ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

BIOQUIMICA II
GUIA DE PRCTICA (4) REACCIONES DE PRECIPITACIONES DE PROTEINAS

DOCENTE: Q.F. Anglica Minaya INTEGRANTES: Cotrina Jorge, Franco Joel Velsquez Gonzales, Susana Tito Requis, Luis Armando Ruiz Anda , Jhojan Robles Quispe, Paola Marichini Cordero ,Abel

REACCIONES DE PRECIPITACION DE PROTEINAS

OBJETIVOS: Determinar algunas de las propiedades fisicoqumicas de las protenas que las caracterizan as como identificar sus propiedades tericas segn su estructura. Observar la desnaturalizacin de las protenas provenientes de la clara del huevo mediante diferentes mtodos. INTRODUCCION: SEDIMENTACION DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO: Las protenas, como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl.(NH4)2SO4 y NaSO 4]. Aparentemente la precipitacin s e d e b e a l a n e u t r a l i z a c i n y d e s h i d r a t a c i n d e l a molcula, seguida de agregacin y precipitacin. EFECTO DEL CALOR: E l c a l o r e s u n o d e l o s a g e n t e s p r i m o r d i a l e s d e desnaturalizacin, la mayor parte de las protenas en solucin son inestables a temperaturas superiores a 6 0 C . L a s a l t e r a c i o n e s q u e s u f r e l a m o l c u l a disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las protenas se denomina coagulacin. LA DESNATURALIZACIN: Es un cambio estructural de las protenas o cidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su ptimo funcionamiento y a veces tambin cambian sus propiedades fisicoqumicas .Las protenas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional y as su caracterstico plegamiento de su estructura. LA COAGULACIN: Se refiere al proceso de desestabilizacin de las partculas suspendidas de modo que se reduzcan las fuerzas de separacin entre ellas.

PRECIPITACIN DE LAS PROTENAS POR EFECTO DE CIDOS FUERTES Los cidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las protenas desnaturalizacin insolubles conocidos como metal protenas.

formando

de

PRECIPITACION CON ACIDOS ORGANICOS Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin PRECIPITACIN DE LAS PROTENAS POR METALES PESADOS Las protenas cuando se encuentran en solucin a pH s u p e r i o r e s a s u p u n t o i s o e l c t r i c o s o n c a p a c e s d e reaccionar con diferentes metales pesados formando las correspondientes protenas insolubles

MARCO TEORICO: La importancia la prctica reside en conocer ensayos de separacin de protenas bajo condiciones de solubilidad. Este efecto se emplea rutinariamente como base de la purificacin de una protena. DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION Se llama desnaturalizacin de las protenas a la perdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena poli peptdica reducida a un polmero esta estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija. Estado nativo Estado desnaturalizado

La desnaturalizacin frecuentemente es irreversible pero, en una serie de casos, la separacin de los agentes desnaturalizantes conlleva a la restitucin de la conformacin inicial de la molcula proteica y de sus propiedades naturales; es decir, la protena desplegada y desnaturalizada se vuelve a plegar espontneamente adoptando su estructura terciaria correcta y recuperando su actividad cataltica. RENATURALIZACION

DESNATURALIZACION DE ALBUMINA Se separan albuminas de globulinas. DESNATURALIZACION DE GELATINA La gelatina comercial no se desnaturaliza, ya que es un producto de degradacin parcial del colgeno, extrada por desnaturalizacin en calentamiento tras un tratamiento en medio cido o alcalino.

AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS. La desnaturalizacin de protenas puede llevarse a cabo por accin no solo del calor sino tambin de extremos de pH, ciertos disolventes orgnicos miscibles en agua como el alcohol o la acetona, ciertos solutos tales como la urea o el cloruro de guanidinio o mediante detergentes. El tratamiento con los agentes desnaturalizantes no rompe enlaces covalentes de la cadena polipeptidica. Los disolventes orgnicos, la urea y los detergentes actan principalmente rompiendo las interacciones hidrofobicas que forman el ncleo estable de las protenas globulares; los extremos de pH alteran la carga neta de la protena, dando lugar a la aparicin de repulsiones electrostticas ya a la destruccin de algunos enlaces de hidrogeno. Los estados desnaturalizados obtenidos con estos diversos tratamientos no son necesariamente equivalentes.

Protena a diferentes Phs.

La desnaturalizacin depende de la hidropata de la protena.

1.- Protenas en dilucin de sulfato de amonio. La precipitacin por salado es la base de los procedimientos de purificacin de protenas. La solubilidad de protenas disminuye generalmente a concentraciones elevadas de sal, un efecto denominado salting out (salado). La adiccin de algunas sales en cantidades apropiadas puede precipitar selectivamente algunas protenas, permaneciendo las restantes en solucin. El sulfato de amonio [NH4(SO)4] es particularmente efectivo y se utiliza a menudo para salar protenas. Para tener la protena de inters aislada se debe de separar de los disolventes en dilisis con papel filtro, aprovechando as el mayor tamao de las protenas. El extracto purificado de protena se obtiene por dilisis, para eliminar el sulfato de amonio.

2.- Coagulacin de protenas por calentamiento: La precipitacin de protenas por calentamientocoagulacines caracterstica casi para todas las protenas (excepto la gelatina que no se coagula por calentamiento). Particularmente, la precipitacin de la protena ocurre ms completa y fcil en medio dbilmente cido, cercano al punto isoelctrico. En medio neutro y fuertemente cido la precipitacin es peor, y en medio alcalino no se produce. El proceso de plegamemiento y cantidad de conformacin nativa (coagulo) se puede ver, termodinmicamente.

3.- Precipitacin de protenas con cidos minerales: El mtodo se basa en la capacidad de los cidos minerales de provocar la neutralizacin de las cargas y la destruccin de la estructura espacial de la protena, lo que conlleva a su desnaturalizacin y precipitacin. 4.-Precipitacin de protenas con cidos orgnicos: El mtodo se basa en la capacidad de los cidos orgnicos de neutralizar la carga de la molcula de la protena y de destruir su estructura espacial, lo que conlleva a su desnaturalizacin y precipitacin. 5.- Precipitacin de protenas con metales pesados y sales: El mtodo se basa en la unin de los ines de metales pesados con los grupos funcionales de los radicales laterales de los aminocidos en la molcula proteica, como resultado de lo cual se destruye su estructura espacial y ocurre la precipitacin de la protena desnaturalizada. Al aadir un exceso de sales de metales pesados (excepto AgNO3 y HgCl2) se produce la disolucin del precipitado formado inicialmente, debido a la adsorcin del in metlico y, como consecuencia de esto, la adquisicin de una carga positiva por la molcula proteica.

MATERIALES Y MTODO tubos de ensayo bombilla

agua destilada

Becker

pipetas

gradilla

huevo (albumina)

papel filtro

gelatina (colapiz)

mechero bunsen

embudo

REACTIVOS: o o o o Sulfato de amonio cido actico 1% cido actico 10% cido sulfosaliclico 20% o o o o cido sulfrico cido muritico 28% Cloruro de sodio cido tricloroacetico 5% o o o o Hidrxido de sodio 10% cido ntrico Sulfato de cobre 5% Acetato de plomo 5%

Mtodo:
SEDIMENTACION DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO: 1. En un tubo de ensayo pipetear 1.5 ml de albumina. 2. Adicionar 1.5 ml de solucin saturada de sulfato de amonio. 3. Suavemente agitar la mezcla. Aparece un sedimento de la precipitacin (globulinas) 4. Filtrar el lquido turbio a travs de un filtro seco. 5. Parte del filtrado transparente calentar hasta ebullicin y se va ha observar la coagulacin de las albuminas que se encuentra en la solucin. 6. Observar y anotar resultados.

COAGULACION DE PROTEINAS POR CALENTAMIENTO: 1) En cinco tubos de ensayo agregar 2 ml de solucin proteica. 2) Calentar el contenido del primer tubo de ensayo. El precipitado de la protena aparece mucho ms antes de que el lquido hierva. 3) Agregar al segundo tubo una gota de cido actico al 1% y calentar. Aparicin de un precipitado coposo. 4) Agregar al tercer tubo cerca de 0.5 ml de cido actico al 10% y lo calienta. 5) Agregar al cuarto tubo de ensayo cerca 0.5 ml de cido actico al 10% y algunas gotas de solucin saturada de cloruro de sodio y calentar. 6) Agregar al quinto tubo cerca de 0.5 ml de solucin de hidrxido de sodio y calentar. 7) Observar y anotar resultados.

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ACIDOS CONCENTRADOS: 1. En tres tubos de ensayo secos agregar 2 ml de acido ntrico, cido sulfrico y cido muritico. 2. Inclinar cada tubo y POR LAS PAREDES agregar 0.5 ml de albumina de manera que no se mezcle con el acido. 3. En la zona de contacto de los dos lquidos aparece un precipitado de protena blanco amorfo. 4. Agitar los tres tubos. 5. El mismo procedimiento realizarlo con la gelatina y en las mismas cantidades anteriormente mencionadas. 6. Observar y anotar resultados. 7. Realizar el mismo procedimiento con el colapiz.

PRECIPITACION CON ACIDOS ORGANICOS: 1) En dos tubos de ensayo agregar 2.5 ml de albumina. 2) Aadir a uno de los tubos algunas gotas de cido tricloroactico al 5%. 3) Al otro tubo aadir algunas gotas de cido sulfosaliclico al 20%. 4) En ambos casos se observa precipitado. 5) Observar y anotar la intensidad coloraciones.

de

las

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON METALES PESADOS: 1) En dos tubos de ensayo agregar 1.5 ml de albumina. 2) Aadir a uno de los tubos algunas gotas de sulfato de cobre al 5%. 3) Al otro tubo aadir algunas gotas de acetato de plomo al 5%. 4) En ambos casos se observa precipitado. 5) Observar y anotar la intensidad de las coloraciones

ENSAYO 1.-SEDIMENTACION DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO

RESULTADOS En la filtracin se obtuvo dos partes a. filtrado transparente b. precipitado (globulinas) La parte a. se calent y esta mostro una coagulacin. El sulfato de amonio precipita fraccionadamente las globulinas que no son solubles en agua. Cuando se calienta el filtrado lo que se observa es la coagulacin de las albuminas que se encuentran en la solucin. (desnaturalizacin)

2.-COAGULACION CALENTAMIENTO

DE

PROTEINAS

POR TUBO1: Precipitado ligero (+) TUBO2: Formacin de precipitado blanquecino coposo (+) TUBO3: Precipitado blanco lechoso (+) TUBO4: Precipitado blanco lechoso (+) TUBO5: color amarillo La coagulacin de la las protenas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalizacin por soluciones acidas, salinas, alcohol, etc. Que al actuar sobre la protena la desordenan por la destruccin de sus estructuras.

3.-PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ACIDOS CONCENTRADOS GELATINA

TUBO1 (ACIDO NITRICO): no hay reaccin de precipitado. (-) TUBO2 (ACIDO SULFURICO): no hay reaccin de precipitado. EXOTERMICA (-) TUBO3 (ACIDO CLORHIDRICO): no hay reaccin de precipitado. (-) La gelatina es mas estable a pH cido o tal vez el pH en el que realiza su funcin biolgica es cido

ALBUMINA:

TUBO1 (ACIDO NITRICO): formacin de precipitado (amarillo) (+) TUBO2 (ACIDO SULFURICO): no hay precipitado, se disuelve. REACCION EXOTERMICA. (-) TUBO3 (ACIDO CLORHIDRICO): formacin de precipitado, no se disuelve. (+) Esto indica que la albmina tiene una sensibilidad mayor a los pH cidos

4. PRECIPITACIN CON ACIDOS ORGANICOS TUBO1 ((acido tricloroactico): formacin de precipitado es poco denso y blanco claro (+) Esto indica que la albmina tiene una sensibilidad mayor a los pH cidos. TUBO2 (cido sulfosaliclico): precipitado sigue siendo lechoso peso ms denso (coagulo) (+)

5.PRECIPITACION DE PROTEINAS CON METALES PESADOS

TUBO1 (sulfato de cobre): color celeste cloro (+) TUBO2 (acetato de plomo): color blanco (+) La albmina forma, con el cloruro de mercurio, con el sulfato de cobre, con el acetato de plomo o el nitrato de plomo, precipitados insolubles

DISCUSIONES: 1. El cido tricloroacetico es un cido orgnico dbil que adems est en baja concentracin por lo que al cambiar en poco el pH la precipitacin por desnaturalizacin de las protenas puede darse. Sin embargo, en el caso de la adicin de cido ntrico los grupos amino libres de las protenas reaccionan con el cido ntrico liberando nitrgeno, sustituyndolo con grupos hidroxilo y dando como resultado protenas desaminadas. Con esto se destruye la estructura de la protena permitiendo que sta precipite. El cido clorhdrico es un cido fuerte y al disminuir el pH de la solucin se forman grupos protonados y por lo tanto con cargas que ocasionan repulsin entre varias partes de la protena de manera que sta pierde su estructura. 2. En el experimento 1 el sulfato de amonio se utiliza para precipitar fraccionadamente las globulinas que no son solubles en agua y para poder diferenciarlas de la albumina. Lo que hace el sulfato de amonio, es que, el agua compita entre la disolucin de esta sal o de la protena (formada por muchos grupos carboxilos y amonio) causando que precipite la protena (globulina).

CONCLUSIONES: 1. Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitacin, permite solubilizar nuevamente las protenas 2. En la prctica esta reaccin dar una precipitacin en la clara del huevo donde ser separada en dos fracciones: globulina (pp) y albumina (sobrenadante). A temperaturas mayores de 40 a 50C, la mayora de las protenas son inestables y se empieza a desnaturalizar. Con este fenmeno hay una prdida de solubilidad en la zona de pH neutro, pudindose precipitar la protena. 3. Las alteraciones que sufre la molcula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las protenas se denomina coagulacin.

4. Los cidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las protenas formando agregados insolubles llamados metaloproteinas. 5. Las protenas son sensibles con las sales metlicas pesadas (mercurio,cobre ,plomo) formando precipitados Las protenas cuando se encuentran en solucin a pH superiores a su punto isoelctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinados insolubles.

Cuestionario:
1.-Explicar, desde el punto de vista qumico los fenmenos de desnaturalizacin y renaturalizacin. Desnaturalizacin: Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Estado nativo

Estado desnaturalizado

Renaturalizacin: El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas las protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. 2.- Cmo influyen las sales diluidas y concentradas sobre la solubilidad de las protenas?

Precipitacin por sal. Cuando se aade sal a una solucin de protenas ocurre un incremento en la solubilidad y esto se conoce con el nombre de solubilizacion por salado (saltin ing). Este incremento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacin de la protena efectuada por un descenso en el coeficiente de actividad de los grupos ionogenicos. A medida que se aumenta la fuerza inica, se obtiene un mximo en la solubilidad seguido por un descenso en la misma que se conoce como insolubilizacin por salado (salting out). Durante la insolubilizacin por salado, ocurre probablemente una competencia entre la protena y al solucin salina por las molculas de agua disponible para su solvatacin, y entonces las interacciones protena- protena se hacen ms importante.

3.- Por qu precipitan las protenas por accin de los metales pesados? Las protenas pueden precipitarse de sus soluciones por sus diversos iones positivos o negativos. Los iones positivos de uso ms comn para precipitar protenas son los metales pesados: Zn++, Cd++, Hg++, Fe+++, Estos iones precipitan protenas de soluciones a pH superior al isoelctrico de cada protena, porque a este pH la protena esta disociada como protena negativa que se combina con el ion metlico positivo para dar un precipitado insoluble de proteinato del metal. Los iones negativos se combinan con protenas en forma de protena positiva (el pH de la solucin es acido respecto de punto isoelctrico de la protena) y forman sales de protenas. Entre los precipitantes de las protenas por accin de iones negativos figuran los cidos wolframio, pcrico, tnico, tricloroacetico, etc. 4.-Explique el fundamento de la precipitacin de protenas por accin del ultrasonido Los ultrasonidos pueden ser suficientes para interrumpir o desactivar un material biolgico. Se utilizan a menudo para romper las membranas celulares y conseguir la liberacin del contenido celular, debido a la intensa agitacin producida. Este proceso se llama sonoporacin. En funcin de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden llegar a destruir incluso las estructuras subcelulares o hacer solubles los complejos proteicos. Para evitar la desnaturalizacin de las protenas provocada por sobrecalentamiento, la sonicacin se suele aplicar en frio. SONICACION (someter la protena o clulas a vibraciones de ultrasonido). Es un mtodo especifico de aislamiento de protenas, estn tambin otros ensayos lisis osmtica, molienda. Mtodo fsico que puede alterar la estabilidad de la protena ya que por ultrasonido el sonicador eleva la temperatura durante la extraccin de la protena en la muestra. Entonces se dice que el ultrasonido tiene un efecto trmico, ya que la protena absorbe la temperatura.

BIBLIOGRAFIA

http://es.scribd.com/doc/15958125/1-PROPIEDADES-QUIMICAS-Y-FISICOQUIMICAS-DE-LASPROTEINAS VOET, BIOQUIMICA, PAG 228,121 LEHNINGER BIOQUIMICA.