TCNICAS DE LABORATORIO

FROTIS
Extensin de una mnima cantidad de una muestra biolgica sobre una lmina portaobjetos de vidrio, para someterla a un proceso de tincin y su posterior examen microscpico.

Mtodos para la preparacin del Frotis

1.- En forma directa:

2.- Frotis indirecto:

MTODOS DE TINCIN BACTERIANA

Los mtodos de Tincin o Coloraciones se basan en el uso de colorantes biolgicos que tienen propiedades qumicas de ciertos grupos ionizables. Se da un proceso de intercambio inico en la reaccin de la tincin o coloracin bacteriana

Mtodo de tincin simple:

Es el mtodo ms fcil de realizarlo, se efecta aplicando un solo colorante bsico en solucin sobre la extensin o frotis de la muestra que ha sido ya fijado y enfriado.

Mtodo de tincin diferencial: El mtodo de tincin diferencial se usa para poder distinguir las partes constitutivas de la estructura bacteriana, mediante la aplicacin de dos o ms colorantes y de otros reactivos complementarios.

Coloracin Gram Reactivos:

Reactivos de la coloracin Gram:

VIOLETA CRISTAL, 30-60 SOLUCIN DE YODO- 60 MEZCLA DE ALCOHOL-ACETONA 30 %, 10 FUCSINA o SAFRANINA: 15-30 AGUA DESTILADA O AGUA CORRIENTE para el lavado del

frotis despus de cada paso de la coloracin.

Las bacterias Gram Positivas no se decoloran, debido a la constitucin de la pared celular, que es mas gruesa y menos permeable a las molculas pequeas y no pueden atravesar la pared, el alcohol cierra tambin los poros de la membrana celular, y no deja escapar al exterior el complejo violeta de cristal - yodo, dando el color violeta a la clula.

En cambio las bacterias Gram negativas se decoloran ya que la constitucin de la pared es diferente, pues, contiene un alto porcentaje de LIPIDOS o substancias grasas, hasta un 20 por ciento, que son disueltas y extradas por la accin de alcohol. El alcohol aumenta tambin la porosidad de la membrana celular y penetra en la bacteria para extraer el complejo violeta cristal-yodo que se elimina fcilmente hacia el exterior.

COLORACIN ZIELHNEELSEN

Identificacin de M. tuberculosis, y M. leprae. Hay tambin otras pocas bacterias que se consideran acidorresistentes leves, como los Actinomicetos (Nocardia), y ciertas especies de Corynebacterium, como el C. equi, que infecta los animales

El bacilo de la Tuberculosis puede identificarse en: Esputo, lavado bronquial y gstrico. En el sedimento de la orina, en heces; en el lquido cefalorraqudeo, Otros fluidos corporales como: pleural, pericrdico, peritoneal, pus, etc.

PROCEDIMIENTO: Frotis

La SOLUCIN DE ZIELH-NEELSEN est constituida por fucsina fenicada o fenolada o carbofucsina, que se aplica sobre el frotis por 35 minutos, sometindola a la accin suave del calor por debajo del portaobjetos, hasta que salgan ligeros vapores, sin dejar secar la solucin ni que burbujee.

Lavar el portaobjetivos que contiene el frotis hasta que se elimine la mayor cantidad del colorante de fuscina.

Aplicar el alcohol cido, que contiene 3% de cido clorhdrico, y se deja actuar durante 35 minutos, para tratar de eliminar casi todo el colorante de fucsina. Lavar. Aplicar el colorante de azul de metileno, por un minuto que es la tincin de contraste y da un fondo azul.

El bacilo de la Tuberculosis y el de la Lepra, NO SON GRAMNEGATIVOS, sino ACIDORESISTENTES, fundamentalmente porque "retienen en su pared celular la fucsina fenolada, la cual NO SE ELIMINA AL EXTERIOR de la clula por la accin del alcohol cido, y los bacilos quedan teidos de rojo.

La reaccin de coloracin se explica porque los bacilos acidorresistentes contienen en su pared celular gran cantidad de LIPIDOS, hasta el 40% de peso seco de la clula. Estos lpidos estn compuestos por FOSFOLIPIDOS Y CERA. Una parte importante de esta cera soluble es el ACIDO MICOLICO, que guarda relacin con la propiedad de acidorresistencia, y que puede considerarse como el substrato en esta reaccin de tincin.

BACILOSCOPIA
REGISTRO / INFORME
(-) Negativo N de BAAR encontrados (+) Positivo (++) Positivo

N DE BAAR
No se encuentran BAAR en 100 campos microscpicos 1 9 BAAR en 100 microscpicos 10 99 BAAR en 100 campos microscpicos 1 10 BAAR por campo en 50 campos microscpicos Ms de 10 BAAR por campo en 20 campos microscpicos.

(+++) Positivo

Para que se puedan observar bacilos de la tuberculosis en el esputo, es necesario que ste contenga por lo menos 100.000 bacilos por ml. En este caso se considera al paciente como altamente infeccioso. Con un golpe de tos, un paciente tuberculoso puede lanzar al aire un ncleo de expectoracin que contiene hasta 100.000 bacilos.

COMPOSICIN BSICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deben cubrir todas las necesidades nutricionales de los microorganismos.
Los medios de cultivo son lquidos cuando los nutrientes estn en solucin acuosa. Si a un medio liquido se aade una sustancia gelificante como agar, se obtiene un medio slido.

Agua
Peptonas.- Se obtienen por hidrlisis acida o enzimtico de protenas. Constituyen una fuente de nitrgeno, de carbono y azufre. Glcidos.Mediante su degradacin enzimtica, suponen una fuente de energa y de carbono para las bacterias. El mas utilizado es la glucosa, aunque tambin se emplea la fructosa, disacridos como la sacarosa y lactosa, polisacridos como el almidn.

Extracto de carne.- Es un concentrado de productos hidrosolubles de la carne de composicin indefinida pero rico en xantina e hipoxantina, glucgeno, acido lctico, grasas, vitamina B y oligoelementos. La carne puede ser como por ejemplo: corazn, msculos, hgado bovino o cerebro. Extracto de levadura.- Procede de la hidrlisis cida o enzimtica de la levadura que ha sido previamente lisada por el calor (levadura de pan o cerveza). Aporta nitrgeno y otras sustancias que son factores de crecimiento. Suero o sangre de caballo o carnero, vitamina.Constituyen elementos importantes para las bacterias exigentes en factores nutritivos.

Cloruro sdico.- Se emplea para equilibrar la presin osmtica del medio.

Sales minerales u otras sustancias que microorganismos sean incapaces de sintetizar

los

Agentes solidificantes.- Se incorporan a los medios lquidos para preparar medios slidos. El agar es un polisacrido obtenido a partir de algas rojas como Gelidium corneum. Es insoluble en agua fra y soluble en agua caliente, funde entre 80 y 100 C y se mantiene en este estado enfriando hasta 45 C. Por debajo de esa temperatura, solidifica dando lugar a un gel muy transparente y resistente a la hidrlisis bacteriana.

Agentes selectivos.- Sustancias qumicas, colorantes, antimicrobianos etc. agregados al medio lo pueden convertir en selectivos para determinados organismos ejm. cristal violeta, sales biliares, telurito de potasio, antibiticos. Sistemas amortiguadores.- Consisten en sales como fosfatos que son incorporados a los medios de cultivos para mantener un ph adecuado en el cultivo. Indicadores de ph.- Se incorporan a los medios de cultivo para dar prueba visual de las variaciones del ph , estas concentraciones no deben ser txicas.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO

SEGN SU CONTENIDO:

Definidos o sintticos.- Son los medios cuya composicin qumica exacta se conoce porque se han elaborado aadiendo los productos qumicos puros e individualizados. Empricos, indefinidos o no sintticos.- En stos, su composicin exacta es desconocida, y su empleo se basa en la experiencia. Es el caso de los medios preparados con peptonas, extractos de carne y de levadura.

SEGN SU ESTADO FSICO

Lquidos.- Tienen los nutrientes disueltos en agua y poseen consistencia lquida. Permiten evaluar el tipo de crecimiento, que ser caracterstico del microorganismo. En estos medios. Es donde se estudian las curvas de crecimiento bacteriano. Slido.- En general, son los mismos medios lquidos a los que se ha aadido una sustancia inerte solidificante como es el agar. Cuando se vierten en placas Petri, aparece una superficie plana y lisa para la siembra. En el lugar donde se deposita una bacteria, su multiplicacin se traduce en la formacin de una masa, macroscpicamente visible, denominada colonia, que es un clon procedente de una misma bacteria. Semislidos.- Contienen slo pequeas cantidades de agar y se pueden emplear para estudiar diferentes comportamientos de las bacterias, tales como su movilidad, o para realizar determinadas pruebas bioqumicas.

SEGN SU UTILIDAD

Usuales o bsicos.- Contienen las sustancias nutritivas mnimas para el crecimiento de las bacterias metablicamente no exigentes. Enriquecidos.- Adems de los componentes bsicos, se han aadido ciertas sustancias imprescindibles para el desarrollo de microorganismos exigentes en requerimientos nutritivos. En ellos, crecern prcticamente todas las bacterias. Tienen en su composicin sustancias como sangre, albmina o suero. Diferenciales.- Incorporan elementos que facilitan la diferenciacin de las colonias formadas por uno u otro tipo de bacterias, generalmente por variaciones de color de las colonias, consecuencia de la manifestacin de algunas propiedades bioqumicas de estos microorganismos. As, por ejemplo, el agarsangre diferencia a las bacterias que producen hemlisis de las que no la producen, y el agar Mac Conkey, que en su composicin incorpora lactosa y un indicador de pH.

SEGN SELECCIN

Selectivos.- Generalmente son slidos e inhiben el crecimiento de unas bacterias, permitiendo el crecimiento de otras. Contienen sustancias inhibidoras tales como: bilis, cristal violeta, antibiticos, o sustancias que modifican el pH hasta valores en los que solo se puedan desarrollar determinadas bacterias.

De enriquecimiento.- Normalmente son lquidos y dificultan el crecimiento de bacterias permitiendo crecer fundamentalmente a la que interesa aislar. Por ejemplo, el caldo selinito, impide el crecimiento de Escherichia Coli, permitiendo la multiplicacin de Salmonella, el agua de peptona alcalina tiene un pH de 8.4 y se utiliza como enriquecimiento para detectar Vibrio Cholerae.

De conservacin.- Sirven para mantener la viabilidad de los microorganismos que en ellos se colocan durante mucho tiempo en condiciones de baja temperatura; suelen llevar leche o glicerol, entre otros componentes. Sin embargo, la mejor forma de conservar los microorganismos es recurriendo a la liofilizacin. De identificacin.- Se utiliza para detectar diferentes productos catablicos microbianos.

TIPOS DE CULTIVO SEGN LA CAPACIDAD DE UTILIZACIN DE OXGENO

Existen 2 tipos de cultivos, dependiendo del microorganismo a aislar segn la capacidad de utilizacin de oxgeno:

Aerobios.- La mayora de los medios de cultivo permiten la utilizacin de oxgeno atmosfrico por las bacterias. El medio de transporte para estudio de bacterias aerobias de todo tipo de muestras es el Stuart o Amies, que est constituido por agar agar, un buffer y agua.
En medio lquido, el microorganismo crece en la disolucin, donde la concentracin de oxgeno es menor, y disminuye en funcin del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminucin de oxgeno, utilizamos dos recursos:

Agitacin Adicin de aire u O2 estril mediante burbujeo

Anaerobios.- Se modifica el contenido del oxgeno por el uso de tapones de parafina o por aceite en la superficie de tubos de cultivo. Permite el crecimiento de bacterias anaerobias estrictas o de otras que lo utilizan en mnimas proporciones. Ejemplo: Medio de Tioglicolato con indicador, para clostridios. El caldo de cultivo para bacterias anaerbicas es el tioglicolato de sodio, que contiene sustancias reductoras del potencial de xido reduccin y est contenido en un tubo hermtico (tapn de goma o tapa rosca).

SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO

La seleccin se hace segn el propsito de la investigacin y el siguiente esquema:

Por la procedencia de la muestra: cavidad oral, nasal, de ojos, nariz, secrecin, del tracto urogenital, piel, heridas, etc. De acuerdo al resultado de la tincin del frotis de la muestra, y la presencia de bacterias, ya sean grampositivos o gramnegativos.
Los grampositivos, en su mayora, crecen mejor en el medio deAGAR

SANGRE. Aqu se observan las reacciones de hemlisis. Se puede adicionar CO2 a este medio, para bacterias anaerobias.
Los gramnegativos, crecen ms abundantemente en los medios de

cultivo que contienen AZCARES. Como la lactosa, glucosa, dextrosa, etc.