Facult pluridisciplinaire de Nador

Dpartement de BCG

METHODES CHROMATHOGRAPHYQUES

ABDELHAKIM BAILAL

I/ HISTORIQUE DE LA CHROMATOGRAPHIE
1903 - Sparation de pigments de la chlorophylle sous la forme danneaux colors sur une colonne remplie de carbonate de calcium (Tswett chimiste russe) 1930- o Edgar Lederer a purifi par la mthode de Tswett la lutine du jaune duf. 1938 - Chromatographie sur couche mince (Ismailov et Shraiber) 1940- Martin et Synge dveloppent la pratique et la thorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952 1952-mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). 1968 - Chromatographie en phase liquide haute performance HPLC (Giddings et Kirkland) Aujourdhui- la chromatographie, elle seule, reprsente plus de la moiti du chiffre daffaires de linstrumentation danalyse molculaire (Plus de 20 milliards d'Euros par an).

II/PRINCIPES DE LA CHROMATOGRAPHIE
1- Dfinitions A - Chromatographie : Ensemble de mthodes qui assurent la sparation des constituants dun mlange en utilisant deux phases non miscibles: les divers constituants sont entrans d'une manire diffrentielle
par une phase mobile (m) le long d'une phase stationnaire (s).

en fait, les soluts se partagent entre la s et la m ; B- phase stationnaire(s) Par dfinition immobile; choisie pour sa grande affinit pour les divers soluts; cependant, l affinit ne doit pas tre trop importante: les soluts doivent pouvoir tre dtachs.

La phase stationnaire la plus utilise en chromatographie est le gel de silice. Il est constitu de micro sphres de diamtre sensiblement constant pouvant varier de 2 5 mm. Le diamtre doit tre le mme pour toutes les particules si on veut viter la cration de chemins prfrentiels. Ces micro sphres sont obtenues par agglutination en prsence dun liant organique ure/formol de microparticules (appeles sol-gel) elles mmes obtenues par polymrisation puis hydrolyse contrle du ttrathoxysilane.

Remarque : Les gels de silice ne supportent pas des pH trop extrmes. Il y a des risques de dissolution pour des pH trop acides ou trop basiques. on se limite donc la gamme 2 < pH < 12. Des gels spciaux existent pour une utilisation pH extrmes. C- phase mobile(m) = luant si la m est liq a) Influence de la polarit de la m lexception de la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile, appele galement luant, est un solvant ou un mlange de plusieurs solvants miscibles. Le rle de la m est de dplacer les composs du mlange vers le haut de la plaque en CCM ou vers la sortie de la colonne en chromatographie sur colonne. - Dans la m : Plus un compos est soluble dans la la m , plus vite il se dplacera - Dans la s : Plus un compos est soluble dans la s liquide, moins vite il se dplacera. - La vitesse de dplacement des composs dun mlange dpend de la polarit de lluant , de celle des composs sparer et des adsorbants utiliss dans la s . b) Srie luotropique des solvants ther de ptrole Cyclohexane Ttrachloromthane Trichloromthane Tolune Benzne Dichloromthane ther dithylique

pouvoir luant croissant

Trichloromthane thanoate dthyle Pyridine Propanone Propan-1-ol thanol Mthanol Eau Acide thanoque c) Polarit des principaux groupements fonctionnels

d) Adsorbants utiliss en chromatographie Papier, cellulose Kieselguhr, terre de diatomes Amidon Sucres Talc Carbonate de sodium Oxyde de magnsium Gel de silice Alumine Charbon activ

Forces dinteractions croissantes avec les composs polaires

Ladsorption est un phnomne d'interface la diffrence de l'absorption

D- luat Solution recueillit la sortie de la colonne. E- lution Processus au cours duquel on spare les phases. F- Chromatogramme: Diagramme montrant lvolution du signal du dtecteur ( la concentration en solut) en fonction du temps dlution (plus rarement du volume dlution).

Lanalyse du chromatogramme permet une analyse : -qualitative : identification / position du pic -quantitative : aire des pics

Sparation des constituants dun mlange par chromatographie dlution sur colonne

2- principe
Chaque solut est soumis : une force de rtention (exerce par la phase stationnaire) une force de mobilit ( due la phase mobile). Les temps de rtention des composs sur la phase stationnaire doivent tre diffrents pour que la sparation se fasse. Les facteurs qui contrlent la sparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rtention de l'chantillon sur la colonne est donc contrle thermodynamiquement.

a) La sparation idale

b) La sparation relle En pratique la sparation idale n'est pas ralisable. Ainsi il se produit un largissement des bandes en raison surtout des phnomnes de diffusion. Les facteurs qui contrlent la diffusion

sont surtout de nature cintique et peuvent tre considrs indpendamment des facteurs thermodynamiques qui influencent la rtention.

Sparation chromatographique relle (non idale)

III/ DIFFRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

1-Classification suivant la nature des phases a) chromato en phase liq (CPL) m=liq m=liq et s=liq (CLL) m=liq et s= solide (CLS) m=liq et s= rsine changeuse dion (IEC) m=liq et s= GEL b) chromato en phase gazeuse m=GAZ m=gaz et s=liq (CGL) m=gaz et s= solide (CGS) c) chromatographie en phase supercritique (CPS) Dans laquelle la phase mobile est un gaz comprim ( sa temprature et sa pression critique) ou une phase liquide / vapeur de mme densit (au-del de la temprature critique, le gaz ne peut tre liqufi quelle que soit sa pression). Avec cette phase mobile, le plus souvent lanhydride carbonique, la dure de lanalyse est de 5 10 fois plus courte quavec les phases mobiles liquides. De viscosit trs faible, cette phase mobile permet un couplage facile avec des dtecteurs comme le spectromtre de masse ou le dtecteur par mesure de la diffusion de la lumire. 2-Classification selon le phnomne chromatographique : Elle dpend de la nature (et de la structure) de la s utilise. On distinguera donc : a) la chromatographie d'adsorption

(LSC, GSC) (lorsque la phase stationnaire est un solide);

La sparation entre les molcules est fonde sur le processus rpt d'adsorption et dsorption par la s.

La phase stationnaire est trs polaire (la phase mobile est alors gnralement peu polaire), les substances sont alors lus en sens inverse de leur polarit propre. Les composants peu polaires ont une plus grande affinit pour la phase mobile et sont donc lus rapidement. Inversement les soluts polaires ont une plus grande affinit pour la phase stationnaire et sont lus lentement. Principaux greffons utiliss en phase normale : Il sagit de greffons comportant des fonctions de nature polaire : - Amine NH2 - Nitrile : CN - Diols : CH2 CHOH CH2OH La s peut tre modifie pour tre apolaire : chromatographie dadsorption en phase inverse. La phase stationnaire est peu polaire ou apolaire (la phase mobile est alors gnralement polaire), les substances sont alors lus dans le sens de leur polarit propre. Les composants polaires ont une plus grande affinit pour la phase mobile et sont donc lus rapidement. Inversement les soluts peu polaires ont une plus grande affinit pour la phase stationnaire et sont lus lentement. Principaux greffons utiliss en phase inverse : Il sagit de greffons comportant des fonctions de nature apolaire : C2 : Dimthylsillyle : C8 : Octylsillyle C18 : Octadcylsillyle

Par extension on pourrait y rattacher la chromatographie d'affinit, qui correspond un cas o les proprits d'adsorption de la phase stationnaire sont spcifiques vis--vis d'un (ou une famille de) compos(s).

la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit pour un solut de lchantillon analyser (affinit enzymesubstrat,ligand-rcepteur, antigne-anticorps).

b) la chromatographie de partage

La sparation est fonde sur les diffrences de solubilit des molcules sparer entre m et s liquide (phase qui imprgne ou qui est greffe sur un solide). Il s'agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).

c) la chromatographie d'change d'ions (IEC)

La s est un solide la surface duquel se trouvent des groupements ioniss : changeur d'ions. Un solut ionis de charge oppose se trouvera d'autant plus retenu que sa charge (oppose celle de la s ) sera plus forte. Cest la loi de COULOMB qui rgit ces changes de forte nergie (40 80

kJ.mole-1) :

d) la chromatographie d'exclusion ou permation de gel, ou tamisage molculaire

(SEC) o la s (poreuse) se comporte comme un tamis et spare les composs en fonction de leur taille. les molcules sparer qui sont trop volumineuses pour pntrer dans les pores sont exclues de la phase stationnaire et sont lues les premires.

3-Classifications selon les procds utiliss : - Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera : a) la chromatographie sur colonne b) la chromatographie sur papier c)la chromatographie sur couche mince - Selon les modalits de migration de la phase mobile, on distinguera a) la chromatographie par dveloppement (les constituants de l'chantillon restent sur la s) b) la chromatographie d'lution (les substances sont entranes hors de la s

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