Craiova Medical

Vol 9, Nr 4, 2007

Studiu clinic
Unele consideraii genetice privind asocierea microftalmiei cu defecte dentare
ZORICA-ILEANA HERTZOG(1), D. HERTZOG(2)
(1)

UMF Craiova, Facultatea de Medicin Dentar, disciplina de Genetic, (2)UMF Craiova, Facultatea de Medicin Dentar, disciplina de Farmacologie

Several genetic considerations regarding the association between microphtalmia and dental defects
REZUMAT Introducere. In ultimii ani au fost
inregistrate progrese remarcabile in identificarea determinantilor moleculari care controleaza dezvoltarea segmentului cefalic, in special dezvoltarea ochilor si a dintilor. Pentru ca toate aceste defecte oculare afecteaza calitatea vietii si, uneori, chiar viata, este necesar sa se identifice cauza genetica a acestor anomalii pentru formularea unui consult genetic corect si a unei strategii terapeutice adecvate. Lucrarea noastra ii propune sa realizeze un studiu genetic in cateva cazuri cu anomalii oculare asociate cu defecte dentare si sa formuleze o retea de semnalizare in care calea de semnalizare a dezvoltarii ochilor se intersecteaza cu aceea a dezvoltarii dintilor. Material si metode de lucru. Au fost luate in studiu 3 cazuri care au prezentat anomalii oculare. Pentru fiecare caz a fost efectuata analiza citogenetica, arborele genealogic si sa urmrit frecvena SCE (sister chromatid exchanges) induse cu bleomicin. Rezultate. Intr-un caz diagnosticat cu sindrom Hallermann Streiff Franois, la care microftalmia a fost asociat cu incisivi de form conic, analiza citogenetic a relevat un cariotip normal (46,XX). Intr-un alt caz, care a etalat microftalmie, strabism, blefaroptoz si anomalii dentare (hipodontie, implantare vicioasa), examenul citogenetic a evidentiat o delXq (16%) alaturi de un cariotip normal (84%). La al treilea caz, care a prezentat microftamnie si cataracta congenitala asociate cu dinti supranumerari (un mesiodens conic) si o usoara retardare mentala, am identificat un izodicentric X in 25% din metafazele examinate. Tratamentul culturilor de celule cu bleomicin, un cunoscut clastogen, a condus la o crestere semnificativa a SCE in toate cele trei cazuri in comparatie cu probele de control, obtinute de la donori voluntari. Analiza genealogica arata o transmitere autozomal recesiva in primele doua cazuri si o transmitere dominanta X-linkata in al treilea caz. Concluzii. Frecventa crescuta a aberaiilor cromozomiale i a SCE induse demonstreaza o deficienta a enzimelor de reparare a leziunilor ADN. Este foarte posibil ca repararea defectuoas a AND s contribuie la defectele oculare i dentare. Asocierea microftalmiei cu anomalii dentare presupune existenta unei complexe retele de semnalizare in dezvoltarea segmentului cefalic in care diferiti factori de transcriptie (Pax6, Pax9, MITF) interactioneaza, iar mutatiile unei gene influenteaza negativ activitatea celorlalte gene.

ABSTRACT Introduction. Remarcable progresses in

the identification of molecular determinants checking both the cephalic segment, and especially, eyes and teeth developments have been achieved in the last years. Because all these ocular defects prevent a good quality of life, and sometimes even the life itself, it is necessary that the genetical cause of these annomalies should be identifiedin order to formulate a correct genetic consulting and an adequate therapeutic strategy. The aim of the paper has to achieve a genetic study in some cases with ocular anomalies associated to dental defects and also to formulate a signal pathway where that of the eyes development intersects to the dental development one. Material and methods. Three patients displaying ocular annomalies have been taken in study. Cytogenetic analysis, pedigree and SCE (sister chromatid exchanges) induced by bleomycin were performed for each case. Results. In a case diagnosed with Hallermann Streiff Franois where microphtalmia has been associated with cone-shaped incisors, cytogenetic analysis shows a normal karyotype (46,XX). In the other case, which exhibited microphtalmia, blepharoptose and dental anomalies (hypodontia, mistaken teeth), the cytogenetic analysis emphasized del(Xq) (16%) and a normal karyotype (84%). In the third case with microphtalmia, congenital cataract, mesiodens cone-incisor and a slight mental retardation, we identified a isodicentric chromosome X in 25% examinated metaphases. The treatment of cell cultures with belomycin, a well-known clastogen, led to a significant increase of chromosomal aberrations and SCE in all the three cases with respect to control samples, obtined from health individuals. Genealogical analysis shows a recessive-autosomale transmission in the first 2 cases and dominante X-linkate in the third case. Conclusions. The increased rate of induced chromosomal aberrations and SCE demonstrated a deficiency in repairing enzymes of DNA lesions. It is very possible that the defective repair of DNA to contribute to ocular and dental defects. The association between microphtalmia and dental deffects suggests the existence of an signaling inrtricate network in the development of the cephalic segment where different transcription factors (Pax6, Pax9, MITF) interact, and the mutations of a gene negatively influences the activity of the other genes.

CUVINTE CHEIE microftalmie, anomalii dentare,

instabilitate cromozomial indus, reea complex de semnalizare

KEY WORDS microphtalmia, dental anomalies,

induced chromosomal instability, a signaling intricate network.

Prof. Univ.Dr Zorica-Ileana Hertzog, UMF Craiova, Facultatea de Medicin Dentar, Disciplina de Genetic

306

Craiova Medical

Vol 9, Nr 4, 2007

Introducere
Tulburrile oculare sunt relativ frecvente n populaia uman, deoarece ele sunt compatibile cu supravieuirea i cu reproducerea. Majoritatea defectelor oculare sunt ereditare i se transmit dup modelul mendelian. Anomaliile oculare congenitale sunt contributorii majori ai morbiditii vizuale la copii. Microftalmia este prezent n peste 200 de sindroame cromozomice i cu toate acestea exist foarte puine lucrri care se refer la genetica microftalmiei, asociate cu alte anomalii oculare, dar i cu o serie de malformaii ale membrelor i ale viscerelor. Deoarece dezvoltarea normal a ochilor, ca i de altfel i a altor organe, se afl sub controlul mai multor gene care codific fie factori de transcripie fie diferite molecule semnalizatoare, se realizeaz o complex interaciune ntre acestea i, astfel, mutaiile unei gene pot influena expresia altor gene care controleaz diferenierea altor organe. Uneori, mutaiile genelor (duplicaii, deleii, inversii, etc.) sunt cauzate de modificri cromozomiale de structur care afecteaz profund procesul de morfogenez. n ultimii ani au fost nregistrate progrese remarcabile n identificarea determinanilor moleculari care controleaz dezvoltarea segmentului cefalic, n special dezvoltarea ochilor i a dinilor. Pentru c toate aceste defecte oculare afecteaz calitatea vieii i, uneori, chiar viaa, este necesar s se identifice cauza genetic a acestor anomalii pentru formularea unui consult genetic corect i a unei strategii terapeutice adecvate. n aceast lucrare ne-am propus s realizm un studiu genetic n cteva cazuri cu anomalii oculare asociate cu defecte dentare, pe baza cruia s sugerm un model de interaciune ntre genele care controleaz dezvoltarea ochilor i genele care sunt implicate n dezvoltarea dinilor. Tratamentul cu bleomicin. n dou cazuri, culturile de limfocite au fost tratate, pentru un interval de 48 de ore, cu bleomicin n concentraie final de 100 mcg/mL, n scopul de a demonstra capacitatea celulelor de a rspunde la un agent clastogen. Tehnica SCE. Tehnica a inclus tratamentul culturilor de celule pentru 48 de ore cu BrdU (un analog al timinei) n concentraie final de 4.105 M, coloraia preparatelor cromozomiale cu Hoechst 33258, iradiere cu raze UV i coloraie Giemsa (Hertzog, 1998). Arborele genealogic. Arborele genealogic a fost alctuit pe baza informaiilor obinute de la prinii probanzilor.

Rezultate i discuii
Un caz (AA) n vrst de 7 ani i jumtate, de sex feminin, diagnosticat cu sindrom Hallermann Streiff Franois, a etalat un facies mbtrnit, microftalmie bilateral, hipotricoz generalizat i statur mic. Dinii aveau form conic. Analiza citogenetic a relevat un cariotip normal 46,XX, ns tratamentul leucocitelor cultivate cu bleomicin a condus la instabilitate cromozomial manifestat prin rupturi, lacune, rearanjamente cromozomiale (fig. 1-2), iar analiza SCE a artat o frecven crescut a acestora (fig. 3) n comparaie cu probele de control, obinute de la donori sntoi, de sex feminin. Metafazele cu modificri cromozomiale au reprezentat 85% n comparaie cu metafazele aberante din culturile de control, care au reprezenatat 6%. SCE/celul au etalat o frecven cuprins ntre 90-128 /celul, comparativ cu 11-13 SCE/celul n celulele de control. Aceste rezultate sugereaz o deficien a enzimelor reparatorii ale leziunilor ADN. Ca urmare a acestui defect, este posibil ca genele implicate n embriogenez s fie afectate.

Material i metod
Au fost luate n studiu 3 cazuri care au prezentat anomalii oculare. Pentru fiecare caz a fost efectuat analiza citogenetic, arborele genealogic i s-a urmrit frecvena SCE (sister chromatid exchanges), un indicator sensibil al mutagenitii. Analiza citogenetic a fost efectuat prin cariotipare standard i a cuprins: iniierea de culturi de limfocite, prepararea cromozomilor i colorarea lor pentru benzi G. Pentru fiecare caz au fost examinate 25 de metafaze.
Fig. 1 Metafaz prezentnd rupturi

307

Zorica-Ileana Hertzog, Dan Hertzog : Unele consideraii genetice privind asocierea microftalmiei cu defecte dentare

dentare (hipodonie, implantare vicioas a dinilor). Analiza citogenetic arat un cariotip normal 46,XX n mozaic cu un cariotip n care este prezent o deleie pe braul lung al cromozomului X, care a aprut n 16% dintre metafaze (fig. 5). Tratamentul celulelor cu bleomicin a fost urmat, de asemenea, de o cretere semnificativ a aberaiilor cromozomiale i a SCE. Analiza genealogic arat o transmitere autozomalrecesiv.

Fig.2 Metafaz prezentnd interschimburi cromozomiale.

Fig. 5 Cariotip parial al deleiei unui cromozom X n cazul PV.

B
Fig. 3 Metafaz prezentnd numeroase schimburi ale cromatidelor surori (SCE). (A)control; (B) proba.

Al treilea caz, PR, de sex masculin, n vrst de 16 ani, a prezentat microftalmie bilateral, cataract congenital, microcornee i un dinte supranumerar de form conic, (incisiv mesiodens) (fig. 6) i o uoar retardare mental. Examenul citogenetic a relevat n 75% dintre metafaze un cariotip normal, 46,XY, iar n 25% din metafaze a fost evideniat un izodicentric X (fig. 7).

Cele mai multe cazuri cu sindrom HallermannStreiff Franois sunt sporadice. Au fost menionate o transmitere autozomal-dominant cu expresie variabil, dar i o transmitere autozomalrecesiv. Cazul nostru arat o transmitere autozomal-recesiv (fig. 4).

Fig. 4 Arborele genealogic al cazului AA.

Al doilea caz (PV), de sex feminin, n vrst de 10 ani, a prezentat microftalmie bilateral, strabism, blefaroptoz, sindactilie i anomalii
308

Fig. 6 Incisiv mesiodens. Studiul arborelui genealogic arat o transmitere dominant X-linkat (fig. 8). n aceast familie, microftalmia a fost asociat cu cataracta congenital, anomalii dentare i cu diferite grade de inteligen. Pacienii 2-III i 3-III au prezentat retardare mental uoar, n schimb la 5-III, retardarea mental a fost sever. Anomaliile dentare cele mai frecvente n aceast familie au

Craiova Medical inclus diastem larg i dini n form de frunz i de mrime mic.

Vol 9, Nr 4, 2007 hipofosforilarea proteinei Rb (Loercher i col., 2005). MITF stimuleaz transcripia genelor care codific enzime ce controleaz sinteza melaninei (Planque i col., 2001). Mutaiile genei Mitf la oarece conduc la microftalmie asociat cu o dezvoltare anormal a epiteliului pigmentar al retinei care apare nepigmentat, iar la om, induc sindromul Waandenburg tip 2, o condiie ereditar asociat cu anormaliti ale melanocitelor (Bertolotto i col., 1998). Anomaliile oculare determinate de mutaiile Mitf trebuie analizate prin prisma promotorilor genei. Exist 4 izoforme ale exonului 1: 1A, 1H, 1B i 1M n direcia 5'3', fiecare codificnd un N-terminus unic fiecrei izoforme. Regiunile care flancheaz 5' a izoformelor exonului 1 au fost denumite promotorii A, H, B i M. Dintre aceti promotori, promotorul M este funcional numai n linia celular din care deriv melanocitele i este reglat pozitiv prin calea de semnalizare Wnt. Mai mult, promotorul M este reglat pozitiv de o serie de ali factori de transcripie (PAX3, SOX10 i CREB) (Shibahara i col., 2001). Produsul celular al genei Pax-6 este un factor de transcripie, iar mutaiile genei Pax-6 produc microftalmie i aniridie. Proteinele MITF i PAX6 interacioneaz ntr-o cale de semnalizare care controleaz dezvoltarea ochilor. O ntrebare fireasc apare: Cum este posibil ca mutaiile genelor implicate n dezvoltarea ochilor s influeneze dezvoltarea anormal a dinilor? Noi ncercm s rspundem la aceast ntrebare sugernd o interaciune complex ntre produii celulari ai genelor care se exprim n perioada de embriogenez (fig. 9).

Fig. 7 Metafaz, bandat G, etalnd un i dic(X) (cazul PR).

Fig. 8 Arborele genealogic al cazului PR.

Discuii
Analiza citogenetic la cazurile investigate a artat ntr-un caz cariotip normal, iar n dou cazuri mozaicuri cu dou linii celulare: una normal i alta cu aberaii cromozomiale de structur. Frecvena lor mic sugereaz producerea lor ntr-o faz mai tardiv a embriogenezei, dar frecvena crescut a aberaiilor de structur i a SCE cnd celulele au fost tratate cu bleomicin, indic o deficien a enzimelor implicate n repararea leziunilor ADN. Este foarte posibil ca repararea defectuoas a ADN, evideniat printr-o frecven crescut a rupturilor, s contribuie la defectele oculare i dentare (Hou, 2003). Microftalmia este determinat de mutaii n gena Mitf (microphtalmia transcription factor) care este localizat n intervalul 3p14.1-p12.3 (Tachibana i col., 1994), iar dezvoltarea normal a ochilor este condiinat de gena Pax-6, localizat pe cromozomul 11. Produsul celular al genei Mitf, un factor de transcripie, are rol n controlul diviziunii celulare i n diferenierea celulelor. Factorul de transcripie MITF blocheaz ciclul celular prin activarea expresiei proteinei p16INK4A i prin

Fig. 9 O posibil reea de semnalizare n morfogeneza ochilor i a dinilor.

Gena Wnt13 (Wingless), care se exprim foarte timpuriu n embriogenez, controleaz expresia genei Shh (Sonic Hedge Hog) n epiteliul dentar i a genei Mitf n epiteliul pigmentar al retinei. Dar pentru inducia i meninerea expresiei genelor

309

Zorica-Ileana Hertzog, Dan Hertzog : Unele consideraii genetice privind asocierea microftalmiei cu defecte dentare

Wnt13 i Mitf, gene specifice epiteliului pigmentat al retinei, este necesar mezenchimul extraocular care elibereaz molecule semnalizatoare asemntoare activinei (Fuhrmann i col., 2000). Dac MITF interacioneaz cu factorul de transcripie PAX-6, atunci este simplu s se sugereze c MITF poate interaciona i cu ali factori ai familiei PAX, cum ar fi de exemplu PAX-9 care codific, de asemenea, un factor de transcripie ce controleaz numrul dinilor. O mutaie n oricare din aceste gene poate influena dezvoltarea anormal a dinilor. Asocierea microftalmiei cu cataracta congenital i cu anomalii dentare poate fi explicat prin prisma mutaiilor genei Nhs (NanceHoran syndrome) care este localizat pe cromozomul Xp22 i care are un rol cheie n controlul diferenierii segmentului cefalic al embrionului. Gena Nhs este activ n timpul dezvoltrii embrionare i codific o protein cu rol reglator n diferenierea cristalinului, difereniere care are loc concomitent cu dezvoltarea dinilor (Burdon i col., 2003). Cum gena Nhs se gsete n imediata vecintate a genei Amg (amelogenin Xp22.1) i a genei Mrx2 (retardare mentalXp22). Pentru c aceste gene sunt foarte apropiate, iar posibilitatea unei recombinri genice este practic nul, este foarte posibil ca mutaia unei gene s influeneze negativ expresia genelor nvecinate; de altfel, exist numeroase exemple n patologia genetic n care mutaia unei gene are efect pleiotropic.

alta cu o aberaie de structur, prevalent fiind linia euploid. Este foarte posibil ca repararea defectuoas a ADN, evideniat printr-o frecven crescut a rupturilor i a SCE induse de bleomicin, expresie a deficienei enzimelor reparatorii, s contribuie la defectele oculare i dentare. Limitarea acestor malformaii n populaie necesit imperativ investigaii genetice moleculare prin amniocentez ntr-o instituie de stat sau privat autorizate. Bibliografie
1. Bertolotto C., Abbe P., Hemesath TJ., Bille K., Fisher DE., Ortonne JP., Balotti R., (1998) Microphtalmia gene product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. J Cell Biology, 142 (3): 827-835. 2. Burdon KP., McKay JD., Sale MM., Russell-Egitt IM., Mackey DA., Wirth MG., Elder JE., Nicoll A., Clarke MP., FitzGerald LM., et al., (2003) Mutations in a novel gene, NHS, cause the pleiotropic effects of Nance-Horan syndrome, including severe congenital cataract dental anomalies, and mental retardation. Am J Hum Genet., 73: 1120-1130. 3. Fuhrmann S., Levine EM., Reh TA., (2000) Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development, 127: 4599-4609. 4. Hou JW., (2003) Hallermann-Streiff syndrome associated with small cerebellum endocrinopathy and increased chromosomal breakage. Acta Pediatr., 92:869-871. 5. Loercher AE., Tank EMH., Delston RB., Harbour JW., (2005) MITF links differentiation with cell cycle arrest in melanocytes by transcriptional activation of INK4A. J Cell Biology, 168 (1) 35-40. 6. Planque N., Leconte L., Coquelle FM., Martin P., Saule S., (2001) Specific Pax-6/microphtalmia transcription factor interactions involve their DNAbinding domains and inhibit transcriptional properties of of both proteins. J Biol Chem., 276 (31): 29330-29337. 7. Shibahara S., Takeda K., Yasumoto K., Udono T., Watanabe K., Saito H., Takahashi K., (2001) Microphtalmia-associated transcription factor (MITF): Multiplicity in structure, function, and regulation. J Investig Dermatology, 6 (1): 99. 8. Tachibana M., Perez-Jurado LA., Nakayama A., Hodkinson CA., Li X., Schneider M., Fex J., Francke U., Arnheiter H., (1994) Cloning of MITF, the human homolog of the mouse microphtalmia gene and assignement to chromosome 3p14.1-p12.3, Hum Mol Genet., 3 (4): 553-557.

Concluzii
Microftalmia se asociaz ntotdeauna cu alte modificri oculare i cu anomalii dentare i aceasta pentru c produii celulari ai genelor care controleaz dezvoltarea ochilor interacioneaz cu produii celulari ai genelor care controleaz dezvoltarea dinilor i invers sau mutaiile unei gene pot exercita un efect pleiotropic aupra genelor linkate. Unele cazuri cu microftalmie au etalat cariotipuri normale, iar altele au prezentat mozaicuri cu dou linii celulare: una euploid i

Adresa pentru coresponden: Prof. univ.dr. Zorica Ileana Hertzog,,UMF Craiova, Facultatea de Medicin Dentar, disciplina de Genetic

310