BIOENGENHARIA

A produo de diferentes tipos de clulas em laboratrio e sua utilizao para recuperar tecidos ou rgos lesados est deixando de ser um sonho. Estudos com clulas-tronco vm demonstrando que elas podem se diferenciar em todos os tipos celulares presentes em um organismo adulto, e acredita-se que tal processo ser controlado em breve. Mesmo os debates ticos e religiosos sobre o uso de clulas-tronco retiradas de embries perderam o sentido, com a descoberta de que essas clulas existem em indivduos adultos e mantm sua capacidade de diferenciao. Est aberto o caminho para a bioengenharia, que revolucionar a medicina.

Clula
Todo organismo pluricelular composto por diferentes tipos de clulas. Entre os cerca de 75 trilhes de clulas existentes em um homem adulto, por exemplo, so encontrados em torno de 200 tipos celulares distintos. Todos eles derivam de clulas precursoras, denominadas clulas-tronco (figura 1). O processo de diferenciao, que gera as clulas especializadas da pele, dos ossos e cartilagens, do sangue, dos msculos, do sisteFigura 1. Colnias ma nervoso e dos outros rgos e tecidos humanos de clulas-tronco humanas, embrionrias, podem ser regulado, em cada caso, pela expresso de genes esmantidas indiferenciadas pecficos na clula-tronco, mas ainda no se sabe em em cultura tais colnias, detalhes como isso ocorre e que outros fatores esto s vezes, apresentam envolvidos. Compreender e controlar esse processo uma margem externa um dos grandes desafios da cincia na atualidade. de clulas j diferenciadas A clula-tronco prototpica o vulo fertilizado (zigoto). Essa nica clula capaz de gerar todos os tipos celulares existentes em um organismo adulto, at os gametas vulos e espermatozides que daro origem a novos zigotos (figura 2). A incrvel capacidade de gerar um organismo adulto completo a partir de apenas uma clula tem fascinado os bilogos desde que o fisio-

A medicin

Antonio Carlos Campos de Carvalho Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
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a do futuro
logista alemo Theodor Schwann (1810-1882) lanou, em 1839, as bases da teoria celular. J no incio do sculo 20, vrios embriologistas, entre eles os alemes Hans Spemann (1869-1941) e Jacques Loeb (1859-1924), comearam a decifrar os segredos das clulas-tronco atravs de experimentos engenhosos com clulas de embries. Tais pesquisas revelaram que, quando as duas primeiras clulas de um embrio de anfbio so separadas, cada uma capaz de gerar um girino normal, e que, mesmo aps as quatro primeiras divises celulares de um embrio de anfbio, o ncleo dessas clulas embrionrias ainda pode transmitir todas as informaes necessrias formao de girinos completos, se transplantado para uma clula da qual o ncleo tenha sido retirado (clula enucleada). A originalidade desses experimentos permitiu que Spemann formulasse, em 1938, uma pergunta fundamental para a moderna biologia do desenvolvimento: o ncleo de uma clula totalmente diferenciada seria capaz de gerar um indivduo adulto normal, se transplantado para um vulo enucleado? Em

s-tronco

1996, o nascimento da ovelha Dolly, primeiro mamFigura 2. Entender fero clonado a partir do ncleo de uma clula adulta em detalhes diferenciada (uma clula epitelial de glndula macomo um mria), trouxe a resposta. organismo completo, A continuao dos estudos sobre as clulas-troncom inmeros tipos co demonstrou que elas tm as seguintes caractersdiferentes de clulas, forma-se ticas bsicas: so indiferenciadas e tm a capacidaa partir de apenas de de gerar no s novas clulas-tronco como granuma clula de variedade de clulas diferenciadas funcionais. o vulo fertilizado Para realizar essa dupla tarefa (replicao e diferen(zigoto) ainda ciao), a clula-tronco pode seguir dois modelos b um desafio para a cincia sicos de diviso: o determinstico, no qual sua diviso gera sempre uma nova clula-tronco e uma diferenciada, ou o aleatrio (ou estocstico), no qual 4
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Figura 3. A diviso das clulas-tronco embrionrias segue dois modelos: o determinstico (A), que gera sempre uma clula-tronco e uma clula diferenciada, e o aleatrio (B), que gera diversas combinaes de clulas

algumas clulas-tronco geram somente novas clulas-tronco e outras geram apenas clulas diferenciadas (figura 3). As clulas-tronco conhecidas h mais tempo so as embrionrias, que aos poucos, com o desenvolvimento do embrio, produzem todas as demais clulas de um organismo. Mas nas ltimas dcadas descobriu-se que tecidos j diferenciados de organismos adultos conservam essas clulas precursoras.

As clulas-tronco embrionrias
As clulas-tronco embrionrias so estudadas desde o sculo 19, mas s h 20 anos dois grupos independentes de pesquisadores conseguiram imortaliz-las, ou seja, cultiv-las indefinidamente em laboratrio. Para isso, utilizaram clulas retiradas da massa celular interna de blastocistos (um dos estgios iniciais dos embries de mamferos) de camundongos. Essas clulas so conhecidas pela sigla ES, do ingls embryonic stem cells (clulas-tronco embrionrias), e so denominadas pluripotentes, pois podem proliferar inFigura 4. As clulas-tronco definidamente in vitro sem se diferenciar, mas tambm podem se diferenciar se forem modificadas as embrionrias so denominadas condies de cultivo (figura 4). De fato, preciso culpluripotentes, tivar as clulas ES sob condies muito especiais porque podem para que proliferem e continuem indiferenciadas, proliferar indefinidamente e encontrar essas condies foi o grande desafio vencido pelos cientistas. in vitro sem se diferenciar, Outra caracterstica especial dessas clulas que, o que s ocorre quando reintroduzidas em embries de camundonse forem go, do origem a clulas de todos os tecidos de um alteradas animal adulto, mesmo as germinativas (vulos e as condies espermatozides). Apenas uma clula ES, no entande cultivo

to, no capaz de gerar um embrio. Isso significa que tais clulas no so totipotentes, como o vulo fertilizado. A disponibilidade de clulas ES de camundongos tornou corriqueira a manipulao gentica desses animais. A possibilidade de introduzir ou eliminar genes nas clulas ES in vitro e depois reimplant-las em embries permitiu gerar camundongos transgnicos (uns expressam genes exgenos e outros chamados de knockouts no tm um ou mais genes presentes em animais normais) essenciais para muitas pesquisas (figura 5). As clulas-tronco modificadas podem originar at clulas germinativas nos animais transgnicos adultos, permitindo em muitos casos a sua reproduo. Esses animais tm ajudado a caracterizar muitas doenas humanas resultantes de alteraes genticas. O fato de as clulas ES reintroduzidas em embries de camundongo gerarem tipos celulares integrantes de todos os tecidos do animal adulto revela que elas tm potencial para se diferenciar tambm in vitro em qualquer desses tipos, de uma clula da pele a um neurnio. Na verdade, vrios laboratrios j conseguiram a diferenciao de clulas ES de camundongos, em cultura, em tipos to distintos quanto as clulas hematopoiticas (precursoras das clulas sangneas) e as do sistema nervoso (neurnios, astrcitos e oligodendrcitos), entre outras (figura 6). A capacidade de direcionar esse processo de diferenciao permitiria que, a partir de clulastronco embrionrias, fossem cultivadas controladamente os mais diferentes tipos celulares, abrindo a possibilidade de construir tecidos e rgos in vitro, na placa de cultura, tornando vivel a chamada bioengenharia. Esse sonho biotecnolgico tornou-se um pouco mais real em 1998, quando o bilogo James Thomson e sua equipe conseguiram, na Universidade de Wisconsin (Estados Unidos), imortalizar clulas ES de embries humanos. No mesmo ano, tambm foram imortalizadas clulas embrionrias germinativas humanas (EG, do ingls embryonic germ cells), derivadas das clulas reprodutivas primordiais de fetos, pelo embriologista John Gearhart, da Universidade Johns Hopkins (Estados Unidos) e equipe. Como as ES, as EG tambm so pluripotentes, ou seja, podem gerar qualquer clula do organismo adulto.

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A disponibilidade de clulas ES e EG humanas abriu horizontes impensveis para a medicina, mas tambm trouxe complexos problemas tico-religiosos. Se j podemos imaginar o cultivo de clulas ES humanas gerando neurnios em cultura, que substituiriam clulas nervosas danificadas em doenas como as Parkinson e de Alzheimer, no podemos esquecer que esse cultivo feito a partir de clulas retiradas de embries humanos, e para isso eles precisam ser sacrificados. Alm disso, com a disponibilidade de clulas ES humanas e com as experincias de transferncia nuclear, a clonagem de seres humanos tornou-se uma possibilidade cada vez mais real. Diante de questes to polmicas, preciso que a sociedade como um todo se manifeste, atravs de seus legisladores, e defina o que socialmente aceitvel no uso de clulas-tronco embrionrias humanas para fins mdicos. Inaceitvel impedir o progresso cientfico baseado na premissa de que o uso do conhecimento pode infringir conceitos religiosos ou morais. O Congresso dos Estados Unidos parece ter chegado a essa concluso ao autorizar recentemente o uso de clulas ES humanas nas pesquisas financiadas pelo National Institutes of Health (NIH). calizadas no interior dos ossos, mostraram que elas Figura 5. Introduzindo ou originam clulas progressivamente mais difereneliminando genes ciadas e com menor capacidade proliferativa. Esnas clulas ES in sas clulas-tronco podem gerar as linhagens previtro e em seguida cursoras mielide e linfide, que terminam por dar reimplantando-as origem a todos os nove tipos celulares presentes no em embries foi possvel gerar sangue, de hemcias a linfcitos. A renovao do camundongos sangue to intensa que diariamente entram em transgnicos (que circulao cerca de 8 mil novas clulas sangneas. expressam genes assombroso que o organismo consiga controlar exgenos) um processo proliferativo to exuberante, impee knockouts (que no tm ou no dindo, em circunstncias normais, que o nmero expressam de clulas produzidas exceda o necessrio e que as um ou mais genes) clulas liberadas na circulao estejam no estgio correto de diferenciao. relativamente recente a constatao de que, alm da pele, do intestino e da medula ssea, outros tecidos e rgos humanos fgado, pncreas, msculos esquelticos (associados ao sistema locomotor), tecido adiposo e sistema nervoso tm um estoque de clulas-tronco e uma capacidade limitada de regenerao aps leses. Figura 6. Mais recente ainda a idia de que essas Estudos clulas-tronco adultas so no apenas em laboratrios multipotentes (capazes de gerar os tipos de vrios pases celulares que compem o tecido ou rgo j conseguiram que as clulas-tronco especfico onde esto situadas), mas tamembrionrias se bm pluripotentes (podem gerar clulas de diferenciassem, outros rgos e tecidos). em cultura, O primeiro relato incontestvel dessa em diversos propriedade das clulas-tronco adultas foi 4 tipos celulares
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As clulas-tronco adultas
Sabe-se, desde os anos 60, que alguns tecidos de um organismo adulto se regeneram constantemente. Isso acontece com a pele, com as paredes intestinais e principalmente com o sangue, que tm suas clulas destrudas e renovadas o tempo inteiro, em um complexo e finamente regulado processo de proliferao e diferenciao celular. Os estudos feitos h dcadas sobre a hematopoiese (processo de produo de clulas sangneas) a partir de clulas-tronco multipotentes, lo-

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feito em 1998 por cientistas italianos, aps um estudo liderado pela biloga Giuliana Ferrari, no Instituto San Rafaelle-Telethon em que clulas derivadas da medula ssea regeneraram um msculo esqueltico. Embora esse tipo de msculo tambm tenha clulas-tronco (clulas-satlite), os pesquisadores usaram clulas da medula ssea, geneticamente marcadas para identificao posterior. Essas clulas, quando injetadas em msculos (lesados quimicamente) de camundongos geneticamente imunodeficientes, mostraram-se capazes de se diferenciar em clulas musculares, reduzindo a leso. Em outro experimento, em vez da injeo de clulas medulares diretamente na leso muscular, os camundongos imunodeficientes receberam um transplante de medula ssea. Feito o transplante, os pesquisadores verificaram que as clulas-tronco (geneticamente marcadas, e por isso identificveis como do animal doador) migraram da medula para a rea muscular lesada do animal. Isso demonstrou que, existindo uma leso muscular, clulas-tronco medulares adultas podem migrar at a regio lesada e se diferenciar em clulas musculares esquelticas. O trabalho, portanto, estabeleceu duas novas e importantes idias: clulas-tronco de medula ssea podem dar origem a clulas musculares esquelticas e podem migrar da medula para regies lesadas no msculo. Nesse trabalho, porm, as clulas-tronco de medula, de reconhecida plasticidade, deram origem a clulas no medulares mas de mesma origem embriolgica, j que tanto o tecido muscular quanto as clulas do sangue derivam do mesoderma (uma das trs camadas germinais que aparecem no incio da formao do embrio).

Figura 7. Clulas-tronco humanas cultivadas na Universidade de Wisconsin, nos Estados Unidos, foram observadas diferenciando-se aleatoriamente em clulas do intestino (A), do sistema nervoso (B), de medula ssea (C), de cartilagem (D), de msculos (E) e de rim (F)
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Um resultado ainda mais surpreendente foi relatado em janeiro de 1999 por cientistas liderados por dois neurobilogos, o canadense Christopher Bjornson e o italiano Angelo Vescovi. Em seu trabalho, publicado na revista Science, com o ttulo Transformando crebro em sangue: um destino hematopoitico adotado por uma clulatronco neural adulta in vivo, eles demonstraram que clulas-tronco neurais de camundongos adultos podem restaurar as clulas hematopoiticas em camundongos que tiveram a medula ssea destruda por irradiao. Esse achado revolucionou os conceitos at ento vigentes, pois demonstrou que uma clula troncoadulta derivada de um tecido altamente diferenciado e com limitada capacidade de proliferao pode seguir um programa de diferenciao totalmente diverso se colocada em um ambiente adequado. Tambm deixou claro que o potencial de diferenciao das clulas-tronco adultas no limitado por sua origem embriolgica: clulas neurais tm origem no ectoderma e clulas sangneas vm do mesoderma embrionrio. Ainda em 1999, em outros estudos, clulas-tronco adultas da medula ssea de camundongos transformaram-se em precursores hepticos e, pela primeira vez, clulas-tronco adultas de medula ssea humana foram induzidas a se diferenciar, in vitro, nas linhagens condroctica (cartilagem), osteoctica (osso) e adipognica (gordura). Em junho de 2000, um grupo do Instituto Karolinska (Sucia), liderado por Jonas Frisen, confirmou que clulas-tronco neurais de camundongos adultos tm capacidade generalizada de diferenciao, podendo gerar qualquer tipo celular, de msculo cardaco a estmago, intestino, fgado e rim, quando injetadas em embries de galinha e camundongo. Esse resultado quebrou todos os dogmas, indicando que uma clula-tronco adulta capaz de se diferenciar em qualquer tipo de clula, independentemente de seu tecido de origem, desde que cultivada sob condies adequadas (figura 7). Essa pluripotencialidade das clulas-tronco adultas coloca a questo do uso medicinal dessas clulas em bases totalmente novas. So eliminadas no s as questes tico-religiosas envolvidas no emprego das clulas-tronco embrionrias, mas tambm os problemas de rejeio imunolgica, j que clulas-tronco do prprio paciente adulto podem ser usadas para regenerar seus tecidos ou rgos lesados. Torna ainda possvel imaginar que um dia no haver mais filas para os transplantes de rgos, nem famlias aflitas em busca de doadores compatveis. Em breve, em vez de transplantes de rgos, os hospitais faro transplantes de clulas retiradas do prprio paciente. No h dvida de que a terapia com clulas-tronco ser a medicina do futuro.

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A luta contra as doenas cardacas

Reconhecendo o enorme potencial das clulas-tronco na prtica mdica, o Laboratrio de Cardiologia Celular e Molecular, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), iniciou no ano passado um projeto de pesquisa que objetiva transplantar clulas-tronco para coraes submetidos a infarto experimental. O infarto do miocrdio hoje uma das principais causas de mortalidade no mundo. Quando no mata de imediato, o infarto em geral provoca uma leso que resulta em insuficincia cardaca a capacidade de bombeamento do corao fica reduzida, impedindo o paciente de exercer atividades que requerem maior esforo. Quanto maior a rea de msculo cardaco lesada durante o infarto, maior o grau de insuficincia. Infelizmente, a insuficincia cardaca progressiva, de modo que o quadro clnico dos pacientes s piora: 22% dos homens e 46% das mulheres que sofrem infartos evoluem para insuficincia cardaca congestiva em um prazo de seis anos. Essa doena grave e sua incidncia vem crescendo, tanto que, nos Estados Unidos, a taxa de mortalidade por insuficincia cardaca aumentou 138% entre 1979 e 1998. bvia, portanto, a necessidade de uma terapia ainda inexistente que possa dar aos pacientes maior expectativa de vida aps o infarto. Curiosamente, embora haja clulas-tronco em vrios tecidos diferenciados, elas ainda no foram encontradas no corao adulto. No entanto, a j citada pluripotencialidade das clulas-tronco hematopoiticas e neurais permite imaginar que tais clulas, se cultivadas em ambiente adequado, poderiam originar clulas cardacas. Isso foi confirmado em fins de 1999, quando surgiu (no Journal of Clinical Investigation) o primeiro e at agora nico relato da diferenciao de clulas-tronco hematopoiticas em clulas do msculo cardaco em cultura, feito por Shinji Makino e colaboradores, na Universidade de Keio, no Japo. Vrios laboratrios, inclusive o da UFRJ, tentam desde ento, sem sucesso, reproduzir os resultados da equipe de Makino. O sistema hematopoitico, porm, no a nica fonte de clulas-tronco para os transplantes cardacos. Os msculos esquelticos contm clulas-tronco (as clulas-satlite), que podem se diferenciar facilmente em clulas desses msculos (e restaurar reas lesadas), embora no exista relato da transformao de clulas-satlite em clulas do msculo cardaco. No Laboratrio de Cardiologia Celular e Molecular, e em muitos outros no mundo, possvel isolar e cultivar essas clulas por longo tempo. No momento, na UFRJ, cultivamos as clulas-satlite de ratos sob diferentes condies, tentando induzi-las a se di-

ferenciar em clulas musculares cardacas (figura 8). Uma abordagem que parece mais promissora a cultura conjunta das clulas-satlite com clulas isoladas de coraes neonatais dos mesmos ratos. H pouco, foi iniciada outra abordagem, empregando o modelo de corao infartado desenvolvido pelo grupo da biloga Masako Oya Masuda, no Instituto de Biofsica da UFRJ, e o transplante direto para a regio infartada do corao de clulas-tronco de medula ssea (hematopoiticas) ou clulas-satlite, marcadas geneticamente para posterior identificao. No ambiente cardaco, possvel que as clulastronco de medula ou de msculo esqueltico recebam os sinais necessrios para sua transformao em micitos cardacos. Vrios laboratrios no mundo vm tentando essa abordagem. O primeiro relato de sucesso artigo publicado a 5 de abril na revista Nature descreve, pela primeira vez, a diferenciao de clulas-tronco medulares em msculos cardacos, em camundongos infartados (ver Clulas-tronco regeneram corao infartado, em CH n 171) bastante animador, e permite prever para breve o uso teraputico dessa tcnica. Testes clnicos j vm sendo feitos: recentemente, um grupo do Centro Cardiolgico do Norte, em Saint Denis (Frana), do qual participa um pesquisador brasileiro, o cardiologista Marcio Scorsin, relatou melhora significativa de um paciente com insuficincia cardaca em estgio avanado, aps o transplante de clulas-satlite do prprio paciente para o seu corao. O Laboratrio de Cardiologia Celular e Molecular, da UFRJ, desde que conte com os recursos necessrios para financiar esses projetos, certamente poder, em um futuro prximo, oferecer a pacientes brasileiros mais esse recurso da medicina moderna, que cada vez mais depende dos avanos da cincia biomdica. E outros laboratrios nacionais que trabalham com clulas-tronco tambm tm condies, se tiverem o apoio adequado, de garantir ao pas o domnio dessa tecnologia, de grande importncia para a sade dos brasileiros. n

Figura 8. Clulas-satlite retiradas de msculos da perna de ratos e injetadas na corrente sangnea de ratos submetidos a infarto migraram para o corao lesado e foram localizadas (setas) por microscopia de fluorescncia

Sugestes para leitura

GAGE, F. H. & CHRISTEN, Y. (Eds.). Isolation, characterization and utilization of stem cells, Springer Verlag, Berlim, 1997. POTTEN, C. S. (Ed.). Stem cells, Academic Press, Londres, 1997 VRIOS AUTORES. Stem cell research and ethics, Science (nmero especial), v. 287, n 5.457 (25 de fevereiro), 2000.

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