Trasporti attraverso la membrana Proteine di trasporto

Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico impermeabile alle proteine e alla maggior parte delle piccole molecole
Gas

Piccole molecole polari non cariche

Etanolo

Acqua Urea
Grosse molecole polari non cariche Ioni

Glucosio

Molecole polari cariche

Aminoacidi ATP Glc-6-P

Proteine di trasporto
2 principali classi di proteine di trasporto:
Proteine Carrier Proteine Canale

soluto

ione

bilayer lipidico

sito di legame del soluto

poro acquoso

Diffusione Facilitata

Caratteristiche dei trasporti mediati

I carriers sono dotati di specificit

Sono soggetti a saturazione

Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi Hanno unelevata dipendenza termica e dal pH

I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi

I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi Legano selettivamente il loro substrato, cio la molecola che deve essere trasportata Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dallaltro lato

Ritornano alla conformazione originale per legare unaltra molecola di substrato

Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente allaumentare della concentrazione

Ma la Ia legge di Fick non viene pi rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers
Fmax
Flusso netto [moli/(cm s] 20

15

300

F=kdDC

200
10 F 100 5 0 0

F m ax ka 1 C
30

I flussi mediati da carriers a differenza della diffusione libera - sono saturanti

10

DC 20

0 0 50 100 150

200 104

DC (mM)

Ci accade per due motivi: 1. Sulla membrana presente un numero finito di carriers; 2. Ciascun carrier opera ad una velocit finita

Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico

Per semplicit consideriamo una membrana con un solo carrier
Velocit del carrier: 50 p/s

Flusso (Particelle/Carrier/s)

N. partic. 1 10 50 100 1000

Flusso 1 10 50 50 50

50 40 30 20 10 0 0 800 N. particelle 1000

Quesito su cui meditare Distruggendo la met dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?

Come stato ottenuto il grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione?
20 Flusso netto [moli/(cm s]

C1

15

10

5 F1 0 0 C1 20

?
1.
40

Cellule in sospensione

DC (mM)

60

80

100

Si introduce nella provetta substrato S radioattivo ad una concentrazione C1 A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, ) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo allinterno delle cellule del campione Normalizzando la velocit v1 rispetto allarea della membrana si ottiene il primo valore del flusso F1 riferito alla concentrazione C1

2.

5 4 3 [S]in 2 1 0 0

pendenza della retta

D[ S ]in v1 Dt

3.

10

20

30 Tempo

40

50

20 F4 Flusso netto [moli/(cm s] F3 15 F2 10

Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C2, C3, C4 . crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente
C2
0 C2 C1 20 C3 40 60 DC (mM) 80 C4 100

5 F1
0

C3

C4

40

V4F4

30 V3F3 20 [S]in V2F2

10

0 0 10 20 Tempo 30 40 50

I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva

Fmax
Flusso netto [moli/(cm s] 20

15

+Ic +Ic

10

0 0 50 100 150

200 104

DC (mM)

Quindi, in presenza di inibitore competitivo il valore di Fmax non cambia.

In presenza di Ic varia ka
Calcolo della costante di affinit ka
20 Flusso netto [moli/(cm s] 20

F max

Flusso netto [moli/(cms]

15

15

10

10

F m ax 2
ka3 0 ka1 ka2 10

0 0 50 100 150 200

DC (mM)

DC (mM)

20

30

ka quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso la met di quello massimo ka inversamente proporzionale allaffinit del carrier per il substrato

Come funziona un inibitore competitivo?

[S] .01 .1 1 [Ic] 10 10 10 Prob .001 .010 .091

solo S

S << Ic
substrato Inibitore comp.

S >> Ic

10
100 1000 10000

10
10 10 10

.5
.909 .990 .999

20 20

Se si vuole costruire un grafico che 15 rappresenti Sun range di 10 S+Ic concentrazioni molto ampio (alcuni 5 ordini di grandezza) conviene usare una scala logaritmica 0
0 2000 4000 6000 [S] 8000 10000

15 Flusso

Flusso

10

5 S S+Ic 0 0.01 0.1 1 10 [S] 100 1000 10000

Quesito del giorno

Un ricercatore trova che la velocit con cui una sostanza trasportata allinterno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella. 1. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che larea di membrana su cui sono state fatte le misure 310-2 cm2; 2. Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica; 3. Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.
Conc. mM v (mmol/s) 0.1 3.0 1 10.0 5 16.7 10 18.2 20 19.0 30 19.4 50 19.6 100 19.8 200 19.9

Risposta al quesito

700 600 500

2

700 600 500 mmoli/s/cm

2

mmoli/s/cm

400 300 200 100 0 0 50 100 Concentr. 150 200

400 300 200 100 0 0.01 0.1 1 Concentr. 10 100

Esempio di Diffusione facilitata Il Trasportatore del Glucosio Glucosio Permeasi

extracell.

intracell.

poro: formato da 5 a-eliche transmembrana anfipatiche

Diffusione Facilitata
soluto

stato A
esterno

stato B

bilayer lipidico

gradiente di concentrazione

interno proteina carrier sito di legame del soluto

es. Trasportatore del glucosio negli epatociti

La driving force per il tranporto in qualsivoglia direzione determinata dal gradiente di concentrazione attraverso la membrana

Attivita' di Ricerca
Responsabili Prof. M. Toselli e Dr. Gerardo Biella Il LABORATORIO DI FISIOLOGIA E BIOFISICA DEI CANALI IONICI del Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia Cellulari e Molecolari dell'Universita' di Pavia, diretto dal Prof. Mauro Toselli svolge attivita di ricerca sui seguenti argomenti: l Canali ionici voltaggio-dipendenti: proprieta' biofisiche e loro correlazione ad aspetti funzionali dell'eccitabilita' elettrica nei neuroni durante lo sviluppo. l Modulazione dei canali del calcio e Regolazione del traffico intracellulare: meccanismi molecolari e biofisici dei processi di regolazione dell'attivita' dei canali del calcio voltaggio-dipendenti da parte di protein chinasi e proteine G, e conseguenze nel controllo della trasmissione, ricezione e immagazinaggio dell'informazione nei neuroni. l Neurofisiologia cellulare: Identificazione e caratterizzazione funzionale dei circuiti sinaptici delle cortecce paraippocampali. In particolare: ruolo che l'attivit ritmica sincronizzata dei neuroni del sistema limbico esercita sui processi di apprendimento e memorizzazione. l Cellule staminali neuronali: caratterizzazione elettrofisiologica di cellule staminali neuronali in coltura.

Le tecniche correntemente impiegate comprendono misurazioni elettrofisiologiche di patch-clamp sui seguenti preparati: a) linee cellulari stabili di origine neuronale, wild-type o opportunamente ingenierizzate per l'espressione di specifiche proteine ricombinanti normali o mutagenizzate; b) colture primarie di neuroni; c) sezioni sottili di tessuto; d) cellule staminali in coltura.

Numero di posti disponibili: tre posti disponibili dallinizio del secondo semestre a dicembre 2005; Requisiti per l'accettazione: verra data la priorita agli studenti che abbiano superato gli esami di Fisica e Chimica Generale.

Alcune considerazioni di bioenergetica

Lenergia la capacit di compiere un lavoro
Un sistema allequilibrio non pu compiere un lavoro. Esso al minimo della collina energetica Energia del Sistema

Equilibrio

La parte di Energia che il sistema pu utilizzare per compiere un lavoro definita energia libera del sistema

Le reazioni non allequilibrio spontaneamente procederanno nella direzione che porta allequilibrio
Tali reazioni sono dette esoergoniche

Una reazione pu essere forzata a procedere in senso non spontaneo. In questo caso la reazione assorbe energia: cio occorre compiere un lavoro sul sistema Una reazione di questo tipo detta endoergonica

Le reazioni chimiche accoppiate

Un processo endoergonico pu avvenire se esso viene opportunamente accoppiato ad un processo esoergonico

Consideriamo la seguente reazione endoergonica:

A + B A-B DG>0 Affinch essa possa avvenire deve attingere energia da una reazione esoergonica: X-P X + P + Energia DG<0

La sequenza di reazioni accoppiate sar la seguente: A + X-P A-P + X A-P + B A-B + P

I contenitori di energia nelle cellule

Legami ad alta energia: ATP GTP Gradienti transmembranari:
Gradienti ionici a cavallo del plasmalemma Contenitori intracellulari di Ca2+

Trasporti passivi e attivi a confronto

molecola trasportata proteina carrier
bilayer lipidico gradiente di concentraz.

diffusione semplice

mediata da canale

mediata da carrier trasporto attivo

trasporto passivo

Trasporti passivi e attivi a confronto

Il gradiente di concentrazione attraverso la membrana determina la direzione e la velocit della diffusione passiva. Nella diffusione passiva le molecole si muovono dalla zona ad alta concentrazione a quella a bassa concentrazione (trasporto in discesa)

Diffusione semplice: le molecole diffondono attraverso il bilayer lipidico

Diffusione facilitata: diffusione attraverso la membrana mediata da proteine di trasporto (non richiesta energia) Muovere un soluto in salita (contro il gradiente di concentrazione) richiede un ingresso di energia Trasporto Attivo

Trasporti Attivi
Il trasporto di un soluto contro un gradiente elettrochimico richiede lutilizzo di energia Due strategie sono adottate dalle cellule animali:
Pompe ATP-dipendenti Trasporti accoppiati
Gradiente elettrochimico

Trasporto in salita accoppiato direttamente allidrolisi dellATP

Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di unaltra

Na+/K+ ATPasi

Na+/K+ ATPasi
sito di legame per K+ e ouabaina gradiente di Na+ gradiente di K+

cytosol
sito di legame del Na+

Na+/K+ ATPasi
La pompa idrolizza lATP ad ADP per trasportare simultaneamente 3 Na+ dalla cellula e 2 K+ dentro la cellula ad ogni ciclo della pompa La Na+-K+ ATPasi responsabile di >30% del consumo totale di ATP Mantiene un gradiente del Na+ (ext>int) e del K+ (int>ext)

Contribuisce a creare un potenziale di membrana negativo allinterno

bloccata dalla ouabaina

Ione
Na+ K+

Intracellulare
5-15 mM 140 mM

Extracellulare
145 mM 5 mM

Ciclo della pompa Na+/K+ ATPasi

fosforilazione ATP-dipendente

la proteina subisce un cambiamento conformazionale, il Na rilasciato allesterno

ext
int

il Na si lega al sito citosolico

il K si lega al sito extracellulare

la proteina ritorna alla conformazione originale, il K rilasciato allinterno

defosforilazione

1 ciclo 10 millisecondi

Alcune importanti caratteristiche della pompa

Velocit di attivit dipendente dalla concentrazione intracellulare di Na+

Bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e bassa [ATP]i Stechiometria - 3 Na+ fuori, 2 K+ dentro, 1 ATP usato

Elettrogenica, pu generare direttamente da -2 a -20 mV

Tiene la pressione osmotica sotto controllo, prevenendo il rigonfiamento cellulare

Gradiente elettrochimico
A cavallo della membrana della maggior parte delle cellule c una differenza di potenziale elettrico il potenziale di

membrana

Il potenziale di membrana influenza il movimento transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni)

Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica di solito ha un potenziale pi negativo rispetto allesterno

La forza elettrostatica spinge i cationi nella cellula e guida gli anioni fuori
Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva di soluti carichi attraverso una membrana, due forze devono essere considerate: (a) il gradiente di concentrazione transmembrana (b) la differenza di potenziale transmembrana

La driving force netta = Gradiente Elettrochimico

Gradiente Elettrochimico

fuori

dentro

potenziale di membrana=0

potenziale di membrana negativo dentro trasporto dei cationi aumentato

potenziale di membrana positivo dentro trasporto dei cationi ridotto

Quesito del giorno

In base a quanto detto a lezione, stabilire se la pompa Na+/K+, che elettrogenica dal momento che trasporta un numero netto di cariche elettriche, aumenter o diminuir la sua velocit dazione qualora la membrana venga depolarizzata. Ricordarsi che una depolarizzazione comporta un aumento delle cariche positive allinterno della cellula rispetto alla situazione di riposo (potenziale di riposo).

Alcune definizioni
molecola trasportata ione co-transportato

ione controtransportato Uniporto

Simporto Antiporto Trasporti accoppiati

Altri esempi di trasporti attivi primari

Trasporti accoppiati
Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na+) viene usato per guidare in salita il trasporto di una seconda molecola - trasporto attivo secondario

Gradiente elettrochimico

Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di unaltra

Trasporti accoppiati al gradiente di Na

Nelle cellule animali molti processi di trasporto di membrana sono accoppiati al gradiente del Na. Es. Trasporto del glucosio in cellule dellepitelio intestinale Na+ stato stato A B glucosio

gradiente di Na

ext
gradiente di glucosio

carrier

int

Stechiometria: 2 Na+ 1 Glc Bloccante: florizina

Altri esempi di trasporti attivi secondari

Trasporto del glucosio dal lume intestinale al sangue

Sangue
GLU permeasi Glucosio nel sangue Canale del K+

Cellule dellepitelio intestinale

Glucosio assunto

Co-trasportatore Na/GLU

Lume intest.

Quesito del giorno

Una cellula si trova immersa in una soluzione extracellulare contenente glucosio 10 mM. Trascorso un certo tempo la concentrazione di glucosio nel citoplasma sale a 50 mM. Secondo voi, perche cio prova che la membrana plasmatica di quella cellula dispone di un trasportatore attivo del glucosio? Come fareste a dimostrare sperimentalmente che tale trasportatore e Na+-dipendente (trasporto attivo secondario)?

Mantenimento dei livelli di Ca2+ intracellulare

Il Ca2+ coinvolto in molti processi cellulari Il mantenimento di bassi livelli di Ca2+ intracellulare critico for il normale funczionamento cellulare La [Ca2+] extracellulare >>>> della [Ca2+] intracellulare

Le pompe del Ca2+ ATP-dipendenti della membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico pompano attivamente Ca2+ fuori dal citoplasma
Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che pompa attivamente Ca2+ fuori dalla cellula

Quali meccanismi mantengono lampio gradiente di calcio?

3Na
+
ESTERNO INTERNO

ATP ADP

Ca++

Ca++
Scambiatore Sodio:Calcio

Pompa del Calcio

I gradienti di calcio esistono sia allinterno della cellula che a cavallo della membrana plasmatica

Contrazione

Ca2+
Secrezione Esocitosi Ca2+ Espressione di geni Secondo messaggero Ca2+ Ca2+ Ca2+

Ca2+

Na+

Concentrazioni ioniche intracellulari ed extracellulari

Ione Intracellulare Extracellulare

Na+ K+ Mg2+ Ca2+ H+

ClAnioni fissi

5-15 mM 140 mM 0.5 mM 10-7 mM 10-7.2 M (pH 7.2)

5-15 mM high

145 mM 5 mM 1-2 mM 1-2 mM 10-7.4 M (pH 7.4)

110 mM 0 mM

La [intracellulare] molto diversa dalla [extracellulare] I cationi sono bilanciati dagli anioni

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Bioenergetics.doc