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Definizione di gene Inducibile : gene la cui espressione è indotta dalla presenza del substrato della via catabolica per la quale codificano . Ad esempio

via Catabolica

A

B

Glucosio

Se A non c’è , manca il substrato della via catabolica e il gene non esprime nulla .

L’Operone Lac di E. coli ( INDUCIBILE )

Il lattosio è un disaccaride che iene idrolizzato dalla beta- galattosidasi

galattosio. L’operone del lattosio è formato da

nei due monomeri glucosio e

  • - 3 geni strutturali ( codificanti per i tre enzimi necessari alla degradazione del lattosio )

  • - Gene regolatore

Il gene regolatore codifica per 1 proteina-repressore che è allosterica, ossia esiste in due conformazioni caratterizzate da competenze biologiche diverse: una lega l’operatore ( conformazione più stabile ), l’altra lega una molecola induttore ( e non l’operatore )

Si produce proteina dal gene regolatore Assenza di lattosio Questa proteina normalmente è maggiormente presente nella conformazione più stabile (che lega l’operatore) La proteina-repressore lega l’operatore Si forma il complesso Operatore-Repressore Non parte la trascrizione

Si produce proteina-repressore dal gene regolatore Presenza di lattosio Il lattosio lega/sequestra la proteina-repressore Si sposta l’equilibrio verso la conformazione meno stabileDiventa presente in maggior quantità Non c’è quasi più la conformazione che lega l’operatore reprimendolo Si dereprime l’operatore lac Parte la trascrizione dei geni.

Quando le cellule vengono fatte crescere in presenza di lattosio (e in assenza di glucosio) sintetizzano rapidamente tutti gli enzimi necessari per la utilizzazione del lattosio. I geni coinvolti sono attivati dalla presenza del lattosio che agisce da induttore.

Gli enzimi necessari per la degradazione del lattosio sono:

1) la β-galattosidasi

2) la lattosio permeasi e 3) la trans-acetilasi.

Il prodotto della trascrizione della regione codificante dell’operone lac è un unico messaggero policistronico. L’operone lac in E.coli comprende tre geni: lacZ, lacY e lacA che vengono espressi da un RNA policistronico la cui sintesi è regolata da un unico promotore.

LacZ codifica per la beta- galattosidasi (enzima che scinde il lattosio in glucosio e galattosio) lacY per la lattosio permeasi (facilita l’ingresso del lattosio nella cellula) lacA codifica per la tiogalattoside transacetilasi (libera la cellula dai tiogalattosidi tossici che vengono importati dal prodotto di lacY).

1

La trascrizione di questi geni è regolata da due proteine:

1)

l’attivatore CAP (Catabolite Activator Protein)

2)

il repressore Lac , che si legano ai rispettivi siti di legame sul DNA.

Ci sono diversi punti di controllo per l'espressione genica : al livello della trascrizione, della maturazione del trascritto, della localizzazione ecc. Il primo livello di controllo è quello a livello trascrizionale dellmRNA perché le cellule procariotiche sono organismi unicellulari che vivono singolarmente nell'ambiente esterno senza alcuna difesa o barriera dall'ambiente circostante, quindi necessitano di avere una risposta più rapida possibile a uno stimolo esterno sintetizzando un determinato gene che codifica quella funzione, anche perché l'organizzazione genica dei procarioti è tale che non c'è separazione fisica ne temporale tra trascrizione e traduzione.

Al contrario le cellule eucariotiche che vivono in un organismo vivono in ambienti dove il pH, la Temperatura ecc sono pressoché costanti e subiscono meno "attacchi" dall'ambiente esterno quindi non hanno la necessità di sviluppare risposte immediate infatti la traduzione e la trascrizione non avvengono contemporaneamente.

Le cellule procariotiche per rispondere più velocemente agli stimoli esterni hanno una struttura del genoma che fa si che geni che codificano per proteine (prodotti) aventi funzioni correlate siano raggruppati e trascritti insieme su unico mRNA ( detto mRNA policistronico) durante la trascrizione. Addirittura su un unico mRNA può esserci l’informazione per proteine che permettono di far avvenire un'intera via metabolica.

Questo non accade per gli eucarioti perché i segnali di inizio della traduzione sono diversi, in quanto un mRNA di procarioti può essere tradotto anche a partire da un punto interno, mentre negli eucarioti la traduzione parte soltanto dal primo giro con il cappuccio che viene riconosciuto da ribosoma. Quest'ultimo scorre lungo il mRNA fino a trovare il codone d'inizio, quindi anche se c'è un secondo codone d'inizio non viene tradotto perchè non c'è il cappuccio. Nelle cellule eucariotiche si formano mRNA monocistronici cioè mRNA che portano l'informazione di un unico gene.

La regolazione della trascrizione prevede l'interferenza positiva o negativa con la formazione del complesso d'inizio. L'inibizione può avvenire con due meccanismi diversi che permettono di rendere inaccessibile i determinanti molecolare del promotore ( box -10 e -35) alla RNA polimerasi, cioè per

1) occupazione del sito da parte di un'altra proteina che riconosce un altro segnale molecolare presente sul DNA ci si lega e lo occupa

2) formazione di strutture complesse del DNA che rendono inaccessibile i siti -10 e -35 alla RNA polimerasi per ingombro sterico

L'interferenza positiva che comporta l'attivazione e l'aumento dell'efficienza del promotore avviene in genere tramite delle proteine che fanno aumentare l'affinità (stabilità) di legame tra RNA polimerasi e il promotore. Tale meccanismo avviene grazie all'interazione di questa proteina con un segnale presenti in prossimità del promotore a cui si lega in modo da esporre il segnale che promuove il legame con la RNA polimerasi.

2

Per vedere se un promotore è forte o debole devo tener conto del tempo che impiega il complesso della RNA polimerasi per legarsi e staccarsi dal promotore determinando il numero di trascritti in un certo intervallo di tempo. Quindi vedo l'efficienza , cioè la costante di stabilità che mi da la misura della frequenza di trascritti nel tempo. Un promotore forte è un promotore che determina un numero più elevato di trascrizioni rispetto a quello debole.

Le proteine come fanno a legarsi al DNA su sequenze aspecifiche?

Le basi azotate, oltre ad impegnare la maggior parte dei loro residui, sono capaci di formare delle interazioni tra cui i legami idrogeno ( fungendo da donatori o accettori di elettroni)

Verso l'interno dell'asse dell'elica (struttura aperta cioè non è molto compatta), espongono anche verso l'esterno, soprattutto nel solco maggiore, un pannello caratteristico di gruppi donatori e accettori di legami idrogeno.

Quindi le proteine che si legano al DNA devono essere di natura basica per interagire con esso e complementari alla sequenza tridimensionale aspecifica del DNA. Se queste interazioni non sono stabilizzate da legami forti abbiamo una costante di stabilità bassa quindi la proteina si lega e si stacca velocemente dal DNA (interazione debole).

La velocità di formazione di un complesso dipende appunto dal tipo di interazione che si crea tra proteine e DNA, quindi dalla costante di affinità. Più la proteina possiede residui complementari alla sequenza aspecifica del DNA più è stabile l'interazione.

Un gene costitutivo è un gene la cui espressione non dipende dalle condizioni ambientali, quindi vengono espressi sempre perché codificano per proteine basilari per la sopravvivenza della cellula.

  • I geni che vengono controllati da interferenze positive o negativi (geni regolati) sono di due tipi:

- geni del catabolismo (non basale x la cellula) -geni dell'anabolismo

In genere l'espressione dei geni regolati è repressa e si attiva quando è presente nell'ambiente la molecola che funge da substrato alla via catabolica inibita, che fa attivare quella via.

Quindi i geni regolatori sono quei geni la cui espressione dipende dall'ambiente e vengono regolati da particolari proteine che ne attivano o ne reprimono l'espressione genica.

  • I geni del catabolismo possono essere inibiti dall'eccesso di produzione della proteina finale del processo catabolico.

La cellula promuove questa regolazione per non spendere energia nella produzione di proteina quando non c'è bisogno lo svolgimento di una funzione o di quel metabolismo.

Operone : è un insieme di geni strutturali che codificano per prodotti metabolici strettamente correlati che vengono trascritti su uno stesso mRNA sotto il controllo degli stessi elementi di regolazione.

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Operone del lattosio

è un operone costituito da:

1)

3 geni strutturali che codificano per tre prodotti :

beta galattosidasi (è un enzima presente nella cellula che scinde il lattosio in glucosio e galattosio) transacetilasi permeasi ( è una proteina trasportatrice che permette l'internalizzazione del lattosio)

Questi tre geni sono controllati da uno stesso promotore e trascritti su un unico mRNA.

Sull’ mRNA policistronico ci sono tre sequenze d'inizio e tre di fine che regolano la traduzione dei tre tipi di proteine.

2)

promotore

3)

segnali di regolazione (operatori): sequenze di DNA responsabili di legami con proteine specifiche.

4)

gene regolatore è un gene che ha un suo promotore e porta alla codifica una proteina detta regolatore che ha due proprietà:

- è una proteina allosterica cioè è presente in due conformazioni differenti che hanno competenze biologiche diverse, in questo caso sono in grado di legare l'una l'induttore l'altra l'operatore. l'induttore è la molecola di lattosio.

- le due forme si trovano in equilibrio tra la forma più stabile(R1) e meno stabile (R2). Quella più stabile è la conformazione che lega l'operatore.

Il gene regolatore può stare vicino all' operatore oppure lontano. Regolazione dell’ operone lac

In assenza di lattosio: prevale nell'equilibrio la conformazione più stabile (repressone) esso si lega all'operatore è blocca l'espressione dei geni strutturali.

Quando c'è il lattosio lega R1 (conformazione meno stabile) così facendo sposta l'equilibrio facendo aumentare la concentrazione di R1 e diminuendo la concentrazione di R2 che si stacca dall'operatore e si attiva la trascrizione.

Un biosensore è un sistema che è capace, usando sistemi biologici, di regolare la concentrazione di un composto.

Anche in questo esempio di operone abbiamo un biosensore che è in grado di spostare l'equilibrio tra R1 e R2 in base a una concentrazione minima di I.

La concentrazione totale di R (repressore) è determinato dalla forza dell'espressione del promotore del gene R. Piccole aumenti di I provoca lo spostamento dell'equilibrio tra la conformazione R1 e R2. se abbiamo che la concentrazione di I>R questo fa spostare l'equilibrio tra R1 e R2 promuovendo la conformazione R1 che attiva la trascrizione.

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Se R>>I , I non riesce a promuovere l'attivazione dell'operone perché c'è sempre una quantità di R2 che riesce a legarsi all'operatore. Quindi per far si che l'operone sia regolato il promotore del gene R deve essere per forza un gene costitutivo debole cioè deve produrre una quantità di R sufficiente da far in modo che l'aumento o la diminuzione di I faccia spostare l'equilibrio tra le due forme del repressore.

La struttura di questo promotore è di tipo debole quindi anche depresso da livelli di trascrizioni bassi, questo perchè in presenza di glucosio e lattosio la cellula preferisce usare prima il glucosio perché ha un risparmio energetico quindi non ha bisogno di un elevata espressione dell'operone del lattosio.

Quando non c'è glucosio la cellula necessita di una elevata espressione di questo operone x fare ciò la cellula ha bisogno di un sistema di regolazione. tale sistema è regolato da una proteina che lega cAMP che è una proteina allosterica di cui una conformazione lega un operatore detto sito di legame della proteina che lega cAMp e l'altro nn lo lega.

L'equilibrio tra queste due conformazioni viene spostato dalla cAMP , la conformazione che lega cAMP e l'operatore è meno stabile rispetto a quella che non la lega. Quindi la presenza di cAMP sposta l'equilibrio e permette il legame della proteina al DNA che promuove l'attivazione della trascrizione.

La concentrazione di cAMP è controllata da due enzimi:

-fosfodiesterasi è un enzima che trasforma cAMP in AMP tramite un idrolisi;

-

La regolazione effettuata dalla proteina che lega cAMP è detta repressione da catabolita perché uno dei cataboliti della via glicolitica aumenta e va a inibire l'adenilato ciclasi quindi non si produce cAMP.

Quando la via glicolitica rallenta i cataboliti diminuiscono e l'adenilato ciclasi si attiva portando alla formazione di cAMP.

La proteina che lega cAMP si lega al DNA a monte del promotore in modo da promuovere il legame della sub unità alfa della RNA polimerasi.

DNA-asi è un enzima che catalizza l'idrolisi del DNA. Se voglio sapere la parte del DNA che regola l'espressione di un gene, prendo una parte di DNA lo metto in una provetta contenente RNA polimerasi e DNA-asi quest'ultima andrà a idrolizzare tutto il DNA tranne la sequenza legata alla RNA polimerasi.

Il repressore può anche legare il DNA provocando la formazione di un loop in modo da nascondere il promotore provocando un silenziamento ancora più forte.

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Operone dell'arabinosio (ara)

è presente anke qui la repressione da catabolita. l'arabinosio è uno xucchero costituito da 5 atomi di carbonio. la presenza di arabinosio comporta l'attivazione degli enzimi che fanno parte della via catabolica dello stesso arabinosio.in presenza anke di glucosio la cellula tende ad usare prima qst'ultimo e poi l'arabinosio.

questo operatone è costituito da:

1)

tre geni stutturali che codificano per proteine:

AraA cioè il ribulosio chinasi "

Ara B

Ara C

"

" arabinosio isomerasi ribulosio 5 eminerasi

"

I geni di queste proteine sono ara a, b ,d e sono controllati dalla proteina regolatrice ara c e un proteina che lega cAMP.

La proteina regolatrice esiste in due conformazioni:

  • - una reprime l'operone legandosi al DNA mentre

  • - l'altra si lega in un altro sito attivando l'espressione genica.

Il gene ara c si autoregola cioè reprime in certe condizioni la sua trascrizione.

In questo operone i geni regolatori si trovano vicino all'operone e il sistema di controllo e un esempio di regolazione a distanza che avviene per ripiegamento del DNA. Quindi il gene regolatore ara c è un gene autoregolatore.

2)

4 operatori:

I1 , I2 ,

o1 , o2

3)

promotore

4)

Sito di legame di una proteina che lega cAMP

5)

Il gene arac(codifica la proteina arac) avente un suo promotore

Se non c’è arabinosio :

Si ha la repressione dell'operone perché la proteina Ara C assume la conformazione di un dimero che è in grado di legare il sito I1 e O2 provocando il ripiegamento del DNA e impedisce la trascrizione dell'operone.

Però abbiamo ancora l'attivazione del promotore del gene arac quindi continua la sintesi del repressore aumentando di concentrazione. arac riesce a legare anche O1 con un affinità minore.

quando arac arriva a una certa concentrazione riesce a legare O1 impedendo la sua trascrizione. quando le molecole cominciano a degradarsi a causa del loro turnover, il primo sito che si libera è proprio quello di O1 e a questo punto si inizia di nuovo la sua trascrizione aumentando di nuovo.

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Se c'è arabinosio :

L'arabinosio ( funge da induttore) si lega alla conformazione meno stabile della proteina AraC spostando l'equilibrio. La seconda conformazione di AraC ( è sempre un dimero ) si lega al sito I1 e I2 promuovendo la trascrizione dell'operatore perché non provoca una variazione della conformazione del DNA.

La presenza di una proteina che lega cAMP aumenta ancora di più la trascrizione dell'operone. L 'arabinosio è un regolatore positivo dell'operone.

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I procarioti hanno la necessità di attivare e disattivare in tempi brevi i geni , poiché per sopravvivere devono rispondere prontamente alle variazioni dell’ambiente che li circonda. Gli RNA -messaggeri dei procarioti sono altamente instabili e si degradano in brevissimo tempo, per questo è ancora più importante regolare velocemente la trascrizione, in modo che gli RNA-messaggeri vengano immediatamente prodotti quando la situazione ambientale richiede la proteina per cui codificano.

Concetto di Operone : insieme di geni strutturali che codificano per prodotti molecolari metabolicamente correlati, che vengono co-trascritti in un unico RNA- messaggero , e la cui trascrizione è regolata dagli stessi elementi di regolazione.

Concetto di Promotore forte : Promotore dotato di elevata affinità per l'enzima RNA polimerasi che controlla geni che vengono quindi trascritti in numerose copie. Insomma , l’RNA Polimerasi si lega più frequentemente nell’unità di tempo a questo tipo di promotore. Tale affinità è indicata da una costante di stabilità Ks . Possiamo intervenire per aumentare o diminuire tale stabilità utilizzando dei segnali che legano proteine specifiche, le quali poi andranno a legarsi al complesso Promotore- RNA Polimerasi diminuendone o aumentandone la stabilità.

Risparmio in termini energetici :

  • - Considerando un meccanismo catabolico, degradativo, se non c’è il substrato di quel catabolismo non solo la cellula non fa funzionare gli enzimi coinvolti nella via catabolica, ma non fa nemmeno partire la trascrizione dei geni che codificano per tali enzimi.

  • - Considerando un meccanismo anabolico, biosintetico, se c’è molto prodotto finale della stessa via anabolica non ne produce altro e, in più, non fa partire la trascrizione dei geni che codificano per gli enzimi della via anabolica stessa.

Operone del lattosio:

Abbiamo visto che l’operone del lattosio e costituito da tre geni strutturali che codificano per tre proteine coinvolte nel metabolismo del lattosio; un enzima la β-galattosidasi, un trasportatore la Permeasi e una Acetilasi . Il lattosio è un disaccaride formato da glucosio e galattosio. L’operone lac è sotto il controllo di un promotore e vari elementi di regolazione.

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C’è anche un gene ( che non deve stare necessariamente vicino all’operone poiché funziona grazie ad un prodotto solubile che lo trova ovunque sia ) che codifica per una proteina regolatrice che ha la proprietà di esistere in due conformazioni caratterizzate da competenze biologiche diverse:

  • - Una lega l’ Operatore ( Conformazione 1 )

  • - Una non lega l’ Operatore ( Conformazione 2 ) ma un’altra molecola che è il substrato di quella via catabolica, in questo caso il lattosio.

Se la conformazione più stabile è quella che lega l’operatore, quando la proteina è sintetizzata la maggior parte della proteina tenderà a stare nella conformazione ( Conformazione 1 ) che lega l’operatore e va a legare l’ Operatore. Se la concentrazione di tale proteina è discreta, l’operatore passa molto tempo legato e ciò significa che il promotore non è disponibile per la trascrizione e il gene non viene trascritto o è trascritto a livelli molto bassi. In presenza di lattosio, il lattosio si lega alla proteina in Conformazione 2; l’equilibrio tra le due conformazioni si sposta verso la Conformazione 2 e ciò comporta che la concentrazione di proteina con Conformazione 1 diminuisce , così che l’operatore sarà per un certo periodo disponibile per la trascrizione. Man mano il lattosio lega quasi tutta la proteina con Conformazione 2 e l’operatore così sarà sempre libero e la trascrizione dei geni procede . In questo modo è stato de- represso un operone la cui espressione è normalmente repressa. Insomma, la presenza del lattosio ( che è il substrato della via catabolica ) de-reprime l’operone lac , che normalmente è represso e permette al processo catabolico di iniziare.

Operone dell’ Arabinosio

Segue la regolazione tipica dei cataboliti.

  • - Se c’è glucosio, l’arabinosio non viene consumato

  • - Se non c’è glucosio, l’arabinosio viene consumato e si esprimono i geni.

Tale regolazione necessita di una proteina regolatrice ( Ara C ), codificata dal gene ara C .

Il promotore del gene ara C deve avere delle particolari caratteristiche:

  • - È costitutivo ( ossia non regolato )

  • - È debole

Differenze tra l’operone ara e l’operone lac :

1)

La molecola Ara C esiste in due conformazioni con competenze biologiche diverse e può fungere sia da attivatore che da repressore.

2)

Il gene ara C deve essere posizionato vicino poiché è sotto il controllo di un operone regolato.

3)

La proteina Ara C regola a distanza il funzionamento dell’ operone attraverso un ripiegamento del

DNA. Regolazione generale dell’ operone ara.

Loperone arabinosio (ara), studiato in E. coli, è unico, in quanto la stessa proteina regolatrice è capace di esercitare un controllo positivo e negativo, e come risultato può indurre o reprimere lespressione genica.

L’operone è composto da tre geni strutturali, ara B, A e D ( chiamati anche geni Ara BAD ) che codificano per tre enzimi necessari alla catabolizzazione dell’arabibosio in xilulosio 5- fosfato. A monte di AraBad è

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presente il promotore P-BAD. La loro trascrizione è controllata dalla proteina regolatrice AraC, codificata dal gene araC, che interagisce con due regioni regolatrici, ara I e araO2.

O2

---

Ara C --- P-C + O1 ---
Ara C
---
P-C + O1 ---

CRP ---

Ara I

---

P-BAD ------------------ AraB

AraA

AraD

presente il promotore P-BAD. La loro trascrizione è controllata dalla proteina regolatrice AraC, codificata dal gene

L’operone è regolato dal prodotto del gene ara C chiamato proteina Ara C. Questa proteina , che viene trascritta a partire dal promotore P-C , svolge 2 funzioni:

1) regola la propria sintesi, legandosi al sito operatore ara O1 situato nel promotore Pc , quando la sua concentrazione nella cellula aumenta, reprimendo in tal modo la trascrizione del gene Ara C

2) agisce da regolatore dei geni BAD sia in senso positivo che in senso negativo (comportandosi,

all’occorrenza, da attivatore o da inibitore della trascrizione).

presente il promotore P-BAD. La loro trascrizione è controllata dalla proteina regolatrice AraC, codificata dal gene

Regolazione Negativa:

In assenza sia di arabinosio sia di cAMP (Adenosina monofosfato ciclico ) , dei dimeri di proteina AraC si legano in maniera coordinata al sito Ara I e al sito O2. Quando sia I e sia O2 sono legati da AraC, si verifica un cambiamento conformazionale nel DNA, grazie al quale si forma uno stretto anello che provoca la repressione, inibendo laccesso dellRNA polimerasi alla regione del promotore. In tal modo, non vengono prodotti inutilmente gli enzimi necessari alla catabolizzazione dell’ arabinosio che non è presente.

Regolazione Positiva : In presenza di arabinosio e cAMP

L’ arabinosio si legherà alla proteina Ara C e la cAMP al sito CRP ( Regione di Controllo del Promotore) . La conformazione di AraC cambia a causa dell’arabinosio e , come risultato di queste modificazioni, AraC - arabinosio viene richiamata sul sito AraI e vi si legano .Diventano ora un attivatore della trascrizione, agendo sinergicamente al complesso CRP-cAMP per indurre la trascrizione dei geni Ara BAD. Si producono

così gli enzimi necessari a catabolizzare l’arabinosio presente. MODELLO di Operoni Reprimibili : l’ operone trp

Operoni reprimibili : insieme di geni la cui espressione è normalmente funzionante, ma che vengono repressi con la presenza di particolari sostanze chiamate co-repressori. Ad esempio, il triptofano reprime il gene trp dell’operone del triptofano.

Il co-repressore è in genere il prodotto della via metabolica.

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Operone trp : come è fatto

R

------------------

P

O

L

E

D

C

B

A

R : gene regolatore E, D, C, B, A : 5 Geni strutturali che codificano per 5 proteine O : gene Operatore

P, O, L, E, D, C, B, A L : regione leader

: operone trp

Il gene regolatore R codifica per una proteina che è un repressore inattivo che ha due conformazioni differentemente stabili :

  • - Conformazione 1 : lega l’ Operatore. Conformazione meno stabile e presente in minor concentrazione.

  • - Conformazione 2 : non lega l’ Operatore. Questa conformazione è la più stabile e presente in più alta concentrazione.

La presenza del triptofano ( il co-repressore ) cambia l’equilibrio : si lega al repressore inattivo in Conformazione 1 , spostando l’equilibrio verso questa conformazione che lega l’operatore . Ora il numero

  • di repressori in Conformazione 1 diventa molto maggiore di quello in Conformazione 2 e si attacca

all’operatore e lo reprime. Quindi non si trascrive nessun mRNA del triptofano.

Operone trp : come è fatto R ------------------ P O L E D C B A

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Analisi del gene leader L dell’operone trp

L è una sequenza ORF ( Open Reading Frame ) di DNA con le seguenti caratteristiche :

1)

Divisa in quattro zone ( zona 1- 2- 3- 4 ) che quando trascritte sono a 2 a 2 complementari, ossia il

2)

trascritto di questo gene può ripiegarsi a formare una forcina ( simile a quella dei terminatori ). A cavallo della zona 1 , la sequenza di DNA è una fase aperta di lettura potenzialmente traducibile

3)

( ciò significa che è un susseguirsi ininterrotto di triplette di senso , ossia senza triplette di stop, che è traducibile se sono presenti i segnali di inizio traduzione, ossia una tripletta di inizio correttamente spaziata da una sequenza Shine - Dalgarno , e una tripletta di fine traduzione ) In questa fase aperta di lettura sono iper-rappresentati i 2 codoni che codificano per l’amminoacido

4)

che è il prodotto finale della via metabolica ( in questo caso il trp ) A valle del quarto elemento c’è una sequenza di T ( che trascritta diventa una poli U )

Regolazione dell’ operone del trp :

In presenza di abbastanza triptofano

  • - La RNA polimerasi si lega all’ operone e inizia a trascrivere la regione leader L.

  • - La RNA polimerasi trascrive un mRNA abbastanza lungo da permettere l’attacco del ribosoma.

  • - Il ribosoma inizia la traduzione della zona 1 della ORF ( fase aperta di lettura ) . Traduce a velocità normale se ci sono in soluzione abbastanza trp-tRNA

  • - Il ribosoma arriva alla zona 2 e inizia a tradurla. Intanto la RNA polimerasi ha trascritto la zona 3 che , non trovando disponibile ad appaiarsi la zona 2 che è in quel momento coperta dal ribosoma, si lega alla zona 4

appena trascritta. La forcina formata da 3 e 4 abortisce la trascrizione. In presenza di poco triptofano

  • - Il ribosoma staziona più tempo sulla zona 1 ( poiché sono disponibili pochi trp- tRNA ).

  • - Intanto le zone 2 e 3 vengono trascritte dalla RNA Polimerasi e si appaiano , dato che 2 non è coperto dal ribosoma, formando una forcina 2-3 che non è abortiva.

  • - La zona 4 viene trascritta ma non può appaiarsi alla 3 , che si è già appaiata alla 2.

  • - La trascrizione continua normalmente e alla fine della via metabolica si sintetizza il triptofano.

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L’infezione da parte del fago λ delle cellule di E.coli si può propagare in due modi alternativi: litico o lisogeno .

L’infezione da parte del fago λ delle cellule di E.coli si può propagare in due modi

La crescita litica implica la replicazione del DNA fagico e l’espressione delle sue proteine che porta alla formazione di molte particelle fagiche e alla lisi cellulare. La crescita lisogena comporta l’integrazione del genoma fagico (profago) nel cromosoma batterico.

Fago λ è un batteriofago dotato di un filamento di DNA lineare lungo circa 45.000 coppie di basi, dotato di estremità coesive , ossia estremità sporgenti complementari che permettono la circolarizzazione dopo l’infezione in E.Coli . Tale circolarizzazione avviene grazie ad una DNA- Ligasi che salda la parte a singolo filamento delle due estremità con dei legami fosfodiestere.

Sul DNA del fago lambda sono presenti anche dei segnali che fanno partire la trascrizione. La trascrizione dei geni di λ è fatta dalle RNA-polimerasi σ 70 di Coli ( che sono le RNA polimerasi più abbondanti di Coli , la cui parte sigma è la sigma 70 ).

Il genoma del fago ( 50 geni ) contiene una regione di controllo critica nella quale sono presenti due geni (cI e cro) e tre promotori PL, PRM e PR. PL e PR sono promotori forti che regolano la sintesi di tutti i geni del fago o direttamente o attraverso i loro prodotti. PRM ( Promoter for repressor maintenance ) è un promotore debole che trascrive solo il gene cI e richiede un attivatore.

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Che vantaggio ricavano le cellule ospiti dall’infezione? L’ acquisizione di informazione genetica a vantaggio della specie.

Che vantaggio ricavano le cellule ospiti dall’infezione? L’ acquisizione di informazione genetica a vantaggio della specie. Infatti, il virus alla fine del ciclo litico può casualmente inglobare parte del genoma dell’ospite e lo porta al genoma della cellula che infetterà dopo.

Che vantaggio ricavano le cellule ospiti dall’infezione? L’ acquisizione di informazione genetica a vantaggio della specie.

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Da PL la trascrizione termina su TL1 che è un terminatore forte ( infatti è un terminatore Rho indipendente che forma una forcina molto stabile. Un terminatore debole invece fa una forcina meno stabile, la quale non interrompe tutte le trascrizioni che lo attraversano ).

Da PR la trascrizione incontra TR1 che è un terminatore debole; le trascrizioni che superano TR1 arrivano al terminatore successivo TR2 , che essendo forte blocca tutte le trascrizioni che non si erano fermate a TR1.

Da PR I le trascrizioni si fermano su T 6S che è un terminatore forte che ferma tutte le trascrizioni sempre. La trascrizione da PR I a T 6S produce un 6S- RNA.

Da PL la trascrizione termina su TL1 che è un terminatore forte ( infatti è un

PL induce la trascrizione del gene N, da cui si produce la proteina N.

PR induce la trascrizione del gene Cro , da cui si produce la proteina Cro ( la concentrazione di Cro aumenta molto lentamente rispetto a quella di N, che invece aumenta velocemente )

N è una proteina anti-terminatore , ossia si lega al complesso di trascrizione ed altera la capacità di riconoscere i terminatori ( impedendo la formazione della forcina terminatrice ).

N funziona su TL1 , TR1 , TR2 ma non su T6S , per cui le trascrizioni che partono da PL e PR continuano quando N è legato ai terminatori.

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Dopo che la concentrazione della proteina N è aumentata , comincia ad aumentare anche la concentrazione

Dopo che la concentrazione della proteina N è aumentata , comincia ad aumentare anche la concentrazione di Cro e inizia la produzione di tre altre proteine : C3 , C2 e Q .

C3 , Cro e C2 sono proteine regolatorie . Q invece è una proteina anti-terminatore che silenzia il terminatote T6S , il quale quando silenziato non fa più terminare la trascrizione che parte da PR I , e così i geni strutturali del corpo del fago che si trovano dopo T6S vengono trascritti per essere usati nel ciclo litico.

Cro: Proteina regolativa che lega il DNA su particolari sequenze specifiche chiamate determinanti , determinando così la modifica del funzionamento del promotore.

Definiz. Di OPERATORE : segmento di DNA che è un insieme di determinanti molecolari a cui si legano proteine specifiche , regolando l’attività dei geni.

OL1 , OL2

, OL3

OL1 , OL2 , OL3 Questi sono gli operatori che si trovano a

Questi sono gli operatori che si trovano a

OR1 , OR2 , OR3

monte

dei promotori PL e

PR .

Ciclo litico : Cro si lega agli operatori ma con diverse costanti di affinità , per cui si lega più velocemente all’operatore con cui ha costante di affinità più alta. Cro silenzia il gene C1 ( così non si produce la proteina C1 che è sua antagonista ) e intanto la proteina Q silenzia T6S Ciclo litico e lisi cellulare.

Dopo che la concentrazione della proteina N è aumentata , comincia ad aumentare anche la concentrazione

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A monte di P ( un promotore attualmente silente ) , le proteine C2 e C3

A monte di P RE ( un promotore attualmente silente ) , le proteine C2 e C3 formano tra loro un complesso

che lega il DNA e attivano il promotore P RE

.

Ora da P RE parte la trascrizione del gene C1 e così aumenta la concentrazione della proteina C1 per la quale il gene codifica.

C1 e Cro sono due inibitori di trascrizione competitivi poiché anche C1 si lega agli stessi operatori di Cro ma con affinità inversa. Cro lega, in ordine di affinità, OR3, OR2 e OR1. C1 lega, in ordine di affinità, OR1, OR2 e

OR3.

Se prevale C1 Rimane in Lisogenia il virus resta silente Se prevale Cro Parte il Ciclo litico si esprimono i geni tardivi per il ciclo litico.

Quando prevale C1 , C1 satura tutti i siti PL e PR ( bloccando l’ulteriore produzione di proteina Cro ) . C1 lega OR1 , OR2 , OR3 attivando così la trascrizione dal promotore PRM ( Promotore per il Mantenimento del Repressore ) che prima era inattiva . Da PRM si producono nuove proteine C1 e la loro [ ] aumenta.

A monte di P ( un promotore attualmente silente ) , le proteine C2 e C3

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Il fago rimane in fase lisogena se predomina la proteina C1 , mentre si avvia nella fase litica se predomina Cro. Fase litica e lisogena si autoescludono attraverso le seguenti condizioni:

-in assenza di C1, il gene Cro può essere trascritto; -in presenza di C1, solo il gene C1 può essere trascritto; -ad alte concentrazioni di C1, è inibita la trascrizione di entrambi i geni. C1 è una proteina dimerica , e solo come dimero C1 lega il DNA.

Il fago rimane in fase lisogena se predomina la proteina C1 , mentre si avvia nella

La sua parte N-terminale è responsabile del legame al DNA, mentre la sua pare C-terminale è responsabile della dimerizzazione di C1.

C1 è anche un sensore del livello metabolico della cellula. Se C1 viene idrolizzata dalle proteasi che la cellula ospite produce in risposta all’infezione, significa che la cellula è in salute e abbondante di proteasi; prevale Cro e si esprimono i geni tardivi per la produzione di nuovi virus con il ciclo litico . Se C1 non viene idrolizzata, la sua concentrazione aumenta e Cro non viene più prodotta, così C1 prevale e sia avvia la lisogenia, in quanto la cellula ospite sembra carente di proteasi e nutrienti , due fattori che non comprometterebbero il ciclo litico.

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Il DNA del fago lambda è lineare e a doppia elica, ma circolarizza quando entra nella cellula ospite grazie alla DNA ligasi. Esso contiene delle sequenze che sono riconosciute dalla Rna polimerasi della cellula ospite e si ha inizio alla trascrizione delle prime proteine virali. Tali proteine sono regolate da promotori:

-PL1 avente un terminatore forte TL1(permette un’ottima trascrizione del gene) che codifica per una proteina N;

-PR avente un terminatore debole TR1 (è una sequenza di DNA che porta alla formazione di una forcina meno stabile, a causa della presenza di pochi legami, non promuovendo sempre la fine della trascrizione quindi molto spesso la trascrizione che parte da PR non termina, ma continua fino al terminatore TR2) che codifica cro.

-PR’ ha un terminatore forte T6s codifica per 6s RNA

La proteina N è un anti-terminatore cioè si lega a una sequenza specifica del RNA impedendo la formazione della forcina che provoca la fine della trascrizione.

La cro è una proteina regolatrice cioè una proteina, che si lega a una sequenza specifica del DNA in modo da favorire l'attivazione di geni silenti.

La concentrazione di N aumenta in modo esponenziale mentre cro con una velocità minore.

La proteina N si lega su TL1, TR1 e TR2 in modo che le trascrizioni che partono da PL non si fermano più al suo terminatore ma continua, in modo da codificare i geni della proteina C3, mentre la trascrizione che parte da PR continua così che si ha la trascrizione anche di C2 e Q.

Queste proteine sono trascritte sempre quando lambda infetta E. Coli indipendentemente del tipo di ciclo vitale che esso svolgerà.

Intanto aumenta cro che riconosce gli operatori a monte del promotore PL1 cioè OL1, OL2 e OL3 e gli operatori a monte del promotore PR: OR1, OR2 e OR3. La cro lega questi operatori con affinità crescente quindi lega prima l’operatore più lontano(OR3) e man mano che aumenta la sua concentrazione andrà a saturare i restanti operatori.

Oltre alla proteina cro aumentano anche la concentrazione di C3 e C2(proteine regolatrici) che si uniscono per formare un complesso che promuove l’attivazione di promotori silenti.I siti di legame di tale complesso sono gli operatori a monte di PRE e di Pint(terminatore Tint) in modo da interagire con la RNA polimerasi, che si stabilizza dando inizio alla trascrizione. PRE porta alla codifica C1, cioè una proteina regolatrice che si lega agli stessi operatori che si lega cro con affinità crescente ma inversa, mentre da Pint una proteina che

funge da integrasi, cioè catalizza l’integrazione del Dna di Lambda nel genoma della cellula ospite.La

produzione di C1 provoca il silenziamento di PL1, cioè l’inibizione della trascrizione di N, e interferisce agendo da repressore forte con la trascrizione di cro quando si lega sugli operatori a monte di PR, quindi la concentrazione di quest'ultima aumenta più lentamente rispetto a prima ma non è repressa immediatamente. Oltre a queste funzioni C1 promuove anche la sua stessa trascrizione.

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C1 non funziona se non si trova sottoforma di dimero costituito essenzialmente da due domini strutturali:

  • - Uno permette di legare il Dna in sequenze aspecifiche;

  • - L’altro permette la dimerizzazione di molecole di C1 portando alla formazione di un complesso più

stabile.

Questi due domini sono tenuti insieme da una catena polipeptidica non strutturata (flessibile) che rende C1 più sensibile alle proteasi (che ne provocano l’idrolisi). Quindi se ci sono molte proteasi le proteine C1 nonostante siano prodotte, i domini strutturali vengono idrolizzati impendendo il legame con il DNA. Questo controllo serve al virus per misurare il livello metabolico della cellula ospite, se è elevato, fa si che le

proteine di C1 siano idrolizzate e abbiamo la prevalenza di CRO se è basso, abbiamo l’inverso.

Nel primo caso abbiamo la saturazione degli operatori (OL1, OL2,OL3,OR1,OR2,OR3)da parte di cro in modo da reprimere la trascrizione di PL e PR. Nello stesso tempo aumenta anche la concentrazione di Q che ha il ruolo di anti-terminatore specifico per T6S in modo che le trascrizioni che partivano da PR’ continuino oltre a tale terminatore per far trascrivere i geni strutturali del virus cioè quelli che codificano per le proteine

della capsula ecc. Con la prevalenza di CRO il virus attiva il ciclo litico. All’interno del gene Q è presente un

altro promotore PAQ(è un promotore debole), attivato dal complesso C2-C3, la cui trascrizione prosegue a sinistra portando alla formazione di un trascritto anti-senso contenente sequenze complementari al RNAm che codifica per Q quindi i due trascritti si ibridano formando una struttura a doppia elica che non viene tradotta dal ribosoma, in quanto non riconosce tale struttura. In questo modo permette il graduale aumento di Q in modo che se si ha un improvviso aumento di C1 il sistema disattiva il ciclo litico per attivare

quello litogenico.

Si innesca il ciclo litogenico quando invece abbiamo la prevalenza di C1 quest’ultimo tenderà a legarsi per prima con gli operatori con maggiore affinità cioè con OR1 e OR2 in modo da determinare l’attivazione di

PRM, blocca la trascrizione del promotore PR, PR’ e PL1 e promuove solo la sua trascrizione. A questo punto si inibiscono anche i promotori PRE e INT a causa del turnover delle proteine C2 e C3 che non vengono più sintetizzate. Intanto C1 aumenta di concentrazione fino ad arrivare a una certa soglia che gli

permette di occupare anche l’operatore OR3 bloccando il promotore PRM(codifica sempre per la proteina C1). Questo sistema regola la concentrazione di C1 in modo da rimanere a ql soglia xk se va al di sotto di qst sblocca OR3 si attiva PR1 e riparte la trascrizione di C1 se la supera blocca completamente OR3 e quindi nn

si ha più la trascrizione di se stesso. Quindi per riportare all’attivazione completa di PR ci deve essere un

segnale esterno che fa si che C1 si stacchi da OR1, OR2 e OR3.

Quindi ricapitolando la scelta dei due tipi di cicli virali dipende essenzialmente dall’equilibrio che si crea tra C1 e CRO.

Lisi:

  • - All’inizio le basse concentrazioni di CRO fa si che quest’ultima si lega all’operatone OR3 in modo da

spegnere il promotore PRM quindi inibisce la sintesi di C1;

  • - Ad alte concentrazioni CRO si lega anche a OR1, OR3, OL1 ecc

..

e spegne anche i promotori PR e PL;

  • - Aumenta Q e CRO attiva PR’ ,presente a valle di T6s , codificante per i geni della struttura del virus.

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Nel ciclo litogenico invece si ha il crollo di CRO e l’aumento di C1 che va a silenziare PR’, PL e Pr ma porta all’attivazione di PRM.

In condizioni ambientali normali C1 prevale su CRO perché è prodotto più velocemente grazie

all’attivazione di PRE da parte di C2 e C3 nonostante CRO abbia bloccato PRM. Man mano che C1 aumenta

  • di concentrazione andrà a legare OR3 al posto di CRO in modo da attivare la sua trascrizione tramite PRM.

C1 ha anche la funzione di inibire Pint, le ultime proteine int prodotte permettono l’integrazione del genoma virale all’interno di ql della cellula procariote. Per cambiamenti dell’ambiente può provocare

l’improvviso calo di C1 e l’aumento di CRO indirizzando la cellula verso il ciclo litico.

Come abbiamo visto Lambda racchiude tutti i diversi meccanismi che possono regolare i geni delle cellule

procariotiche solo che in questo caso regolano l’intero genoma.

Cascata dei fattori sigma

  • Ci sono alcuni virus, come SPO1, che svolgono solo il ciclo litico quindi hanno bisogno di meccanismi che

regolano i loro geni. Perché se non ci fosse questo sistema dopo l’infezione virale si produce subito il lisozima, un enzima, che va a idrolizzare i legami della parete cellulare portando l’ospite alla lisi cellulare quindi il virus non si può più “riprodurre”. Il meccanismo che adotta questo virus è quello di avere degli operatori che vengono regolati da promotori diversi che necessitano di fattori sigma differenti per potersi esprimere. Il primo promotore della catena è riconosciuto dalla RNA polimerasi della cellula ospite e porta alla trascrizione di una proteina con una subunità sigma che promuove l’espressione del secondo promotore della cascata e così via. Se non è presente la seconda subunità, il secondo promotore non viene

trascritto perché non è riconosciuto dalla prima subunità del primo promotore quindi si blocca la cascata di regolazione. La terza subunità è trascritta più lentamente.

Le proteine regolatrici :

Sono proteine capaci di legare il DNA in modo sequenza aspecifico ( ossia hanno una conformazione tale che si può adattare alla conformazione della doppia elica ansa grande-ansa piccola ) .

Un gruppo/classe di proteine regolatrici è quello con la conformazione elica- gomito- elica . L’altra classe contiene quelle con la struttura a cerniera di leucina , ossia con due eliche anfipatiche ( ossia eliche che espongono su uno dei due lati amminoacidi con lo stesso carattere ) le cui facce idrofobiche interagiscono e dispongono queste eliche nella tipica posizione. Un terzo tipo di classe prot. regolatrice è quello a dita di zinco , con un loop in cui ci sono conservati degli aa che coordinano uno ione zinco al centro .

In genere il segnale di riconoscimento di tali proteine sul DNA è una sequenza palindromica . Infatti non è vero che il DNA espone solo verso l’interno le basi pirimidiniche e puriniche, ma ce ne sono anche alcune che sporgono verso l’esterno fungendo da segnali di riconoscimento per le proteine regolatrici.

Come e dove inizia la duplicazione del DNA in Coli ? ( ripetizione )

Su oriC , che è un determinante molecolare che indica che quello è il sito di origine della duplicazione . Che proprietà ha oriC ? Una sequenza di 9 coppie di basi che è ripetuta 4 volte , poi una sequenza di 13 coppie

  • di basi ripetuta 3 volte .

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Poi c’è la proteina Dna-A che quando lega ATP si stabilizza in una conformazione che lega una sequenza di 9 coppie di basi e così ripiega il DNA inserendo un superavvolgimento , a cui la topologia del DNA rimedia denaturando il DNA sulla sequenza di 13 coppie di basi ( particolarmente ricche di legami A=T che sono più facilmente denaturabili ) , così si forma la prima bolla di replicazione.

Gli eucarioti hanno problemi di regolazione diversi da quelli dei procarioti. Devono regolare l’espressione

dei loro geni in funzione della scelta di sviluppo che ogni singola cellula ha e che è dovuta a tutta una serie di segnali chimici e fisici. Ossia, se da una stessa cellula si originano otto nuove cellule con lo stesso materiale genetico, tali cellule devono poter esprimere pannelli diversi di segnali. Ossia fare la scelta durante lo sviluppo di differenziarsi. Come è possibile ?

L’espressione di un gene degli eucarioti non è solo funzione della struttura del promotore e della polimerasi

che si lega , ma anche funzione della formazione di complessi DNA-proteine che sono in grado di reclutare

la polimerasi. Supponiamo che quando la cellula 1 si divide , in una delle 2 cellule nuove viene espresso un

fattore di trascrizione 1 non espresso nell’altra , per cui queste due cellule esprimono pacchetti di geni

differenti grazie a differenti tipi di fattori . Tale differenziazione non è determinata dall’ambiente, in quanto le cellule si trovano nello stesso ambiente. Quando queste due cellule si duplicano , le 4 nascenti hanno lo stesso materiale genetico e sono sempre nello stesso ambiente , ma anche loro esprimono 4 pannelli

diversi di geni grazie a diversi tipi di fattori .

L’espressione di un gene in eucarioti avviene grazie a molteplici fattori . Se a monte di un gene X ci sono 3

elementi A, B, C che legano 3 fattori necessari alla trascrizione , per esprimere X servono obbligatoriamente questi 3 fattori. Ma perché in una cellula si esprimono ( per un evento temporalmente limitato ) geni che in altre cellule non si esprimono e la cui espressione viene poi trasmessa alla progenie?

C’è un segnale transitorio che determina quello che deve succedere. Una cellula uovo è una cellula con un

sacco di citoplasma, e proprio il citoplasma determina quello che deve succedere. Per cui ad un certo punto dopo la fecondazione della cellula uovo, si presentano gradienti chimici e fisici che determinano che un

gene venga attivato. L’espressione di tale gene è sotto il controllo della stessa proteina ( che chiameremo

proteina A ) per cui codifica. Quindi : il gene viene attivato , esprime A e A si lega al promotore del gene stesso facendo in modo che la produzione di A continui. Ovviamente , tale proteina A rimane nel citoplasma

della cellula e quindi , dopo la sua duplicazione , le cellule figlie avranno nel loro citoplasma la proteina A . Ma negli eucarioti non c’è solo questo differenziamento; c’è anche il programma di espressione regolato durante lo sviluppo.

Rileviamo diversi meccanismi e livelli di regolazione di espressione genica negli eucarioti :

Condensazione : Nel materiale genetico si rilevano due tipi di cromatina: l'EUCROMATINA e

l'ETEROCROMATINA. L’eucromatina a differenza dell'eterocromatina, contiene una quantità maggiore di

proteine non istoniche ed è costituita da DNA scarsamente ripetitivo ed attivamente trascritto.

L’eterocromatina rappresenta il materiale cromosomico densamente impacchettato composto

prevalentemente di sequenze ripetitive, che rimane condensato durante l’intero ciclo cellulare . Soltanto un

DNA che può andare in conformazione a filo di perle può essere trascritto.

Amplificazione genica : ci sono momenti nella vita della cellula in cui a causa dello sviluppo a cui è programmata è necessario che si abbia una forte amplificazione di certi geni , poiché necessario in gran

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quantità il prodotto codificato da quei geni. Ad esempio , durante la duplicazione cellulare servono un gran numero di proteine e quindi di ribosomi , per cui si amplificano i geni deputati alla produzione delle sub unità ribosomiali.

Metilazione del DNA : l'addizione di un gruppo metile sul DNA. È associata all’inattivazione genica , infatti i geni iper- metilati sono ipo- espressi . Il meccanismo della metilazione è ereditario. Come funziona? La metilazione del DNA recluta degli enzimi che modificano la natura chimica degli istoni , rendendo la cromatina più densa ( e quindi inattiva ) .

Riarrangiamento Genico : con il termine riarrangiamento in biologia si intende uno spostamento fisico di sequenze del genoma, le quali formano nuove combinazioni dette ricombinazioni; quando tali ricombinazioni interessano i cromosomi si parla di riarrangiamento cromosomico e quando tali ricombinazioni interessano i geni prendono il nome di riarrangiamento genetico . Infatti, esistono parti di DNA movibili chiamate trasposoni . I trasposoni sono elementi genetici presenti nei genomi di procarioti ed eucarioti, capaci di spostarsi da una posizione all'altra del genoma. Questo processo di trasferimento è noto come trasposizione e richiede la presenza di siti per la ricombinazione del DNA, posti sia sul trasposone che sul cromosoma bersaglio, e l'azione di specifici enzimi, detti trasposasi. In seguito alla trasposizione si può avere l'inattivazione funzionale di un gene, nel caso in cui il trasposone si inserisca in questo gene, o la modificazione dei livelli di espressione di un gene, nel caso in cui il trasposone si inserisca nel promotore del gene.

Varietà Anticorpale : Un anticorpo (più propriamente immunoglobulina) è una proteina con una peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a "Y". Gli anticorpi hanno la funzione, nell'ambito del sistema immunitario di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri chiamati antigeni . I geni che

codificano per le immunoglobuline: tratti di DNA che codificano per differenti e combinabili “pezzi” che

possono dar luogo a combinazioni diverse ( da qui nasce la varietà anticorpale ) , così si producono tutti i

tipi di anticorpi. Nel corpo si producono tutti i tipi di anticorpi, ma se essi non incontrano l’antigene non si

stabilizzano e non si duplicano e vengono smaltiti , in quanto inutili . ________________________________________

Nei procarioti , l’interazione tra DNA e RNA polimerasi è diretta . Il controllo della trascrizione consiste nel controllare la capacità della RNA polimerasi di legarsi al promotore , diminuendo l’affinità o addirittura bloccando la possibilità di fare l’interazione o aumentando l’affinità ( aumentando la costante di stabilità )

Infatti , la forza di un promotore la si può sapere misurando la costante di stabilità del complesso RNA Polim – DNA . La costante di stabilità da una misura della frequenza con cui avviene l’interazione .

Negli eucarioti il processo è diverso , infatti ci sono delle differenze tra la trascrizione in eucarioti e in procarioti . La differenza fondamentale è che la RNA Polimerasi non lega il DNA , infatti il determinante sul DNA da solo non è sufficiente a far stabilizzare e avvenire la formazione del complesso di inizio trascrizione.

Perché ciò avvenga , c’è bisogno che si formi un complesso DNA – Proteine , e questo complesso è quello che poi recluta l’ RNA Polimerasi .

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Come sono fatti i promotori degli eucarioti ?

  • I promotori degli eucarioti hanno molti segnali . Tali segnali possono essere raggruppati in due categorie :

    • - Segnali PROSSIMALI : che sono riconosciuti e legati dai fattori di trascrizione basali , che sono i

segnali necessari ma non sufficienti per garantire un’efficace trascrizione

  • - Segnali DISTALI : che attraverso la mediazione di fattori , proteine e attivatori , determinano la formazione del complesso.

Negli eucarioti , tale differenza strutturale nasce dalla diversa esigenza del promotore . Negli eucarioti esiste un processo che è il DIFFERENZIAMENTO , cioè da una singola cellula ( un uovo fecondato ) si possono generare organismi ,che sono insiemi di cellule . Gruppi di queste cellule hanno assunto la capacità

  • di esprimere solo un pacchetto di informazioni , ma il 99% di queste cellule non ha perso nulla del

patrimonio genetico anche se lo esprimono in parte . Se il meccanismo di trascrizione avvenisse come quello dei procarioti , sarebbe difficile spiegarci come fa una cellula, per esempio ,del tessuto epiteliale a esprimere geni non altri , dovrebbero essere repressi tutti quanti gli altri . Il meccanismo che funziona negli eucarioti è che sono espressi nei tipi di cellule che hanno optato per una scelta soltanto una classe o un raggruppamento di proteine ( che sono fattori di trascrizione ) che determinano l’espressione di quei geni , e non di altri . Quindi il primo problema che ci poniamo non è come si muova la risposta in funzione dei cambiamenti ambientali ( era il problema dei procarioti ) , ma piuttosto come avviene questo meccanismo

  • di differenziamento .

Tale differenziamento è una non- attivazione di alcune classi di geni , e attivazione di altre classi di geni .

  • I processi per l’espressione dell’informazione genetica sono più complessi negli eucarioti , perché non basta

che si inizi la trascrizione di un gene che codifica per una funzione perché questa funzione avvenga ,infatti

il trascritto generalmente non porta l’informazione o non la porta in modo funzionale e perché questo

avvenga ( ossia che diventi un trascritto che porti informazione funzionale ) deve avvenire un processo di maturazione del trascritto primario . Nel nucleo infatti avvengono i processi di Capping , Terminazione e Splicing per dare vita a un RNA Messaggero che poi deve essere portato fuori del nucleo , dove poi svolge la sua funzione .

Anche l’organizzazione dei promotori degli eucarioti è diversa da quella dei procarioti , perché i segnali

responsabili della promozione della regolazione nei procarioti sono tutti posizionati a monte del primo nucleotide trascritto , e sono tutti posizionati in prossimità del sito di inizio trascrizione . Negli eucarioti invece , i segnali che modulano la trascrizione negli eucarioti sono più complessi e divisi tra Distali e Prossimali ( vedi sopra ) .

  • I promotori sono vettoriali sia in eucarioti che in procarioti , ma i segnali specialmente quelli distali della

trascrizione nei promotori di eucarioti non hanno necessità di essere orientati , ma funzionano in qualsiasi orientazione proprio per quello che è il meccanismo di funzionamento : devono essere legati dalla proteina, devono formare una struttura di ripiegamento( in genere del DNA ) che stabilizza il complesso , quindi non

importa in che orientazione sia .

Gli operatori funzionano indipendentemente dall’orientazione .

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Appendice . I promotori degli eucarioti si dividono in tre classi :

Classe 1 : promotori si trovano all’interno delle sequenze codificanti , non a monte né a valle .

Classe 2 : regola la trascrizione dei geni che codificano per i precursori di RNA messaggeri .

Classe 3 : promotori si trovano all’interno delle sequenze codificanti , non a monte né a valle .

Un’altra peculiarità degli eucarioti è che spesso anche i segnali basali sono posizionati all’interno e non

all’esterno del trascritto . Questo è un inconveniente , perché c’è un tratto di DNA che svolge due funzioni :

codifica per il messaggio e porta l’RNA polimerasi sul promotore . Quindi qualsiasi mutazione cambia due

fenotipi . Quindi la probabilità che una mutazione sia dannosa è più bassa . Perché non accade che i segnali

basali non siano all’interno dei geni di classe 2 ? perché imporrebbe limiti alle sequenze codificanti . Perché

è un limite determinato dal fatto che quella struttura è tale perché deve legare il fattore di trascrizione , quindi non sarebbero accessibili tutte le sequenze e quindi tutte le possibili varianti del trascritto . Comunque , anche nei geni di classe due i segnali distali possono essere posizionati anche a valle della trascrizione e in genere sono molto distanti , anche migliaia di coppie di basi . I controllo della trascrizione genica negli eucarioti può avvenire a più livelli ( ciò non accade nei procarioti ) .

Il primo è quando parte la trascrizione . Un altro è la maturazione dell’ mRNA , durante lo splicing normale

e alternativo . Un altro è il controllo del trasporto . Un altro ancora è il controllo della traduzione , e dopo

la sintesi della proteina c’è l’ulteriore controllo con il folding . Poi c’è il processo di localizzazione delle

proteine , affinché esprimano la loro funzione nel posto giusto della cellula .

Il folding di una proteina è un processo difficile . La struttura tridimensionale di una proteina ( quella a cui compete l’attività biologica ) non è elettrostatica , ma è quella fra le più stabili e cineticamente più accessibili . Il folding richiede la presenza di proteine che ne facilitino il processo . Il passaggio da proteina a proteina attiva è determinato non solo dal folding ma anche da altri processi post-traduzionali o co- traduzionali come la glicosilazione e la formazione dei ponti disolfurici .

Come è possibile la differenziazione dell’uovo fecondato in vari tipi di cellule ?

Il controllo dell’inizio della trascrizione è di un tipo particolare. Non c’è la lettura diretta del DNA , ma tale

lettura è mediata da proteine specifiche che permettono la formazione del complesso di inizio trascrizione .

Un segnale transitorio chimico o fisico attiva la trascrizione di una proteina A , che è un fattore di trascrizione indispensabile per la trascrizione di un gene che codifica per la prot A stessa . Quando il gene è attivato dalla proteina A , produce nuova proteina A , e tale gene risulterà attivo e sempre espresso anche nella progenie della cellula , dato che in tale progenie sarà già presente la prot A nel citoplasma necessaria al funzionamento del gene .

C’è anche un altro elemento da considerare . La quantità di informazione in una cellula eucariota è

enorme. E il loro genoma è altamente organizzato . La struttura trascrizionalmente attiva del genoma è la collana di perle . La compattazione del DNA in strutture diverse può rendere il DNA trascrivibile o non

trascrivibile . E questo è un altro meccanismo di regolazione della trascrizione .

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Il genoma è presente nelle due forme di Eucromatina e Eterocromatina . Soltanto l’eucromatina è potenzialmente trascrivibile , ossia assume la conformazione a filo di perle che ne permette l’accesso.

Questo e i processi di amplificazione e delezione genica sono altri modi di regolare la trascrizione .

Un meccanismo di regolazione ereditario è quello che riguarda le modificazioni covalenti del DNA , e una di queste modificazioni covalenti è la metilazione . Nei procarioti le metilasi :

-metilano il DNA endogeno e così facendo lo proteggono dall’azione di DNAsi , che vanno a tagliare solo il DNA esogeno proveniente ad esempio da virus che non è metilato .

-metilano il sito OriC durante la duplicazione per ritardare l’inizio di un secondo round di duplicazione .

Anche negli eucarioti la metilazione svolge un ruolo di difesa , ma oltre a questo svolge un ruolo di regolazione genica : i geni ipermetilati sono ipo-espressi , mentre i geni ipometilati sono iper-espressi .

La zona di DNA che è metilata è inaccessibile alle proteine responsabili della messa a disposizione del promotore dai sistemi di promozione .

Un altro meccanismo che regola l’espressione genica è il riarrangiamento genico : sequenze di DNA si spostano da un posto all’altro nel genoma . I Trasposoni sono parti di DNA che hanno questa capacità , e

sono caratterizzati da due estremità che sono segnali riconosciuti dagli enzimi trasposasi , i quali

promuovono il distacco del trasposoma dal genoma. Lo spostamento del trasposoma all’interno del DNA

può avvicinare gli operatori ai promotori , oppure creare delle mutazioni se quella parte di DNA viene

trascritta . La classe di geni codificante per i ribosomi è molto soggetta a amplificazione .

Un anticorpo (più propriamente immunoglobulina) è una proteina con una peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a "Y". Gli anticorpi hanno la funzione, nell'ambito del sistema immunitario di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri chiamati antigeni . I geni che codificano per le immunoglobuline: tratti di DNA che codificano per differenti e combinabili “pezzi” che possono dar luogo a combinazioni diverse ( da qui nasce la varietà anticorpale ) , così si producono tutti i tipi di anticorpi. Nel corpo si producono tutti i tipi di anticorpi, ma se essi non incontrano l’antigene non si stabilizzano e non si duplicano e vengono smaltiti , in quanto inutili .

Come funzionano le immunoglobuline ? Sono costituite da 4 catene proteiche , due pesanti e due leggere , e sono caratterizzate da una parte costante e da una parte variabile .

I geni che codificano per le immunoglobuline non sono singoli , ma sono classi di geni in cui ci sono vari elementi codificanti per la parte costante , vari elementi codificanti per la parte variabile , ecc.

Quello che avviene , è che grazie al ri- arrangiamento genico del tutto casuale questi vari elementi si

risistemano a formare un singolo gene , che poi codifica per l’anticorpo . Quando è stato prodotto , l’anticorpo se non incontra l’antigene non si stabilizza e viene degradato , e quindi non viene trasmesso alla

prole .

Enhancer : Gli enhancer sono sequenze segnale di DNA che svolgono il loro ruolo pro-trascrizione attraverso l'associazione con diverse proteine, tra cui diversi fattori coinvolti nell'avvio della trascrizione

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stessa. Essi legano attivatori che aumentano la stabilità del comlesso d’inizio. Gli enhancers sono sequenze nucleotidiche cis-agenti che esplicano la loro funzione aumentando notevolmente (fino a 200 volte) la frequenza di trascrizione del gene che controllano. Dal punto di vista strutturale, un enhancer non differisce molto da un promotore: entrambi contengono sequenze base e moduli regolativi che controllano la loro funzione (associandosi a proteine specifiche) , ma la differenza è che la densità di tali moduli è maggiore negli enhancer . Gli enhancers non devono necessariamente essere vicini ai promotori: è possibile infatti trovare degli enhancer a parecchie centinaia di migliaia di paia di basi di distanza a valle o a monte del sito d'inizio della trascrizione. In alcuni casi, l'orientamento dell'enhancer può essere invertito senza che diminuisca la loro efficacia . Gli enhancers funzionano attraverso una proteina che non importa quanto distante lega un segnale e stabilizza il complesso di inizio della trascrizione. Gli enhancers si muovono ,

ossia si girano in una direzione o nell’altra in modo tale da legarsi meglio con la sua proteina specifica ( si

gira a seconda di dove si trova tale proteina ) .

I promotori degli eucarioti posseggono oltre a enhancer , sequenze distali , ecc anche :

-

-

-

Core

Negli eucarioti ci sono le famiglie geniche . La famiglia genica è un gruppo di geni che mostrano una certa similarità di sequenza di DNA e derivano tutti da un gene ancestrale comune. L'evento biologico che sta alla base delle famiglie geniche è la duplicazione genica seguita da fenomeni di divergenza.

Ci sono classi di geni che si trovano in una singola cellula in migliaia di copie ( altamente rappresentate ) , altre classi che sono ripetute centinaia di volte ( mediamente rappresentate ) , ma è raro che in una cellula un gene sia presente in singola copia .

Vediamo i geni codificanti per gli RNA ribosomali : c’è un cluster genico che codifica per un precursore di

18-38 s ( uno spazio non trascritto ) e un precursore di 45 s . Questi cluster sono organizzati in più copie .

Tra procarioti e eucarioti cambia anche la dimensione dell’operatore , e la quantità del segnale

riconosciuto. Più è alta la concentrazione di proteina attivatrice , più avviene la formazione di un complesso

di inizio più stabile , perché tale proteina si lega in più siti .

Abbiamo visto che i fattori di trascrizione si possono legare e provocare un rimodellamento dei nucleosomi e quindi l’intervento di altre proteine .

Richiamo : La TATA Box si chiama così perché presenta coppie di basi A-T che sono più facilmente denaturabili rispetto alle coppie C-G .

Un repressore di eucarioti può funzionare in modo :

-

competitivo : mascherando l’attività/ funzionalità di un attivatore ( compete con l’attivatore )

non competitivo : legando il complesso ma impedendo al complesso di andare avanti e quindi impedendo la trascrizione

-

Nelle cellule eucariote si producono molte proteine dimeriche , che presentano diversi domini funzionali . Il guadagno energetico sta nel fatto che non si producono numerose altre proteine , ma si attivano o disattivano le diverse funzionalità dei domini del dimero : ad esempio , un dimero con due domini A e B , se

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serve l’attività di A si disattiva quella di B e viceversa . ma possono anche funzionare entrambi , come nel caso della proteina C1 di lambda .

In sintesi : il processo della trascrizione negli eucarioti è complesso , non è una diretta interazione tra RNA- Polimerasi e DNA e quindi sia i repressori sia gli attivatori funzionano in modo diverso, ma sempre sulla

base dello stesso principio : stabilizzare o interferire con la formazione del complesso con l’ RNA –

Polimerasi .

Regolazione delle cellule eucariotiche

Nelle cellule eucariotiche:

-hanno esigenze diverse e quindi meccanismi diversi di regolazione -hanno la membrana nucleare, quindi c’è la separazione fisica della trascrizione e della traduzione

-non c’è corrispondenza lineare tra gene e il prodotto codificante funzionale, poiché il suo trascritto deve subire un processo di maturazione.

  • - comunicano tra loro sempre, per potersi organizzare per svolgere determinate funzioni, con meccanismi più complessi rispetto a quelli usati dai procarioti

Il controllo maggiore dell’espressione genica nei procarioti è quello che avviene all’inizio della trascrizione,

in questo modo riesce a controllare il funzionamento del prodotto finale di quel gene. Nelle cellule

eucariotiche invece abbiamo più meccanismi di controllo cioè:

-l’inizio della trascrizione

  • - maturazione

-export dal nucleo -traduzione -folding e localizzazione cellulare -degradazione delle proteine, che non è un processo spontaneo, ma è un vantaggio per modulare meglio

l’espressione genica. Ad esempio , se nella cellula ci sono enzimi per la degradazione del glucosio ma non c’è glucosio , allora creo un sistema di degradazione che le distrugge , inibendo quella funzione a

facilitandone una nuova .

Un altro esempio di controllo è quello di rendere più o meno accessibile un tratto di DNA, rendendo trascrivibile o meno determinati geni, sfruttando delle modificazioni sulle code degli istoni che diminuiscono o aumentano il livello di compattazione del DNA. Un altro esempio è la metilazione cioè una modifica covalente. Tutte queste modifiche, che caratterizzano il differenziamento cellulare, devono essere trasmesse alle cellule figlie per formarne altre differenziate.

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Trascrizione

Rna polimerasi non è in grado di legare direttamente il DNA quindi ha bisogno di legarsi a un complesso proteico che successivamente ha riconosciuto e legato i segnali determinanti presenti sul DNA per far avvenire la trascrizione di un determinato gene.

I geni omeo box sono una cascata di geni che codificano per fattori trascrizionali cha a loro volta,

determina l’attivazione dell’espressione a cascata di geni. Nella cellula differenziata viene espresso solo una

parte di tali geni perché hanno attivato, durante il loro ciclo di differenziamento, solo una parte dei geni

omeo box.

Altri meccanismi di controllo dell’espressione genica sono per esempio la perdita d’informazioni genetiche,

usato in pochissime cellule perché porta degli svantaggi.

L’amplificazione genica è basata sul meccanismo di trasposizione e amplificazione della trascrizione cioè i trasposoni si amplificano aumentando le copie delle classi geniche.

Le famiglie geniche sono geni la cui espressione è regolata durante lo sviluppo per generare un organismo maturo.

Il primo evento che deve scattare per dare origine alla trascrizione genica è quello di rendere più accessibile

l’informazione genetica ma non basta trasformare un tratto di DNA da forma super avvolta a filo di perle (che è una struttura potenzialmente trascrivibile) , infatti, quest’ultima deve essere modellata grazie a una proteina attivatrice, che riconosce determinati segnali, e recluta delle altre proteine che modificano le code istoniche, per esempio acetilasi, rendendo più disponibile il tratto di DNA con la formazione del complesso

d’inizio. Questo livello è modulato dalla trasmissione dei segnali durante la crescita oppure provenienti

dalle cellule intorno ad essa.

Maturazione dell’ RNA messaggero

Sul RNA m ci sono delle modifiche co-trascrizionali ( cioè modifiche che sono effettuate contemporaneamente alla trascrizione ) che portano alla formazione :

-del cappuccio, cioè l’aggiunta di 7-metil guanosina all’estremità 5’ del RNAm, tramite un legame insolito 5’- 5’ anidridico. Questa modifica è riconosciuta da una particolare proteina che promuove il legame con il ribosoma e si da inizio alla traduzione. Il cappuccio stabilizza, in più , l’RNA messaggero .

-poli A

-splicing

Splicing :

È un processo che porta alla rimozione degli introni presenti sul RNAm. Per fare questo deve riconoscere un

particolare nucleofilo ed elettrofilo posto uno vicino all’ altro.

Le smurp sono le proteine dello Spliceosoma e sono costituite da proteine e piccoli RNA e formano il complesso che provoca l’escissione degli introni sul RNAm. Per fare questo la smurp U1 si lega grazie

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all’appaiamento tra il suo piccolo RNA con una particolare sequenza sul RNAm in prossimità dell’introne e

insieme alle altre subunità rimuovono tale sequenza. Splicing alternativo

Questo processo provoca la formazione di forme alternative delle proteine che svolgono la stessa funzione,

nelle diverse cellule differenziali. Ciò è dovuto dall’attivazione di differenti fattori trascrizionali che attivano geni differenti che codificano per gli RNA delle smurp. Quest’ultime riconosceranno diverse giunture

introne-esone quindi per esempio elimina un esone anziché un introne e così via. Per esempio l’amilasi nell’uomo si trova in due forme alternative una presente nella saliva l’altra nel fegato ma svolgono la stessa funzione perché hanno lo stesso dominio catalitico. L’amilasi salivaria deve essere solubile mentre quella

del fegato deve essere legata alla membrana quindi hanno diversi domini.

Lo splicing alternativo può servire come meccanismo che indirizza o meno la trascrizione di un gruppo di geni agendo sul gene che codifica per la proteina regolatrice. Perché in presenza di determinati fattori trascrizionali abbiamo la codifica di un RNA che quando andrà a formare le smurp riconoscerà come introne il dominio che permette alla proteina regolatrice di essere attiva di conseguenza tale meccanismo

influenzerà sull’attivazione o meno di particolari geni.

In presenza di determinati fattori , si produce un RNA delle smurp che riconosce come introne il dominio funzionale della proteina regolatrice e questo viene rimosso, quindi tale proteina non è più capace di attivare una particolare classe di geni .

Editing è un processo che porta la formazione di proteine aventi la stessa funzione ma con domini strutturali

diversi perché differiscono dalla mancanza di un dominio al N-terminale. Un esempio è il gene che codifica per l’apolipoproteina B il cui trascritto primario subisce lo splicing e poi viene tradotto in proteine oppure in un altro tipo di cellule oltre a subire lo splicing subisce un secondo meccanismo di maturazione cioè

l’editing. Tale processo porta l’aggiunta nel trascritto maturato di uracile al posto di una citosina portando alla formazione di un codone di termine, quindi la traduzione finisce prima rispetto all’altro trascritto e non si ha la traduzione di un particolare dominio. Quindi l’editing è un processo catalizzato e specifico rispetto

allo splicing alternativo.

La cellula che non ha bisogno del processo Editing non ha neanche i geni che codificano per i complessi che svolgono tale operazione.

Un altro meccanismo oltre allo splicing è quello della scelta di diversi siti di inizio della trascrizione di uno stesso gene in cellule differenti. Il posizionamento del complesso d’inizio è dato dalla tatabox. Evidentemente sul gene ci sono due potenziali siti d’inizio ( quindi più siti tatabox ) e la presenza di

determinati fattori di trascrizione attivano uno dei due siti. Con questo meccanismo portano la formazione di forme alternative di una proteina.

Ritornando all’Editing Come si inserisce una tripletta di stop all’interna dell’RNAm? Questo processo è effettuato da una proteina

legata a un piccolo RNA detto RNA guida. La proteina riconosce e lega RNAm e inizia a percorrerlo fino a

quando RNA guida non si appaia con determinata sequenza del trascritto. Questa proteina riconosce il suo substrato (un particolare RNAm) tramite i legami che si stabiliscono tra RNA guida e una specifica regione

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presente sul RNAm. Se tali interazioni sono instabili il complesso di editing si stacca altrimenti permane sul substrato. Anche un dominio della proteina si lega al RNAm però in modo aspecifico, ma tale legame non è sufficiente a stabilizzare il complesso se RNA guida non si appaia con la sequenza complementare presente sul RNAm.

Una volta che i due diversi RNA si sono appaiati, vicino a una zona ricca di nucleofili e elettrofili, la parte proteica del complesso di editing fa avvenire la reazione di trans esterificazione che fa inserire un uracile in

un codone già presente sull’ mRNA , fino a quando non ha creato un codone di stop . In altri casi , l’editing

porta non alla sostituzione ma alla de-amminazione di una Citosina che diventa Uracile .

Un altro sistema è quello che modula la stabilità di un trascritto.

Negli eucarioti essendo che non c’è contemporaneità tra trascrizione e traduzione i messaggeri hanno un emivita e quindi una stabilità maggiore rispetto a quelli della cellula procariotica. La stabilità è data dalla

presenza del cappuccio, che non è riconosciuto dalle nucleasi, e dalla coda di poli A che viene man mano degradato in un tempo tale da permettere la trascrizione del RNAm. Un esempio è il recettore chiamato

transferrina presente sulla membrana cellulare e si occupa dell’ingresso del ferro nella cellula. Più ferro c’è all’esterno della cellula più ci sono tali ricettori. L’accumulo di gran quantità di ferro all’esterno della cellula può portare l’ossidazione delle proteine di membrana.

Il destino del trascritto è modulato tramite il legame tra una proteina X (detto elemento di risposta al ferro) e la sua estremità poli A (sequenza non traducibile). Questa proteina X si trova in due conformazioni presenti in equilibrio, dove quella più stabile è la forma che lega il poli A. La molecola che cambia tale equilibrio è il ferro.

Se c’è una gran quantità di ferro nella cellula, l’equilibrio della proteina X allosterica si sposta verso la conformazione che non lega RNAm in modo che quest’ultimo si destabilizza e venga degradato dalle nucleasi. In assenza di ferro l’equilibrio si sposta verso l’altra conformazione che si lega al RNAm in modo da stabilizzarlo. In questo modo si hanno delle maggiori trascrizioni della transferrina.

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Quali sono i processi che mantengono elevati i livelli di fedeltà ossia abbassano la frequenza di errore

durante la duplicazione e l’espressione genica ?

1)

Durante la replicazione di DNA , il processo di correzione di bozze che corregge un nucleotide

2)

inserito erroneamente grazie a delle esonucleasi . Il fatto che molte triplette codificanti per lo stesso amminoacido o per amminoacidi con proprietà

simili differiscono tra loro solo nella terza base , e quindi un errore su questa terza base è relativamente grave , infatti porterebbe a una mutazione del genotipo ma non del fenotipo .

3)

Nella traduzione : il controllo che avviene nell’appaiamento tra il tRNA giusto e l’amminoacido

giusto è fondamentale. Tale controllo lo fa l’aminoacil –tRNA sintetasi : tale enzima ha a) un sito che riconosce tutti i tipi di t-RNA ma si lega bene solo a quello con cui fa un’interazione più duratura e b) un altro sito attivo che può accogliere tutti gli amminoacidi ma che lega e fa reagire

col tRNA solo quello giusto .

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Le famiglie geniche sono insiemi di geni che codificano per una funzione analoga , e sono simili tra loro ma non identici .

Abbiamo anche visto nella lezione precedente i vari processi di maturazione che regolano l’espressione genica , tra cui quelli dello splicing alternativo , dell’editing che permette la produzione di proteine con domini diversi per funzioni diverse , della scelta di siti alternativi di inizio ( che avviene all’ ammino terminale ) e della modulazione della stabilità dell’ RNAmessaggero ( esempio della transferrina ) . Poi

anche il folding , che non è un processo spontaneo e necessita di diverse proteine , influenza

l’espressione di una funzione , infatti una proteina neosintetizzata non espleta nessuna funzione , fino a

quando non fa il folding e allora diventa una proteina funzionale.

Il folding : è un processo non spontaneo e necessita di diverse proteine , tra cui gli chaperon . I

chaperon evitano l’azione di proteasi e se ci sono tratti di sequenze idrofobiche che possono appaiarsi e

far precipitare la proteina prima che faccia il folding , loro si attaccano in lì impedendo alle parti idrofobiche di unirsi e danno il tempo alla proteina di fare il folding . Altro processo importante per il folding è la formazione di ponti disolfurici ( S S ) che sono legami covalenti tra cisteine che si legano grazie all’enzima disolfuro-isomerasi . Tale enzima permette ad una cisteina di sperimentare più partner fino a trovare quello giusto con cui fare il ponte.

UBIQUITINA : è una piccola proteina che viene legata come “etichetta” alle proteine da degradare . Il fenomeno dell’ubiquitinazione è ubiquitario . L’ubiquitina si lega covalentemente tramite un legame ammidico ad un residuo di lisina durante il processo di ubiquitinazione . La formazione di tale legame richiede l’attivazione di uno dei due partecipanti alla sintesi . L’attivazione avviene con consumo di energia attraverso la formazione di un tioestere , cioè l’ubiquitina viene legata a un gruppo –SH di una cisteina del primo enzima coinvolto nel processo , ossia E1 ( Enzima di Attivazione dell’ Ubiquitina ) . Il processo di ubiquitinazione usa tre enzimi diversi : E1 , E2 , E3 .

Protein Turnover : ci sono alcune teorie su cosa determini la stabilità di una proteina e su come la cellula decida se e quanto rapidamente farla andare a degradare. Essenzialmente le teorie sono due :

N-end Rule in base al tipo di amminoacidi che ci sono all’ammino-terminale , l’emivita della proteina è maggiore o minore .

PEST una proteina ricca in glutammico , serina e treonina hanno un’emivita più bassa .

La scelta della degradazione dipende in parte dalla sequenza primaria della proteina e in parte dal fatto che la proteina dopo un certo periodo inizia a invecchiare , e diventa meno stabile infatti da una conformazione giusta passa ad assumerne una sbagliata .

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Per quanto riguarda l’accessibilità della struttura a filo di perle bisogna rendere ancora di più trascrivibile il promotore. Questo viene effettuato da una proteina che legge determinanti molecolari e recluta degli enzimi per esempio le acetilasi che modificano covalentemente l’istone del nucleosoma che si apre rendendo più disponibile il promotore al complesso d’inizio. Oppure recluta un complesso di

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rimodellazione della cromatina che rimodella il nucleosoma. Il primo evento dura di più perchè abbiamo bisogno di una de-acetilasi che toglie, mentre il secondo meccanismo si ha subito il ripristino della conformazione originale del DNA non appena il complesso si stacca.

La metilazione protegge il DNA perché impedisce il legame con delle proteine che possono indurre la

modificazione conformazione che rende la struttura del DNA accessibile per il complesso d’inizio della

trascrizione. la metilazione viene effettuata da un enzima che aggiunge un gruppo metilico. Trasporto delle proteine Le cellule eucariotiche hanno un grande livello di organizzazione della compartimentazione delle proteine.

Il mitocondrio è un organello costituito da un doppio strato membranoso, spazio intermembrana e uno matrice mitocondriale in cui ci sono RNA, proteina, DNA ecc. Il genoma mitocondriale codifica per poche proteine mitocondriali le restanti vengono codificate nel genoma nucleare, tradotte nel citoplasma(in cui devono essere inattive) e poi trasportate nel mitocondrio dove vengono attivate per poter svolgere la loro funzione. Le amminotrasferasi sono enzimi codificati in forme alternative sia dalla cellula che dal mitocondrio ma hanno la stessa funzione.

Le proteine mitocondriali codificate dal nucleo della cellula, vengono trasferite su particolari recettori presenti sul mitocondrio dove continua la trascrizione e si ha la strutturazione proteica.

Per vedere se il traporto è co-traduzionale si fa un esperimento, cioè si inserisce una proteina sintetizzata viene messa in presenza di microsomi cioè vescicole e vedo che la proteina non riesce ad attraversare la membrana. se invece faccio avvenire la sintesi proteica in presenza di microsomi troverò

una quantità al suo interno in cui non c’è la presenza di un tratto amminoacidico. Questo esperimento testimonia che è un processo di trasporto co-traduzionale e la sequenza segnale d’indirizzamento è presente sull’estremità ammino terminale.

Tale segnale viene riconosciuto da un ricettore presente sulla membrana che deve attraversare e

consente l’attraversamento della proteina in sintesi attraverso tale ricettore. Dopo di che questo

segnale viene tagliato grazie a una proteasi specifica.

La prima parte che viene sintetizzato della proteina è la sequenza segnale che è ricca di amminoacidi idrofobici. A questo punto tale segnale si ritrova in un ambiente polare e quindi tende a ripiegarsi sul ribosoma bloccando la traduzione fino a quando a non incontra una SRP( formata da una parte proteica e RNA). Se non si blocca la traduzione la proteina che viene sintetizzata non sarà più in grado di entrare nel mitocondrio.

Il complesso SPR-ribosoma viene riconosciuto dal ricettore di SRP. Tale interazione permette di esporre il ribosoma in un ambiente idrofobico che fa si che il segnale entri nel canale e si ri-inizia la traduzione. Quando la proteina entra nel lume la sequenza segnale viene tagliata e assume la sua conformazione nativa.

La proteina idrofobica può contenere un altro segnale costituito da amminoacidi idrofobici, che quando entra nel ricettore incontra altri amminoacidi idrofobici si creano delle interazioni che bloccano tale segnale. Intanto la sintesi proteica continua verso l’esterno e verso l’interno della membrana portando la formazione di una proteina di membrana.

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Un esempio di modifica post-traduzionale è la glicosilazione. Sulla proteina in sintesi può essere presente un segnale che permette il legame con delle catene oligosaccaridiche. Tale catena viene sintetizzata da un particolare enzima, contemporaneamente alla sintesi proteica, sul dolicolo fosfato (è uno steroide) ancorato non in modo fisso alla membrana. Una volta sintetizzata la catena oligosaccaridica la trasferasi la stacca dal dolicolo fosfato per legarla alla proteina.

Trasferasi

La parte glicosidica viene ulteriormente modificata nell’apparato del Golgi in base al destino della locazione della proteina.

Le proteine presenti nella membrana cellulare rivolte verso l’esterno sono glicosilate perché tale

modifica le rende più stabili.

Come comunicano le cellule degli organismi eucarioti?

Essi non hanno la stessa esigenza delle cellule procariotiche, ossia non devono repentinamente adattarsi

alle condizioni ambientali che cambiano all’improvviso. Ma devono lo stesso comunicare tra loro perché il

loro sviluppo è in un certo senso organizzato, specie negli eucarioti superiori. Possono comunicare direttamente: sulla superficie della cellula ci sono dei recettori/proteine che sono

capaci di leggere l’informazione, ossia il recettore è legato sulla superficie esterna della cellula e lega il

segnale; tale evento ( formazione del complesso recettore + segnale ) da inizio alla trasduzione del segnale,

ossia il segnale dato da questa molecola (all’esterno) viene trasmesso e diffuso all’interno della cellula. Tale

segnale può passare ad esempio per il sangue e poi arrivare alle cellule riceventi, oppure attraverso

l’apparato endocrino. L’altra possibilità è che non ci sia un sistema di trasporto, ma una comunicazione più

locale tra cellule vicine, e in alcuni casi può addirittura essere una comunicazione contatto-dipendente con o senza un sistema/apparato di contatto, come nel caso delle cellule nervose.

Il segnale risulta in genere in una variazione di comportamento, ad esempio può ridurre la frequenza della contrazione muscolare, può attivare un particolare metabolismo, ecc. In più, è importante che ci sia una amplificazione del segnale iniziale, affinché esso arrivi a tutte le cellule di destinazione e affinché ci sia una risposta sensibile anche a piccole variazioni di concentrazioni del segnale.

In genere, i recettori del segnale sono sulla superficie cellulare, per cui nella maggior parte dei casi parliamo di segnali idrofilici, che possono diffondersi liberamente in quanto sono solubili in acqua ( non permeano la membrana a meno che non ci sia un trasportatore o canali ionici , ad esempio il lattosio entra grazie ad una permeasi ). Invece quelli idrofobici riescono ad attraversare la membrana e quindi il recettore è spesso intracellulare, trovandosi magari nel nucleo.

I segnali possono determinare divisione cellulare, differenziamento, morte, … della cellula che raggiungono. Come avviene l’internalizzazione del segnale, ossia la trasduzione del segnale?

Non è necessariamente un trasporto vero e proprio all’interno della cellula del segnale che arriva ( caso del lattosio ), ma ci può essere anche solo l’import dell’informazione che arriva; ossia, senza far entrare la

molecola/segnale stessa, entra solo il messaggio mediante la modifica conformazionale del dominio citosolico dei recettori di membrana, modifica che poi da il via a varie attivazioni e modifiche .

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Come può essere trasportato all’interno della cellula il ligando ( ossia il segnale ) ?

  • 1- Canale ionico: per il trasporto di ioni o molecole cariche negativamente o positivamente; sono canali più o meno selettivi, che hanno il vantaggio di poter lavorare anche contro gradiente.

    • 2- Trasportatore: il ligando si lega al dominio esterno del recettore e ne determina una modifica conformazionale, che poi ne permette il passaggio all’interno della cellula.

      • 3- Internalizzazione: il ligando entra grazie ad una vescicola, ossia quando il segnale tocca il recettore induce la formazione di una micella ( endocitosi ). In questo caso entra nella cellula anche il recettore, e la sua concentrazione sulla membrana diminuisce. Va considerato anche il fatto che in questo caso è più difficile arrivare ad una saturazione dei recettori, dato che questi entrano subito dopo nella cellula e in un certo senso la sensibilità della cellula a quello stesso segnale diminuisce.

Internalizzazione del segnale, ossia dell’informazione ma non del ligando stesso:

La membrana è una struttura fluida , e le proteine di membrana possono muoversi. Il legame con un ligando determina in genere una dimerizzazione del recettore, creando nella parte citolasmatica della cellula una struttura nuova , che sarà il sito di legame di una nuova proteina monomerica che attiva molto spesso una cascata di fosforilazione, ossia fosforila una nuova molecola cambiandone le proprietà e che magari a sua volta fosforilerà una terza molecola, e così via. Tali proteine attivano quindi direttamente o indirettamente dei processi finalizzati alla trasmissione del segnale. La cascata di fosforilazione è

assolutamente necessaria, affinchè il segnale venga correttamente “inviato” e arrivi sicuramente.

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Ripetizione molto generale della glicolisi e del ciclo di Krebs. Quando il segnale arriva al nucleo,

Ripetizione molto generale della glicolisi e del ciclo di Krebs.

Quando il segnale arriva al nucleo, attiva o inattiva a seconda del caso il fattore di trascrizione con la conseguente modificazione dell’espressione genica. Per esempio, in E.coli se arrivano trp la prima cosa che succede è l’inibizione feedback del primo enzima della via metabolica ( in tempi praticamente immediati ). Quindi i livelli di risposta sono due, ma quello principale è la modifica dell’espressione genica.

Ci sono due tipi di attivazione dei recettori:

  • - Attivazione di una chinasi, che fosforila il

  • - Attivazione di una proteina G.

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Un canale ionico permette il passaggio di ioni, distinguendo due casi : 1) Trasportatore , che

Un canale ionico permette il passaggio di ioni, distinguendo due casi :

1)

Trasportatore , che è sempre aperto ma specifico per un tipo di ione.

2)

Canale ionico , normalmente chiuso ma che si apre ad una determinata concentrazione di ioni.

Si possono formare questi canali all’interno delle membrane grazie alle alfa eliche anfipatiche ( le quali sono stabili in quando le facce idrofobiche toccano la membrana e quelle idrofiliche formano l’interno del canale) si strutturano a barile.

Certi canali hanno dei tappi, per esempio il canale del potassio ha una struttura “palla e catena” che permette l’apertura e chiusura del canale. In genere comunque la struttura dei canali è :

Filtro + Cavità centrale + Poro interno

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Diverse proteine G hanno vari effettori con diversi ruoli, comunque la più importante è la stimolazione

dell’adenilato ciclasi:

Diverse proteine G hanno vari effettori con diversi ruoli, comunque la più importante è la stimolazione

La proteina G in oltre è divisa in più parti o subunità: la parte alfa è normalmente legata alla beta e gamma e tutte si trovano vicino al recettore. Quando il ligando lega il recettore, esso si modifica e G-alfa si stacca dal complesso Gbeta+Ggamma ; quindi, G-alfa ora lega GTP e migra fino a toccare una nuova proteina effettrice, la cAMP e la attiva.

Diverse proteine G hanno vari effettori con diversi ruoli, comunque la più importante è la stimolazione

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L’evoluzione, ovviamente, ha conservato nel tempo le strutture terziarie ( non primaria o secondaria ) dei

siti attivi delle proteine legate alla comunicazione. Per esempio, se la funzione della proteina è legare l’ ATP, nel 90% delle proteine che devono legare l’ ATP troveremo un sito attivo strutturalmente simile e

conservato.

Una volta che si è evoluta una buona funzione, si massimizzano le possibilità di utilizzare quella funzione anche in processi diversi.

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