KAEDAH-KAEDAH DALAM

BIOLOGI MOLEKUL
• PENGEMPARAN- PEMISAHAN MOLEKUL/
MAKROMOLEKUL/ORGANEL BERDASARKAN
SAIZ, BENTUK, KELIKATAN & , KETUMPATAN

• ELEKTROFORESIS- PEMISAHAN MOLEKUL/

MAKROMOLEKUL BERDASARKAN CAS

• MIKROSKOPI- PENGAMATAN MOLEKUL/

MAKROMOLEKUL/ORGANEL YANG AMAT
SENI
 PENGEMPARAN
• ALAT PENGEMPAR ADALAH ALAT YANG
DIGUNAKAN UNTUK MEMISAHKAN
BAHAN/PARTIKEL DALAM LARUTAN
• KELAS-KELAS:
-PENGEMPARAN ANALITIKAL/ PENYEDIAAN
-PENGEMPARAN ULTRA DAN KELAJUAN
RENDAH
-PENGEMPARAN PEMBEZA/PENZONAN
http://ntri.tamuk.edu/centrifuge/centrifugation.html
PENGEMPARAN ANALITIKAL
• DIGUNAKAN UNTUK MENGUKUR CIRI
FIZIKAL PARTIKEL YANG DIENAP
SEPERTI KOEFISIEN PENGENAPAN DAN
BERAT MOLEKUL
PENGEMPARAN PENYEDIAAN
• MEMISAHKAN PARTIKEL YANG SPESIFIK
YANG BOLEH DIGUNAKAN SEMULA
• JENIS-JENIS:
-ZON BERKADARAN
-PEMBEZA
-PENGEMPARAN ISOPIKNIK
 PENGEMPARAN ULTRA/
KELAJUAN RENDAH
• BERDASARKAN KELAJUAN
• PENGEMPARAN ULTRA- KELAJUAN
MELEBIHI 20,000 RPM
• PENGEMPARAN ULTRA KELAJUAN
SUPER- KELAJUAN 10,000 RPM-20,000
RPM
• PENGEMPARAN KELAJUAN RENDAH-
KELAJUAN DIBAWAH 10,000 RPM
 PENGEMPARAN PEMBEZA

• PARTIKEL-PARTIKEL YANG TERKANDUNG

DALAM SAMPEL AKAN TERPISAH KE DALAM
SUPERNATAN DAN PELET ATAU BERADA
DALAM KEDUA-DUANYA BERGANTUNG
KEPADA SAIZ, BENTUK, KETUMPATAN DAN
KEADAAN PENGEMPARAN.
• PELET TERKANDUNG DIDALAMNYA
CAMPURAN KESEMUA KOMPONEN TERENAP
DAN BOLEH MENGANDUNGI BAHAN TAK
TERENAP PADA MULANYA
 PENGEMPARAN PEMBEZA

• SUPERNATAN MENGANDUNGI BAHAN YANG

TIDAK TERENAP DAN BOLEH DIENAPKAN
DENGAN PENGEMPARAN PADA KELAJUAN
YANG LEBIH TINGGI
PENGEMPARAN PEMBEZA
PENGEMPARAN PENZONAN

• SAMPEL DILETAKKAN DIATAS LARUTAN

SUKROSA ATAU SESIUM KLORIDA
• PARTIKEL AKAN TERPISAH MENGIKUT SAIZ
& BENTUK (ZON BERKADARAN-MASA) ATAU
KETUMPATAN (ISOPIKNIK)
PENGEMPARAN PENZONAN
PENGEMPARAN PENZONAN
ISOPIKNIK
 KOEFISIEN PENGENAPAN
• APABILA KOMPONEN SEL MISALNYA
DIEMPAR MELALUI LARUTAN
BERKECERUNAN, KOMPONEN SEL ITU AKAN
BERPISAH KEPADA ZON TERSENDIRI ATAU
JALURAN
• KADAR BILA MANA KOMPONEN TADI
MEMISAH DISEBUT SEBAGAI KOEFISIEN
PENGENAPAN ATAU NILAI s (UNIT
SVEDBERG)
• 1 S = 1 X 10-13 SAAT
NILAI KOEFISIEN PENGENAPAN
PARTIKEL ATAU KOEFISIEN
MOLEKUL PENGENAPAN

LISOSOM 9400S
VIRUS MOSAIK TEMBAKAU 198S
RIBOSOM 80S
MOLEKUL RNA RIBOSOM 28S
MOLEKUL tRNA 4S
MOLEKUL HEMOGLOBIN 4.5S
KELAJUAN PENGEMPARAN
• PARTIKEL YANG BERPUSING
MEMPUNYAI DAYA TARIKAN YANG
BERUPA MAGNITUD KEPADA FUNGSI
HALAJU PADA SUDUT TERTENTU
(KELAJUAN PUSINGAN) DAN RADIUS
PENGEMPARAN (JARAK ANTARA BEKAS
SAMPEL DENGAN PUSAT ROTOR
• TERDAPAT 2 CARA UNTUK
MEMPERIHALKAN DAYA TARIKAN INI :
a)KUASA PENGEMPARAN RELATIF
b) PUTARAN SEMINIT (rpm)
 KUASA PENGEMPARAN
RELATIF
• DAYA TARIKAN PENGEMPARAN
BERDASARKAN ATAU RELATIF KEPADA
TARIKAN GRAVITI PIAWAI
• CONTOHNYA 500x g BERMAKSUD DAYA
TARIKAN YANG 500 KALI LEBIH BESAR
DARIPADA DAYA TARIKAN GRAVITI
PIAWAI
 KUASA PENGEMPARAN
RELATIF
• PERSAMAAN
R.C.F. = 1.119 x 10 -5 (rpm2) r
rpm=pusingan seminit
r=radius (dalam cm)
UNIT g
 ELEKTROFORESIS
• PERGERAKAN PARTIKEL BERCAS YANG
DIPENGARUHI OLEH ALIRAN ELEKTRIK
• ELEKTROFORESIS ADALAH KAEDAH
UNTUK MEMISAHKAN MAKROMOLEKUL
SEPERTI ASID NUKLEIK DAN PROTEIN
BERDASARKAN SAIZ, CAS ELEKTRIK
DAN CIRI FIZIKAL SEPERTI KETUMPATAN
DAN LAIN-LAIN
• PEMISAHAN DIBANTU OLEH MATRIKS
SEPERTI POLIAKRILAMID ATAU
AGAROS
 ELEKTROFORESIS
• PRINSIP: PEMISAHAN MAKROMOLEKUL
BERGANTUNG KEPADA DUA CIRI IAITU BERAT
DAN CAS
• ALIRAN ELEKTRIK DARI ELEKTROD AKAN
MENOLAK MOLEKUL MANAKALA ELEKTROD
YANG LAGI SATU AKAN MENARIKNYA PADA
MASA YANG SAMA
• MOLEKUL AKAN BERGERAK ANTARA LIANG
YANG TERBINA ANTARA JALINAN MATRIKS
YANG BERTINDAK SEBAGAI PENAPIS YANG
AKAN MEMISAHKAN MOLEKUL BERDASARKAN
SAIZ
 ELEKTROFORESIS
• ALIRAN ELEKTRIK AKAN MEMAKSA
MAKROMOLEKUL MELALUI LIANG
• PERGERAKAN MAKROMOLEKUL
BERGANTUNG KEPADA KEKUATAN MEDAN
ELEKTRIK, SAIZ DAN BENTUK MOLEKUL,
SIFAT HIDROFOBIK RELATIF SAMPEL DAN
KEKUATAN IONIK SERTA SUHU PENIMBAL
ELEKTROFORESIS
• PEWARNAAN AKAN MEMBOLEHKAN
MAKROMOLEKUL KELIHATAN DALAM
BENTUK SIRI JALURAN YANG TERPISAH
ELEKTROFORESIS PROTEIN
• PROTEIN MEMPUNYAI CAS BERSIH POSITIF
ATAU NEGATIF HASIL GABUNGAN ASID
AMINO-AMINO BERCAS YANG
TERKANDUNG DIDALAMNYA
• MATRIKS YANG SERING DIGUNAKAN
UNTUK MEMISAHKAN PROTEIN ADALAH
POLIAKRILAMID
• ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI-
PEMISAHAN PROTEIN BERDASARKAN TITIK
ISOELEKTRIK DAN BERAT MOLEKUL
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D
• PEMFOKUSAN ISOELEKTRIK-
-LANGKAH PERTAMA: PEMISAHAN
PROTEIN BERDASARKAN TITIK
ISOELEKTRIK (PROTEIN MENGANDUNGI
BERBAGAI NISBAH CAS POSITIF DAN
NEGATIF)
-MELALUI GEL BERBENTUK TIUB
ELEKTROFORESIS, PROTEIN AKAN
BERGERAK DALAM LARUTAN YANG
MEMPUNYAI KECERUNAN PH -
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D
• PEMFOKUSAN ISOELEKTRIK-
-PROTEIN AKAN TERHENTI BILA IA TIBA
DI NILAI pH YANG SAMA DENGAN TITIK
ISOELEKTRIKNYA IAITU APABILA PROTEIN
ITU TIDAK MEMPUNYAI CAS BERSIH

+ BERBES

- BERASID
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D
• ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI-
-LANGKAH KEDUA ADALAH MEMBUAT
LARIAN ELEKTROFORESIS DALAM ARAH
ORTHOGON DARI LANGKAH PERTAMA
DAN SDS DITAMBAHKAN

-
ELEKTROFORESIS PROTEIN 2-D
ELEKTROFORESIS PROTEIN 1-D
• PEMISAHAN PROTEIN SATU DIMENSI:
PEMISAHAN PROTEIN BERDASARKAN BERAT
MOLEKUL
• TEKNIK INI DIPANGGIL ELEKTROFORESIS GEL
POLIAKRILAMID-SDS (PAGE) ATAU SDS-PAGE
KERANA KEHADIRAN SDS DALAM
PENYEDIAAN SAMPEL
• SIMULASI ELEKTROFORESIS 1-DIMENSI
http://www.rit.edu/~pac8612/electro/
Electro_Sim.html
 SDS-PAGE
• PEMISAHAN PROTEIN BERSAIZ 5 - 2,000 kDa
• LIANG ANTARA POLIAKRILAMID DIUBAH
ANTARA 3%-30%
• SAMPEL PROTEIN YANG DIKAJI ADALAH
DALAM BENTUK STRUKTUR PRIMER
PROTEIN (PENDIDIHAN BERSAMA DENGAN
SDS DAN β-MERKAPTOETANOL)
• PEWARNAAN PROTEIN DENGAN PEWARNA
BIRU COOMASIE ATAU PERAK
• PEWARNAAN TAK LANGSUNG: ANTIBODI
TERIKAT RADIOISOTOP, ENZIM ATAU
PEWARNA FLUORESENS
 SDS-PAGE
• FUNGSI SDS: DETERGEN
BERCAS NEGATIF YANG
BERGABUNG DENGAN
KAWASAN HIDROFOBIK
MOLEKUL PROTEIN DAN
MENGAKIBATKANNYA
TERBUKA MENJADI
RANTAI POLIPEPTIDA
YANG PANJANG DAN
TERBEBAS DARI IKATAN
DENGAN LAIN-LAIN PROTEIN
DAN LIPID
 SDS-PAGE
• FUNGSI β-MERKAPTOETANOL
MEMECAHKAN IKATAN DISULFIDA BAGI
MEMBOLEHKAN SUBUNIT PROTEIN
DIANALISA
 ELEKTROFORESIS ASID
NUKLEIK
• MATRIKS YANG SERING DIGUNAKAN
UNTUK MEMISAHKAN ASID NUKLEIK
ADALAH AGAROS ATAU POLIAKRILAMID
• TEKNIK INI DIPANGGIL ELEKTROFORESIS
GEL AGAROS
• SAMPEL MENGANDUNGI DNA AKAN
DIMASUKKAN KE DALAM TELAGA YANG
LETAKNYA BERDEKATAN DENGAN
ELEKTROD BERCAS NEGATIF
• DNA YANG BERCAS NEGATIF AKAN
DITARIK KE ARAH ELEKTROD POSITIF
 ELEKTROFORESIS ASID
NUKLEIK
• DNA YANG BERSAIZ BESAR AKAN
BERGERAK LAMBAT MANAKALA YANG
BERSAIZ KECIL AKAN BERGERAK CEPAT
• PEWARNAAN DENGAN ETIDIUM BROMIDA
AKAN MEMBOLEHKAN KITA MELIHAT ASID
NUKLEIK KERANA BERLAKUNYA SELITAN
ETIDIUM BROMIDA DIANTARA BES-BES
PADA ASID NUKLEIK
• ETIDIUM BROMIDA AKAN BERWARNA OREN
APABILA DISINARKAN DENGAN LAMPU
ULTRA-LEMBAYUNG
ELEKTROFORESIS ASID
NUKLEIK
 MIKROSKOPI
• KAEDAH AWAL DALAM MENGKAJI
BIOLOGI SEL
• PRINSIP: MEMBESARKAN IMEJ YANG
KECIL
• JENIS-JENIS MENGIKUT SAIZ
PEMBESARAN IMEJ
-MIKROSKOP CAHAYA (300nm-2mm)
-MIKROSKOP ELEKTRON (0.15nm-100µm)
 MIKROSKOP CAHAYA
• PRINSIP PEMBESARAN IMEJ:
CAHAYA DARI BAWAH MIKROSKOP
MELALUI KONDENSER YANG AKAN
MENUMPUKAN CAHAYA KE ARAH
SPESIMEN. CAHAYA YANG MELALUI
SPESIMEN AKAN DIKUMPULKAN
SEMULA OLEH KANTA OBJEKTIF
YANG AKAN MENGHASILKAN IMEJ
 MIKROSKOP CAHAYA
• JENIS-JENIS:
MIKROSKOP MEDAN TERANG
MIKROSKOP MEDAN GELAP
MIKROSKOP KONTRA-FASA
MIKROSKOP GANGGUAN-PEMBEZA
MIKROSKOP PENDARFLUOR (UV)
(FLUORESIN/RHODAMIN)
 MIKROSKOP ELEKTRON
• PRINSIP:
-PENGGUNAAN ELEKTRON DAN
BUKANNYA CAHAYA UNTUK
MEMBESARKANNYA IMEJ.
-SPESIMEN PERLU MENJALANI PROSES
PERSEDIAAN SEPERTI DILAPISKAN
DENGAN SALUTAN EMAS NIPIS BAGI
MEMBOLEHKAN ELEKTRON TERPANTUL
SEMULA SEBELUM IMEJ DITUMPUKAN
KE SKRIN
 MIKROSKOP ELEKTRON
• JENIS-JENIS:
1) MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI
ELEKTRON AKAN MELALUI SPESIMEN
DAN IMEJ DITUMPUKAN PADA SKRIN
FLUORESENS
-STRUKTUR DALAMAN SPESIMEN DAPAT
DILIHAT
 MIKROSKOP ELEKTRON
• JENIS-JENIS:
2) MIKROSKOP ELEKTRON PENGIMBAS
ELEKTRON AKAN DITUMPUKAN KEPADA
SPESIMEN YANG KEMUDIANNYA AKAN
TERPANCAR SEMULA (DIIMBAS) KE
BAHAGIAN PENGESAN DAN IMEJ
DIHANTAR KE SKRIN UNTUK DILIHAT
-STRUKTUR LUARAN SPESIMEN DAPAT
DILIHAT
MIKROSKOP ELEKTRON
ALAT ELEKTRON
MIKROSKOP PENGIMBAS
IMEJ NYAMUK
MENGGUNAKAN
MIKROSKOPI ELEKTRON
PENGIMBAS
 KAEDAH-KAEDAH LAIN
• KROMATOGRAFI
-KERTAS: PEMISAHAN PROTEIN
MENGGUNAKAN KERTAS TURAS
-PERTUKARAN-ION (ION EXCHANGE)
-TURASAN GEL (GEL FILTRATION)
-KEAFINAN (AFFINITY)
-CECAIR BERTEKANAN TINGGI (HPLC)
 KAEDAH-KAEDAH LAIN
• PENGGUNAAN RADIOISOTOP UNTUK MENANDA
MOLEKUL: 32P, 131I, 35S, 14C, 45Ca, 3H
- RIA, EKSPERIMEN ‘PULSE-CHASE’,
AUTORADIOGRAFI
• PENGGUNAAN ANTIBODI
(MONOKLON/POLIKLON) UNTUK MENANDA
MOLEKUL:EIA, IF, ELISA
• ANALISA DIFRAKSI X-RAY: PENENTUAN
STRUKTUR PROTEIN
• TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN