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1878 in Yeast Kuhne 1897 Filtrados de extractos cell free Buchner 1894 Hiptese chave-fechadura Emil Fischer
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1926 Primeiro enzima (urease) a ser cristalizado Summer 1920s Desenvolvimento da ultracentrfuga Svedberg 1960 Sequncia do ribonuclease enzima que catalisa a hidrlise do cido ribonucleico 1965 Estrutura tridimensional (cristalografia de Raio-X) do lisosima enzima de clivagem 50s-60s Flexibilidade estrutural 1958 induced-fit (Teoria do encaixe induzido) Koshland
1961
Modelo
alostreo
(actividade
modulada
por
modificaes
fisiolgicas) Monod 1968 (Kempner e Miller) O meio celular heterogneo com elevado contedo em protenas (100-300mg/ml em eucariotas), abundncia de superfcies membranares e citoesqueleto 1969 sntese qumica do ribonuclease Merrifield 1973/74 Kacser e Burns/Heinrich e Rapoport O estado estacionrio de fluxos metablicos e de concentraes de metabolitos na clula so propriedades do sistema
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Aula 3 Outrs moleculs com ctividde ctl tic. Proprieddes dos enzims.
Anticorpos Catalticos
Anticorpos que podem catalisar uma ampla variedade de reaces qumicas. So caracterizados pela elevada especificidade para os substratos, compartilhando muitos aspectos mecansticos com os os enzimas. Exploram a capacidade de ligao (reconhecimento molecular) modulao do substrato (tipo de relao antignio-anticorpo) Construo de um anlogo do estado de transio So bons em reaces simples mas so limitados por: preciso e separao. Aplicaes: destoxificao por cocana
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Enzimas Artificiais
Servem para reproduzir a funo do enzima, mimetizar uma reaco qumica: 1. Transformao qumica ligao covalente; 2. Reconhecimento molecular Mimic binding (H, hidrfoba, inica) 3. Recriao do centro activo de um enzima. A ter em conta: Tem de ser um passo inicial de ligao Dimenso: importante para a ligao e libertao do produto
Exemplos: Ciclodextrinas Criptandos ligandos multi-dentados que ligam caties Anticorpos catalticos
Especificidade
A maioria dos enzimas so bastante especficos tanto para a natureza do substrato que utilizam, tanto para a reaco que catalisam. As reaces catalisadas enzimaticamente raramente do origem a produtos alternativos. A especificidade varia de enzima para enzima. Uma especificidade mais baixa, por exemplo, comumente observada em enzimas de degrao.
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Existem vrios tipos de especificidade: Especificidade de ligao baixa (peptidases, fosfatases) Especificidade de molcula intermdia (hexocinase) Especificidade de grupo absoluta (urease)
Regulao
A actividade cataltica de muitos enzimas pode variar em resposta s concentraes de outras substncias que no os seus substratos. Estes processos regulatrios incluem o controle alostreo, modificao covalente e variao da quantidade de enzima utilizado.
Nomenclatura
Em geral, adiciona-se o sufixo ase ao substrato sobre o qual actua (ex: urease catalisa a decomposio da ureia), ou ao nome da reaco que o enzima catalisa (ex: lcool desidrogenase catalisa a desidrogenao do lcool). No entanto existem excepes. Por exemplo pepsina e tripsina enzimas digestivos.
Classificao
Os nomes dos enzimas so dados seguindo certas regras bem definidas. Os seis tipos principais de reaces catalisadas por enzimas so: EC 1 Reaces de oxidao-reduo, catalisadas por oxidoreductases; EC 2 Reaces de transferncia de grupo, catalisadas por transferases; EC 3 Reaces hidrolticas, catalisadas por hidrolases; Pgina 5 de 84
EC 4 Reaces de eliminao nas quais formada uma dupla ligao, catalisadas por liases; EC 5 Reaces de isomerizao, catalisadas por isomerases; EC 6 Reaces nas quais duas molculas se juntam custa de energia (normalmente ATP), catalisadas por ligases.
O nome sistemtico completo de um enzima no s mostra o tipo de reaco catalisada, mas descreve se o substrato(s) adicionou qualquer outra informao importante.
Exemplos: EC 2.3.1.17 (Aspartato N-acetiltransferase) 2 transferase 2.3. acetiltransferase 2.3.1. transferncia de grupo sem ser aminoacetil 2.3.1.17 17 enzima com estas caractersticas EC 1.1.1.1 (lcool desidrogenase) 1 Oxidoreductase 1.1 dador (lcool) 1.1.1 aceitador (NAD+) Nome sistemtico: lcool: NAD+ oxidoreductases (dador:aceitador) Nome trivial (a usar): lcool desidrogenase
Enzima
ATP + Glu
6-P-Glucose
ATP: Glucose 6-fosfato transferase Classificao dos enzimas do tipo EC a.b.c.d. onde: a) O primeiro nmero indica o tipo de reaco catalisada e pode tomar valores entre 1 e 6, de acordo com a classificao feita anteriormente. b) O segundo nmero indica a subclasse, que normalmente especifica o tipo de substrato ou, mais precisamente, a ligao clivada. Pgina 6 de 84
c) O terceiro nmero indica a sub-subclasse, permitindo uma definio ainda mais precisa da reaco catalisada em termos do tipo de aceitador de electres (no caso dos oxidoreductases, por exemplo) ou do tipo de grupo removido (nas liases, por exemplo). d) O quarto nmero indica o serial number do enzima na sua sub-subclasse.
Sistemas multienzimticos
Multienzimas so protenas que exibem mais do que uma actividade cataltica. Para efeitos de nomenclatura, a recomendao que, quando est a ser atribuda mais do que uma nica actividade cataltica, deve-se referir a um sistema multienzimtico. Assim, enzimas multifuncionais tero mais de um nmero de EC e posio no esquema de classificao.
semelhanas entre enzimas, para o desenho racional de drogas e para a explorao do enzima para fins industriais. Supondo que est disponvel uma fonte de enzima, as principais etapas de trabalho so: 1. Determinao da massa molecular relativa, Mr; 2. Determinao aminocidos; 3. Determinao das estruturas secundria e terciria; 4. Determinao da estrutura quaternria. da estrutura primria e composio em
O termo estrutura primria refere-se sequncia de aminocidos numa cadeia polipeptdica. Este tipo de estrutura contm apenas informao unidimensional e diz-nos pouca coisa acerca da estrutura tridimensional. Os termos estrutura secundria e terciria referem-se a diferentes aspectos da estrutura tridimensional: a estrutura secundria refere-se a elementos regulares da estrutura, tais como a hlice- e a folha-, nas quais esto envolvidas interaces entre regies prximas. A estrutura terciria refere-se ao folding de uma cadeia, no qual pores da molcula bem separadas na sequncia so trazidas para mais prximo uma da outra. O termo estrutura quaternria refere-se ao arranjo de subunidades individuais num enzima que contm mais do que uma subunidade.
Determinao de Mr
Enzimas so macromolculas com valores de Mr que esto num intervalo de cerca de 10 000 at alguns milhes. As determinaes dos valores de Mr dos enzimas nos dias so feitas, hoje em dia, recorrendo a uma destas tcnicas: 1. Ultracentrifugao; 2. Filtrao em gel; 3. Electroforese SDS Page; 4. Espectrometria de massa.
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Destes mtodos, (2) e (3) so semi-empricos e possveis comparaes so feitas com molculas standard de massa molecular conhecidas. No entanto, no mtodo (1), Mr pode ser calculada usando equaes derivadas de princpios prvios. As tcnicas recentes da espectrometria de massa (4) podem fornecer valores de M r extremamente precisos. A massa molecular relativa de um enzima uma pea de informao fundamental uma vez que nos permite converter a concentrao de uma soluo de unidades de massa por volume (mg.cm-3 por exemplo) para unidades de molaridade. Esta informao pode ento ser utilizada de vrias maneiras, tais como: consideraes de composio (quantos aminocidos de um dado tipo esto presentes por molcula de enzima?), actividade cataltica (quantas molculas de substrato so formadas por uma molcula de enzima por segundo?), e ligao do ligando (quantas molculas de ligando esto ligadas por molcula de enzima?). Medies de Mr feitas na ausncia e presena de agentes desnaturantes iro mostrar se o enzima ou no composto por subunidades e pode indicar o nmero de subunidades. Por exemplo, o lactato desidrogenase da levedura tem uma Mr de 140 000 numa filtrao em gel, mas numa electroforese em SDS-Page a Mr perto de 35 000, indicando que este enzima um tetrmero (4 subunidades).
Mtodo directo
Mtodo indirecto
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Folha- Estrutura tambm mantida por ligaes de hidrognio entre as unidades peptdicas. Neste caso, as ligaes so estabelecidas diferentes, entre cadeias e
polipeptdicas
distendidas
estrutura
terciria
descreve
conformao tridimensional que a molcula assume em soluo, explicando o dobramento da cadeia peptdica com os enrolamentos, dobras e voltas que a compem e que a levam a uma forma geral globular.
Estrutura terciria
As interaces responsveis pela estrutura tridimensional dos enzimas so todas as foras fracas: ligaes de hidrognio, foras electrostticas, foras de Van der Waals e ligaes hidrfobas.
organizao presente nas protenas e descreve quantos e quais monmeros compem a molcula e como esto associados. A maior parte dos enzimas consistem num nmero de subunidades mantidas juntas por foras no covalentes so oligmeros.
Estrutura quaternria
Podem-se fazer vrias questes acerca dos enzimas oligomricos: 1. Quantas subunidades existem? E de que tipo? 2. Como esto as subunidades organizadas? 3. Que foras esto envolvidas? 4. Qual o significado, para o enzima, de ter mltiplas subunidades?
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1. Quantas subunidades existem? E de que tipo? a. Estudos de Massa Molecular Uma indicao de que um enzima consiste em mltiplas subunidades fornecido por resultados de massa molecular realizados na ausncia e presena de agentes desnaturantes (exemplo: cloreto de guanidina). O lcool desidrogenase de levedura, por exemplo, por ultracentrifugao apresenta um Mr de 145 000. No entanto, sob condies desnaturantes, obtido um valor de Mr de 36 000, sugerindo que este enzima consiste em 4 subunidades (145/36 ~ 4) provavelmente idnticas. b. Estudos de Cross-Linking Outro dos mtodos utilizar um agente de cross-linking, como o dimetilsuberimidato. Este composto reage com os pares de cadeias laterais de Lisina, que praticamente se encontram superfcie do enzima, para criar ligaes cruzadas que desnaturantes. Digamos que fazemos reagir um enzima com 4 subunidades com um agente de cross-linking: ser formada uma mistura de espcies que podem ser separadas por electroforese em gel de poliacrilamida, dando um so estveis na presena de agentes
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total de 4 bandas. O nmero de bandas corresponde ao nmero de subunidades. c. Estudos de ligao de ligandos O nmero de stios de ligao num enzima para um substrato ou outro ligando pode ser utilizado para indicar o nmero de subunidades. Por exemplo, o lcool desidrogenase de levedura liga 4 mol de NADH, enquanto o de fgado liga 2 mol de NADH, o que indica que o primeiro um tetrmero (4 subunidades) e o segundo um dmero (2 subunidades).
d. Estudos de Simetria O tipo de simetria de um dado enzima, deduzida por cristalografia de raio-X pode, por vezes, ser usada para determinar o nmero de subunidades num enzima, ou pelo menos, usada para excluir vrias estruturas de subunidade propostas.
2. Como esto as subunidades organizadas? A disposio das subunidades num enzima oligomrico podem ser usualmente deduzidas pelo tipo de simetria que as molculas possuem (atravs da cristalografia de raio-X). No geral, o arranjo das subunidades tal que permite o mximo de contacto entre subunidades. Assim, para um enzima tetramrico, como o lactato desidrogenase, o arranjo geomtrico preferencial o tetradrico. Para um enzima hexamrico, o arranjo preferido ser o octadrico.
3. Que foras esto envolvidas? As foras envolvidas na associao de subunidades so as fracas (no-covalentes) ligaes de hidrognio, foras electroestticas, foras de van der Waals e foras hidrfobas. As superfcies envolvidas na associao de subunidades so, na sua grande maioria (+ de 67%) nopolares.
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4. Qual subunidades?
significado,
para
enzima,
de
ter
mltiplas
H, pelo menos, 4 possveis razes que explicam que vantajoso para um organismo possuir enzimas com mltiplas subunidades: a) A presena de mltiplas subunidades confere
possibilidades adicionais ao enzima de regulao da actividade cataltica; b) A combinao de diferentes tipos de subunidades num largo complexo permite uma variao nas propriedades catalticas; c) Aumento da estabilidade; d) Associaes geram grandes estruturas com determinada simetria que podem dar origem a funes biolgicas especficas com economia gentica (menos probabilidade de erro).
"Economia gentica"
O enzima tem de ter rea superficial suficiente para se ligar a mltiplos locais na clula e para se integrar nas suas funes metablicas
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As rotaes ocorrem em torno de ligaes simples, levando a alteraes conformacionais que se tornam no passo limitante.
Classificao de Estruturas
Entre os vrios sistemas de classificao para os elementos estruturais em protenas inteiras ou em domnios individuais, o mais utilizado tem sido o sistema de quatro classes introduzido por Levitt e Chothia. As quatro classes de estrutura da protena so os seguintes: 1. Enzimas s tm estrutura em hlice- (Exemplos: regio varivel das imunoglobulinas); 2. Enzimas tm, maioritariamente, estrutura em folha- (Exemplos: regio fixa e varivel das imunoglobulinas);
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3. Enzimas / tm segmentos mistos ou alternados de hlice- e folha- (Exemplos: cinases e desidrogenases); 4. Enzimas + tm estruturas em hlice- e folha- que esto separadas ao longo da cadeia polipeptdica (Exemplos:
Famlias de folds
Existem 9 superfolds (30% das protenas)
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Assim, a maioria dos enzimas podem ser facilmente desenrolados (unfolded) e dissociados (no caso de enzimas com mltiplas subunidades) por uma variedade de condies: valores de pH extremos, calor, adio de solventes orgnicos, agentes caotrpicos e altas concentraes de ureia e cloreto de guanidina. A perda da estrutura tridimensional de um enzima enrolado conhecida como desnaturao. A desnaturao de um enzima pode ser seguida pela perda de actividade, ou alterao de parmetros-CD e fluorimetria.
Folding de Enzimas
Em 1960, Anfinsen realizou uma experincia importante que mostrou que um enzima desnaturado podia ganhar de volta a sua estrutura folded quando o agentes desnaturante era removido experincia com mercaptoetanol (para quebrar ligaes persulfureto) e ureia (enzima reduzido). Esta experincia levou concluso de que a estrutura primria de um enzima contm toda a informao necessria para o levar estrutura tridimensional. Dogma de Anfinsen nas condies ambiente (temperatura, concentrao de solvente) s quais ocorre o folding, a estrutura nativa estvel e cineticamente acessvel com um mnimo de energia livre.
O folding de enzimas explica a especificidade de ligandos. Deficincia de folding leva ao estudo da 2 metade do cdigo gentico
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Mr = 50 000
massa elevada
interaes adicionais
Channeling processo de transferncia directa de um intermedirio metablico entre os centros activos dos enzimas que catalisam duas reaces sequenciais numa via biossinttica: o produto de uma reaco serve de substrato para a reaco seguinte.
Cofactores
Muitos enzimas requerem um componente no-proteico para apresentarem actividade esse componente denomina-se cofactor.
derivados de vitaminas
Orgnicos
flavina
Cofactores
Inorgnicos
Ies metlicos
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Grupo prosttico componente de origem no proteica essencial para a actividade do enzima. Cofactores parte integrante do enzima (no saem: ligam-se permanentemente). Orgnicos Coenzimas metalo-orgnicos complexos participam orgnicos realmente ou na
que
Grupos prostticos
Coenzimas
protes ou agentes nuclefilos que participam em reaces de transferncia de grupo. Ligam-se fraca e no permanentemente aos enzimas.
Um enzima contendo um cofactor ou grupo prosttico denominado holoenzima. Quando o cofactor removido, passa a denominar-se apoenzima. Metalo-enzima enzima que inclui na sua estrutura proteica, ies metlicos. Neste caso o metal, com funes catalticas e/ou estruturais, est geralmente no centro cataltico.
Uma cintica de converso entre esses produtos. Tem de se ter em conta a estrutura de cada um dos complexos.
Estratgias de Catlise
Efeito de proximidade
Efeito de orientao
Catlise: cido-base: resduos de aminocidos intervenientes dependem do pKa da cadeia lateral. Este pKa no microambiente do centro activo pode ser diferente do aminocido isolado. Covalente: h um complexo intermedirio com ligao covalente entre o enzima e o substrato. As cadeias laterais funcionam como nuclefilos. Por estabilizao do Estado de Transio: interaces electroestticas, ligaes de hidrognio e organizao geomtrica do centro activo podem favorecer associao com estado de transio (mais forte do que com substratos). Exemplo: anticorpos catalticos.
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macromolculas) Antigamente pensava-se que a cristalizao era uma prova da pureza do enzima. Hoje sabe-se que alguns enzimas, mesmo na forma cristalina, no se encontram puros. Na maior parte dos processos de purificao, a cristalizao no includa, a no ser que se pretenda determinar a estrutura tridimensional do enzima. Pgina 21 de 84
Estratgia
O procedimento a ser adotado para um dado enzima envolve escolhas como: i) ii) iii) A fonte do enzima Mtodos de homogeneizao Mtodos de separao
O progresso de purificao deve ser registado numa tabela. i) Fonte do enzima (Tecidos animais; Plantas; Microrganismos bactrias, leveduras; Clulas em cultura; Fraes subcelulares mitocndrios, membranas, entre outros)
a. Abundncia do enzima A fonte deve possuir o enzima em grandes quantidades. Se no for possvel obter grandes quantidades pode-se manipular as condies de uma dada cultura de forma que a produo do enzima seja aumentada. Apesar de em alguns casos ser necessrio utilizar a espcie WT, tambm se pode utilizar tecnologias de DNA recombinante e produzir o enzima pretendido,
independentemente da fonte. A produo de enzimas de clulas eucariotas em clulas procariotas pode apresentar problemas, uma vez que as clulas procariotas no tm a Pgina 22 de 84
maquinaria necessria para que ocorra transformaes pos-traducionais. Assim, o ideal ser produzir o enzima numa clula eucariota mais simples, como as leveduras, que apresentam crescimento rpido e no precisam de muitos nutrientes.
b. Disponibilidade Uma fonte com abundancia razovel de enzima pode no existir e portanto, nestes casos necessrio haver um compromisso entre a disponibilidade e a abundncia do enzima.
c. Estudos comparativos Pode-se estudar o enzima numa espcie diferente da pretendida. Para tal necessrio o conhecimento das propriedades dos isoenzimas.
d. Localizao subcelular Se a reao catalisada por um dado enzima apenas ocorrer numa dada localizao da clula necessrio haver, na purificao desse enzima, um passo de homogeneizao ou de extrao. Quando o enzima existe em mais do que um lugar na clula necessrio proceder a um fracionamento celular. O fracionamento celular normalmente conseguido atravs de centrifugaes sucessivas (velocidade de rotao cada vez maiores), em que os organitos maiores (ncleo, mitocndrio,) sedimentam primeiro
ii)
Mtodos de homogeneizao Existem diversos mtodos para homogeneizar clulas e libertar o seu contedo; Dependem do tipo de tecido ou organismo utilizado como fonte de enzima; A utilizao de uma soluo tampo de extrema importncia.
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a. Tecidos de mamferos A falta de uma parede celular rgida permite uma fcil homogeneizao do tecido que utilizado como fonte do enzima. A extrao tem de ser efetuada com uma soluo isotnica (quando importante evitar a rotura de organelos, como os vacolos) ou com uma soluo hipotnica. Em alguns casos pode ser necessrio adicionar inibidores de proteases ou agentes redutores como o ditiotreitol. b. Plantas, fungos e bactrias As clulas tm uma parece celular rgida e portanto so necessrios mtodos mais abrasivos como areia, congelao/ descongelao, presso mecnica prolongada (com ou sem esferas de vidro). Tambm podem ser utilizados enzimas hidrolticos Nas plantas a homogeneizao pode criar alguns problemas pois, durante este processo, pode ocorrer a libertao do contedo dos vacolos (que so acdicos e contm proteases), que poder danificar o enzima pretendido. A adio de um tampo apropriado e de inibidores de proteases pode evitar tal danificao. iii) Mtodos de separao As principais propriedades dos enzimas que podem ser exploradas nos mtodos de separao so: Tamanho ou massa Polaridade (carga ou hidrofobicidade) Solubilidade (pH, fora inica) Locais de ligao especfica a outras molculas
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coli; no entanto, manipulao das condies de crescimento permitem alterar esta solubilidade)
ii)
O que (ainda) no se pode prever a partir da sequncia de aminocidos a. Multi-subunidades; homomultmeros, heteromultmeros? Mesmo
com previso da estrutura do enzima impossvel prever se o mesmo existe em soluo como monmero ou como um multmero (ex. hexmero). Muitos enzimas existem na clula como multi-complexos e a sua purificao depende em muito da ligao aos seus interatuantes b. Propriedades de precipitao (Ainda no possvel prever que
iii)
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v) Utilizar
tcnicas
diferentes
em
cada
passo
(tirar
partido
das
caractersticas da protena para a purificao (tamanho, carga, hidrofobicidade, especificidade para ligandos...) vi) Minimizar o n de passos (evitar perda de rendimento) vii) Combinar passos de maneira lgica (reduz o tempo de purificao, sem comprometer a qualidade do produto final)
Exemplo
A purificao de enzimas um processo dispendioso e nem todos os enzimas podem ser purificados. necessrio, portanto, uma investigao bsica sobre a biologia celular e as vias metablicas em que os enzimas participam, a identificao do gene (e da sua sequncia) que codifica para o enzima.
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) pode ser
[ ]
[ ]
[ ]
Obtm-se:
[ ] [ ]
ou
[ ] [ ]
[ ]
[ ] em funo de
[ ] [ ]
o Vida mdia,
reagente a 50%
Assim, considera-se [ ]
, logo [ ]
[ ]
e[ ]
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[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
Casos especiais
o [ ] o [ ]
[ ] cintica de pseudo 1ordem [ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
Integrando:
[ ]
[ ] [ ]
[ ]
angular
Reaes reversiveis
Por exemplo:
[ ] e[ ] [ ]
e[ ]
[ ]
[ ]
[ ] Integrando: [ ] [ ] Pgina 31 de 84
duas duas
equaes incgnitas
com
Sistema possvel e
Pr-equilibrio
determinado!
Trata-se de uma cintica complexa, a menos que se admita que [AB] constante
durante um perodo suficientemente longo da reaco (aproximao de estadoestacionrio) [ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ]
[ ][ ]
Quebra rpida de
[ ][ ]
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Quebra lenta de
[ ][ ]
[ ][ ]
[ ][ ]
Equao de Arrhenius
Cada reao dever ultrapassar uma barreira de eneria: o estado de transio (TS, X). Quando a temperatura elevada, o
nmero de molculas que ultrapassam essa barreira maior. Resolvendo a equao em ordem a k: Para determinar Ea, basta medir a duas temperaturas ( ( ( )) )
Teoria da Coliso
( )
Onde P o factor de probabilidade (uma vez que nem todas as colises so eficazes) e Z o nmero de colises por segundo.
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Para determinar os parmetros de ativao: Determinar k a diferentes temperaturas; Atravs do grfico ln(k/T) em funo de 1/T obtm-se H; Atravs da expresso:
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Obtm-se Sabendo
; e , calcula-se .
Cintica enzimtica
A cintica enzimtica no prova nada em termos de mecanismos. No entanto, no precisa de enzima puro. Estes estudos fornecem informaes sobre grupos ativos e tipos de intermedirios envolvidos na reao. Os estudos cinticos devem ser anteriores a quaisquer outros no estudo do mecanismo.
Wong e Hanes (1962) A espcie que entra para a reao encontra-se por cima da seta, a espcie que sai encontra-se por baixo da seta. Pgina 35 de 84
Cleland (1963) mais utilizada A linha horizontal representa o enzima; as espcies que entram para a reao apresentam uma seta no sentido do enzima, as que saem apresentam uma seta no sentido oposto.
Ainsworth (1975) Esta forma de representao no mostra os intermedirios formados. O numero 1 corresponde ao enzima e o numero 11 corresponde a isomerizao. O simbolo significa que a reao reversvel.
Mecanismo Theorell-Chance (1951) Utiliza-se este mecanismo quando o composto intermedirio no detetado experimentalmente.
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Equao comum
[ ] [ ] [ ] Sendo que [ ] substrato, [ ]
[ ]
[ ].
Como geralmente a concentrao de enzima inicial no conhecida, sabendo que a velocidade limite, V, dada por: [ ] Pgina 37 de 84
Pode obter-se a seguinte equao: [ ] [ ] Pode determinar-se os parmetros cinticos realizando um grfico de velocidade inicial em funo da concentrao de substrato:
Grandezas e unidades
[ ] Velocidade limite (mM s-1); Constante cataltica ou nmero turnover (min -1) Constante de Michaelis concentrao de substrato para a qual a velocidade inicial metade da velocidade mxima (mM) Constante de especificidade (mM-1 min-1), determina a preferncia do enzima para os diferentes substratos, uma medida da eficincia catalitica Unidades enzimticas U quantidade de enzima que catalisa a formao de 1mol de produto por minuto (mol min-1) Katal (kat) quantidade de enzima que catalisa a formao de 1 mol de produto por segundo (mol s-1)
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Eficincia
A razo (unidade: s-1mM-1) permite saber a eficincia do enzima em
relao a um substrato. Quanto maior a razo, maior a eficincia. Quando a razo da ordem 108 (que a velocidade de difuso dos metabolitos da clula) o enzima denomina-se wonderful enzyme
Significado de Km
O valor de Km depende do substrato particular e das condies do meio, como o pH, fora inica, temperatura, entre outros. O K m indica a afinidade do complexo EA quando Km dado por: for maior que .
[ Km igual a Kd se
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Parmetros cinticos
Os parmetros cinticos so: Qual o substrato mais especifico? Um maior indica uma reao mais rpida para baixas concentraes Kcat Km
de substrato Um maior Kcat indica uma reao mais rpida quando a concentrao de substrato elevada
Constante de especificidade,
o melhor parmetro para comparar substratos que competem. Quando esta constante muito semelhante para dois substratos
Mtodo de Lineweaver-Burk
Faz-se a inverso da equao de Michaelis Menten, obtendo-se: [ ] Representando em funo de
[ ]
obtm-se uma
reta que, atravs do coeficiente angular, ordenada na origem e abcissa na origem permite calcular os parmetros cinticos.
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Mtodo de Hanes
Mtodo a utilizar em caso de dvida, pois o mais correto. Obtm-se a equao de Hanes multiplicando a equao de LineweaverBurk (que o inverso da equao de MM) por [A]. [ ] [ ]
Mtodo de Eadie-Hofstee
Caso o grfico obtido seja linear, o enzima segue uma cintica Michaeliana.
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Critrio dos mnimos quadrados Fornece as melhores estimativas (menor varincia), se: 1. Os erros nas medidas esto distribudos segundo uma normal; 2. S uma varivel (varivel dependente) est sujeita a erro (em cintica enzimtica a velocidade); 3. Os pesos adequados so conhecidos; 4. Os erros no esto correlacionados, ou seja, a grandeza ou sinal de um erro no tem influncia na grandeza ou sinal de outro erro. 5. Erro sistemtico pode ser ignorado, ou seja, a curva de distribuio para cada erro tem mdia 0.
Mtodos no paramtricos
Na prtica, no possvel verificar a satisfao das condies de 1 a 5: pouco se sabe sobre a distribuio dos erros. Os mtodos da estatstica no paramtrica (ou "independentes da distribuio") s exigem a satisfao da condio 5. A regresso no paramtrica baseada na generalizao da noo de mediana a espaos n-dimensionais. (2D no caso da equao de Michaelis-Menten)
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A equao pode ser particularizada para quando a concentrao de substrato igual a 0 (tem sinal negativo porque foi definido em termos de variao de produto ao longo do tempo):
Relao de Haldane
Sabe-se que no equilbrio a velocidade de reao nula, a concentrao de substrato variou desde o tempo inicial bem como a concentrao de produto, e que a constante de equilbrio a razo entre a concentrao de produto e a concentrao de substrato:
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O enzima liga-se ao substrato (formando EA) ou ao inibidor (EI) mas no a ambos (EAI) O inibidor estruturalmente semelhante ao substrato. A inibio pode desaparecer aumentando a concentrao de substrato. Neste tipo de inibio o complexo enzima-substrato-inibidor (EAI) no se dissocia no complexo enzima-substrato (EA), por isso a constante de dissociao de EAI infinita (Kii=) Pgina 46 de 84
A inibio mista em geral a inibio por produto. Neste modelo no existem equilbrios.
o Inibio no competitiva pura mista: um tipo de inibio mista, rara, em que a constante de inibio, Ki, igual constante de dissociao de EAI, Kii.
Anti-competitiva (cataltica) A velocidade limite diminui e o Km diminui (aumenta a afinidade ao substrato) e a razo mantm-se constante.
Neste tipo de inibio o inibidor s se liga a uma espcie de enzima modificada, como por exemplo o complexo EA. Na presena de inibidor o enzima passa a apresentar uma maior afinidade para o substrato.
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O inibidor ao ligar-se ao EA impede a sada de substrato uma vez que este no se liga ao enzima diretamente (s sua forma modificada). Assim, como a espcie enzimtica EI no existe, no h libertao de substrato e portanto a constante de inibio infinita (, K i=) Equaes de velocidade da inibio reversvel
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Grfico linear direto Num tipo de inibio competitiva, no grfico observa-se o aumento de Km atravs da abcissa dos pontos de interseo. Na inibio mista
observa-se tanto o aumento do K m como a diminuio da velocidade limite. No caso da inibio no competitiva pura (caso particular da inibio mista), o K m mantm-se constante enquanto a velocidade limite diminui. Na inibio anti-competitiva observa-se uma diminuio tanto do Km como da velocidade limite. Clculo de K i e K ii Os grficos de Dixon e de Cornish-Bowden complementam-se na determinao do tipo de inibio. Atravs do grfico de Dixon pode-se determinar o Ki, enquanto pelo grfico de Cornish-Bowden pode-se determinar Kii.
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Marcadores de afinidade
Apresentam uma semelhana estrutural com o substrato e so mais especficos que os reagente com especificidade de grupo. Exemplo: TosilL-fenilalaninil quimiotripsina. clorometilcetona, que anlogo ao substrato para o
Inibidores suicidas
Mecanismo de ao: so substratos modificados que inicialmente seguem o mecanismo cataltico normal, mas depois h a formao de um intermedirio reativo que inativa o enzima por modificao covalente. Assim, o enzima participa na sua prpria inibio irreversvel.
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1. No ser grande (massa molecular inferior a 500 Da); 2. No ser lipfila (coef. partio etanol/agua 105) 3. No ter grande capacidade de formar lig de H (mximo: 5 H dadores e 10 OH aceitadores) O transporte mediado no deve ser considerado uma exceo!
Inibidor tight-binding molcula que se liga fortemente mas de forma reversvel Inibidor irreversivel molcula que reage irreversivelmente levando perda de atividade do enzima Inibidor mechanism-based ou inibidor suicida substrato que leva o enzima a reagir formando um estado inativado irreversvel em vez de produtos
Aula 18 Deduo d equo de velocidde de estdo estcionrio (me todo de King e Altmn)
As concentraes das diversas espcies enzimticas no variam ao longo do tempo no estado estacionrio, ou seja:
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Sendo
mecanismo de catlise (incluindo a forma livre do enzima, que o somatrio de todas as espcies enzimticas envolvidas). Pelo mtodo de King e Altman obtm-se expresses para ,
em funo das constantes de velocidade dos vrios passos do mecanismo. Nestas expresses os denominadores so iguais em todas as espcies enzimticas e so a soma de todos os numeradores (de todas as espcies enzimticas). A equao de velocidade derivada a partir destas expresses, considerando a formao do produto a partir de algumas das formas enzimticas. Tome-se como exemplo o seguinte mecanismo:
1 passo
cada espcie de enzima corresponde ao vrtice de um polgono (como no exemplo apenas existem 3 espcies enzimticas, o polgono obtido um tringulo). Neste passo tambm se deve identificar os processos que levam transformao entre cada espcie enzimtica (por exemplo para transformar E em EA o processo k 1A). 2 passo Desenhar todos os padres possveis contidos no
padro principal. Regras: i. Tm de conter todas as formas enzimticas; ii. No existem ciclos (ou seja, os lados do polgono, n, so reduzidos para n-1); iii. No tm em considerao a reversibilidade da
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Assim, para chegar espcie enzimtica E, os caminhos possveis so: EP EA E, o que corresponde a k-2k-1 EP E EA, o que corresponde a k-1k3 EAEPE, o que corresponde a k2k3 Logo a equao ser: Para chegar espcie enzimtica EA, os caminhos possveis so: EP EA E, o que corresponde a k-1Ak-2 EP E EA, o que corresponde a k1Ak3 EEPEA: no existe porque a via EEP irreversvel Logo a equao ser: Para chegar espcie enzimtica EP, os caminhos possveis so: E EA EP, o que corresponde a k1Ak2 E EP EA, no existe porque a via EEP irreversvel EAEEP: no existe porque a via EEP irreversvel Logo a equao ser:
3 passo
passos da formao do produto. Neste caso o produto s se forma a partir da espcie enzimtica EP, na reao de k 3:
Como
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Concluindo:
4 passo
Sabendo que:
concentraes fixas do substrato A, estes dados podem ser utilizados para descobrir qual o mecanismo da reaco.
A maioria das reaces inclui 2 substratos e dois produtos (reaces bi-bi): As reaces bi-bi podem ser descritas cineticamente pelo modelo michaeliano aplicado s reaces uni-uni, considerando a concentrao de um dos substratos constantes (saturante).
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Esta categoria pode tambm ser dividida: a. Reaces onde o complexo ternrio formado por um mecanismo sequencial, ou seja, reaces onde o substrato B s se pode ligar ao enzima depois do substrato A j estar ligado. Segue-se um exemplo:
b. Reaces onde o complexo ternrio formado por um mecanismo random, ou seja, qualquer um dos substratos se pode ligar primeiro. Segue-se um exemplo:
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c. Mecanismo de Theorell-Chance, onde existe uma ligao ordenada de substratos e libertao ordenada de produtos. No entanto, o tempo de vida do complexo ternrio extremamente curto, pelo que se torna cineticamente insignificante. 2. Aquelas que no envolvem um complexo ternrio a. Mecanismo ping-pong, onde formada uma forma modificada do enzima, E, juntamente com o primeiro produto, antes do secundo substrato se ligar:
Elucidao do mecanismo
1. Estudos na ausncia de produtos (mantendo alternadamente um dos substratos constantes);
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2. Estudos
de
inibio
por
um
dos
produtos
(supondo
mecanismos reversveis).
A adio de um s dos produtos s altera as equaes de velocidade por adio de termos ao denominador. O produto actua como inibidor: pelo tipo de inibio elucida-se o mecanismo.
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Equao de Dalziel
Em Enzimologia, a equao formal para reaces com 2 substratos.
Mecanismos Reaccionais com 3 ou mais substratos Estes mecanismos so raros, mas importantes. Um exemplo de enzimas que apresentam este tipo de mecanismos so os aminoacil-tRNA sintetases. No entanto, 3 substratos no implicam 3 produtos (em geral TerBi).
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Onde os fatores que levam ao consumo de A tm sinal negativo e os que levam sua formao tm sinal positivo.
Determinaes
In situ significa no lugar. Em termos de Enzimologia in situ refere-se ao estudo de enzimas no local onde eles se encontram (no seu habitat natural); In vivo refere-se experimentao feita dentro ou no tecido vivo de um organismo vivo, em oposio a um parcialmente ou totalmente morto. Pgina 61 de 84
In vitro processos biolgicos que tm lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratrio.
Enzimologia in situ
O objectivo desta rea estudar enzimas no seu habitat natural. In vitro: [protena] [substrato]
In vivo: [protena] [substrato] Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentrao de quase tudo. necessrio preservar a concentrao celular dos enzimas. Como permeabilizar a clula de um modo suave? necessrio ter em conta a concentrao de protena exposta ao meio reaccional. O azul de Comassi constitudo por trs espcies principais e por nove espcies secundrias. A digitonina insolvel em gua temperatura ambiente. Tambm um composto termoestvel. Assim, na preparao da digitonina deve aquecer-se a gua e adicionar-se a digitonina em gua quente para que seja solvel. Tem de se utilizar agitao. Caso contrrio, h sedimentao da levedura na cuvette.
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Cooperao interdisciplinar:
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Enzimas ou clulas?
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Custo (elevado?) dos enzimas Preos dependem de: Pureza Do tipo de enzima Prprio custo de produo do enzima, mas tambm da sua contribuio para o produto final No diferem muito do custo de outros catalisadores O preo do enzima deve ser comparado com o valor do produto final.
Estabilidade de um enzima: Muitos so instveis a temperaturas elevadas ou valores extremos de pH Outros em soluo podem perder actividade temperatura ambiente
fundamental que o enzima seja estvel nas condies de operacionais do processo de fabrico. Regenerao de cofactores em sistemas com enzimas: Cofatores como o NAD(P) ou NAD(P)+ nem sempre so fceis de regenerar Se o enzima for dependente de cofatores, tem que existir no meio um sistema de regenerao dos cofatores, de forma econmica e eficiente. Exemplos de como regenerar os cofatores:
membrana! - O NADH ligado ao PEG (NADH-PEG), aumentando a massa molecular do cofator. Isto permite que o cofator fique retido dentro do reator (dentro da membrana) com os enzimas, enquanto que o substratos e os produtos passam pela membrana livremente.
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Fonte dos enzimas Plantas Animais Microrganismos Enzimas recombinantes A produo poder no conseguir
Imobilizao de enzimas Limitao do movimento, atravs de processos qumicos ou fsicos: Mtodo eficiente, fcil, barato e universalmente aceite para aplicaes na indstria alimentar e em medicina A velocidade de reaco e o rendimento dependem de vrios parmetros: tipo de suporte, pH, temperatura, concentrao de substratos Optimizao emprica Mtodo mais comum: ligao a suportes (carriers) porosos necessrio o conhecimento das propriedades na superfcie do enzima: hidrofobicidade, grupos inicos, grupos funcionais Pode ser necessrio fazer engenharia da superfcie do enzima Introduo de grupos funcionais de forma a aumentar as ligaes, a estabilidade e a actividade Alterao do ponto isoelctrico
Vantagens da imobilizao de enzimas Reutilizao do enzima aps remoo dos produtos (reduz os custos) Facilidade de isolamento do produto Uso em processo contnuo (devido reutilizao) Aumento da estabilidade do enzima
Limitaes da imobilizao de enzimas Custo dos carriers e da imobilizao Alteraes das propriedades Problemas com a regenerao de cofatores Pgina 66 de 84
1. Cross-link Mtodo barato, mas no muito usado na imobilizao de enzimas solveis com objetivo de biocatlise: So poucos os enzimas imobilizados que apresentam elevada atividade Os agentes de cross-link podem desnaturar o enzima Usado com sucesso em cristais de enzimas
2. Ligao a um suporte (carrier) Mtodo bastante utilizado na imobilizao de enzimas O suporte deve ser inerte e estvel Classificao do carrier (material de que feito, origem ou estrutura): Pgina 67 de 84
o Inorgnico (Ex. slica, vidro, argilas) o Orgnico de fontes naturais (Ex. derivados da celulose, dextrano, polisacridos, agarose) o Orgnico de materiais sintticos (Ex. poliestireno, polmeros acrlicos) Caractersticas do carrier: o Qumicas - hidrofobicidade, estabilidade qumica e microbiolgica o Morfolgicas - dimetro da partcula, tamanho do poro, capacidade da superfcie para adsoro o Mecnicas resistncia presso e
compressibilidade, elasticidade o Gerais - custo, food or pharma grade Mtodos mais utilizados Adsoro Os enzimas so adsorvidos superfcie (interna ou externa) de um suporte atravs de interaces fracas (electrostticas, inicas, de hidrognio, van der Waals) Com o passar do tempo os enzimas podem perder-se, uma vez que as interaces envolvidas so fracas Como se processa: Misturar o enzima com o material adsorvente, em condies adequadas de pH e fora inica Incubar Lavar os enzimas no adsorvidos ou fracamente ligados Mtodos mais utilizados Ligao covalente Os enzimas so ligados covalentemente a uma matriz utilizada em gamas alargadas de pH, fora inica e outras condies variveis, por ser muito estvel Os grupos mais reativos no enzima so: amina e hidroxilo. No entanto, os resduos de lisina so os mais utilizados o Elevada abundncia superfcie da protena o Elevada reatividade Pgina 68 de 84
o Geralmente no esto envolvidos no centro ativo dos enzimas o Elevada estabilidade da ligao com o suporte As ligaes dependem do suporte e do grupo envolvido na reao. Os enzimas podem ser inativados se a ligao promover alteraes no centro ativo. O sucesso deste mtodo para a biocatlise depende da correta conformao do enzima e acessibilidade do centro ativo Este mtodo pode ser combinado com um cross-linker, como o glutaraldedo, de forma a formar agregados de protena:
gel ou com os monmeros de gel; o gel forma-se (ou polimeriza a partir do monmero) e o enzima fica preso no seu interior O tamanho do poro do gel crucial e depende do
tamanho do enzima que se pretende imobilizar Encapsulamento: interior ou nylon do enzima. Mtodo barato e fcil, mas a sua eficcia depende da estabilidade de A soluo contendo os enzimas encapsulada no uma estrutura que contm uma membrana
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Aplicaes com enzimas imobilizados Biorreatores produo de L-aminocidos por amino ciclases (catalisam a desacetilao dos aminocidos); Biossensores deteo e quantificao de diversos compostos em amostras complexas; Biorremediao remoo e desintoxicao de contaminantes;
Imobilizao de clulas
Alternativa imobilizao de enzimas A caracterstica mais importante a atividade e estabilidade dos enzimas de interesse No relevante se as clulas esto vivas ou mortas (permeabilizadas), desde que os enzimas estejam ativos Os mtodos utilizados so os mesmos descritos para a imobilizao de enzimas: Adsoro Ligao covalente Cross-link de clulas Encapsulamento ou aprisionamento (entrapment)
Como obter novos e melhores biocatalisadores? Screening clssico o A partir de colees de culturas o Recolha de amostras de ambientes Biblioteca ambiental de genes (environmental gene library) Pgina 70 de 84
o Metagenoma ambiental: genomas combinados de todos os microrganismos de um dado meio ambiente o Screening das bibliotecas (ex. procurar clones com determinada atividade) Pesquisa em bases de dados o Projectos de sequenciao de genomas e de sequenciao massiva o Muitos enzimas (ainda) no caracterizados Melhoramento de um biocatalisador conhecido o Desenho racional (engenharia baseada na estrutura, site-directed mutagenesis) o Evoluo dirigida (mutagnese aleatria, gene shuffling)
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Depende ainda da engenharia de enzimas, da descoberta de novos enzimas, da biologia e bioqumica de sistemas (cataloga novas vias, novas redes metablicas e as estratgias de regulao de diferentes organismos com interesse para desenvolver novas funes celulares) e da biologia sinttica (desenvolve novas estratgias para perturbar as redes metablicas endgenas, permitindo a obteno de dados de sistemas em condies de celulares no fisiolgicas).
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baseados em parmetros obtidos experimentalmente Permite perceber os circuitos moleculares que controlam sistemas
1 passo Abstrao do modelo: Seleo de vias metablicas que incluam os principais componentes que controlam os fluxos metablicos. 2 passo Construo do modelo: Desenvolvimento de um modelo computacional (de referncia) das vias metablicas selecionadas, baseado no conhecimento existente dos parmetros do sistema (concentrao de enzimas, parmetros dos enzimas,). 3 passo Otimizao do modelo: Perturbao do modelo de referncia (por ex. a deleo do gene ou a sobre-expresso do enzima) em posies selecionadas (nicas ou mltiplas) de forma a aumentar a produo de um determinado composto. 4 passo Teste experimental: Desenho de novas experincias (novas estirpes, melhoradas) com base nos resultados das simulaes. 5 passo Iterao do modelo: Otimizao do modelo at o
comportamento experimental do sistema ser satisfatrio, num processo cclico. 6 passo Produo industrial: Scale-up das culturas com o objetivo de produo do composto escala industrial
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Produo de protenas recombinantes em clulas de insetos, fungos ou bactrias com maior rendimento e baixo custo. Utilizao da via secretria de forma protena sair da clula medida que expressa (facilidade de isolamento)
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Modos de regulao
Quantitativos (escala de tempo lenta) coarse control Regulao da sntese proteica (em vrios passos possveis) Regulao da protelise Neste tipo de regulao existe uma modificao na espcie enzimtica inicial. [ ] [ ]
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Qualitativos (escala de tempo rpida) fine control Modificao covalente irreversvel Modificao covalente reversvel Modificao conformacional induzida por ligando Neste tipo de regulao pode ocorrer uma modificao covalente que leva alterao da constante de velocidade, conformacionais que alteram a funo do enzima. , ou modificaes de
Modificaes Conformacionais
Observaes experimentais: Muitos enzimas do primeiro passo da via eram inibidos por produtos do final da via estruturalmente distintos dos seus substratos e produtos; Pgina 76 de 84
Cinticas sigmoidais; Oligmeros; Era possvel interferir com ligao do inibidor sem afectar ligao de substratos. Alosteria Propuseram que inibidores (ou activadores, efectores) se ligassem noutro local do enzima que no o centro activo; Este centro poderia estar distante do centro activo e ter forma diferente centro alostreo; Ligao do efector poderia induzir modificaes conformacionais que teriam impacto no centro ativo.
Cooperatividade
Propriedade de enzimas e protenas que respondem com grande sensibilidade a variaes de concentrao de substratos ou efetores Variao de velocidade com concentrao de substrato (ou efector) no hiperblica maioria dos casos apresentam cinticas sigmides Pgina 77 de 84
A cooperatividade pode ser: o Homotrpica (se o ligando for semelhante para todos os centros ativos) ou heterotrpica (se os ligandos tiverem naturezas diferentes) o Pode ser positiva (se a ligao de um ligando promove a ligao dos outros o enzima pode deixar de apresentar sigmoicidade), negativa (se a ligao de um ligando impede a
ligao dos outros) ou mista (se a ligao de um ligando promove ou impede a ligao dos outros dependendo da concentrao a que se encontra).
Exemplo mais conhecido: hemoglobina. Protena oligomrica com cooperatividade homotrpica positiva Ligao do substrato a uma subunidade induz aumento de afinidade nas restantes subunidades
AlosteriaCooperatividade Oligomeria
Um enzima pode: Ter centros alostreos sem apresentar cooperatividade e sem ser oligomrico Ter cooperatividade sem ser oligomrico e sem ter centros alostreos Ser oligomrico sem ter alosteria nem cooperatividade
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Para ajustar ligao da hemoglobina ao oxignio, Hill formulou a seguinte equao: [ ] [ ] Em que Y a frao de protena ligada, [A] a concentrao de substrato, a constante de semi-saturao, e [ ] [ ] Na equao de Michaelis Menten o coeficiente de Hill igual a 1, ou seja, no existe cooperatividade. Quando a cooperatividade positiva, h > 1; quando a cooperatividade negativa, h < 1. o coeficiente de Hill.
Modelos explicativos
Modelo de Hill No modelo de Hill a cooperatividade extrema, ou seja, ou no h ligao de substrato ou todos os centros tm substrato ligado. O ndice de cooperatividade apenas indica o nmero de centros de ligao para o ligando na situao limite. O grfico de Hill obtm-se atravs da seguinte equao: ( ) [ ] a ordenada na origem. ) Razo entre as concentraes de
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Modelo de Adair Supe-se que existem dois centros de ligao no enzima. um modelo geral para interao entre protena e mltiplos ligandos, assumindo associao/dissociao em equilbrio.Este modelo soluciona o problema do modelo de Hill, ou seja, a cooperatividade no extrema. So as constantes de cooperatividade intrnseca que ao variarem permitem explicar a cooperatividade. Se o valor de K, constante de dissociao microscpica, aumentar, tem-se cooperatividade negativa. Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva.
As definies de cooperatividade por Hill e Adair no so totalmente equivalentes mas so quantitativamente idnticas (ambos definiram um ndice de cooperatividade: se se observar cooperatividade positiva pela equao de Hill tambm se observar em Adair mas o valor ser diferente, consoante a equao que se aplique). A equao de Adair (quando aplicvel) tem maior significado fsico dado que mais adequado pensar-se que os ligandos se ligam a tempos diferentes, mas no permite calcular Induced-fit Surge o conceito de flexibilidade e desaparece o conceito de proximidade. Segundo este modelo uma alterao conformacional no enzima e posteriormente ocorre a ligao do ligando: o centro ativo tem o potencial Pgina 80 de 84 .
para ligar o substrato mas s adota a conformao correta quando este se liga (alterao conformacional conseguida pela ligao dos diferentes grupos do substrato com o enzima). Este modelo permitiu explicar a alosteria e a cooperatividade como efeitos distncia.
Modelo Concertado ou Simtrico: Enzimas oligomros em que, na ausncia de ligando, cada subunidade pode estar em duas conformaes: R (relaxada representada por um circulo) e T (tensa representada por um quadrado)
Substrato tem maior afinidade para a forma relaxada (Kr<Kt) No oligmero, todas as subunidades tm a mesma conformao, ou esto todos na forma relaxada ou todos na forma tensa. Aforma tensa, Tn, est em equilbrio com a forma relaxada, Rn, com constante de equilbrio constante alostrea.
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Casos particulares: 1. Quando n=1, apenas existe um centro de ligao por enzima, logo:
2. L= 0, da equao
3. L, da equao
Resumindo, segundo este modelo: Para haver cooperatividade so necessrias 2 conformaes (pelo menos) Essas formas tem de ser funcionalmente diferentes (K R KT ) Explica modificadores alostreos (efeitos heterotrpicos): o Ativador tem maior afinidade pela forma relaxada o Inibidor tem maior afinidade pela forma tensa.
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Modelo KNFKoshland, Nmethy,Filme r A protena s pode ter diferentes conformaes na presena de ligandos. Assim, as diferentes conformaes no esto implcitas na protena e s ocorrem se houver ligandos. A presena de ligandos induz uma alterao conformacional que perpetuada s outras subunidades. Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois admite a existncia de formas hbridas e permite explicar a cooperatividade negativa. Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa forma R. Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenmenos de cooperatividade das cincias da vida. Ambos os modelos existem porque admitem que as protenas so oligmeros. No entanto, pode haver cooperatividade em protenas s com uma subunidade. Resumindo, este modelo: Gera expresses de y vs a complexas, por exemplo:
A forma da curva determinada pela relao entre K R:R e KR:T K0.5 depende de KT, KA e KR:R Consegue explicar cooperatividade positiva e negativa consoante relao entre KR:R e KR:T o o Cooperatividade positiva (R:R mais estvel que R:T) Cooperatividade negativa (R:T mais estvel que R:R)
enzima
encontra-se
inicialmente na sua forma tensa e vai passando para a forma ativa, relaxada, conforme seja necessrio.
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Modelos de associao dissociao Cooperatividade pode resultar de equilbrio entre formas de protena em diferentes estados de agregao (no h relao entre cooperatividade e alteraes conformacionais) O ligando tem afinidades diferentes para as diferentes formas Semelhanas com o modelo de simetria mas nas equaes aparece concentrao de protena (o que constitui uma vantagem prtica)
Modelos cinticos Modelo de Ferdinand e Rabin A cooperatividade pode surgir por motivos cinticos.
Consequentemente, uma nica cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma estrutura quaternria.
Modelo de Rabin o substrato que provoca alteraes conformacionais no enzima (EA) e s assim que vai ser possvel dar o produto.
O enzima tem memria e lembra-se da conformao que tinha quando o substrato estava em baixas concentraes. A este fenmeno designa-se por histerese (tendncia de um material ou sistema de conservar suas propriedades na ausncia de um estmulo que as gerou)
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