adems. los hemates estn deformados y presentan una tonalidad uniforme. En su porcin terminal suelen ser plaquetas, sobre todo si son grandes. ms abundantes las

1.2. CUERPO.

1.3. COLA.

1.4. BORDES.

Contienen una mayor proporcin de leucocitos grandes.

Si estn deshilachados, en ellos las clulas son difciles de reconocer por estar deformadas o destruidas

2. CARACTERSTICAS DE UNA BUENA EXTENSIN.

La cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta. La cola debe estar cercana al otro extremo del porta, pero sin llegar a l. El borde de la cola tiene que estar finamente deshilachado. Ese fino deshilachamiento recibe el nombre de "barbas". Toda la extensin ha de ser fina y homognea. Los bordes laterales de la extensin deben estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente. Una extensin normal ha de tener una longitud de las partes del portaobjetos. El uso de teidores automticos exige la realizacin de extensiones ms cortas que las consideradas normalmente como correctas (con una longitud de la mitad del portaobjetos).

3. DEFECTOS DE UNA EXTENSIN.

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se debe a un inadecuado tamao de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a un fallo en el ngulo de extensin de la misma. Presencia de escalones o estras. Esto est ocasionado por una falta de uniformidad en el deslizamiento de la gota.

Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta. Extremo final excesivamente dentado.

4. UTILIDAD DE LAS EXTENSIONES. El estudio de las extensiones sanguneas es esencial para el anlisis morfolgico de las clulas hemticas y para la realizacin del recuento diferencial linfocitario (RDL). Adems, es imprescindible para la distincin de una autntica trombopenia de una pseudotrombopenia producida por agregados plaquetarios. La investigacin de las extensiones tambin es til para la comprobacin de las alarmas que proporcionan los autoanalizadores hematolgicos 5. REALIZACIN DE UNA EXTENSIN SANGUNEA. Las extensiones sanguneas se llevan a cabo deslizando una porta sobre otro en el que se ha depositado previamente una gota de sangre. Con esto se obtiene una fina capa de clulas sanguneas que puede ser adecuadamente observada con el microscopio. Material necesario

Una lanceta de aplicacin manual o automtica Algodn. Un capilar no heparinizado, si la muestra es sangre venosa anticoagulada, o heparinizado, si la muestra es sangre capilar. 2 portas limpios y libres de grasa. Uno de ellos puede ser normal y el otro ha de ser, preferentemente. esmirilado y biselado (el porta extensor). Para mantener limpios los portas, se deben seguir las siguientes indicaciones: Lavar los portas con agua y jabn lquido. Aclararlos con abundante agua caliente. Sumergir los portas, durante una hora en una solucin de etanol- ter etlico o, simplemente etanol. Volver a aclarar los portas y dejar secar. Por ltimo recordar que siempre debemos tocar los portas por los bordes, de esta forma evitamos manchar las superficies de los mismos con suciedad o grasa procedente de los dedos.

Guantes desechables. Un rotulador de vidrio.

Reactivos

Un desinfectante: alcohol etlico (etanol) de 70, o mejor an, solucin alcohlica de povidona yodada. Solucin de etanol-eter etlico en una proporcin de 50:50. Muestra Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada. La forma correcta de extraer sangre capilar es la siguiente: Elegir el tercer o cuarto dedo de una de las manos. Desinfectar el pulpejo del dedo selecciondo con un algodn embebido en un desinfectante apropiado. Dejar que el desinfectante se evapore. Con una lanceta, pinchar firme y rpidamente una cara lateral de este pulpejo. Tras lo anterior con un algodn seco retiramos la primera gota emitida. Presionamos el extremo del dedo, a nivel del lado opuesto al de la puncin, hasta obtener la cantidad de sangre deseada. Por ltimo, tapamos el pulpejo con una tirita. La sangre venosa tiene que haber sido extrada hace menos de 3 horas, ya que pasado este tiempo, se producen unos cambios apreciables en las clulas, que se manifiestan, al ser teidas stas, como alteraciones en su morfologa. Una vez extrada, la sangre venosa ha de ser anticoagulada con EDTA. Para realizar frotis sanguneos no debe utilizarse sangre anticoagulada con heparina, ya que sta agrega las clulas y produce un fondo azul en las extensiones de sangre teidas con el colorante de Wright.

Hay que tener en cuenta que la sangre capilar contiene ms hemates y leucocitos y menos plaquetas que la sangre venosa. Tcnica

Con los dedos ndice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. Tambin puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazn de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ngulo con la mesa. Con un capilar cargado mediante capilaridad de sangre problema, depositar una pequea gota de sta (de unos 5 microlitros) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano. Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ngulo de 45 con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta funcin.

Desplazar suavemente hacia atrs el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre. Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte. Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensin del porta extensor. Secar rpidamente la extensin, agitndola al aire, para que sus clulas no se distorsionen. Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensin.

Lectura de resultados

A la hora de leer los resultados, se han de tener en cuenta las caractersticas propias de una buena extensin y los defectos que puede tener una extensin incorrecta. COLORACION 1. La tincin de Giemsa es un mtodo habitual para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Este mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las clulas huspedes. La coloracin de giemsa se emplea tambin para teir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la tcnica de citoconcentracin para parsitos sanguneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parsito principal, con excepcin de los trofozoitos jvenes y el plasmodium falciparum. 2. Tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematologa este tipo de tincin, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de informacin a partir del examen de un frotis de sangre perifrica bien teido. Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B.La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas. Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Cubrir el extendido de sangre con 14 gotas de colorante Dejar actuar por 1 minuto Cubrir con igual cantidad de agua destilada y dejar actuar por 4 minutos Lavar con agua destilada

5.

Dejar secar en posicin vertical al medio ambiente

OBSERVAR CON OBJETIVO DE INMERSION PROCEDER AL RECUENTO

PRUEBA DE VRDL VDRL (por su siglas en ingls, Venereal Disease Research Laboratory) es una prueba serolgica realizada en medicina con sensibilidad y especificidad para complementar el diagnstico de sfilis. La prueba de VDRL comenz a desarrollarse antes de la Primera Guerra Mundial, con la participacin de August von Wassermann y Albert Ludwig Sigesmund Neisser. Modificaciones generales ocurrieron en 1946, las cuales son la base de la prueba actual. Debido a que la prueba del VDRL emplea marcadores indirectos de infeccin, se le conoce como una prueba para sfilis notreponemica. Interpretacin Un VDRL positivo (reactivo), es un parmetro altamente sugestivo de sfilis, pero nunca sinnimo de sta, por lo que debe evaluarse en combinacin con la historia clnica del sujeto y sus antecedentes epidemiolgicos.4 Cuando el resultado de la prueba confirmatoria resulta negativo, se considera que el resultado reactivo del VDRL es un verdadero negativo y que el sujeto no se encuentra infectado. Si el resultado de una prueba confirmatoria es positivo, se considera confirmado el diagnstico de sfilis en el paciente y este debe ser referido para tratamiento. Cualquier enfermedad por treponemas causa un VDRL positivo: sfilis, frambesia, pinta, bejel, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme y otras borreliosis. Resultados reactivos tambin resultan con otras enfermedades infecciosas, como tuberculosis, lepra, neumococo, endocarditis infecciosa, mononucleosis infecciosa, neumonas virales, sarampin, varicela, paludismo y 3 tripanosomiasis. Algunas enfermedades no infecciosas que pueden producir un VDRL reactivo incluyen las anemias hemolticas

autoinmunes, enfermedades del colgeno, sndrome antifosfolipdico primario, ciertas inmunizaciones y el embarazo.4 Los falsos positivos, por lo general, no superan los ttulos de dilucin de 1/8; y pueden ser transitorios o permanentes, segn persistan, o no, ms de 6 meses. El resultado no reactivo (negativo) tampoco descarta sfilis, porque durante el perodo de incubacin de la enfermedad y hasta 15 das despus de la aparicin del chancro sifiltico, an no se han producido anticuerpos. Adicionalmente, en pacientes con ttulos muy altos de anticuerpos anticardiolipina (1 2 % de los pacientes con sfilis) se observa una reaccin proznica que causa falsos negativos. Durante el embarazo, especialmente en el ltimo trimestre, se produce paso de la inmunoglobulina G a travs de la placenta, de manera que una serologa positiva en el recin nacido no permite diferenciar entre el traspaso pasivo de anticuerpos maternos y la infeccin verdadera del recin nacido. Valores normales Un examen negativo es normal y significa que no se detectaron anticuerpos contra la sfilis. La prueba de deteccin es ms probable que sea positiva en la sfilis secundaria y latente. Durante la sfilis primaria y terciaria, el resultado del examen puede ser falso negativo. El examen con resultado positivo puede indicar que usted tiene sfilis. Si el examen es positivo, el siguiente paso es confirmar los resultados con examen FTA-ABS, que es un examen ms especfico para la sfilis. La capacidad del examen VDRL para detectar sfilis depende de la etapa de la enfermedad. La sensibilidad del examen para detectar la sfilis se acerca al 100% durante las etapas intermedias y es menos sensible durante las etapas ms tempranas y tardas.

PRUEBA DE WIDAL La reaccin de Widal, es un test basado en el principio de aglutinacin antigeno- anticuerpo, fue desarrollada por Georges Fernand Isadore Widal, Medico francs, para el diagnostico serolgico de la fiebre tifoidea. Debido a la baja especificidad de esta prueba debe ser interpretada en el contexto clnico del paciente.

La aglutinacin se considera como una reaccin en 2 etapas. Cuando se aade el Ag al suero se produce una combinacin fisicoqumica en la que el Ac se fija a la superficie del Ag; va seguido de una aglutinacin en presencia de solucin salina. El grado de aglutinacin depende de la composicin de la solucin salina y de la temperatura de la reaccin (7). BASES INMUNOLGICAS DE LA REACCIN DE WIDAL: La reaccin de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antgenos H (flagelar) u O (somtico) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea. Los anticuerpos contra el antgeno O aparecen luego de 6 a 8 das de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses. Los anticuerpos contra el antgeno H aparecen a los 8 a 12 das, alcanzando ttulos ms elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por ms de 1 ao. Los anticuerpos contra el antgeno Vi aparecen ms tardamente, a la tercera semana, sin embargo lo hacen en ttulos bajos 1:10-1:20 con respecto a los previos (3,6). Interpretacin de los resultados El ttulo del suero es la dilucin ms alta que muestra aglutinacin frente al Ag. En el curso de la enfermedad se produce un aumento en el ttulo de aglutininas contra los antgenos somtico (O) y flagelar (H), lo que alcanza un mnimo durante la 3ra semana. Un aumento del ttulo al cudruple o mayor en ausencia de inmunizacin contra la fiebre tifoidea durante las ltimas 4 a 6 semanas, debe considerarse sospechoso de infeccin. Sin embargo, el clnico no puede esperar este tiempo para establecer un tratamiento, por lo cual se debe considerar la posibilidad de esta entidad con un ttulo aislado determinado, mas los datos clnicos, pues ningn ttulo aislado puede considerarse diagnstico. En los individuos no vacunados es significativo un ttulo igual o superior a 1/160 para los Ag O y H; pero en los vacunados, estos ttulos pueden aumentar hasta 4 veces en el curso de enfermedades febriles no relacionadas con la fiebre tifoidea, por lo que no debe utilizarse la serologa como nico mtodo de diagnstico. La tcnica inicial de Widal se ha sustituido por una tcnica ms precisa que investiga por separado las aglutininas O y las H aparecidas en el suero como respuesta a la estimulacin creada por los antgenos (Ag) somticos O y flagelares H de la salmonella. Los ttulos altos frente al

Ag O significan infeccin en la fase aguda; los ttulos altos frente al Ag H corresponden a la fase de convalecencia. En general, se recomienda tener en cuenta la fiebre tifoidea con ttulos Anti-O=1:160-200 y/o H =160-200 en zonas endmicas; en zonas no endmicas se debe pensar con ttulos ms bajos Anti-O =1:50-100. Adems, debemos saber que una reaccin negativa no excluye el diagnstico de fiebre tifoidea en el contexto de un cuadro clnico compatible. Esta prueba tiene sensibilidad moderada (negativa en el 30% de los casos demostrados mediante cultivo), y adems carece de especificidad (muchas cepas de Salmonella no tifoideas tienen antgenos H y O con reaccin cruzada; en la cirrosis se observa produccin inespecfica de anticuerpos, con falsa reaccin positiva) (8,9). Limitaciones de la reaccin de Widal La importancia de la aglutinacin de Widal radica en ser un mtodo serolgico, rpido, barato, y ampliamente conocido para el diagnstico de la fiebre tifoidea; sin embargo, tiene grandes limitaciones por reacciones antignicas cruzadas con otras bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo Salmonellas no typhi), parsitos, virus y hongos, llevando con frecuencia al clnico a sobrediagnosticar sndromes febriles como fiebre tifoidea (10). Como ejemplo de estos falsos positivos, se ha descrito en fiebre paratifoidea por Paratyphi A, ttulos Anti-O y Anti-H =100 en un 53 y 22% de los pacientes, respectivamente (11). En pacientes con malaria, estudiados en Nigeria, con hemocultivos negativos para Salmonella typhi, se encontraron reacciones de Widal positivas con ttulos 1:40, 1:80, y 1:160 en el 85, 12, y 3% de los casos, respectivamente (12). En la India, se report test de Widal con ttulos >1:100 en el 12, 17 y 24% de pacientes con malaria por Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum con bajas parasitemias, y altas parasitemias, respectivamente (13,14). En Surat, se evidenciaron ttulos Anti-O y Anti-H en el 15 y 10% de los pacientes con malaria, respectivamente, informando que cuatro semanas despus estos fueron negativos (15). Dentro de las limitaciones de la reaccin de Widal, se debe tener en cuenta que hasta un 50 y 33% de los pacientes con fiebre tifoidea no tratada no presentan el aumento caracterstico en los ttulos Anti-O y tienen negatividad en los ttulos Anti-H, respectivamente (16).

En un estudio realizado en Vietnam se report que el 17 y 33% de los pacientes con fiebre tifoidea y hemocultivos positivos tenan ttulos Anti-O y Anti-H =100, respectivamente. Otro elemento a considerar es la presencia de Anti-O y Anti-H en la poblacin sana, lo cual est determinado principalmente por la prevalencia de salmonelosis en una comunidad determinada Procedimiento:

Suero (ul) Antigeno Aglutinaci n Resultado

1/2 0 80 I got a -

1/40 40 I gota + sospecho so

1/80 20 I gota + sospecho so

1/16 0 10 I gota + +

1/32 0 5 I gota + +

Contr ol + I gota I gota

Contr ol I gota I gota