PROVAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICAO DE BACILOS GRAMNEGATIVOS Esta aula tem como objetivo a identificao de enterobactrias em gneros ou espcies,

atravs da utilizao de meios de cultura especiais que possibilitam a verificao da presena de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vrios substratos. As alteraes nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano serviro de base para sua identificao de acordo com o esquema a seguir: 1) PLAQUEAMENTO SELETIVO a etapa de isolamento bacteriano a partir do espcime clnico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presena dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactrias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactrias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem cidos que dissociam este sal, apresentando-se como colnias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as no fermentadoras (LAC-) formam colnias transparentes. 2) CONFIRMAO BIOQUMICA um conjunto de provas bioqumicas necessrias para a identificao das colnias suspeitas. Sero utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentao da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactrias isoladas em espcimens clnicos. A) Meio EPM O meio EPM contm os testes de fermentao e produo de gs a partir de glicose, produo de H2S, hidrlise da uria e desaminao de triptofano. B) Meio MILi O Meio MILi contm os testes de motilidade, indol e descarboxilao de lisina. C) Citrato de Simons Este teste permite identificar espcies que utilizam citrato como nica fonte de carbono. 2.1) Fundamento terico: Hdrlise da uria: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uria, formando duas molculas de amnia pela ao da enzima urease (uria 2 NH3 + CO2 + H2O). Motilidade: O teste visa verificar se a bactria mvel ou imvel. Logo pode ajudar na diferenciao de alguns gneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactrias proporcionada pela presena de um ou mais flagelos. As bactrias imveis no possuem flagelos.

Produo de indol: Este teste tem como princpio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molcula de triptofano. Pode ajudar na diferenciao de alguns gneros de bactrias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-). Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo capaz de utilizar citrato como uma nica fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactrias citrato positivas crescem usando sais de amnia como fonte de nitrognio, liberando amnia e conseqentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH o azul de bromotimol, que em meio cido fica amarelo e em meio bsico, azul. Produo de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produo de ons S-2 a partir do metabolismo bacteriano. Produo de gs: Este teste visa determinar a capacidade de produo de gs CO2 a partir da fermentao da glicose. Descarboxilao de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ao da enzima lisina descarboxilase.

2.2) Procedimento: Tocar a colnia com agulha bacteriolgica e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfcie inclinanda. No meio EPM introduzir a agulha at o fundo do tubo e ao retir-la semear a superfcie do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo. 2.3) Leitura e interpretao: A) Meio EPM: Produo de gs: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Produo de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade. Hidrlise da uria: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reao fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou no. Desaminao do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfcie do meio. B) Meio MILi Motilidade: A bactria mvel cresce alm da linha de picada. A imvel somente nesta linha. Resultado Positivo (+) Negativo (-) Cor do meio Crescimento fora do local da picada Crescimento ao redor da picada

Descarboxilao da lisina: Quando a lisina descarboxilada o meio adquire cor prpura acentuada ou discreta. Quando o aminocido no

utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio no estiver amarelo. Produo de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio e agitar levemente. Quando a bactria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando no produz, o reativo mantm sua cor inalterada. Resultado Positivo (+) Negativo (-) Cor do reagente Rosa Amarelo

C) Meio Citrato de Simmons A utilizao do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfcie do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio no sofre alterao. Resultado Cor do meio Positivo (+) Azul Negativo (-) Verde SISTEMA NUMRICO PARA ENTEROKIT B As 9 reaes bioqumicas do Enterokit B foram agrupadas em 3 conjuntos de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um nmero de 3 dgitos, que identifica uma espcie bacteriana. Os 3 conjuntos de provas e seus valores so: Primeiro algarismo Segundo (A) algarismo(B) Lactose 4 Urease Gs 2 LTD H2S 1 Mot Terceiro algarismo(C) 4 2 1 Indol Lisina Citrato 4 2 1

Observaes: 1) Para a interpretao das provas ver item Leitura e Interpretao. 2) Quando a reao da cepa investigada positiva (+), colocamos o nmero correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reao negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores obtidos em cada srie. O valor de A d o primeiro algarismo, o valor de B d o segundo e o valor de C d o terceiro algarismo. Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado bioqumico:

Lactose - 0 Gs -0 H2S +1 Total: 1

Urease LTD Mot Total:

+4 +2 +1 7

Indol -0 Lisina -0 Citrato +1 Total:1

ter o nmero 171 que corresponde na relao bactria Proteus mirabillis