REKAYASA GENETIKA RESUME Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika II Dibimbing oleh Prof. Dr.

Duran Corebima A., M.Pd

oleh Kelompok 16 Rico Kharist Zein Putri Dhamira (100341404616) (100341404624)

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MALANG November 2012

REKAYASA GENETIKA Berikut ini dikemukakan arti rekayasa genetika (genetic enginecring) yang dikutip dari tiga sumber Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan cara mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu (Miclos, dkk, 1990). Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk

menghasilkan suatu sifat yang dikehendaki yang biasanya disebut teknologi rekombinan DNA (Rasmussen, dkk, 1990).

Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau individu dengan cara pemindahan selektif, insersi atau dengan modifikasi gen balik yang individual maupun yang berupa perangkat gen (Klug, dkk, 1994). Berdasarkan kutipan tersebut,pada rekayasa genetika terdapat manipulasi

atas materi genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Berbagai fenomena genetik alami jika dicermati dapat menjadi model alami dari teknik rekayasa genetika contohnya crossing over, gene pick up, transduksi, dll. Fenomena ini terjadi pemutusan, penyambungan, serta perpindahan bagian materi genetik yang dapat mengakibatkan penambahan atau perpindahan suatu gen atau beberapa gen. PROSES REKAYASA GENETIKA Menurut Smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam teknik rekayasa genetika meliputi teknik vektor, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektoporasi. Selain itu klug menambahkan juga teknik kopresipitassi kalsium pospat dan endositosis dan dikenal pula teknik proyektil mikro. Transfer Vektor

Transfer vektor merupakan cara memasukan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan pembawa (carrier) khusus yang memanfaatkan proses alami seperti pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektoryang digunakan adalah plasmid, bakteriofage dan cosmid (russel, 1992). Secara kimiawi vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA. Sebagai vektor suatu molekul DNA harus memiliki sifat-sifat yang harus dimiliki DNA seperti di bawah ini (Klug, dkk.,1994) Molekul DNA mampu melekukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membuahi suatu ori Molekul DNA harus mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim retrisi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmensegmen DNA. Molekul DNA harus membuhai suatu penenda yang dapat dimanfaatkan. Molekul DNA harus mudah terbebas kembali ari sel inang.

Selain sifat-sifat itu ada pula sifat lain yang diharapkan (Old dan Primrose, 1989) Betar molekul rendah Adanya kemampuan untukmemberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel inang. a. Plasmid Plasmid terbentuk secara alami invitro. Plasmid terdapat pada E. coli (plasmid RSF 2124 merupakan derifat dari plasmid ColE1). Plasmid-plasmid itu terdapat pada E.coli (plasmid RSF2124 merupakan derivat dari plasmid CoE1).

b. Bakteriofag Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.coli adalah fag . Seluruh gen fag sudah diidentifikasi dan dipetakan urut-urutan genom secara keseluruhan sudah diketahui. Seluruh derivat fag yang digunakan sebagai vektor transfer sudah direkayasa sehingga hanya siklus titik saja. Derivat-derivat fag lebih dari 100 derivat yang dimanfaatkan sebagai vektor dibuat dengan cara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah tengah.

Selain bakteriofag yang digunakan sebagai vektor, salah satunya adalah M 13. Materi genetik pada M 13 berupa DNA unit tunggal. Jika M 13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model DNA unting ganda yang disebut RF (Replikasi Form). Molekul RF setara dengan plasmid dan DNA asing dapat diinsersikan ke tapak-tapak pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom. Susunan dari molekul RF terdiri dari suatu unting tunggal (+) yang mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan. Klon DNA unting tunggal yang di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi.
c.

Kosmid (cosmid)

Kosmid adalah vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan uruturutan cos dan fag yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid)

untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag , contoh plasmid yang digunakan Pbr322.

d. Vektor ulang-alik (Shuttle vectors)

Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakterio fag , dan kosmid yang digunakan untuk pengklonan DNA, vektor lain yang dimanfaatkkan untuk memanfaatkan untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel prokariotik maupun eukariotik. Vektor-vektor semacam itu disebut vektor ulang alik atau shuttlr vectors. Vektor ulang alik atau shuttlr vectors adalah vektor pengklon yang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih mahkluk hidaup inang. 3. Injeksi mikro, fusi protoplas, elektroporasi, kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis, serta proyeksi mikro Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat di gabung menjadi satu, misalnya fusi antara sel sel-sel yang di kultur dengan protoplas bakteri yang mengandung DNA eksogen. Fusi protoplas, suatu sistem transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang disebut sebagai lipofeksi (lipofection).

Pada teknik eletroporasi menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan dengan elektroporasi informasi dari Old dan Primrose (1989) menyebutkan bahwa pada pendedahan singkat kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000 V, sel-sel memperoleh DNA eksogen dan larutan sekitar (tampaknya melalui lubang-lubang yang terbentuk sesaat pada membran plasma) dengan kejutan listrik akan meningkatkan frekuensi efisien transformasi (Potter dkk., 1984 dalam Old dan Primrose, 1989). Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butirbutir kopresipitas kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis (Old dan Primrose, 1989). Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia. Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel (Klein dkk., 1987 dalam Old dan Primrose 1989), teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien. Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantai vektor akan dikemukakan lebih lanjut (Klug dkk., 1994). Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik Segmen-segmen digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor. Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul DNA yang baru terbentuk. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin yang disebut klon-klon.

Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel identik yang semua membawahi urut-urutan yang dklon.

Secara

potensial,

DNA

diklon

dapat

ditranskripsikan,

RNA-d

ditranslasikan serta produk-produk gen diisolasi dan di kaji. Peran Enzim Endonuklease Retriksi Pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur dasar teknik DNA rekombinan yang diperantai oleh vektor enzim endonuklease dibutuhkan untuk memotong molekul DNA dalam rangka pembuatan fragmen DNA. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa abntuan enzim endunuklease restiksi. Penanaman endunuklease restiksi di beri nama berdasarkan macam makhluk hidup tempat enzim tersebut diisolasi secara konvensional digunakan sistem tiga huruf dalam posisi huruf miring yang diikuti dengan suatu angka romawi. Enzim endonuklease retriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992). Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan (Russel,1992). Enzim endonuklease restriksi bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Untuk pengenalan ezim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam urutan basa 5 pada komplementernya. Enzim endonuklease restriksi sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan nukleotida yang spesifik untuk enzim yang 3 pada unting DNA sama dengan urutan basa 5 3

bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan ditemukan pada DNA. Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmen-fragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna. Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu DNA oleh enzim endonuklease restriksi II dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan pengenal, sepanjang keberadaan tiap pasangan nukleotida bersifak acak. Peluang jumlah tersebut ditunjukkan pada tabel berikut. Pasangan nukleotida pada tapak restriksi 4 5 6 8 11 (1/4)4 = 1 dalam 256 bp (1/4)5 = 1 dalam 1024 bp (1/4)6 = 1 dalam 4096 bp (1/4)8 = 1 dalam 65, 476 bp (1/4)11 Probabilitas kejadian

Seleksi Klon Rekombinan Pada urutan dari fragmen DNA restriksi yang ditranskripsikan menjadi RNA atau membuat peta urut-urutan hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen restriksi. Oleh karena itu, Southern mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel agarose yang komplementer denga urutan RNA atau DNA tertentu, metode ini dikenal dengan Southern Blotting. Pada inti metode ini mentransfer makro molekul dari gel yang berarti telah di pisahkan secara elektroforesis ke suatu permukaan membran. MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIKA

Manfaat rekayasa genetika dapat dilihat kaitannya dengan analisis genetik, diagnosis atas penyakit manusia, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi (Klug dkk, 1994). Analisis Genetika Para ahli genetika menggunakan teknik-teknik DNA rekombinan untuk analisis genetik (Klug dkk, 1994). Teknik-teknik ini memungkinkan pengadaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan klon, demikian pula memungkinkan pemetaan genetika maupun fisik yang lengkap, serta memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan kromosom. Peta fisisk yang dihasilkan memperlihatkan seluruh gen pada genom yang di tandai oleh urutan nukleotida, tanpa pula memperhatikan mutan bahkan sering tanpa dukungan pengetahuan awal tentang fungsi atau fenotip dari gen-gen yang dipetakan. Diagnosis molekuler atas penyakit manusia Pemanfaatan urutan DNA yang diklon memungkinkan pengamatan langsungterhadap genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen yang belum di kenal atau yang tidak terekspresi. Contoh deteksi molekuler dapat dilakukan atas Thelessemia dan Sickle cell anemia. Terapi gen Kemampuan mengisolasi dan mengklon gen-gen spesifik manusia yang pada mulanya dikembangkan sebagai suatu penelitian. Proses terapi semacam ini di sebut terapi gen. Metode ini dikembangkan untuk memasukkan gen ke dalam sel manusia, termasuk pemanfaatan vektor virus maupun fusi sel dengan vesikula buatan yang mengandung urutan DNA yang diklon, transfer kimiawi yang mendorong pengangkutan gen melewati membran sel jika sudah dilakukan.

Panduan terapi gen sudah disusun dan mencakup beberapa persyaratan (Klug dkk., 1994) yang akan dikemukan lebih lanjut. Gen harus diisolasi dan ditransfer. Cara transfer gen yang efektif harus ada. Jaringan target harus dapat dicapai, sebagai contoh percobaan terapi gen yang pertama menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekursornya sebagai jaringan target. Terapingen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang efektif.

Pertanyaan
1. Bagaimana

proses

injeksi

mikro,

fusi

protoplas,

elektroporasi,

kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis, serta proyeksi mikro? Jawab: Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Fusi protoplas, suatu sistem transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang disebut sebagai lipofeksi (lipofection). Pada teknik elektroporasi menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir kopresipitas kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis. Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia. Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel, teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien. 2. Apakah yang membedakan antara enzim endonuklease retriksi? Jawab: Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan. Enzim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan. Dalam urutan basa 5 DNA sama dengan urutan basa 5 3 pada unting 3 pada komplementernya.

3. Apa yang dimaksud dengan kosmid, jelaskan ! Jawab: Kosmid merupakan vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-urutan cos dan fag yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag