Definizione di gene Inducibile : gene la cui espressione indotta dalla presenza del substrato della via catabolica per

r la quale codificano . Ad esempio via Catabolica A B Glucosio

Se A non c , manca il substrato della via catabolica e il gene non esprime nulla . LOperone Lac di E. coli ( INDUCIBILE ) Il lattosio un disaccaride che iene idrolizzato dalla beta- galattosidasi nei due monomeri glucosio e galattosio. Loperone del lattosio formato da 3 geni strutturali ( codificanti per i tre enzimi necessari alla degradazione del lattosio ) Gene regolatore

Il gene regolatore codifica per 1 proteina-repressore che allosterica, ossia esiste in due conformazioni caratterizzate da competenze biologiche diverse: una lega loperatore ( conformazione pi stabile ), laltra lega una molecola induttore ( e non loperatore ) Si produce proteina dal gene regolatore Assenza di lattosio Questa proteina normalmente maggiormente presente nella conformazione pi stabile (che lega loperatore) La proteina-repressore lega loperatore Si forma il complesso Operatore-Repressore Non parte la trascrizione Si produce proteina-repressore dal gene regolatore Presenza di lattosio Il lattosio lega/sequestra la proteina-repressore Si sposta lequilibrio verso la conformazione meno stabile Diventa presente in maggior quantit Non c quasi pi la conformazione che lega loperatore reprimendolo Si dereprime loperatore lac Parte la trascrizione dei geni. Quando le cellule vengono fatte crescere in presenza di lattosio (e in assenza di glucosio) sintetizzano rapidamente tutti gli enzimi necessari per la utilizzazione del lattosio. I geni coinvolti sono attivati dalla presenza del lattosio che agisce da induttore. Gli enzimi necessari per la degradazione del lattosio sono: 1) la -galattosidasi 2) la lattosio permeasi e 3) la trans-acetilasi. Il prodotto della trascrizione della regione codificante delloperone lac un unico messaggero policistronico. Loperone lac in E.coli comprende tre geni: lacZ, lacY e lacA che vengono espressi da un RNA policistronico la cui sintesi regolata da un unico promotore. LacZ codifica per la beta- galattosidasi (enzima che scinde il lattosio in glucosio e galattosio) lacY per la lattosio permeasi (facilita lingresso del lattosio nella cellula) lacA codifica per la tiogalattoside transacetilasi (libera la cellula dai tiogalattosidi tossici che vengono importati dal prodotto di lacY).

La trascrizione di questi geni regolata da due proteine: 1) lattivatore CAP (Catabolite Activator Protein) 2) il repressore Lac , che si legano ai rispettivi siti di legame sul DNA.

Ci sono diversi punti di controllo per l'espressione genica : al livello della trascrizione, della maturazione del trascritto, della localizzazione ecc. Il primo livello di controllo quello a livello trascrizionale dell mRNA perch le cellule procariotiche sono organismi unicellulari che vivono singolarmente nell'ambiente esterno senza alcuna difesa o barriera dall'ambiente circostante, quindi necessitano di avere una risposta pi rapida possibile a uno stimolo esterno sintetizzando un determinato gene che codifica quella funzione, anche perch l'organizzazione genica dei procarioti tale che non c' separazione fisica ne temporale tra trascrizione e traduzione. Al contrario le cellule eucariotiche che vivono in un organismo vivono in ambienti dove il pH, la Temperatura ecc sono pressoch costanti e subiscono meno "attacchi" dall'ambiente esterno quindi non hanno la necessit di sviluppare risposte immediate infatti la traduzione e la trascrizione non avvengono contemporaneamente. Le cellule procariotiche per rispondere pi velocemente agli stimoli esterni hanno una struttura del genoma che fa si che geni che codificano per proteine (prodotti) aventi funzioni correlate siano raggruppati e trascritti insieme su unico mRNA ( detto mRNA policistronico) durante la trascrizione. Addirittura su un unico mRNA pu esserci linformazione per proteine che permettono di far avvenire un'intera via metabolica. Questo non accade per gli eucarioti perch i segnali di inizio della traduzione sono diversi, in quanto un mRNA di procarioti pu essere tradotto anche a partire da un punto interno, mentre negli eucarioti la traduzione parte soltanto dal primo giro con il cappuccio che viene riconosciuto da ribosoma. Quest'ultimo scorre lungo il mRNA fino a trovare il codone d'inizio, quindi anche se c' un secondo codone d'inizio non viene tradotto perch non c' il cappuccio. Nelle cellule eucariotiche si formano mRNA monocistronici cio mRNA che portano l'informazione di un unico gene. La regolazione della trascrizione prevede l'interferenza positiva o negativa con la formazione del complesso d'inizio. L'inibizione pu avvenire con due meccanismi diversi che permettono di rendere inaccessibile i determinanti molecolare del promotore ( box -10 e -35) alla RNA polimerasi, cio per 1) occupazione del sito da parte di un'altra proteina che riconosce un altro segnale molecolare presente sul DNA ci si lega e lo occupa 2) formazione di strutture complesse del DNA che rendono inaccessibile i siti -10 e -35 alla RNA polimerasi per ingombro sterico L'interferenza positiva che comporta l'attivazione e l'aumento dell'efficienza del promotore avviene in genere tramite delle proteine che fanno aumentare l'affinit (stabilit) di legame tra RNA polimerasi e il promotore. Tale meccanismo avviene grazie all'interazione di questa proteina con un segnale presenti in prossimit del promotore a cui si lega in modo da esporre il segnale che promuove il legame con la RNA polimerasi. 2

Per vedere se un promotore forte o debole devo tener conto del tempo che impiega il complesso della RNA polimerasi per legarsi e staccarsi dal promotore determinando il numero di trascritti in un certo intervallo di tempo. Quindi vedo l'efficienza , cio la costante di stabilit che mi da la misura della frequenza di trascritti nel tempo. Un promotore forte un promotore che determina un numero pi elevato di trascrizioni rispetto a quello debole. Le proteine come fanno a legarsi al DNA su sequenze aspecifiche? Le basi azotate, oltre ad impegnare la maggior parte dei loro residui, sono capaci di formare delle interazioni tra cui i legami idrogeno ( fungendo da donatori o accettori di elettroni) Verso l'interno dell'asse dell'elica (struttura aperta cio non molto compatta), espongono anche verso l'esterno, soprattutto nel solco maggiore, un pannello caratteristico di gruppi donatori e accettori di legami idrogeno. Quindi le proteine che si legano al DNA devono essere di natura basica per interagire con esso e complementari alla sequenza tridimensionale aspecifica del DNA. Se queste interazioni non sono stabilizzate da legami forti abbiamo una costante di stabilit bassa quindi la proteina si lega e si stacca velocemente dal DNA (interazione debole). La velocit di formazione di un complesso dipende appunto dal tipo di interazione che si crea tra proteine e DNA, quindi dalla costante di affinit. Pi la proteina possiede residui complementari alla sequenza aspecifica del DNA pi stabile l'interazione. Un gene costitutivo un gene la cui espressione non dipende dalle condizioni ambientali, quindi vengono espressi sempre perch codificano per proteine basilari per la sopravvivenza della cellula. I geni che vengono controllati da interferenze positive o negativi (geni regolati) sono di due tipi: - geni del catabolismo (non basale x la cellula) -geni dell'anabolismo In genere l'espressione dei geni regolati repressa e si attiva quando presente nell'ambiente la molecola che funge da substrato alla via catabolica inibita, che fa attivare quella via. Quindi i geni regolatori sono quei geni la cui espressione dipende dall'ambiente e vengono regolati da particolari proteine che ne attivano o ne reprimono l'espressione genica. I geni del catabolismo possono essere inibiti dall'eccesso di produzione della proteina finale del processo catabolico. La cellula promuove questa regolazione per non spendere energia nella produzione di proteina quando non c' bisogno lo svolgimento di una funzione o di quel metabolismo. Operone : un insieme di geni strutturali che codificano per prodotti metabolici strettamente correlati che vengono trascritti su uno stesso mRNA sotto il controllo degli stessi elementi di regolazione.

Operone del lattosio un operone costituito da: 1) 3 geni strutturali che codificano per tre prodotti : beta galattosidasi ( un enzima presente nella cellula che scinde il lattosio in glucosio e galattosio) transacetilasi permeasi ( una proteina trasportatrice che permette l'internalizzazione del lattosio) Questi tre geni sono controllati da uno stesso promotore e trascritti su un unico mRNA. Sull mRNA policistronico ci sono tre sequenze d'inizio e tre di fine che regolano la traduzione dei tre tipi di proteine. 2) promotore 3) segnali di regolazione (operatori): sequenze di DNA responsabili di legami con proteine specifiche. 4) gene regolatore un gene che ha un suo promotore e porta alla codifica una proteina detta regolatore che ha due propriet: - una proteina allosterica cio presente in due conformazioni differenti che hanno competenze biologiche diverse, in questo caso sono in grado di legare l'una l'induttore l'altra l'operatore. l'induttore la molecola di lattosio. - le due forme si trovano in equilibrio tra la forma pi stabile(R1) e meno stabile (R2). Quella pi stabile la conformazione che lega l'operatore. Il gene regolatore pu stare vicino all' operatore oppure lontano. Regolazione dell operone lac In assenza di lattosio: prevale nell'equilibrio la conformazione pi stabile (repressone) esso si lega all'operatore blocca l'espressione dei geni strutturali. Quando c' il lattosio lega R1 (conformazione meno stabile) cos facendo sposta l'equilibrio facendo aumentare la concentrazione di R1 e diminuendo la concentrazione di R2 che si stacca dall'operatore e si attiva la trascrizione. Un biosensore un sistema che capace, usando sistemi biologici, di regolare la concentrazione di un composto. Anche in questo esempio di operone abbiamo un biosensore che in grado di spostare l'equilibrio tra R1 e R2 in base a una concentrazione minima di I. La concentrazione totale di R (repressore) determinato dalla forza dell'espressione del promotore del gene R. Piccole aumenti di I provoca lo spostamento dell'equilibrio tra la conformazione R1 e R2. se abbiamo che la concentrazione di I>R questo fa spostare l'equilibrio tra R1 e R2 promuovendo la conformazione R1 che attiva la trascrizione.

Se R>>I , I non riesce a promuovere l'attivazione dell'operone perch c' sempre una quantit di R2 che riesce a legarsi all'operatore. Quindi per far si che l'operone sia regolato il promotore del gene R deve essere per forza un gene costitutivo debole cio deve produrre una quantit di R sufficiente da far in modo che l'aumento o la diminuzione di I faccia spostare l'equilibrio tra le due forme del repressore. La struttura di questo promotore di tipo debole quindi anche depresso da livelli di trascrizioni bassi, questo perch in presenza di glucosio e lattosio la cellula preferisce usare prima il glucosio perch ha un risparmio energetico quindi non ha bisogno di un elevata espressione dell'operone del lattosio. Quando non c' glucosio la cellula necessita di una elevata espressione di questo operone x fare ci la cellula ha bisogno di un sistema di regolazione. tale sistema regolato da una proteina che lega cAMP che una proteina allosterica di cui una conformazione lega un operatore detto sito di legame della proteina che lega cAMp e l'altro nn lo lega. L'equilibrio tra queste due conformazioni viene spostato dalla cAMP , la conformazione che lega cAMP e l'operatore meno stabile rispetto a quella che non la lega. Quindi la presenza di cAMP sposta l'equilibrio e permette il legame della proteina al DNA che promuove l'attivazione della trascrizione. La concentrazione di cAMP controllata da due enzimi: -fosfodiesterasi un enzima che trasforma cAMP in AMP tramite un idrolisi; La regolazione effettuata dalla proteina che lega cAMP detta repressione da catabolita perch uno dei cataboliti della via glicolitica aumenta e va a inibire l'adenilato ciclasi quindi non si produce cAMP. Quando la via glicolitica rallenta i cataboliti diminuiscono e l'adenilato ciclasi si attiva portando alla formazione di cAMP. La proteina che lega cAMP si lega al DNA a monte del promotore in modo da promuovere il legame della sub unit alfa della RNA polimerasi. DNA-asi un enzima che catalizza l'idrolisi del DNA. Se voglio sapere la parte del DNA che regola l'espressione di un gene, prendo una parte di DNA lo metto in una provetta contenente RNA polimerasi e DNA-asi quest'ultima andr a idrolizzare tutto il DNA tranne la sequenza legata alla RNA polimerasi. Il repressore pu anche legare il DNA provocando la formazione di un loop in modo da nascondere il promotore provocando un silenziamento ancora pi forte.

Operone dell'arabinosio (ara) presente anke qui la repressione da catabolita. l'arabinosio uno xucchero costituito da 5 atomi di carbonio. la presenza di arabinosio comporta l'attivazione degli enzimi che fanno parte della via catabolica dello stesso arabinosio.in presenza anke di glucosio la cellula tende ad usare prima qst'ultimo e poi l'arabinosio. questo operatone costituito da: 1) tre geni stutturali che codificano per proteine: AraA cio il ribulosio chinasi Ara B " " arabinosio isomerasi Ara C " " ribulosio 5 eminerasi

I geni di queste proteine sono ara a, b ,d e sono controllati dalla proteina regolatrice ara c e un proteina che lega cAMP. La proteina regolatrice esiste in due conformazioni: - una reprime l'operone legandosi al DNA mentre - l'altra si lega in un altro sito attivando l'espressione genica. Il gene ara c si autoregola cio reprime in certe condizioni la sua trascrizione. In questo operone i geni regolatori si trovano vicino all'operone e il sistema di controllo e un esempio di regolazione a distanza che avviene per ripiegamento del DNA. Quindi il gene regolatore ara c un gene autoregolatore. 2) 3) 4) 5) 4 operatori: I1 , I2 , o1 , o2 promotore Sito di legame di una proteina che lega cAMP Il gene arac(codifica la proteina arac) avente un suo promotore

Se non c arabinosio : Si ha la repressione dell'operone perch la proteina Ara C assume la conformazione di un dimero che in grado di legare il sito I1 e O2 provocando il ripiegamento del DNA e impedisce la trascrizione dell'operone. Per abbiamo ancora l'attivazione del promotore del gene arac quindi continua la sintesi del repressore aumentando di concentrazione. arac riesce a legare anche O1 con un affinit minore. quando arac arriva a una certa concentrazione riesce a legare O1 impedendo la sua trascrizione. quando le molecole cominciano a degradarsi a causa del loro turnover, il primo sito che si libera proprio quello di O1 e a questo punto si inizia di nuovo la sua trascrizione aumentando di nuovo.

Se c' arabinosio : L'arabinosio ( funge da induttore) si lega alla conformazione meno stabile della proteina AraC spostando l'equilibrio. La seconda conformazione di AraC ( sempre un dimero ) si lega al sito I1 e I2 promuovendo la trascrizione dell'operatore perch non provoca una variazione della conformazione del DNA. La presenza di una proteina che lega cAMP aumenta ancora di pi la trascrizione dell'operone. L 'arabinosio un regolatore positivo dell'operone. ____________________________________

I procarioti hanno la necessit di attivare e disattivare in tempi brevi i geni , poich per sopravvivere devono rispondere prontamente alle variazioni dellambiente che li circonda. Gli RNA -messaggeri dei procarioti sono altamente instabili e si degradano in brevissimo tempo, per questo ancora pi importante regolare velocemente la trascrizione, in modo che gli RNA-messaggeri vengano immediatamente prodotti quando la situazione ambientale richiede la proteina per cui codificano. Concetto di Operone : insieme di geni strutturali che codificano per prodotti molecolari metabolicamente correlati, che vengono co-trascritti in un unico RNA- messaggero , e la cui trascrizione regolata dagli stessi elementi di regolazione. Concetto di Promotore forte : Promotore dotato di elevata affinit per l'enzima RNA polimerasi che controlla geni che vengono quindi trascritti in numerose copie. Insomma , lRNA Polimerasi si lega pi frequentemente nellunit di tempo a questo tipo di promotore. Tale affinit indicata da una costante di stabilit Ks . Possiamo intervenire per aumentare o diminuire tale stabilit utilizzando dei segnali che legano proteine specifiche, le quali poi andranno a legarsi al complesso Promotore- RNA Polimerasi diminuendone o aumentandone la stabilit. Risparmio in termini energetici : Considerando un meccanismo catabolico, degradativo, se non c il substrato di quel catabolismo non solo la cellula non fa funzionare gli enzimi coinvolti nella via catabolica, ma non fa nemmeno partire la trascrizione dei geni che codificano per tali enzimi. Considerando un meccanismo anabolico, biosintetico, se c molto prodotto finale della stessa via anabolica non ne produce altro e, in pi, non fa partire la trascrizione dei geni che codificano per gli enzimi della via anabolica stessa.

Operone del lattosio: Abbiamo visto che loperone del lattosio e costituito da tre geni strutturali che codificano per tre proteine coinvolte nel metabolismo del lattosio; un enzima la -galattosidasi, un trasportatore la Permeasi e una Acetilasi . Il lattosio un disaccaride formato da glucosio e galattosio. Loperone lac sotto il controllo di un promotore e vari elementi di regolazione.

C anche un gene ( che non deve stare necessariamente vicino alloperone poich funziona grazie ad un prodotto solubile che lo trova ovunque sia ) che codifica per una proteina regolatrice che ha la propriet di esistere in due conformazioni caratterizzate da competenze biologiche diverse: Una lega l Operatore ( Conformazione 1 ) Una non lega l Operatore ( Conformazione 2 ) ma unaltra molecola che il substrato di quella via catabolica, in questo caso il lattosio.

Se la conformazione pi stabile quella che lega loperatore, quando la proteina sintetizzata la maggior parte della proteina tender a stare nella conformazione ( Conformazione 1 ) che lega loperatore e va a legare l Operatore. Se la concentrazione di tale proteina discreta, loperatore passa molto tempo legato e ci significa che il promotore non disponibile per la trascrizione e il gene non viene trascritto o trascritto a livelli molto bassi. In presenza di lattosio, il lattosio si lega alla proteina in Conformazione 2; lequilibrio tra le due conformazioni si sposta verso la Conformazione 2 e ci comporta che la concentrazione di proteina con Conformazione 1 diminuisce , cos che loperatore sar per un certo periodo disponibile per la trascrizione. Man mano il lattosio lega quasi tutta la proteina con Conformazione 2 e loperatore cos sar sempre libero e la trascrizione dei geni procede . In questo modo stato derepresso un operone la cui espressione normalmente repressa. Insomma, la presenza del lattosio ( che il substrato della via catabolica ) de-reprime loperone lac , che normalmente represso e permette al processo catabolico di iniziare. Operone dell Arabinosio Segue la regolazione tipica dei cataboliti. Se c glucosio, larabinosio non viene consumato Se non c glucosio, larabinosio viene consumato e si esprimono i geni.

Tale regolazione necessita di una proteina regolatrice ( Ara C ), codificata dal gene ara C . Il promotore del gene ara C deve avere delle particolari caratteristiche: costitutivo ( ossia non regolato ) debole

Differenze tra loperone ara e loperone lac : 1) La molecola Ara C esiste in due conformazioni con competenze biologiche diverse e pu fungere sia da attivatore che da repressore. 2) Il gene ara C deve essere posizionato vicino poich sotto il controllo di un operone regolato. 3) La proteina Ara C regola a distanza il funzionamento dell operone attraverso un ripiegamento del DNA. Regolazione generale dell operone ara. Loperone arabinosio (ara), studiato in E. coli, unico, in quanto la stessa proteina regolatrice capace di esercitare un controllo positivo e negativo, e come risultato pu indurre o reprimere lespressione genica. Loperone composto da tre geni strutturali, ara B, A e D ( chiamati anche geni Ara BAD ) che codificano per tre enzimi necessari alla catabolizzazione dellarabibosio in xilulosio 5- fosfato. A monte di AraBad 8

presente il promotore P-BAD. La loro trascrizione controllata dalla proteina regolatrice AraC, codificata dal gene araC, che interagisce con due regioni regolatrici, ara I e araO2.

O2 --- Ara C --- P-C + O1 --- CRP --- Ara I --- P-BAD ------------------ AraB AraA AraD

Loperone regolato dal prodotto del gene ara C chiamato proteina Ara C. Questa proteina , che viene trascritta a partire dal promotore P-C , svolge 2 funzioni: 1) regola la propria sintesi, legandosi al sito operatore ara O1 situato nel promotore Pc , quando la sua concentrazione nella cellula aumenta, reprimendo in tal modo la trascrizione del gene Ara C 2) agisce da regolatore dei geni BAD sia in senso positivo che in senso negativo (comportandosi, alloccorrenza, da attivatore o da inibitore della trascrizione).

Regolazione Negativa: In assenza sia di arabinosio sia di cAMP (Adenosina monofosfato ciclico ) , dei dimeri di proteina AraC si legano in maniera coordinata al sito Ara I e al sito O2. Quando sia I e sia O2 sono legati da AraC, si verifica un cambiamento conformazionale nel DNA, grazie al quale si forma uno stretto anello che provoca la repressione, inibendo laccesso dell RNA polimerasi alla regione del promotore. In tal modo, non vengono prodotti inutilmente gli enzimi necessari alla catabolizzazione dell arabinosio che non presente. Regolazione Positiva : In presenza di arabinosio e cAMP L arabinosio si legher alla proteina Ara C e la cAMP al sito CRP ( Regione di Controllo del Promotore) . La conformazione di AraC cambia a causa dellarabinosio e , come risultato di queste modificazioni, AraC arabinosio viene richiamata sul sito AraI e vi si legano .Diventano ora un attivatore della trascrizione, agendo sinergicamente al complesso CRP-cAMP per indurre la trascrizione dei geni Ara BAD. Si producono cos gli enzimi necessari a catabolizzare larabinosio presente. MODELLO di Operoni Reprimibili : l operone trp Operoni reprimibili : insieme di geni la cui espressione normalmente funzionante, ma che vengono repressi con la presenza di particolari sostanze chiamate co-repressori. Ad esempio, il triptofano reprime il gene trp delloperone del triptofano. Il co-repressore in genere il prodotto della via metabolica. 9

Operone trp : come fatto

------------------ P O L E D C B A

R : gene regolatore E, D, C, B, A : 5 Geni strutturali che codificano per 5 proteine O : gene Operatore P, O, L, E, D, C, B, A : operone trp L : regione leader Il gene regolatore R codifica per una proteina che un repressore inattivo che ha due conformazioni differentemente stabili : Conformazione 1 : lega l Operatore. Conformazione meno stabile e presente in minor concentrazione. Conformazione 2 : non lega l Operatore. Questa conformazione la pi stabile e presente in pi alta concentrazione.

La presenza del triptofano ( il co-repressore ) cambia lequilibrio : si lega al repressore inattivo in Conformazione 1 , spostando lequilibrio verso questa conformazione che lega loperatore . Ora il numero di repressori in Conformazione 1 diventa molto maggiore di quello in Conformazione 2 e si attacca alloperatore e lo reprime. Quindi non si trascrive nessun mRNA del triptofano.

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Analisi del gene leader L delloperone trp L una sequenza ORF ( Open Reading Frame ) di DNA con le seguenti caratteristiche : 1) Divisa in quattro zone ( zona 1- 2- 3- 4 ) che quando trascritte sono a 2 a 2 complementari, ossia il trascritto di questo gene pu ripiegarsi a formare una forcina ( simile a quella dei terminatori ). 2) A cavallo della zona 1 , la sequenza di DNA una fase aperta di lettura potenzialmente traducibile ( ci significa che un susseguirsi ininterrotto di triplette di senso , ossia senza triplette di stop, che traducibile se sono presenti i segnali di inizio traduzione, ossia una tripletta di inizio correttamente spaziata da una sequenza Shine - Dalgarno , e una tripletta di fine traduzione ) 3) In questa fase aperta di lettura sono iper-rappresentati i 2 codoni che codificano per lamminoacido che il prodotto finale della via metabolica ( in questo caso il trp ) 4) A valle del quarto elemento c una sequenza di T ( che trascritta diventa una poli U )

Regolazione dell operone del trp : In presenza di abbastanza triptofano - La RNA polimerasi si lega all operone e inizia a trascrivere la regione leader L. - La RNA polimerasi trascrive un mRNA abbastanza lungo da permettere lattacco del ribosoma. - Il ribosoma inizia la traduzione della zona 1 della ORF ( fase aperta di lettura ) . Traduce a velocit normale se ci sono in soluzione abbastanza trp-tRNA - Il ribosoma arriva alla zona 2 e inizia a tradurla. Intanto la RNA polimerasi ha trascritto la zona 3 che , non trovando disponibile ad appaiarsi la zona 2 che in quel momento coperta dal ribosoma, si lega alla zona 4 appena trascritta. La forcina formata da 3 e 4 abortisce la trascrizione. In presenza di poco triptofano Il ribosoma staziona pi tempo sulla zona 1 ( poich sono disponibili pochi trp- tRNA ). Intanto le zone 2 e 3 vengono trascritte dalla RNA Polimerasi e si appaiano , dato che 2 non coperto dal ribosoma, formando una forcina 2-3 che non abortiva. La zona 4 viene trascritta ma non pu appaiarsi alla 3 , che si gi appaiata alla 2. La trascrizione continua normalmente e alla fine della via metabolica si sintetizza il triptofano.

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Linfezione da parte del fago delle cellule di E.coli si pu propagare in due modi alternativi: litico o lisogeno .

La crescita litica implica la replicazione del DNA fagico e lespressione delle sue proteine che porta alla formazione di molte particelle fagiche e alla lisi cellulare. La crescita lisogena comporta lintegrazione del genoma fagico (profago) nel cromosoma batterico. Fago un batteriofago dotato di un filamento di DNA lineare lungo circa 45.000 coppie di basi, dotato di estremit coesive , ossia estremit sporgenti complementari che permettono la circolarizzazione dopo linfezione in E.Coli . Tale circolarizzazione avviene grazie ad una DNA- Ligasi che salda la parte a singolo filamento delle due estremit con dei legami fosfodiestere. Sul DNA del fago lambda sono presenti anche dei segnali che fanno partire la trascrizione. La trascrizione dei geni di fatta dalle RNA-polimerasi 70 di Coli ( che sono le RNA polimerasi pi abbondanti di Coli , la cui parte sigma la sigma 70 ). Il genoma del fago ( 50 geni ) contiene una regione di controllo critica nella quale sono presenti due geni (cI e cro) e tre promotori PL, PRM e PR. PL e PR sono promotori forti che regolano la sintesi di tutti i geni del fago o direttamente o attraverso i loro prodotti. PRM ( Promoter for repressor maintenance ) un promotore debole che trascrive solo il gene cI e richiede un attivatore.

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Che vantaggio ricavano le cellule ospiti dallinfezione? L acquisizione di informazione genetica a vantaggio della specie. Infatti, il virus alla fine del ciclo litico pu casualmente inglobare parte del genoma dellospite e lo porta al genoma della cellula che infetter dopo.

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Da PL la trascrizione termina su TL1 che un terminatore forte ( infatti un terminatore Rho indipendente che forma una forcina molto stabile. Un terminatore debole invece fa una forcina meno stabile, la quale non interrompe tutte le trascrizioni che lo attraversano ). Da PR la trascrizione incontra TR1 che un terminatore debole; le trascrizioni che superano TR1 arrivano al terminatore successivo TR2 , che essendo forte blocca tutte le trascrizioni che non si erano fermate a TR1. Da PRI le trascrizioni si fermano su T6S che un terminatore forte che ferma tutte le trascrizioni sempre. La trascrizione da PRI a T6S produce un 6S- RNA.

PL induce la trascrizione del gene N, da cui si produce la proteina N. PR induce la trascrizione del gene Cro , da cui si produce la proteina Cro ( la concentrazione di Cro aumenta molto lentamente rispetto a quella di N, che invece aumenta velocemente ) N una proteina anti-terminatore , ossia si lega al complesso di trascrizione ed altera la capacit di riconoscere i terminatori ( impedendo la formazione della forcina terminatrice ). N funziona su TL1 , TR1 , TR2 ma non su T6S , per cui le trascrizioni che partono da PL e PR continuano quando N legato ai terminatori.

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Dopo che la concentrazione della proteina N aumentata , comincia ad aumentare anche la concentrazione di Cro e inizia la produzione di tre altre proteine : C3 , C2 e Q . C3 , Cro e C2 sono proteine regolatorie . Q invece una proteina anti-terminatore che silenzia il terminatote T6S , il quale quando silenziato non fa pi terminare la trascrizione che parte da PRI , e cos i geni strutturali del corpo del fago che si trovano dopo T6S vengono trascritti per essere usati nel ciclo litico. Cro: Proteina regolativa che lega il DNA su particolari sequenze specifiche chiamate determinanti , determinando cos la modifica del funzionamento del promotore. Definiz. Di OPERATORE : segmento di DNA che un insieme di determinanti molecolari a cui si legano proteine specifiche , regolando lattivit dei geni. OL1 , OL2 , OL3 OR1 , OR2 , OR3 Questi sono gli operatori che si trovano a monte dei promotori PL e PR .

Ciclo litico : Cro si lega agli operatori ma con diverse costanti di affinit , per cui si lega pi velocemente alloperatore con cui ha costante di affinit pi alta. Cro silenzia il gene C1 ( cos non si produce la proteina C1 che sua antagonista ) e intanto la proteina Q silenzia T6S Ciclo litico e lisi cellulare.

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A monte di PRE ( un promotore attualmente silente ) , le proteine C2 e C3 formano tra loro un complesso che lega il DNA e attivano il promotore PRE . Ora da PRE parte la trascrizione del gene C1 e cos aumenta la concentrazione della proteina C1 per la quale il gene codifica. C1 e Cro sono due inibitori di trascrizione competitivi poich anche C1 si lega agli stessi operatori di Cro ma con affinit inversa. Cro lega, in ordine di affinit, OR3, OR2 e OR1. C1 lega, in ordine di affinit, OR1, OR2 e OR3. Se prevale C1 Rimane in Lisogenia il virus resta silente Se prevale Cro Parte il Ciclo litico si esprimono i geni tardivi per il ciclo litico. Quando prevale C1 , C1 satura tutti i siti PL e PR ( bloccando lulteriore produzione di proteina Cro ) . C1 lega OR1 , OR2 , OR3 attivando cos la trascrizione dal promotore PRM ( Promotore per il Mantenimento del Repressore ) che prima era inattiva . Da PRM si producono nuove proteine C1 e la loro [ ] aumenta.

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Il fago rimane in fase lisogena se predomina la proteina C1 , mentre si avvia nella fase litica se predomina Cro. Fase litica e lisogena si autoescludono attraverso le seguenti condizioni: -in assenza di C1, il gene Cro pu essere trascritto; -in presenza di C1, solo il gene C1 pu essere trascritto; -ad alte concentrazioni di C1, inibita la trascrizione di entrambi i geni. C1 una proteina dimerica , e solo come dimero C1 lega il DNA.

La sua parte N-terminale responsabile del legame al DNA, mentre la sua pare C-terminale responsabile della dimerizzazione di C1. C1 anche un sensore del livello metabolico della cellula. Se C1 viene idrolizzata dalle proteasi che la cellula ospite produce in risposta allinfezione, significa che la cellula in salute e abbondante di proteasi; prevale Cro e si esprimono i geni tardivi per la produzione di nuovi virus con il ciclo litico . Se C1 non viene idrolizzata, la sua concentrazione aumenta e Cro non viene pi prodotta, cos C1 prevale e sia avvia la lisogenia, in quanto la cellula ospite sembra carente di proteasi e nutrienti , due fattori che non comprometterebbero il ciclo litico.

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Il DNA del fago lambda lineare e a doppia elica, ma circolarizza quando entra nella cellula ospite grazie alla DNA ligasi. Esso contiene delle sequenze che sono riconosciute dalla Rna polimerasi della cellula ospite e si ha inizio alla trascrizione delle prime proteine virali. Tali proteine sono regolate da promotori: -PL1 avente un terminatore forte TL1(permette unottima trascrizione del gene) che codifica per una proteina N; -PR avente un terminatore debole TR1 ( una sequenza di DNA che porta alla formazione di una forcina meno stabile, a causa della presenza di pochi legami, non promuovendo sempre la fine della trascrizione quindi molto spesso la trascrizione che parte da PR non termina, ma continua fino al terminatore TR2) che codifica cro. -PR ha un terminatore forte T6s codifica per 6s RNA La proteina N un anti-terminatore cio si lega a una sequenza specifica del RNA impedendo la formazione della forcina che provoca la fine della trascrizione. La cro una proteina regolatrice cio una proteina, che si lega a una sequenza specifica del DNA in modo da favorire l'attivazione di geni silenti. La concentrazione di N aumenta in modo esponenziale mentre cro con una velocit minore. La proteina N si lega su TL1, TR1 e TR2 in modo che le trascrizioni che partono da PL non si fermano pi al suo terminatore ma continua, in modo da codificare i geni della proteina C3, mentre la trascrizione che parte da PR continua cos che si ha la trascrizione anche di C2 e Q. Queste proteine sono trascritte sempre quando lambda infetta E. Coli indipendentemente del tipo di ciclo vitale che esso svolger. Intanto aumenta cro che riconosce gli operatori a monte del promotore PL1 cio OL1, OL2 e OL3 e gli operatori a monte del promotore PR: OR1, OR2 e OR3. La cro lega questi operatori con affinit crescente quindi lega prima loperatore pi lontano(OR3) e man mano che aumenta la sua concentrazione andr a saturare i restanti operatori. Oltre alla proteina cro aumentano anche la concentrazione di C3 e C2(proteine regolatrici) che si uniscono per formare un complesso che promuove lattivazione di promotori silenti.I siti di legame di tale complesso sono gli operatori a monte di PRE e di Pint(terminatore Tint) in modo da interagire con la RNA polimerasi, che si stabilizza dando inizio alla trascrizione. PRE porta alla codifica C1, cio una proteina regolatrice che si lega agli stessi operatori che si lega cro con affinit crescente ma inversa, mentre da Pint una proteina che funge da integrasi, cio catalizza lintegrazione del Dna di Lambda nel genoma della cellula ospite.La produzione di C1 provoca il silenziamento di PL1, cio linibizione della trascrizione di N, e interferisce agendo da repressore forte con la trascrizione di cro quando si lega sugli operatori a monte di PR, quindi la concentrazione di quest'ultima aumenta pi lentamente rispetto a prima ma non repressa immediatamente. Oltre a queste funzioni C1 promuove anche la sua stessa trascrizione.

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C1 non funziona se non si trova sottoforma di dimero costituito essenzialmente da due domini strutturali: Uno permette di legare il Dna in sequenze aspecifiche;

Laltro permette la dimerizzazione di molecole di C1 portando alla formazione di un complesso pi stabile. Questi due domini sono tenuti insieme da una catena polipeptidica non strutturata (flessibile) che rende C1 pi sensibile alle proteasi (che ne provocano lidrolisi). Quindi se ci sono molte proteasi le proteine C1 nonostante siano prodotte, i domini strutturali vengono idrolizzati impendendo il legame con il DNA. Questo controllo serve al virus per misurare il livello metabolico della cellula ospite, se elevato, fa si che le proteine di C1 siano idrolizzate e abbiamo la prevalenza di CRO se basso, abbiamo linverso. Nel primo caso abbiamo la saturazione degli operatori (OL1, OL2,OL3,OR1,OR2,OR3)da parte di cro in modo da reprimere la trascrizione di PL e PR. Nello stesso tempo aumenta anche la concentrazione di Q che ha il ruolo di anti-terminatore specifico per T6S in modo che le trascrizioni che partivano da PR continuino oltre a tale terminatore per far trascrivere i geni strutturali del virus cio quelli che codificano per le proteine della capsula ecc. Con la prevalenza di CRO il virus attiva il ciclo litico. Allinterno del gene Q presente un altro promotore PAQ( un promotore debole), attivato dal complesso C2-C3, la cui trascrizione prosegue a sinistra portando alla formazione di un trascritto anti-senso contenente sequenze complementari al RNAm che codifica per Q quindi i due trascritti si ibridano formando una struttura a doppia elica che non viene tradotta dal ribosoma, in quanto non riconosce tale struttura. In questo modo permette il graduale aumento di Q in modo che se si ha un improvviso aumento di C1 il sistema disattiva il ciclo litico per attivare quello litogenico. Si innesca il ciclo litogenico quando invece abbiamo la prevalenza di C1 questultimo tender a legarsi per prima con gli operatori con maggiore affinit cio con OR1 e OR2 in modo da determinare lattivazione di PRM, blocca la trascrizione del promotore PR, PR e PL1 e promuove solo la sua trascrizione. A questo punto si inibiscono anche i promotori PRE e INT a causa del turnover delle proteine C2 e C3 che non vengono pi sintetizzate. Intanto C1 aumenta di concentrazione fino ad arrivare a una certa soglia che gli permette di occupare anche loperatore OR3 bloccando il promotore PRM(codifica sempre per la proteina C1). Questo sistema regola la concentrazione di C1 in modo da rimanere a ql soglia xk se va al di sotto di qst sblocca OR3 si attiva PR1 e riparte la trascrizione di C1 se la supera blocca completamente OR3 e quindi nn si ha pi la trascrizione di se stesso. Quindi per riportare allattivazione completa di PR ci deve essere un segnale esterno che fa si che C1 si stacchi da OR1, OR2 e OR3. Quindi ricapitolando la scelta dei due tipi di cicli virali dipende essenzialmente dallequilibrio che si crea tra C1 e CRO. Lisi: Allinizio le basse concentrazioni di CRO fa si che questultima si lega alloperatone OR3 in modo da spegnere il promotore PRM quindi inibisce la sintesi di C1; Ad alte concentrazioni CRO si lega anche a OR1, OR3, OL1 ecc.. e spegne anche i promotori PR e PL; Aumenta Q e CRO attiva PR ,presente a valle di T6s , codificante per i geni della struttura del virus.

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Nel ciclo litogenico invece si ha il crollo di CRO e laumento di C1 che va a silenziare PR, PL e Pr ma porta allattivazione di PRM. In condizioni ambientali normali C1 prevale su CRO perch prodotto pi velocemente grazie allattivazione di PRE da parte di C2 e C3 nonostante CRO abbia bloccato PRM. Man mano che C1 aumenta di concentrazione andr a legare OR3 al posto di CRO in modo da attivare la sua trascrizione tramite PRM. C1 ha anche la funzione di inibire Pint, le ultime proteine int prodotte permettono lintegrazione del genoma virale allinterno di ql della cellula procariote. Per cambiamenti dellambiente pu provocare limprovviso calo di C1 e laumento di CRO indirizzando la cellula verso il ciclo litico. Come abbiamo visto Lambda racchiude tutti i diversi meccanismi che possono regolare i geni delle cellule procariotiche solo che in questo caso regolano lintero genoma. Cascata dei fattori sigma Ci sono alcuni virus, come SPO1, che svolgono solo il ciclo litico quindi hanno bisogno di meccanismi che regolano i loro geni. Perch se non ci fosse questo sistema dopo linfezione virale si produce subito il lisozima, un enzima, che va a idrolizzare i legami della parete cellulare portando lospite alla lisi cellulare quindi il virus non si pu pi riprodurre. Il meccanismo che adotta questo virus quello di avere degli operatori che vengono regolati da promotori diversi che necessitano di fattori sigma differenti per potersi esprimere. Il primo promotore della catena riconosciuto dalla RNA polimerasi della cellula ospite e porta alla trascrizione di una proteina con una subunit sigma che promuove lespressione del secondo promotore della cascata e cos via. Se non presente la seconda subunit, il secondo promotore non viene trascritto perch non riconosciuto dalla prima subunit del primo promotore quindi si blocca la cascata di regolazione. La terza subunit trascritta pi lentamente.

Le proteine regolatrici : Sono proteine capaci di legare il DNA in modo sequenza aspecifico ( ossia hanno una conformazione tale che si pu adattare alla conformazione della doppia elica ansa grande-ansa piccola ) . Un gruppo/classe di proteine regolatrici quello con la conformazione elica- gomito- elica . Laltra classe contiene quelle con la struttura a cerniera di leucina , ossia con due eliche anfipatiche ( ossia eliche che espongono su uno dei due lati amminoacidi con lo stesso carattere ) le cui facce idrofobiche interagiscono e dispongono queste eliche nella tipica posizione. Un terzo tipo di classe prot. regolatrice quello a dita di zinco , con un loop in cui ci sono conservati degli aa che coordinano uno ione zinco al centro . In genere il segnale di riconoscimento di tali proteine sul DNA una sequenza palindromica . Infatti non vero che il DNA espone solo verso linterno le basi pirimidiniche e puriniche, ma ce ne sono anche alcune che sporgono verso lesterno fungendo da segnali di riconoscimento per le proteine regolatrici. Come e dove inizia la duplicazione del DNA in Coli ? ( ripetizione ) Su oriC , che un determinante molecolare che indica che quello il sito di origine della duplicazione . Che propriet ha oriC ? Una sequenza di 9 coppie di basi che ripetuta 4 volte , poi una sequenza di 13 coppie di basi ripetuta 3 volte . 20

Poi c la proteina Dna-A che quando lega ATP si stabilizza in una conformazione che lega una sequenza di 9 coppie di basi e cos ripiega il DNA inserendo un superavvolgimento , a cui la topologia del DNA rimedia denaturando il DNA sulla sequenza di 13 coppie di basi ( particolarmente ricche di legami A=T che sono pi facilmente denaturabili ) , cos si forma la prima bolla di replicazione. Gli eucarioti hanno problemi di regolazione diversi da quelli dei procarioti. Devono regolare lespressione dei loro geni in funzione della scelta di sviluppo che ogni singola cellula ha e che dovuta a tutta una serie di segnali chimici e fisici. Ossia, se da una stessa cellula si originano otto nuove cellule con lo stesso materiale genetico, tali cellule devono poter esprimere pannelli diversi di segnali. Ossia fare la scelta durante lo sviluppo di differenziarsi. Come possibile ? Lespressione di un gene degli eucarioti non solo funzione della struttura del promotore e della polimerasi che si lega , ma anche funzione della formazione di complessi DNA-proteine che sono in grado di reclutare la polimerasi. Supponiamo che quando la cellula 1 si divide , in una delle 2 cellule nuove viene espresso un fattore di trascrizione 1 non espresso nellaltra , per cui queste due cellule esprimono pacchetti di geni differenti grazie a differenti tipi di fattori . Tale differenziazione non determinata dallambiente, in quanto le cellule si trovano nello stesso ambiente. Quando queste due cellule si duplicano , le 4 nascenti hanno lo stesso materiale genetico e sono sempre nello stesso ambiente , ma anche loro esprimono 4 pannelli diversi di geni grazie a diversi tipi di fattori . Lespressione di un gene in eucarioti avviene grazie a molteplici fattori . Se a monte di un gene X ci sono 3 elementi A, B, C che legano 3 fattori necessari alla trascrizione , per esprimere X servono obbligatoriamente questi 3 fattori. Ma perch in una cellula si esprimono ( per un evento temporalmente limitato ) geni che in altre cellule non si esprimono e la cui espressione viene poi trasmessa alla progenie? C un segnale transitorio che determina quello che deve succedere. Una cellula uovo una cellula con un sacco di citoplasma, e proprio il citoplasma determina quello che deve succedere. Per cui ad un certo punto dopo la fecondazione della cellula uovo, si presentano gradienti chimici e fisici che determinano che un gene venga attivato. Lespressione di tale gene sotto il controllo della stessa proteina ( che chiameremo proteina A ) per cui codifica. Quindi : il gene viene attivato , esprime A e A si lega al promotore del gene stesso facendo in modo che la produzione di A continui. Ovviamente , tale proteina A rimane nel citoplasma della cellula e quindi , dopo la sua duplicazione , le cellule figlie avranno nel loro citoplasma la proteina A . Ma negli eucarioti non c solo questo differenziamento; c anche il programma di espressione regolato durante lo sviluppo.

Rileviamo diversi meccanismi e livelli di regolazione di espressione genica negli eucarioti : Condensazione : Nel materiale genetico si rilevano due tipi di cromatina: l'EUCROMATINA e l'ETEROCROMATINA. Leucromatina a differenza dell'eterocromatina, contiene una quantit maggiore di proteine non istoniche ed costituita da DNA scarsamente ripetitivo ed attivamente trascritto. Leterocromatina rappresenta il materiale cromosomico densamente impacchettato composto prevalentemente di sequenze ripetitive, che rimane condensato durante lintero ciclo cellulare . Soltanto un DNA che pu andare in conformazione a filo di perle pu essere trascritto. Amplificazione genica : ci sono momenti nella vita della cellula in cui a causa dello sviluppo a cui programmata necessario che si abbia una forte amplificazione di certi geni , poich necessario in gran 21

quantit il prodotto codificato da quei geni. Ad esempio , durante la duplicazione cellulare servono un gran numero di proteine e quindi di ribosomi , per cui si amplificano i geni deputati alla produzione delle sub unit ribosomiali. Metilazione del DNA : l'addizione di un gruppo metile sul DNA. associata allinattivazione genica , infatti i geni iper- metilati sono ipo- espressi . Il meccanismo della metilazione ereditario. Come funziona? La metilazione del DNA recluta degli enzimi che modificano la natura chimica degli istoni , rendendo la cromatina pi densa ( e quindi inattiva ) . Riarrangiamento Genico : con il termine riarrangiamento in biologia si intende uno spostamento fisico di sequenze del genoma, le quali formano nuove combinazioni dette ricombinazioni; quando tali ricombinazioni interessano i cromosomi si parla di riarrangiamento cromosomico e quando tali ricombinazioni interessano i geni prendono il nome di riarrangiamento genetico . Infatti, esistono parti di DNA movibili chiamate trasposoni . I trasposoni sono elementi genetici presenti nei genomi di procarioti ed eucarioti, capaci di spostarsi da una posizione all'altra del genoma. Questo processo di trasferimento noto come trasposizione e richiede la presenza di siti per la ricombinazione del DNA, posti sia sul trasposone che sul cromosoma bersaglio, e l'azione di specifici enzimi, detti trasposasi. In seguito alla trasposizione si pu avere l'inattivazione funzionale di un gene, nel caso in cui il trasposone si inserisca in questo gene, o la modificazione dei livelli di espressione di un gene, nel caso in cui il trasposone si inserisca nel promotore del gene. Variet Anticorpale : Un anticorpo (pi propriamente immunoglobulina) una proteina con una peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a "Y". Gli anticorpi hanno la funzione, nell'ambito del sistema immunitario di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri chiamati antigeni . I geni che codificano per le immunoglobuline: tratti di DNA che codificano per differenti e combinabili pezzi che possono dar luogo a combinazioni diverse ( da qui nasce la variet anticorpale ) , cos si producono tutti i tipi di anticorpi. Nel corpo si producono tutti i tipi di anticorpi, ma se essi non incontrano lantigene non si stabilizzano e non si duplicano e vengono smaltiti , in quanto inutili . ________________________________________

Nei procarioti , linterazione tra DNA e RNA polimerasi diretta . Il controllo della trascrizione consiste nel controllare la capacit della RNA polimerasi di legarsi al promotore , diminuendo laffinit o addirittura bloccando la possibilit di fare linterazione o aumentando laffinit ( aumentando la costante di stabilit ) Infatti , la forza di un promotore la si pu sapere misurando la costante di stabilit del complesso RNA Polim DNA . La costante di stabilit da una misura della frequenza con cui avviene linterazione . Negli eucarioti il processo diverso , infatti ci sono delle differenze tra la trascrizione in eucarioti e in procarioti . La differenza fondamentale che la RNA Polimerasi non lega il DNA , infatti il determinante sul DNA da solo non sufficiente a far stabilizzare e avvenire la formazione del complesso di inizio trascrizione. Perch ci avvenga , c bisogno che si formi un complesso DNA Proteine , e questo complesso quello che poi recluta l RNA Polimerasi .

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Come sono fatti i promotori degli eucarioti ? I promotori degli eucarioti hanno molti segnali . Tali segnali possono essere raggruppati in due categorie : Segnali PROSSIMALI : che sono riconosciuti e legati dai fattori di trascrizione basali , che sono i segnali necessari ma non sufficienti per garantire unefficace trascrizione Segnali DISTALI : che attraverso la mediazione di fattori , proteine e attivatori , determinano la formazione del complesso. Negli eucarioti , tale differenza strutturale nasce dalla diversa esigenza del promotore . Negli eucarioti esiste un processo che il DIFFERENZIAMENTO , cio da una singola cellula ( un uovo fecondato ) si possono generare organismi ,che sono insiemi di cellule . Gruppi di queste cellule hanno assunto la capacit di esprimere solo un pacchetto di informazioni , ma il 99% di queste cellule non ha perso nulla del patrimonio genetico anche se lo esprimono in parte . Se il meccanismo di trascrizione avvenisse come quello dei procarioti , sarebbe difficile spiegarci come fa una cellula, per esempio ,del tessuto epiteliale a esprimere geni non altri , dovrebbero essere repressi tutti quanti gli altri . Il meccanismo che funziona negli eucarioti che sono espressi nei tipi di cellule che hanno optato per una scelta soltanto una classe o un raggruppamento di proteine ( che sono fattori di trascrizione ) che determinano lespressione di quei geni , e non di altri . Quindi il primo problema che ci poniamo non come si muova la risposta in funzione dei cambiamenti ambientali ( era il problema dei procarioti ) , ma piuttosto come avviene questo meccanismo di differenziamento . Tale differenziamento una non- attivazione di alcune classi di geni , e attivazione di altre classi di geni . I processi per lespressione dellinformazione genetica sono pi complessi negli eucarioti , perch non basta che si inizi la trascrizione di un gene che codifica per una funzione perch questa funzione avvenga ,infatti il trascritto generalmente non porta linformazione o non la porta in modo funzionale e perch questo avvenga ( ossia che diventi un trascritto che porti informazione funzionale ) deve avvenire un processo di maturazione del trascritto primario . Nel nucleo infatti avvengono i processi di Capping , Terminazione e Splicing per dare vita a un RNA Messaggero che poi deve essere portato fuori del nucleo , dove poi svolge la sua funzione . Anche lorganizzazione dei promotori degli eucarioti diversa da quella dei procarioti , perch i segnali responsabili della promozione della regolazione nei procarioti sono tutti posizionati a monte del primo nucleotide trascritto , e sono tutti posizionati in prossimit del sito di inizio trascrizione . Negli eucarioti invece , i segnali che modulano la trascrizione negli eucarioti sono pi complessi e divisi tra Distali e Prossimali ( vedi sopra ) . I promotori sono vettoriali sia in eucarioti che in procarioti , ma i segnali specialmente quelli distali della trascrizione nei promotori di eucarioti non hanno necessit di essere orientati , ma funzionano in qualsiasi orientazione proprio per quello che il meccanismo di funzionamento : devono essere legati dalla proteina, devono formare una struttura di ripiegamento( in genere del DNA ) che stabilizza il complesso , quindi non importa in che orientazione sia . Gli operatori funzionano indipendentemente dallorientazione .

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Appendice . I promotori degli eucarioti si dividono in tre classi : Classe 1 : promotori si trovano allinterno delle sequenze codificanti , non a monte n a valle . Classe 2 : regola la trascrizione dei geni che codificano per i precursori di RNA messaggeri . Classe 3 : promotori si trovano allinterno delle sequenze codificanti , non a monte n a valle .

Unaltra peculiarit degli eucarioti che spesso anche i segnali basali sono posizionati allinterno e non allesterno del trascritto . Questo un inconveniente , perch c un tratto di DNA che svolge due funzioni : codifica per il messaggio e porta lRNA polimerasi sul promotore . Quindi qualsiasi mutazione cambia due fenotipi . Quindi la probabilit che una mutazione sia dannosa pi bassa . Perch non accade che i segnali basali non siano allinterno dei geni di classe 2 ? perch imporrebbe limiti alle sequenze codificanti . Perch un limite determinato dal fatto che quella struttura tale perch deve legare il fattore di trascrizione , quindi non sarebbero accessibili tutte le sequenze e quindi tutte le possibili varianti del trascritto . Comunque , anche nei geni di classe due i segnali distali possono essere posizionati anche a valle della trascrizione e in genere sono molto distanti , anche migliaia di coppie di basi . I controllo della trascrizione genica negli eucarioti pu avvenire a pi livelli ( ci non accade nei procarioti ) . Il primo quando parte la trascrizione . Un altro la maturazione dell mRNA , durante lo splicing normale e alternativo . Un altro il controllo del trasporto . Un altro ancora il controllo della traduzione , e dopo la sintesi della proteina c lulteriore controllo con il folding . Poi c il processo di localizzazione delle proteine , affinch esprimano la loro funzione nel posto giusto della cellula . Il folding di una proteina un processo difficile . La struttura tridimensionale di una proteina ( quella a cui compete lattivit biologica ) non elettrostatica , ma quella fra le pi stabili e cineticamente pi accessibili . Il folding richiede la presenza di proteine che ne facilitino il processo . Il passaggio da proteina a proteina attiva determinato non solo dal folding ma anche da altri processi post-traduzionali o cotraduzionali come la glicosilazione e la formazione dei ponti disolfurici . Come possibile la differenziazione delluovo fecondato in vari tipi di cellule ? Il controllo dellinizio della trascrizione di un tipo particolare. Non c la lettura diretta del DNA , ma tale lettura mediata da proteine specifiche che permettono la formazione del complesso di inizio trascrizione . Un segnale transitorio chimico o fisico attiva la trascrizione di una proteina A , che un fattore di trascrizione indispensabile per la trascrizione di un gene che codifica per la prot A stessa . Quando il gene attivato dalla proteina A , produce nuova proteina A , e tale gene risulter attivo e sempre espresso anche nella progenie della cellula , dato che in tale progenie sar gi presente la prot A nel citoplasma necessaria al funzionamento del gene . C anche un altro elemento da considerare . La quantit di informazione in una cellula eucariota enorme. E il loro genoma altamente organizzato . La struttura trascrizionalmente attiva del genoma la collana di perle . La compattazione del DNA in strutture diverse pu rendere il DNA trascrivibile o non trascrivibile . E questo un altro meccanismo di regolazione della trascrizione .

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Il genoma presente nelle due forme di Eucromatina e Eterocromatina . Soltanto leucromatina potenzialmente trascrivibile , ossia assume la conformazione a filo di perle che ne permette laccesso. Questo e i processi di amplificazione e delezione genica sono altri modi di regolare la trascrizione . Un meccanismo di regolazione ereditario quello che riguarda le modificazioni covalenti del DNA , e una di queste modificazioni covalenti la metilazione . Nei procarioti le metilasi : -metilano il DNA endogeno e cos facendo lo proteggono dallazione di DNAsi , che vanno a tagliare solo il DNA esogeno proveniente ad esempio da virus che non metilato . -metilano il sito OriC durante la duplicazione per ritardare linizio di un secondo round di duplicazione . Anche negli eucarioti la metilazione svolge un ruolo di difesa , ma oltre a questo svolge un ruolo di regolazione genica : i geni ipermetilati sono ipo-espressi , mentre i geni ipometilati sono iper-espressi . La zona di DNA che metilata inaccessibile alle proteine responsabili della messa a disposizione del promotore dai sistemi di promozione . Un altro meccanismo che regola lespressione genica il riarrangiamento genico : sequenze di DNA si spostano da un posto allaltro nel genoma . I Trasposoni sono parti di DNA che hanno questa capacit , e sono caratterizzati da due estremit che sono segnali riconosciuti dagli enzimi trasposasi , i quali promuovono il distacco del trasposoma dal genoma. Lo spostamento del trasposoma allinterno del DNA pu avvicinare gli operatori ai promotori , oppure creare delle mutazioni se quella parte di DNA viene trascritta . La classe di geni codificante per i ribosomi molto soggetta a amplificazione .

Un anticorpo (pi propriamente immunoglobulina) una proteina con una peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a "Y". Gli anticorpi hanno la funzione, nell'ambito del sistema immunitario di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri chiamati antigeni . I geni che codificano per le immunoglobuline: tratti di DNA che codificano per differenti e combinabili pezzi che possono dar luogo a combinazioni diverse ( da qui nasce la variet anticorpale ) , cos si producono tutti i tipi di anticorpi. Nel corpo si producono tutti i tipi di anticorpi, ma se essi non incontrano lantigene non si stabilizzano e non si duplicano e vengono smaltiti , in quanto inutili .

Come funzionano le immunoglobuline ? Sono costituite da 4 catene proteiche , due pesanti e due leggere , e sono caratterizzate da una parte costante e da una parte variabile . I geni che codificano per le immunoglobuline non sono singoli , ma sono classi di geni in cui ci sono vari elementi codificanti per la parte costante , vari elementi codificanti per la parte variabile , ecc. Quello che avviene , che grazie al ri- arrangiamento genico del tutto casuale questi vari elementi si risistemano a formare un singolo gene , che poi codifica per lanticorpo . Quando stato prodotto , lanticorpo se non incontra lantigene non si stabilizza e viene degradato , e quindi non viene trasmesso alla prole . Enhancer : Gli enhancer sono sequenze segnale di DNA che svolgono il loro ruolo pro-trascrizione attraverso l'associazione con diverse proteine, tra cui diversi fattori coinvolti nell'avvio della trascrizione 25

stessa. Essi legano attivatori che aumentano la stabilit del comlesso dinizio. Gli enhancers sono sequenze nucleotidiche cis-agenti che esplicano la loro funzione aumentando notevolmente (fino a 200 volte) la frequenza di trascrizione del gene che controllano. Dal punto di vista strutturale, un enhancer non differisce molto da un promotore: entrambi contengono sequenze base e moduli regolativi che controllano la loro funzione (associandosi a proteine specifiche) , ma la differenza che la densit di tali moduli maggiore negli enhancer . Gli enhancers non devono necessariamente essere vicini ai promotori: possibile infatti trovare degli enhancer a parecchie centinaia di migliaia di paia di basi di distanza a valle o a monte del sito d'inizio della trascrizione. In alcuni casi, l'orientamento dell'enhancer pu essere invertito senza che diminuisca la loro efficacia . Gli enhancers funzionano attraverso una proteina che non importa quanto distante lega un segnale e stabilizza il complesso di inizio della trascrizione. Gli enhancers si muovono , ossia si girano in una direzione o nellaltra in modo tale da legarsi meglio con la sua proteina specifica ( si gira a seconda di dove si trova tale proteina ) . I promotori degli eucarioti posseggono oltre a enhancer , sequenze distali , ecc anche : Core

Negli eucarioti ci sono le famiglie geniche . La famiglia genica un gruppo di geni che mostrano una certa similarit di sequenza di DNA e derivano tutti da un gene ancestrale comune. L'evento biologico che sta alla base delle famiglie geniche la duplicazione genica seguita da fenomeni di divergenza. Ci sono classi di geni che si trovano in una singola cellula in migliaia di copie ( altamente rappresentate ) , altre classi che sono ripetute centinaia di volte ( mediamente rappresentate ) , ma raro che in una cellula un gene sia presente in singola copia . Vediamo i geni codificanti per gli RNA ribosomali : c un cluster genico che codifica per un precursore di 18-38 s ( uno spazio non trascritto ) e un precursore di 45 s . Questi cluster sono organizzati in pi copie . Tra procarioti e eucarioti cambia anche la dimensione delloperatore , e la quantit del segnale riconosciuto. Pi alta la concentrazione di proteina attivatrice , pi avviene la formazione di un complesso di inizio pi stabile , perch tale proteina si lega in pi siti . Abbiamo visto che i fattori di trascrizione si possono legare e provocare un rimodellamento dei nucleosomi e quindi lintervento di altre proteine . Richiamo : La TATA Box si chiama cos perch presenta coppie di basi A-T che sono pi facilmente denaturabili rispetto alle coppie C-G . Un repressore di eucarioti pu funzionare in modo : - competitivo : mascherando lattivit/ funzionalit di un attivatore ( compete con lattivatore ) - non competitivo : legando il complesso ma impedendo al complesso di andare avanti e quindi impedendo la trascrizione Nelle cellule eucariote si producono molte proteine dimeriche , che presentano diversi domini funzionali . Il guadagno energetico sta nel fatto che non si producono numerose altre proteine , ma si attivano o disattivano le diverse funzionalit dei domini del dimero : ad esempio , un dimero con due domini A e B , se 26

serve lattivit di A si disattiva quella di B e viceversa . ma possono anche funzionare entrambi , come nel caso della proteina C1 di lambda . In sintesi : il processo della trascrizione negli eucarioti complesso , non una diretta interazione tra RNAPolimerasi e DNA e quindi sia i repressori sia gli attivatori funzionano in modo diverso, ma sempre sulla base dello stesso principio : stabilizzare o interferire con la formazione del complesso con l RNA Polimerasi .

Regolazione delle cellule eucariotiche Nelle cellule eucariotiche: -hanno esigenze diverse e quindi meccanismi diversi di regolazione -hanno la membrana nucleare, quindi c la separazione fisica della trascrizione e della traduzione -non c corrispondenza lineare tra gene e il prodotto codificante funzionale, poich il suo trascritto deve subire un processo di maturazione. - comunicano tra loro sempre, per potersi organizzare per svolgere determinate funzioni, con meccanismi pi complessi rispetto a quelli usati dai procarioti Il controllo maggiore dellespressione genica nei procarioti quello che avviene allinizio della trascrizione, in questo modo riesce a controllare il funzionamento del prodotto finale di quel gene. Nelle cellule eucariotiche invece abbiamo pi meccanismi di controllo cio: -linizio della trascrizione - maturazione -export dal nucleo -traduzione -folding e localizzazione cellulare -degradazione delle proteine, che non un processo spontaneo, ma un vantaggio per modulare meglio lespressione genica. Ad esempio , se nella cellula ci sono enzimi per la degradazione del glucosio ma non c glucosio , allora creo un sistema di degradazione che le distrugge , inibendo quella funzione a facilitandone una nuova . Un altro esempio di controllo quello di rendere pi o meno accessibile un tratto di DNA, rendendo trascrivibile o meno determinati geni, sfruttando delle modificazioni sulle code degli istoni che diminuiscono o aumentano il livello di compattazione del DNA. Un altro esempio la metilazione cio una modifica covalente. Tutte queste modifiche, che caratterizzano il differenziamento cellulare, devono essere trasmesse alle cellule figlie per formarne altre differenziate.

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Trascrizione Rna polimerasi non in grado di legare direttamente il DNA quindi ha bisogno di legarsi a un complesso proteico che successivamente ha riconosciuto e legato i segnali determinanti presenti sul DNA per far avvenire la trascrizione di un determinato gene.

I geni omeo box sono una cascata di geni che codificano per fattori trascrizionali cha a loro volta, determina lattivazione dellespressione a cascata di geni. Nella cellula differenziata viene espresso solo una parte di tali geni perch hanno attivato, durante il loro ciclo di differenziamento, solo una parte dei geni omeo box. Altri meccanismi di controllo dellespressione genica sono per esempio la perdita dinformazioni genetiche, usato in pochissime cellule perch porta degli svantaggi. Lamplificazione genica basata sul meccanismo di trasposizione e amplificazione della trascrizione cio i trasposoni si amplificano aumentando le copie delle classi geniche. Le famiglie geniche sono geni la cui espressione regolata durante lo sviluppo per generare un organismo maturo. Il primo evento che deve scattare per dare origine alla trascrizione genica quello di rendere pi accessibile linformazione genetica ma non basta trasformare un tratto di DNA da forma super avvolta a filo di perle (che una struttura potenzialmente trascrivibile) , infatti, questultima deve essere modellata grazie a una proteina attivatrice, che riconosce determinati segnali, e recluta delle altre proteine che modificano le code istoniche, per esempio acetilasi, rendendo pi disponibile il tratto di DNA con la formazione del complesso dinizio. Questo livello modulato dalla trasmissione dei segnali durante la crescita oppure provenienti dalle cellule intorno ad essa. Maturazione dell RNA messaggero Sul RNA m ci sono delle modifiche co-trascrizionali ( cio modifiche che sono effettuate contemporaneamente alla trascrizione ) che portano alla formazione : -del cappuccio, cio laggiunta di 7-metil guanosina allestremit 5 del RNAm, tramite un legame insolito 55 anidridico. Questa modifica riconosciuta da una particolare proteina che promuove il legame con il ribosoma e si da inizio alla traduzione. Il cappuccio stabilizza, in pi , lRNA messaggero . -poli A -splicing Splicing : un processo che porta alla rimozione degli introni presenti sul RNAm. Per fare questo deve riconoscere un particolare nucleofilo ed elettrofilo posto uno vicino all altro. Le smurp sono le proteine dello Spliceosoma e sono costituite da proteine e piccoli RNA e formano il complesso che provoca lescissione degli introni sul RNAm. Per fare questo la smurp U1 si lega grazie

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allappaiamento tra il suo piccolo RNA con una particolare sequenza sul RNAm in prossimit dellintrone e insieme alle altre subunit rimuovono tale sequenza. Splicing alternativo Questo processo provoca la formazione di forme alternative delle proteine che svolgono la stessa funzione, nelle diverse cellule differenziali. Ci dovuto dallattivazione di differenti fattori trascrizionali che attivano geni differenti che codificano per gli RNA delle smurp. Questultime riconosceranno diverse giunture introne-esone quindi per esempio elimina un esone anzich un introne e cos via. Per esempio lamilasi nelluomo si trova in due forme alternative una presente nella saliva laltra nel fegato ma svolgono la stessa funzione perch hanno lo stesso dominio catalitico. Lamilasi salivaria deve essere solubile mentre quella del fegato deve essere legata alla membrana quindi hanno diversi domini. Lo splicing alternativo pu servire come meccanismo che indirizza o meno la trascrizione di un gruppo di geni agendo sul gene che codifica per la proteina regolatrice. Perch in presenza di determinati fattori trascrizionali abbiamo la codifica di un RNA che quando andr a formare le smurp riconoscer come introne il dominio che permette alla proteina regolatrice di essere attiva di conseguenza tale meccanismo influenzer sullattivazione o meno di particolari geni. In presenza di determinati fattori , si produce un RNA delle smurp che riconosce come introne il dominio funzionale della proteina regolatrice e questo viene rimosso, quindi tale proteina non pi capace di attivare una particolare classe di geni . Editing un processo che porta la formazione di proteine aventi la stessa funzione ma con domini strutturali diversi perch differiscono dalla mancanza di un dominio al N-terminale. Un esempio il gene che codifica per lapolipoproteina B il cui trascritto primario subisce lo splicing e poi viene tradotto in proteine oppure in un altro tipo di cellule oltre a subire lo splicing subisce un secondo meccanismo di maturazione cio lediting. Tale processo porta laggiunta nel trascritto maturato di uracile al posto di una citosina portando alla formazione di un codone di termine, quindi la traduzione finisce prima rispetto allaltro trascritto e non si ha la traduzione di un particolare dominio. Quindi lediting un processo catalizzato e specifico rispetto allo splicing alternativo. La cellula che non ha bisogno del processo Editing non ha neanche i geni che codificano per i complessi che svolgono tale operazione. Un altro meccanismo oltre allo splicing quello della scelta di diversi siti di inizio della trascrizione di uno stesso gene in cellule differenti. Il posizionamento del complesso dinizio dato dalla tatabox. Evidentemente sul gene ci sono due potenziali siti dinizio ( quindi pi siti tatabox ) e la presenza di determinati fattori di trascrizione attivano uno dei due siti. Con questo meccanismo portano la formazione di forme alternative di una proteina. Ritornando allEditing Come si inserisce una tripletta di stop allinterna dellRNAm? Questo processo effettuato da una proteina legata a un piccolo RNA detto RNA guida. La proteina riconosce e lega RNAm e inizia a percorrerlo fino a quando RNA guida non si appaia con determinata sequenza del trascritto. Questa proteina riconosce il suo substrato (un particolare RNAm) tramite i legami che si stabiliscono tra RNA guida e una specifica regione 29

presente sul RNAm. Se tali interazioni sono instabili il complesso di editing si stacca altrimenti permane sul substrato. Anche un dominio della proteina si lega al RNAm per in modo aspecifico, ma tale legame non sufficiente a stabilizzare il complesso se RNA guida non si appaia con la sequenza complementare presente sul RNAm. Una volta che i due diversi RNA si sono appaiati, vicino a una zona ricca di nucleofili e elettrofili, la parte proteica del complesso di editing fa avvenire la reazione di trans esterificazione che fa inserire un uracile in un codone gi presente sull mRNA , fino a quando non ha creato un codone di stop . In altri casi , lediting porta non alla sostituzione ma alla de-amminazione di una Citosina che diventa Uracile .

Un altro sistema quello che modula la stabilit di un trascritto. Negli eucarioti essendo che non c contemporaneit tra trascrizione e traduzione i messaggeri hanno un emivita e quindi una stabilit maggiore rispetto a quelli della cellula procariotica. La stabilit data dalla presenza del cappuccio, che non riconosciuto dalle nucleasi, e dalla coda di poli A che viene man mano degradato in un tempo tale da permettere la trascrizione del RNAm. Un esempio il recettore chiamato transferrina presente sulla membrana cellulare e si occupa dellingresso del ferro nella cellula. Pi ferro c allesterno della cellula pi ci sono tali ricettori. Laccumulo di gran quantit di ferro allesterno della cellula pu portare lossidazione delle proteine di membrana. Il destino del trascritto modulato tramite il legame tra una proteina X (detto elemento di risposta al ferro) e la sua estremit poli A (sequenza non traducibile). Questa proteina X si trova in due conformazioni presenti in equilibrio, dove quella pi stabile la forma che lega il poli A. La molecola che cambia tale equilibrio il ferro. Se c una gran quantit di ferro nella cellula, lequilibrio della proteina X allosterica si sposta verso la conformazione che non lega RNAm in modo che questultimo si destabilizza e venga degradato dalle nucleasi. In assenza di ferro lequilibrio si sposta verso laltra conformazione che si lega al RNAm in modo da stabilizzarlo. In questo modo si hanno delle maggiori trascrizioni della transferrina. ________________________________

Quali sono i processi che mantengono elevati i livelli di fedelt ossia abbassano la frequenza di errore durante la duplicazione e lespressione genica ? 1) Durante la replicazione di DNA , il processo di correzione di bozze che corregge un nucleotide inserito erroneamente grazie a delle esonucleasi . 2) Il fatto che molte triplette codificanti per lo stesso amminoacido o per amminoacidi con propriet simili differiscono tra loro solo nella terza base , e quindi un errore su questa terza base relativamente grave , infatti porterebbe a una mutazione del genotipo ma non del fenotipo . 3) Nella traduzione : il controllo che avviene nellappaiamento tra il tRNA giusto e lamminoacido giusto fondamentale. Tale controllo lo fa laminoacil tRNA sintetasi : tale enzima ha a) un sito che riconosce tutti i tipi di t-RNA ma si lega bene solo a quello con cui fa uninterazione pi duratura e b) un altro sito attivo che pu accogliere tutti gli amminoacidi ma che lega e fa reagire col tRNA solo quello giusto . 30

Le famiglie geniche sono insiemi di geni che codificano per una funzione analoga , e sono simili tra loro ma non identici . Abbiamo anche visto nella lezione precedente i vari processi di maturazione che regolano lespressione genica , tra cui quelli dello splicing alternativo , dellediting che permette la produzione di proteine con domini diversi per funzioni diverse , della scelta di siti alternativi di inizio ( che avviene all ammino terminale ) e della modulazione della stabilit dell RNAmessaggero ( esempio della transferrina ) . Poi anche il folding , che non un processo spontaneo e necessita di diverse proteine , influenza lespressione di una funzione , infatti una proteina neosintetizzata non espleta nessuna funzione , fino a quando non fa il folding e allora diventa una proteina funzionale. Il folding : un processo non spontaneo e necessita di diverse proteine , tra cui gli chaperon . I chaperon evitano lazione di proteasi e se ci sono tratti di sequenze idrofobiche che possono appaiarsi e far precipitare la proteina prima che faccia il folding , loro si attaccano in l impedendo alle parti idrofobiche di unirsi e danno il tempo alla proteina di fare il folding . Altro processo importante per il folding la formazione di ponti disolfurici ( S S ) che sono legami covalenti tra cisteine che si legano grazie allenzima disolfuro-isomerasi . Tale enzima permette ad una cisteina di sperimentare pi partner fino a trovare quello giusto con cui fare il ponte. UBIQUITINA : una piccola proteina che viene legata come etichetta alle proteine da degradare . Il fenomeno dellubiquitinazione ubiquitario . Lubiquitina si lega covalentemente tramite un legame ammidico ad un residuo di lisina durante il processo di ubiquitinazione . La formazione di tale legame richiede lattivazione di uno dei due partecipanti alla sintesi . Lattivazione avviene con consumo di energia attraverso la formazione di un tioestere , cio lubiquitina viene legata a un gruppo SH di una cisteina del primo enzima coinvolto nel processo , ossia E1 ( Enzima di Attivazione dell Ubiquitina ) . Il processo di ubiquitinazione usa tre enzimi diversi : E1 , E2 , E3 .

Protein Turnover : ci sono alcune teorie su cosa determini la stabilit di una proteina e su come la cellula decida se e quanto rapidamente farla andare a degradare. Essenzialmente le teorie sono due : N-end Rule in base al tipo di amminoacidi che ci sono allammino-terminale , lemivita della proteina maggiore o minore . PEST una proteina ricca in glutammico , serina e treonina hanno unemivita pi bassa . La scelta della degradazione dipende in parte dalla sequenza primaria della proteina e in parte dal fatto che la proteina dopo un certo periodo inizia a invecchiare , e diventa meno stabile infatti da una conformazione giusta passa ad assumerne una sbagliata . ____________________________________________________

Per quanto riguarda laccessibilit della struttura a filo di perle bisogna rendere ancora di pi trascrivibile il promotore. Questo viene effettuato da una proteina che legge determinanti molecolari e recluta degli enzimi per esempio le acetilasi che modificano covalentemente listone del nucleosoma che si apre rendendo pi disponibile il promotore al complesso dinizio. Oppure recluta un complesso di 31

rimodellazione della cromatina che rimodella il nucleosoma. Il primo evento dura di pi perch abbiamo bisogno di una de-acetilasi che toglie, mentre il secondo meccanismo si ha subito il ripristino della conformazione originale del DNA non appena il complesso si stacca. La metilazione protegge il DNA perch impedisce il legame con delle proteine che possono indurre la modificazione conformazione che rende la struttura del DNA accessibile per il complesso dinizio della trascrizione. la metilazione viene effettuata da un enzima che aggiunge un gruppo metilico. Trasporto delle proteine Le cellule eucariotiche hanno un grande livello di organizzazione della compartimentazione delle proteine. Il mitocondrio un organello costituito da un doppio strato membranoso, spazio intermembrana e uno matrice mitocondriale in cui ci sono RNA, proteina, DNA ecc. Il genoma mitocondriale codifica per poche proteine mitocondriali le restanti vengono codificate nel genoma nucleare, tradotte nel citoplasma(in cui devono essere inattive) e poi trasportate nel mitocondrio dove vengono attivate per poter svolgere la loro funzione. Le amminotrasferasi sono enzimi codificati in forme alternative sia dalla cellula che dal mitocondrio ma hanno la stessa funzione. Le proteine mitocondriali codificate dal nucleo della cellula, vengono trasferite su particolari recettori presenti sul mitocondrio dove continua la trascrizione e si ha la strutturazione proteica. Per vedere se il traporto co-traduzionale si fa un esperimento, cio si inserisce una proteina sintetizzata viene messa in presenza di microsomi cio vescicole e vedo che la proteina non riesce ad attraversare la membrana. se invece faccio avvenire la sintesi proteica in presenza di microsomi trover una quantit al suo interno in cui non c la presenza di un tratto amminoacidico. Questo esperimento testimonia che un processo di trasporto co-traduzionale e la sequenza segnale dindirizzamento presente sullestremit ammino terminale. Tale segnale viene riconosciuto da un ricettore presente sulla membrana che deve attraversare e consente lattraversamento della proteina in sintesi attraverso tale ricettore. Dopo di che questo segnale viene tagliato grazie a una proteasi specifica. La prima parte che viene sintetizzato della proteina la sequenza segnale che ricca di amminoacidi idrofobici. A questo punto tale segnale si ritrova in un ambiente polare e quindi tende a ripiegarsi sul ribosoma bloccando la traduzione fino a quando a non incontra una SRP( formata da una parte proteica e RNA). Se non si blocca la traduzione la proteina che viene sintetizzata non sar pi in grado di entrare nel mitocondrio. Il complesso SPR-ribosoma viene riconosciuto dal ricettore di SRP. Tale interazione permette di esporre il ribosoma in un ambiente idrofobico che fa si che il segnale entri nel canale e si ri-inizia la traduzione. Quando la proteina entra nel lume la sequenza segnale viene tagliata e assume la sua conformazione nativa. La proteina idrofobica pu contenere un altro segnale costituito da amminoacidi idrofobici, che quando entra nel ricettore incontra altri amminoacidi idrofobici si creano delle interazioni che bloccano tale segnale. Intanto la sintesi proteica continua verso lesterno e verso linterno della membrana portando la formazione di una proteina di membrana. 32

Un esempio di modifica post-traduzionale la glicosilazione. Sulla proteina in sintesi pu essere presente un segnale che permette il legame con delle catene oligosaccaridiche. Tale catena viene sintetizzata da un particolare enzima, contemporaneamente alla sintesi proteica, sul dolicolo fosfato ( uno steroide) ancorato non in modo fisso alla membrana. Una volta sintetizzata la catena oligosaccaridica la trasferasi la stacca dal dolicolo fosfato per legarla alla proteina. Trasferasi La parte glicosidica viene ulteriormente modificata nellapparato del Golgi in base al destino della locazione della proteina. Le proteine presenti nella membrana cellulare rivolte verso lesterno sono glicosilate perch tale modifica le rende pi stabili.

Come comunicano le cellule degli organismi eucarioti? Essi non hanno la stessa esigenza delle cellule procariotiche, ossia non devono repentinamente adattarsi alle condizioni ambientali che cambiano allimprovviso. Ma devono lo stesso comunicare tra loro perch il loro sviluppo in un certo senso organizzato, specie negli eucarioti superiori. Possono comunicare direttamente: sulla superficie della cellula ci sono dei recettori/proteine che sono capaci di leggere linformazione, ossia il recettore legato sulla superficie esterna della cellula e lega il segnale; tale evento ( formazione del complesso recettore + segnale ) da inizio alla trasduzione del segnale, ossia il segnale dato da questa molecola (allesterno) viene trasmesso e diffuso allinterno della cellula. Tale segnale pu passare ad esempio per il sangue e poi arrivare alle cellule riceventi, oppure attraverso lapparato endocrino. Laltra possibilit che non ci sia un sistema di trasporto, ma una comunicazione pi locale tra cellule vicine, e in alcuni casi pu addirittura essere una comunicazione contatto-dipendente con o senza un sistema/apparato di contatto, come nel caso delle cellule nervose. Il segnale risulta in genere in una variazione di comportamento, ad esempio pu ridurre la frequenza della contrazione muscolare, pu attivare un particolare metabolismo, ecc. In pi, importante che ci sia una amplificazione del segnale iniziale, affinch esso arrivi a tutte le cellule di destinazione e affinch ci sia una risposta sensibile anche a piccole variazioni di concentrazioni del segnale. In genere, i recettori del segnale sono sulla superficie cellulare, per cui nella maggior parte dei casi parliamo di segnali idrofilici, che possono diffondersi liberamente in quanto sono solubili in acqua ( non permeano la membrana a meno che non ci sia un trasportatore o canali ionici , ad esempio il lattosio entra grazie ad una permeasi ). Invece quelli idrofobici riescono ad attraversare la membrana e quindi il recettore spesso intracellulare, trovandosi magari nel nucleo. I segnali possono determinare divisione cellulare, differenziamento, morte, della cellula che raggiungono. Come avviene linternalizzazione del segnale, ossia la trasduzione del segnale? Non necessariamente un trasporto vero e proprio allinterno della cellula del segnale che arriva ( caso del lattosio ), ma ci pu essere anche solo limport dellinformazione che arriva; ossia, senza far entrare la molecola/segnale stessa, entra solo il messaggio mediante la modifica conformazionale del dominio citosolico dei recettori di membrana, modifica che poi da il via a varie attivazioni e modifiche . 33

Come pu essere trasportato allinterno della cellula il ligando ( ossia il segnale ) ? 1- Canale ionico: per il trasporto di ioni o molecole cariche negativamente o positivamente; sono canali pi o meno selettivi, che hanno il vantaggio di poter lavorare anche contro gradiente. 2- Trasportatore: il ligando si lega al dominio esterno del recettore e ne determina una modifica conformazionale, che poi ne permette il passaggio allinterno della cellula. 3- Internalizzazione: il ligando entra grazie ad una vescicola, ossia quando il segnale tocca il recettore induce la formazione di una micella ( endocitosi ). In questo caso entra nella cellula anche il recettore, e la sua concentrazione sulla membrana diminuisce. Va considerato anche il fatto che in questo caso pi difficile arrivare ad una saturazione dei recettori, dato che questi entrano subito dopo nella cellula e in un certo senso la sensibilit della cellula a quello stesso segnale diminuisce.

Internalizzazione del segnale, ossia dellinformazione ma non del ligando stesso: La membrana una struttura fluida , e le proteine di membrana possono muoversi. Il legame con un ligando determina in genere una dimerizzazione del recettore, creando nella parte citolasmatica della cellula una struttura nuova , che sar il sito di legame di una nuova proteina monomerica che attiva molto spesso una cascata di fosforilazione, ossia fosforila una nuova molecola cambiandone le propriet e che magari a sua volta fosforiler una terza molecola, e cos via. Tali proteine attivano quindi direttamente o indirettamente dei processi finalizzati alla trasmissione del segnale. La cascata di fosforilazione assolutamente necessaria, affinch il segnale venga correttamente inviato e arrivi sicuramente.

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Ripetizione molto generale della glicolisi e del ciclo di Krebs. Quando il segnale arriva al nucleo, attiva o inattiva a seconda del caso il fattore di trascrizione con la conseguente modificazione dellespressione genica. Per esempio, in E.coli se arrivano trp la prima cosa che succede linibizione feedback del primo enzima della via metabolica ( in tempi praticamente immediati ). Quindi i livelli di risposta sono due, ma quello principale la modifica dellespressione genica. Ci sono due tipi di attivazione dei recettori: Attivazione di una chinasi, che fosforila il Attivazione di una proteina G.

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Un canale ionico permette il passaggio di ioni, distinguendo due casi : 1) Trasportatore , che sempre aperto ma specifico per un tipo di ione. 2) Canale ionico , normalmente chiuso ma che si apre ad una determinata concentrazione di ioni. Si possono formare questi canali allinterno delle membrane grazie alle alfa eliche anfipatiche ( le quali sono stabili in quando le facce idrofobiche toccano la membrana e quelle idrofiliche formano linterno del canale) si strutturano a barile. Certi canali hanno dei tappi, per esempio il canale del potassio ha una struttura palla e catena che permette lapertura e chiusura del canale. In genere comunque la struttura dei canali : Filtro + Cavit centrale + Poro interno

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Diverse proteine G hanno vari effettori con diversi ruoli, comunque la pi importante la stimolazione delladenilato ciclasi:

La proteina G in oltre divisa in pi parti o subunit: la parte alfa normalmente legata alla beta e gamma e tutte si trovano vicino al recettore. Quando il ligando lega il recettore, esso si modifica e G-alfa si stacca dal complesso Gbeta+Ggamma ; quindi, G-alfa ora lega GTP e migra fino a toccare una nuova proteina effettrice, la cAMP e la attiva.

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Levoluzione, ovviamente, ha conservato nel tempo le strutture terziarie ( non primaria o secondaria ) dei siti attivi delle proteine legate alla comunicazione. Per esempio, se la funzione della proteina legare l ATP, nel 90% delle proteine che devono legare l ATP troveremo un sito attivo strutturalmente simile e conservato. Una volta che si evoluta una buona funzione, si massimizzano le possibilit di utilizzare quella funzione anche in processi diversi.

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