J Bras Patol Med Lab v. 42 n. 3 p.

157-162 junho 2006

ARTIgO ORIgINAL ORIgInal papER

Urinlise: comparao entre microscopia ptica e citometria de fluxo

Urinalysis: comparison between microscopic and flow cytometry analysis

Primeira submisso em 28/11/05 ltima submisso em 03/04/06 Aceito para publicao em 11/04/06 Publicado em 20/06/06

Bottini P.V.1; Garlipp C.R.2

unitermos
Urinlise Microscopia ptica comum Citometria de fluxo

resumo
Introduo e objetivo: O exame de urina um procedimento de alta demanda, trabalhoso e pouco padronizado. Este estudo teve por objetivo avaliar o desempenho de um citmetro de fluxo na realizao do exame de urina de rotina. Casustica e mtodos: Foram analisadas 1.140 amostras de urina atravs de microscopia ptica comum e de citometria de fluxo (UF-100/SYSMEX). A preciso foi estabelecida com a anlise de quatro amostras de urina (20 replicaes cada). O clculo da reprodutibilidade foi realizado a partir de 30 determinaes de dois controles comerciais em dias consecutivos. Resultados: As contagens de hemcias e leuccitos mostraram concordncia de 91% e 93%, respectivamente. Cilindros, clulas e bactrias mostraram sobreposio dos valores fornecidos pelo UF-100 quando comparados com os relatados na anlise microscpica. A preciso do UF-100 variou de 4% a 155%, com reprodutibilidade de 3% e 25%, dependendo do parmetro avaliado. Concluso: O equipamento UF-100/SYSMEX demonstra boa preciso, reprodutibilidade e concordncia com a microscopia ptica. A utilizao da citometria de fluxo implica numa maior agilizao e padronizao da rotina, bem como em uma nova maneira de reportar e interpretar o exame de urina de rotina.

abstract
Introduction: Urinalysis is a high demand procedure, with large amount of manual labor and poorly standardized. The purpose of this investigation was to analyze the performance of an automated system based on flow cytometry for routine urinalysis. Material and methods: We analyzed 1,140 urine samples by light field microscopy and by flow cytometry (UF-100/SYSMEX). For the precision study of the UF-100, we calculated the within-run and between-run coefficients of variation using two different levels of commercial controls and four different urine samples. Results: Erythrocytes and leukocytes counts by the two methods showed an agreement of 91% and 93%, respectively. Casts, epithelial cells and bacteria counts by the UF-100 showed a significant overlap when compared to microscopic analysis. Intra assay precision (within-run) ranged from 4% to 155% and interassay precision (between-run) varied from 3% to 25%, depending on the considered parameter. Conclusion: Flow cytometry is a precise and reproducible technique, with a strong correlation with the results obtained by microscopic analysis. Flow cytometry allows a better workflow and a new manner of reporting and interpreting routine urinalysis.

key words y
Urinalysis Microscopic examination Flow cytometry

1. Mdica patologista clnica; supervisora do Servio de Lquidos Biolgicos da Diviso de Patologia Clnica do Hospital de Clnicas da Universidade Estadual de Campinas (HC/UNICAMP). 2. Professora associada do Departamento de Patologia Clnica da Faculdade de Cincias Mdicas (FCM) da UNICAMP. Diviso de Patologia Clnica do HC/UNICAMP.

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Introduo
Embora a anlise do sedimento urinrio fornea informaes essenciais sobre o estado funcional dos rins, o exame de urina um procedimento de alta demanda que requer um trabalho intenso, pouco padronizado e apresenta uma ampla variabilidade interobservadores . Adicionalmente,
(13)

Objetivo
Este estudo teve por objetivo avaliar o desempenho de um citmetro de fluxo (UF-100/SYSMEX), frente a anlises microscpicas do sedimento urinrio, em um hospital de atendimento tercirio.

esse exame gera um custo elevado aos laboratrios, j que para se obter resultados de qualidade h a necessidade de pessoal bastante qualificado(2). Atualmente, tanto o National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) dos EUA(11) como o European Urinalysis Guidelines(5) recomendam a padronizao da contagem de clulas do exame de urina, por meio de um sistema automatizado e/ou de um procedimento padronizado em uma cmara de contagem de clulas de volume pr-definido(12). Na tentativa de se automatizar a anlise microscpica da urina, no final dos anos 1980, surgiram alguns sistemas analisadores de imagens. Esses equipamentos, apesar de melhorarem o fluxo de trabalho e aumentarem a produtividade e preciso das anlises, ainda so bastante dependentes de um observador bem treinado .
(4)

Casustica
Foram avaliadas 1.140 amostras isoladas de urina (jato mdio), encaminhadas ao laboratrio a pedido mdico, para anlise de rotina (exame fsico-qumico e anlise do sedimento urinrio) na Seo de Urinlise da Diviso de Patologia Clnica do Hospital de Clnicas da Universidade Estadual de Campinas (HC/UNICAMP). Este estudo obteve a dispensa da assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, uma vez que os testes laboratoriais foram realizados com o excedente das amostras de urina encaminhadas para o diagnstico e tratamento dos pacientes atendidos em nosso Servio. O anonimato dos indivduos foi preservado, segundo os critrios estabelecidos pela Resoluo 196/96 e observados pelo Comit de tica da Faculdade de Cincias Mdicas (FCM) da UNICAMP.

H alguns anos surgiu no mercado um equipamento que realiza a anlise da urina por citometria de fluxo, o UF-100/SYSMEX. Esse equipamento um analisador totalmente automatizado, que aspira a amostra de urina e, por fluorescncia, cora o DNA e as membranas dos elementos formados na urina nativa (fenantridina para cidos nucleicos e carbocianina para membranas celulares). A seguir, clulas, bactrias e cilindros so analisados e classificados, levando-se em considerao o volume (impedncia), o tamanho (disperso de luz) e as caractersticas tintoriais (fluorescncia) nucleares e citoplasmticas dos elementos urinrios . A distino entre hemcias e leveduras feita
(6)

Mtodos
Todas as amostras foram analisadas por microscopia ptica comum e por citometria de fluxo. Para anlise microscpica do sedimento, as amostras foram inicialmente homogeneizadas e submetidas a centrifugao (10ml de urina a 1.500rpm/min, durante 10 minutos). O sobrenadante foi desprezado, restando 1ml de sedimento, que foi ressuspenso por agitao e transferido para um pocinho da lmina padronizada (KCELL). O sedimento foi inicialmente analisado (aumentado em 100 vezes) para verificar a disposio dos elementos presentes na rea no-demarcada por crculos. A contagem de hemcias e leuccitos foi realizada com aumento de 400 vezes, sendo contados pelo menos 10 campos e o resultado expresso em nmero mdio de leuccitos e hemcias por campo. A presena de bactrias, cilindros, cristais e clulas epiteliais foi expressa de maneira semiquantitiativa (Tabelas 1 e 2). Para anlise por citometria de fluxo utilizou-se o equipamento UF-100/SYSMEX. As amostras foram homogeneizadas e transferidas para tubos de 10ml, os quais

de acordo com a intensidade de suas fluorescncias. Apesar de a anlise microscpica da urina demandar enorme trabalho laboratorial manual e de apresentar preciso limitada, ainda universalmente utilizada para o exame de clulas e partculas presentes na urina. Quando comparados com a microscopia ptica comum, os citmetros de fluxo melhoraram a preciso e a eficcia das contagens, gerando uma substancial reduo do trabalho. No entanto, a falta de padronizao nos seus procedimentos analticos permanece um importante fator limitante para sua ampla utilizao.

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Expresso dos resultados: hemcias Tabela 1 e leuccitos o N mdio/campo Descrio

<1 Entre 1 e 100 > 100 Inferior a 1/campo Nmero/campo Superior a 100/campo

A preciso do UF-100 foi estabelecida a partir da anlise de quatro amostras de urina (20 replicaes cada), sendo o clculo da reprodutibilidade realizado a partir de 30 determinaes de dois controles comerciais, em dias consecutivos.

Anlise estatstica
A anlise estatstica se baseia em testes de concordncia (atravs da construo de tabelas 2 x 2 com posterior anlise pelo 2) e em clculos de sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos, conforme recomendao do fabricante do equipamento.

Expresso dos resultados: cilindros, Tabela 2 cristais e clulas epiteliais No mdio/campo Descrio
0 <1 1a3 >3 Ausentes Raros Nmero regular Numerosos

resultados
O estudo da preciso do UF-100 (Tabelas 3 e 4) apresentou coeficientes de variao (CV) intra-ensaios de 5% a 21% (hemcias); 4% a 24% (leuccitos); 5% a 35% (clulas epiteliais); 66% a 155% (cilindros) e 4% a 6% (bactrias). A reprodutibilidade (coeficiente de variao [CV] interensaio, Tabelas 5 e 6) variou entre 3% e 25%, dependendo do parmetro avaliado.

foram colocados em racks do equipamento. Este realizou a aspirao da amostra e o processamento automatizado da contagem dos elementos figurados presentes na urina. Os resultados foram expressos de forma grfica e numrica (elementos por l e por campo).

Tabela 3
Replicatas Mdia Mnimo Mximo Desvio-padro CV (%)
* Contagem/campo.

Preciso do UF-100/CV intra-ensaio: hemcias e leuccitos Hemcias*

20 39 34 42 2 5 20 5 4 7 1 12 20 4 3 4 0,4 9 20 0,2 0,2 0,3 0,1 21 20 106 101 115 4 4

Leuccitos*
20 2 1 2 0,1 9 20 22 18 30 3 13 20 0,5 0,3 0,7 0,1 24

Tabela 4
Replicatas Mdia Mnimo Mximo Desvio-padro CV (%)
* Contagem/campo.

Preciso do UF-100/CV intra-ensaio: clulas epiteliais, cilindros e bactrias Clulas* Cilindros* Bactrias*
20 14 13 16 1 5 20 1 1 2 0,2 15 20 7 6 10 1 14 20 0,3 0,1 0,5 0,1 35 20 1,0 0 3 0,7 66 20 0,3 0 1 0,3 121 20 0,3 0 1 0,4 109 20 0,2 0 1 0,3 155 20 1087 858 1176 68 6 20 136 124 147 6 4 20 694 564 728 35 5 20 81 75 89 3 4

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Tabela 5

Reprodutibilidade/CV interensaio: hemcias e leuccitos Hemcias*

30 40 31 48 4 10 30 201 187 210 6 3 30 42 33 51 5 11

Leuccitos*
30 196 187 207 6 3

Replicatas (CQ 1 E 2) Mdia Mnimo Mximo Desvio-padro CV (%)

* Contagem/l.

Tabela 6

Reprodutibilidade/CV interensaio: clulas, cilindros e bactrias Clulas* Cilindros*

30 12 8 18 2 19 30 95 92 105 4 5 30 6 5 8 2 25 30 21 15 25 3 13

Bactrias*
30 2.975 2.026 3.763 43 1 30 981 569 1.328 21 2

Replicatas (CQ 1 e 2) Mdia Mnimo Mximo Desvio-padro CV (%)

* Contagem/l.

As contagens de hemcias e leuccitos mostraram concordncia entre os mtodos de 91% e 93%, respectivamente, com valor preditivo (VP) negativo superior a 97% quando consideramos como limite de normalidade uma contagem de at cinco elementos/campo (p < 0,05) (Tabelas 7 e 8). Em relao a cilindros, clulas e bactrias (Figuras 1, 2 e 3), observamos uma grande sobreposio das contagens forne-

cidas pelo UF-100 quando comparados com os relatados na anlise microscpica, onde foram expressos como ausentes, raros, regular nmero e numerosos. O principal interferente nas contagens de cilindros foi a presena de filamentos de muco, enquanto leveduras e cristais de oxalato de clcio discides foram os principais responsveis por contagens de hemcias falsamente elevadas.

Tabela 7

Concordncia entre as contagens de hemcias > 5/campo (MO) at 5/campo (MO)

141 31 172 77 891 968

Total
218 922 1140

> 5/campo (UF 100) at 5/campo (UF 100) Total

Sensibilidade = 82%; especificidade = 92%; VP positivo = 65%; VP negativo = 97%; concordncia = 91%.

Tabela 8

Concordncia entre as contagens de leuccitos > 5/campo (MO) at 5/campo (MO)

25 15 266 61 813 874

Total
312 828 1.140

> 5/campo (UF 100) at 5 / campo (UF 100) Total

Sensibilidade = 94%; especificidade = 93%; VP positivo = 80%; VP negativo = 98%; concordncia = 93%.

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UF - 100 (cilindros/ l)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4

o), com base em clculos de taxas de concordncia das amostras consideradas negativas ou normais. Estudos tm relatado uma boa correlao entre o nmero de clulas contadas por microscopia ptica e citometria de fluxo(1). De fato, nossos resultados apresentaram boa concordncia entre as duas metodologias quando consideramos o limite de normalidade de at cinco elementos/campo (hemcias ou leuccitos). Alm disso, o UF-100 vem se mostrando bastante preciso e com boa reprodutibilidade, o que foi demonstrado neste e em outros estudos(2, 7, 12). J com relao aos cilindros, o elevado coeficiente de variao intra-ensaio observado em nosso estudo se deve ao pequeno nmero de cilindros presentes no material analisado. Vrios autores(2, 12) vm demonstrando que o UF-100 detecta mais hemcias, leuccitos e clulas epiteliais do que a microscopia manual. Isto provavelmente representa a deteco real de elementos que no so identificados pela microscopia ptica, uma vez que a rotina de urinlise compreende vrias etapas, como centrifugao, decantao e ressuspenso, as quais podem levar a uma perda e/ou degenerao celular varivel. Alm desses fatores, at a matria-prima do tubo cnico para centrifugao pode ser mais um fator de variao, podendo ocorrer, ou no, adsoro de elementos celulares s suas paredes(8, 10). Provavelmente, essa observao justifica uma das maiores dificuldades de sua implantao na rotina da maioria dos laboratrios, que reside no fato de seus valores de referncia serem significativamente diferentes e mais elevados do que os habitualmente adotados. No presente trabalho, o principal interferente nas contagens de cilindros foi a presena de filamentos de muco, enquanto leveduras e cristais de oxalato de clcio discides foram os principais responsveis por contagens de hemcias falsamente elevadas. Outros autores(2) observaram que o UF-100 superestimava a contagem de clulas epiteliais na presena de cilindros, Trichomonas sp. e proteinria. Nesse ltimo caso a explicao seria a formao de grumos leucocitrios devido presena de protenas na amostra. Vrios relatos fazem referncia contagem incorreta de hemcias na presena de cristais, leveduras, espermatozides e grande nmero de bactrias(9, 10, 12). Da mesma forma, a principal causa de contagem de leuccitos falsamente elevados a presena de ncleos isolados de clulas epiteliais(12). Segundo Ottiger e Huber(12), a maior parte das revises pode ser atribuda a alertas decorrentes da presena de clulas redondas (SRC), cilindros, cristais, leveduras e espermatozides. Clulas epiteliais agrupadas freqentemente do um alerta para cilindros patolgicos e SRC que necessitam de confirmao. Grande nmero de cristais, leveduras e espermatozides superestimam a contagem de hemcias, como foi comprovado em nosso estudo.

1= ausentes 2 = raros 3 = reg numero 4 = numerosos

microscopia

Figura 1 Relao entre microscopia tica e citometria de fluxo cilindros

UF - 100 (clulas/l)

120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4
microscopia
1= ausentes 2 = raros 3 = reg numero 4 = numerosos

Figura 2 Relao entre microscopia tica e citometria de fluxo clulas epiteliais

UF - 100 (bactrias/l)

20000 15000 10000 5000 0 0 1 2 3 4

microscopia
1= ausentes 2 = raros 3 = reg numero 4 = numerosos

Figura 3 Relao entre microscopia tica e citometria de fluxo bactrias

discusso
A anlise manual do sedimento urinrio, embora de grande utilidade clnica, apresenta muitos problemas metodolgicos. Alm de consumir considervel tempo de trabalho do analista, vrios fatores podem contribuir para a impreciso nos resultados desse mtodo (centrifugao, diferenas de interpretao de elementos celulares, cilindros, entre outros)(2). O analisador UF-100 identifica na urina, pelo princpio da citometria de fluxo, clulas e partculas de maneira anloga dos analisadores de clulas sangneas. Portanto um equipamento totalmente automatizado, multiparamtrico e com boa velocidade de processamento (em torno de 100 amostras/hora). Em relao anlise estatstica, o fabricante do equipamento recomenda o uso de testes de comparao dos resultados entre metodologias (microscopia x automa-

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Na anlise dos dados relativos a cilindros, clulas e bactrias, em razo da sobreposio dos valores fornecidos pelo UF-100 quando comparados com os relatados na anlise microscpica, necessrio estabelecer uma nova maneira de expressar esses resultados em substituio forma de expresso semiquantitativa habitualmente utilizada, ressaltando-se a presena ou ausncia desses elementos. A correta identificao de cilindros e cristais patolgicos ainda necessita ser realizada atravs de microscopia ptica tradicional. Da mesma forma, deve-se ressaltar que todas as amostras que apresentem alertas (flags) ou elementos anormais devem ser submetidas reviso microscpica. Vale lembrar que amostras de urina proveniente de servios de nefrologia apresentam maior taxa de reviso(3). Para o estabelecimento de um algoritmo que reduza o trabalho manual, permitindo maior otimizao das rotinas sem perda de sensibilidade e especificidade, deve-se levar em conta contagens celulares elevadas, presena de cilindros, cristais, leveduras, espermatozides, alm de alertas para elementos patolgicos e da anlise detalhada dos grficos de disperso para detectar um possvel padro anormal.

Antes da liberao final prudente associar uma checagem cruzada entre os resultados obtidos na anlise fsico-qumica (atravs de tiras reagentes) com os dados fornecidos pelo UF-100.

Concluso
Nossos resultados demonstram que o equipamento UF-100 apresenta boa preciso, reprodutibilidade e concordncia com a microscopia ptica. Os dados apresentados confirmam a dificuldade de padronizao e a subjetividade da anlise microscpica do exame de urina. A utilizao rotineira da citometria de fluxo implica em maior agilizao e padronizao da rotina, ao lado de uma nova maneira de se reportar e interpretar o exame de urina de rotina.

Agradecimentos
A Bruna de Carvalho Gallo, Joo Guilherme A. P. Franceschi, Jos Ricardo Lauand e a Susy Helena Afaz pela ajuda inestimvel na compilao dos dados.

referncias
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Endereo para correspondncia Paula V. Bottini Diviso de Patologia Clnica do HC/UNICAMP Cidade Universitria Zeferino Vaz Caixa Postal 6142 CEP: 13083-888 Campinas-SP Tel.: (019) 3788-7539 Fax: (019) 3788-7510 e-mail: lbio@hc.unicamp.br

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