PEMERIKSAAN WIDAL 1.1 Tujuan 1. Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan widal untuk menegakkan diagnosis demam typhoid 2.

Mahasiswa mengetahui adanya antibodi spesifik terhadap bakteri Salmonella 1.2 Metode Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah Rapid Slide Test dan tes aglutinasi tabung reaksi 1.3 Prinsip Prinsip dari tes ini adalah reaksi imunologis antara antibodi yang diproduksi oleh bakteri (agglutinin) dengan jenis lain dari antigen fibril. 1.4 Dasar Teori Tes Widal merupakan tes aglutinasi tabung yang digunakan dalam diagnosis serologis demam enterik. Tes ini dinamai oleh Fernand Georges Isidore Widal, seorang dokter dan ahli bakteriologi Perancis, lahir 9 Maret1862, Aljazair, meninggal 14 Januari 1929, Paris (Anonim, 2013). Uji Widal merupakan suatu metode serologi baku dan rutin digunakan sejak tahun 1896 (Mimin, 2013). Pemeriksaan Widal adalah salah satu pemeriksaan yang bertujuan untuk menegakkan diagnosa demam tipoid. Pemeriksaan ini masih banyak dipakai di negara-negara berkembang dikarenakan biayanya yang relatif terjangkau dan hasilnya pun dapat diketahui dengan segera. Pemeriksaan Widal bertujuan untuk mendeteksi adanya antibodi (kekebalan tubuh) terhadap kuman Salmonella dengan cara mengukur kadar aglutinasi antibodi terhadap antigen O dan H dalam sampel darah. Tubuh kita akan membentuk antibodi jika terpapar kuman Salmonela typhi, baik kuman yang masuk secara alamiah dan

menyebabkan sakit, kuman yang masuk namun tidak menunjukan gejala (karier) ataupun melalui vaksinasi (Vian, 2012). Beberapa keuntungan dari pemeriksaan Widal adalah tekniknya sederhana, mudah dan murah. Sedangkan beberapa kerugian dari pemeriksaan Widal adalah (Lia, 2011) : 1. Adanya reaksi silang 2. Nilai normal daerah endemis tidak sama dengan daerah non endemis 3. Bila terjadi gangguan proses immunitas, pembentukan antibodi terganggu maka uji Widal dapat memberikan hasil negatif palsu. Selain itu keterbatasan uji ini juga dapat memberikan hasil positif palsu. a. Negatif palsu Hasil negatif palsu dapat terjadi jika dalam pemberian antibiotika yang dilakukan sebelumnya sehingga dapat menghalangi respon antibodi (ini kejadian paling sering di negara kita). Misalnya, saat terdapat gejala demam langsung diberi antibiotika dan tidak sembuh dalam 5 hari sudah dilakukan uji Widal. Padahal sebenarnya bisa positif jika dilakukan kultur darah. b. Positif palsu Dapat terjadinya positif palsu misalnya pada beberapa jenis serotipe Salmonella lainnya (misalnya S. paratyphi A, B, C) yang memiliki antigen O dan juga antigen H, sehingga dapat menimbulkan reaksi silang dengan jenis bakteri lainnya, dan bisa menimbulkan hasil positif palsu (false positive). Padahal sebenarnya yang positif kuman non S. typhi (bukan tifoid). 4. Tidak digunakan untuk evaluasi terapi 5. Sebagai sarana penunjang diagnosis demam typhoid, uji Widal memiliki spesifitas yang agak rendah dan kesukaran untuk menginterpretasikan hasil tersebut, sebab banyak faktor yang mempengaruhi kenaikan titer. Selain itu antibodi terhadap antigen H bahkan mungkin dijumpai dengan titer yang lebih tinggi, yang disebabkan adanya reaktifitas silang yang luas sehingga sukar untuk diinterpretasikan. Dengan alasan ini maka pada daerah endemis tidak dianjurkan pemeriksaan antibodi H S.typhi, cukup pemeriksaan titer terhadap antibodi O S.typhi.

Prinsip pemeriksaan Widal adalah reaksi aglutinasi yang terjadi bila serum penderita dicampur dengan suspense antigen Salmonella typhosa. Pemeriksaan yang positif ialah bila terjadi reaksi aglutinasi antara antigen dan antibodi (aglutinin). Antigen yang digunakan pada tes Widal ini berasal dari suspense Salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum (Wikipedia, 2012). Teknik pemeriksaan uji Widal dapat dilakukan dengan dua metode yaitu uji hapusan atau peluncuran (slide test) dan uji tabung (tube test). Perbedaannya, uji tabung membutuhkan waktu inkubasi semalam karena membutuhkan teknik yang lebih rumit dan uji Widal peluncuran hanya membutuhkan waktu inkubasi 1 menit saja yang biasanya digunakan dalam prosedur penapisan. Umumnya sekarang lebih banyak digunakan uji Widal peluncuran. Sensitivitas dan spesifitas tes ini amat dipengaruhi oleh jenis antigen yang digunakan. Menurut beberapa peneliti uji Widal yang menggunakan antigen yang dibuat dari jenis strain kuman asal daerah endemis (lokal) memberikan sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi daripada bila dipakai antigen yang berasal dari strain kuman asal luar daerah endemis (import). Walaupun begitu, menurut suatu penelitian yang mengukur kemampuan uji tabung Widal menggunakan antigen import dan antigen lokal, terdapat korelasi yang bermakna antara antigen lokal dengan antigen S.typhi O dan H import, sehingga bisa dipertimbangkan antigen import untuk dipakai di laboratorium yang tidak dapat memproduksi antigen sendiri untuk membantu menegakkan diagnosis demam typhoid (Mimin, 2013). Pada pemeriksaan uji Widal dikenal beberapa antigen yang dipakai sebagai parameter penilaian hasil uji Widal. Berikut ini penjelasan macam antigen tersebut (Anonim, 2013) : 1. Antigen O Antigen O merupakan somatik yang terletak di lapisan luar tubuh kuman. Struktur kimianya terdiri dari lipopolisakarida. Antigen ini tahan terhadap pemanasan 100C selama 25 jam, alkohol dan asam yang encer.

2. Antigen H Antigen H merupakan antigen yang terletak di flagela, fimbriae atau fili S. typhi dan berstruktur kimia protein. S. typhi mempunyai antigen H phase-1 tunggal yang juga dimiliki beberapa Salmonella lain. Antigen ini tidak aktif pada pemanasan di atas suhu 60C dan pada pemberian alkohol atau asam. 3. Antigen Vi Antigen Vi terletak di lapisan terluar S. typhi (kapsul) yang melindungi kuman dari fagositosis dengan struktur kimia glikolipid, akan rusak bila dipanaskan selama 1 jam pada suhu 60C, dengan pemberian asam dan fenol. Antigen ini digunakan untuk mengetahui adanya karier. 4. Outer Membrane Protein (OMP) Antigen OMP S. typhi merupakan bagian dinding sel yang terletak di luar membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan yang membatasi sel terhadap lingkungan sekitarnya. OMP ini terdiri dari 2 bagian yaitu protein porin dan protein nonporin. Porin merupakan komponen utama OMP, terdiri atas protein OMP C, OMP D, OMP F dan merupakan saluran hidrofilik yang berfungsi untuk difusi solut dengan BM < 6000. Sifatnya resisten terhadap proteolisis dan denaturasi pada suhu 85100C. Protein nonporin terdiri atas protein OMP A, protein a dan lipoprotein, bersifat sensitif terhadap protease, tetapi fungsinya masih belum diketahui dengan jelas. Beberapa peneliti menemukan antigen OMP S typhi yang sangat spesifik yaitu antigen protein 50 kDa/52 kDa. Uji Widal positif artinya ada zat anti (antibodi) terhadap kuman Salmonella, menunjukkan bahwa seseorang pernah kontak atau terinfeksi dengan kuman Salmonella tipe tertentu. Namun, dalam hasil uji Widal, masih ada beberapa hal yang sering disalahartikan yaitu (Vian, 2013) : 1. Pemeriksaan Widal positif dianggap ada kuman dalam tubuh, hal ini pengertian yang salah. Uji Widal hanya menunjukkan adanya antibodi terhadap kuman Salmonella. 2. Pemeriksaan Widal yang diulang setelah pengobatan dan menunjukkan hasil positif dianggap masih menderita tifus, ini juga pengertian yang salah.

Setelah seseorang menderita tifus dan mendapat pengobatan, hasil uji Widal tetap positif untuk waktu yang lama sehingga uji Widal tidak dapat digunakan sebagai acuan untuk menyatakan kesembuhan. 3. Hasil ulang pemeriksaan Widal positif setelah mendapat pengobatan tifus, bukan indikasi untuk mengulang pengobatan bilamana tidak lagi didapatkan gejala yang sesuai. 4. Hasil uji negatif dianggap tidak menderita tifus. Uji Widal umumnya menunjukkan hasil positif 5 hari atau lebih setelah infeksi. Karena itu bila infeksi baru berlangsung beberapa hari, sering kali hasilnya masih negatif dan baru akan positif bilamana pemeriksaan diulang. Dengan demikian, hasil uji Widal negatif, terutama pada beberapa hari pertama demam belum dapat menyingkirkan kemungkinan tifus (Nurahmad, 2011). Untuk menentukan seseorang menderita demam tifoid tetap harus didasarkan adanya gejala yang sesuai dengan penyakit tifus karena uji Widal hanya sebagai pemeriksaan yang menunjang diagnosis. Seorang tanpa gejala, dengan uji Widal positif tidak dapat dikatakan menderita tifus. Pada daerah endemik, terdapat kesulitan dalam interpretasi hasil uji Widal karena sebagian besar populasi sehat juga pernah kontak atau terinfeksi, sehingga menunjukkan hasil uji Widal positif. Hasil survei pada orang sehat di Jakarta pada 2006 menunjukkan hasil uji Widal positif pada 78% populasi orang dewasa. Untuk itu perlu kecermatan dan kehatihatian dalam interpretasi hasil pemeriksaan Widal (Vian, 2013). Interpretasi dari uji Widal ini harus memperhatikan beberapa faktor antara lain sensitivitas, spesifitas, stadium penyakit; faktor penderita seperti status imunitas dan status gizi yang dapat mempengaruhi pembentukan antibodi, saat pengambilan specimen, gambaran imunologis dari masyarakat setempat (daerah endemis atau non endemis), faktor antigen, teknik serta reagen yang digunakan. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi uji Widal dapat dijelaskan sebagai berikut, antara lain (Anonim, 2011) : 1. Keadaan umum : gizi buruk dapat menghambat pembentukan antibodi.

2. Saat pengambilan spesimen : berdasarkan penelitian Senewiratne, dkk. kenaikan titer antibodi ke level diagnostik pada uji Widal umumnya paling baik pada minggu kedua atau ketiga, yaitu 95,7%, sedangkan kenaikan titer pada minggu pertama adalah hanya 85,7%. 3. Pengobatan dini dengan antibiotika, pemberian antibiotika sebelumnya dapat menghambat pembentukan antibodi. 4. Vaksinasi terhadap salmonella bisa memberikan reaksi positif palsu. Hal ini dapat dijelaskan bahwa setelah divaksinasi titer agglutinin O dan H meningkat dan menetap selama beberapa waktu. Jalan keluarnya adalah dengan melakukan pemeriksaan ulang tes Widal seminggu kemudian. Infeksi akan menunjukkan peningkatan titer, sementara pasien yang divaksinasi tidak akan menunjukkan peningkatan titer. 5. Obat-obatan immunosupresif dapat menghambat pembentukan antibodi. 6. Reaksi anamnesa. Pada individu yang terkena infeksi typhoid di masa lalu, kadang-kadang terjadi peningkatan antibodi salmonella saat ia menderita infeksi yang bukan typhoid, sehingga diperlukan pemeriksaan Widal ulang seminggu kemudian. 7. Reaksi silang : beberapa jenis serotipe Salmonella lainnya (misalnya S. paratyphi A, B, C) memiliki antigen O dan H juga, sehingga menimbulkan reaksi silang dengan jenis bakteri lainnya, dan bisa menimbulkan hasil positif palsu (false positive). Padahal sebenarnya yang positif kuman non S. typhi (bukan typhoid). 8. Penyakit-penyakit tertentu seperti malaria, tetanus, sirosis dapat menyebabkan positif palsu. 9. Konsentrasi suspense antigen dan strain Salmonella yang digunakan akan mempengaruhi hasil uji Widal. Kegunaan uji Widal untuk diagnosis demam typhoid masih kontroversial diantara para ahli. Namun hampir semua ahli sepakat bahwa kenaikan titer agglutinin lebih atau sama dengan 4 kali terutama agglutinin O atau agglutinin H bernilai diagnostic yang penting untuk demam typhoid. Kenaikan titer agglutinin yang tinggi pada specimen tunggal, tidak dapat membedakan apakah infeksi tersebut merupakan infeksi baru atau lama. Begitu juga

kenaikan titer agglutinin terutama agglutinin H tidak mempunyai arti diagnostik yang penting untuk demam typhoid, namun masih dapat membantu dan menegakkan diagnosis tersangka demam typhoid pada penderita dewasa yang berasal dari daerah non endemik atau pada anak umur kurang dari 10 tahun di daerah endemik, sebab pada kelompok penderita ini kemungkinan mendapat kontak dengan S. typhi dalam dosis subinfeksi masih amat kecil. Pada orang dewasa atau anak di atas 10 tahun yang bertempat tinggal di daerah endemik, kemungkinan untuk menelan S.typhi dalam dosis subinfeksi masih lebih besar sehingga uji Widal dapat memberikan ambang atas titer rujukan yang berbeda-beda antar daerah endemik yang satu dengan yang lainnya, tergantung dari tingkat endemisitasnya dan berbeda pula antara anak di bawah umur 10 tahun dan orang dewasa. Dengan demikian, bila uji Widal masih diperlukan untuk menunjang diagnosis demam typhoid, maka ambang atas titer rujukan, baik pada anak dan dewasa perlu ditentukan (Nurahmad, 2011). 1.5 Alat, Bahan, dan Reagen A. Alat 1. Kaca objek berbentuk cincin 2. Pipet serum 3. Stik pengaduk 4. Tabung reaksi 5. Pengaduk mekanik (jika diperlukan) B. Bahan 1. Larutan NaCl 0,9% 2. Antigen Fibril 3. Serum C. Reagen 1. Brucella abortus 2. Brucella melitensis 3. Antigen Salmonella Grup A 4. Antigen Salmonella Grup B

5. Antigen Salmonella Grup C 6. Paratyphoid A (Antigen Salmonella Flagellar a ) 7. Paratyphoid B (Antigen Salmonella Flagellar b ) 8. Paratyphoid C (Antigen Salmonella Flagellar c ) 9. Proteus OX2 10. Proteus OX19 11. Proteus OXK 12. Typhoid O (Salmonella Group D, somatik) 1.6 Langkah Kerja A. Rapid Slide Test 1. 5 kaca objek disediakan dan masing-masing dibuat lingkaran dengan diameter 1 inci dengan pensil lilin atau sebuah pensil dengan ujung bercahaya. Untuk tujuan ini bisa juga digunakan kaca jendela yang kecil. Kaca objek berbentuk cincin juga dianjurkan untuk digunakan. 2. Sejumlah serum yang akan diuji ditambahkan dengan pipet yang sesuai, ke dalam lingkaran kaca objek dari kiri ke kanan dengan urutan: 0,08 mL, 0,04 mL, 0,02 mL, 0,01 mL, 0,05 mL. Serum harus bersih dan tidak panas. Prosedur ini diulangi dengan serum kontrol positif dan negatif. 3. Antigen dikocok dengan hati hati untuk memastikan suspensi tercampur merata. 4. Dengan memegang penetes secara vertikal, ditambahkan satu tetes suspensi antigen setiap sejumlah serum. 5. Serum dan antigen dicampur menggunakan stik pengaduk. Stik pengaduk yang berbeda digunakan untuk setiap jumlah serum atau digunakan stick yang sama dan dikerjakan dari kanan ke kiri. Area yang dibentuk setiap campuran harus berukuran inci - 1 inch. 6. Slide digoyangkan dengan tangan atau pengocok mekanik pada kecepatan 150 rpm selama 2-3 menit. 7. Aglutinasi diamati dengan pencahayaan tidak langsung berlatar belakang gelap.

8. Serum positif oleh titer yang dikenali dan serum negatif serum harus termasuk ke dalam control B. Tes Aglutinasi Tabung Reaksi 1. Sepuluh tabung reaksi berukuran 12 x 75 mm disediakan dan diletakkan di rak yang sesuai 2. 1,9 mL larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan ke tabung pertama 3. 1,0 mL larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan ke tabung yang tersisa 4. 0,1 mL serum yang akan diuji ditambahkan ke tabung pertama. 1,0 ml serum yang diencerkan diaduk rata dan dipindahkan dari tabung pertama ke tabung kedua. Prosedur ini diulangi sampai kesepuluh tabung mengandung seri pengenceran serum dua - kali lipat dari 1: 20 sampai 1: 10240. 1,0 mL pengencer serum diambil dari tabung 10 dan dibuang. Tabung no. 1 dianggap sebagai pengenceran 1:20. Prosedur ini diulangi dengan serum kontrol positif dan negatif. 5. Satu tabung ditempatkan di akhir seri tabung pengenceran dan 1,0 mL larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan untuk mengencerkan serum. Tabung itu dilabeli dengan nama "Control Saline 6. Suspensi antigen dihomogenkan dengan mengocok botol hati - hati. Satu tetes antigen ditambahkan untuk setiap tabung. 7. Rak dikocok untuk mencampur antigen dengan serum dan ditempatkan di waterbath. Waktu dan suhu inkubasi yang dianjurkan adalah sebagai berikut: Antigen Salmonella O Group A Salmonella O Group B Salmonella O Group C Salmonella O Group D (Typhoid O) Salmonella H a Temperature 45 - 50 45 - 50 45 - 50 45 - 50 45 - 50 Waktu Inkubasi 18 jam 18 jam 18 jam 18 jam 2 jam

Salmonella H b Salmonella H c Salmonella H d (Typhoid H) Brucella abortus dan Brucella meltonois Proteus OX2, OX19 dan OXK

45 - 50 45 - 50 45 - 50 37 37

2 jam 2 jam 2 jam 48 jam 18 jam

Catatan : Typhoid H dan antigen Salmonella flagellar harus diinkubasi selama 2 jam pada suhu 45 - 50 pada suhu 2 - 8 dilanjutkan dengan inkubasi 10 jam

sebelum pembacaan terakhir.

8. Setelah diinkubasi, rak yang berisi tabung reaksi dipindahkan dengan hati-hati dan diamati aglutinasinya. Menggunakan sumber cahaya tidak langsung dengan latar belakang hitam akan memberikan kondisi optimal untuk pembacaan tabung 9. Hasil tes dicatat sebagai berikut : a. 4+ : Semua organisme berkumpul di dasar tabung dan cairan supernatan bersih b. 3+ : Sekitar 75% organisme berkumpul dan supernatant sedikit keruh c. 2+ : Sekitar 50% organisme berkumpul dan supernatant dengan kekeruhan sedang d. 1+ : Sekitar 25 % organisme berkumpul dan supernatant keruh e. : Tidak ada aglutinasi yang teramati dan muncul kekeruhan pada suspensi 10. Titer dari serum reaktif dicatat sebagai pengenceran terakhir yang memberikan reaksi 2 +

10

1.7 Interprestasi Hasil A. Rapid Slide Test Derajat aglutinasi sebagai berikut : 4+ 3+ 2+ 1+ + Negatif : 100% organisme mengalami aglutinasi : 75% organisme mengalami aglutinasi : 50% organisme mengalami aglutinasi : 25% organisme mengalami aglutinasi : kurang dari 25% organisme mengalami aglutinasi : tidak ada aglutinasi

B. Tes Titrasi Tabung Reaksi 4+ 3+ 2+ 1+ : Semua organisme berkumpul di dasar tabung dan cairan supernatan bersih : Sekitar 75% organisme berkumpul dan supernatan sedikit keruh : Sekitar 50% organisme berkumpul dan supernatan dengan kekeruhan sedang : Sekitar 25 % organisme berkumpul dan supernatan keruh : Tidak ada aglutinasi yang teramati dan muncul kekeruhan Negatif

pada suspensi

11