UNIVERSITE Flix Houphouet BOIGNY COCODY-ABIDJAN

UFR BIOSCIENCES LABORATOIRE DE GENETIQUE

COURS MAGISTRAUX M1 DE GENETIQUE

UNITE DENSEIGNEMENT GENE 2113

Master 1 DE GENETIQUE

Gntique Humaine

Responsable de lUE (Unit dEnseignement) :

Dr COULIBALY Foungotin Hamidou Spcialits
: Expert auprs des Tribunaux (Test dADN, Gntique) Gntique Humaine Biologie de la Procration Cytogntique Spermiologie Essais Cliniques www.crieafrique.net info@crieafrique.net

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GENETIQUE HUMAINE
Les lois de la transmission hrditaires des caractres chez lhomme sont celles des espces diplodes reproduction sexue biparentale. Cependant si ces lois sont universelles, la gntique de lespce humaine se distingue par plusieurs particularits. a) Alors que le gnticien exprimentateur peut mutagniser, entretenir des lignes et planifier des croisements, le gnticien humain se contente des mutations spontanes et observe la transmission des caractres dans les familles et les populations ou le libre arbitre prside aux mariages et la procration. b) Beaucoup d'espces modles des gnticiens ont une fcondit inpuisable ou, si ce n'est pas le cas, les plans de croisement autorisent regrouper directement les descendances de plusieurs couples. En revanche, les fratries humaines sont souvent de petite ou trs petite taille et le mode de recrutement des familles nautorise pas effectuer un regroupement automatique des enfants. En contrepartie, plusieurs gnrations sont souvent observables. c) Le problme central de la gntique humaine est celui des maladies gntiques. On connait bien sr des mutants pathologiques dans les espces modles qui offrent des opportunits danalyse largement exploites, et 1'on ne s'est certes pas limit au rpertoire des mutations morbides chez l'homme; il n'en reste pas moins que la gntique humaine reste avant tout mdicale. L'une des caractristiques des maladies gntiques est que, si elles sont fort nombreuses, chacune prise isolement est une raret, ce qui conduit ne les observer que dans des familles particulires. L'approche prsente dans ce cours est celle de la gntique formelle humaine et de ses particularits. Son but est de formaliser le phnomne hrditaire, c'est--dire de construire un modle permettant d'expliquer le lien reliant les caractres des descendants ceux de leurs parents en prenant en compte le nombre et les modalits de transmission des facteurs sousjacents responsables de ces caractres et leurs modalits d'expression. Dans la plupart des espces modles, cette approche est ralise en superposant les proportions observes pour les caractres des proportions statistiques simples, attendues des lois de Mendel et de la thorie chromosomique de l'hrdit. Chez l'homme, les raisonnements gntiques sont videmment fonds sur les mmes modles, mais adapts l'analyse de la transmission des caractres dans les familles comportant peu d'individus mais plusieurs gnrations, le plus souvent en traant des arbres gnalogiques, aussi appels pedigrees (mot anglais driv du franais pied de grue, allusion au diagramme ramifi qui voque son origine). Apres avoir rappel les grandes lignes des lois de Mendel et des proportions classiques des diffrents modes hrditaires ainsi que le vocabulaire de la gntique et les rgles de la nomenclature chez l'homme, on va s'intresser donc aux modes hrditaires des maladies gntiques, tels que l'on peut les infrer de l'analyse des pedigrees. Une analyse de la transmission suivra, ayant pour but de confirmer le mode hrditaire et dont l'une des difficults statistiques tient au mode de recrutement des familles.

En rsum, ltude de la gntique humaine est difficile pour les diffrentes raisons suivantes: On ne peut imposer un accouplement pour tudier la transmission dun caractre ; La dure dune gnration est longue, le nombre de descendants dune mme famille est faible. Il faut alors raliser un arbre gnalogique et suivre le caractre envisag sur plusieurs gnrations ; Les tudes statistiques portent sur plusieurs familles regroupes, de mmes caractristiques ; Les gnes sont trs nombreux. La dmarche suivre : Etablir le mode de transmission du gne partir des donnes fournies par larbre gnalogique Dterminer le rapport entre les allles : dominant, rcessif, codominant Dterminer la localisation du gne.

I) HEREDITE HUMAINE
Bien que l'tude de l'hrdit qui traite des humains soit plus fastidieuse que celles des plantes ou des animaux, des mthodes permettent d'analyser la descendance des familles. Deux mthodes sont employes, les biotechniques et les pedigrees. Les pedigrees sont surtout utiliss pour tudier les maladies ou anomalies hrditaires d'une famille. On peut de nos jours, l'aide des biotechniques savoir si l'on est porteur d'un gne dfectueux. L'hrdit humaine peut se diviser en trois grandes parties : Hrdit relie aux gnes ou aux super-gnes autosomiques: Couleur des yeux, taille, intelligence, Hrdit relie au chromosome sexuel : Hmophilie, daltonisme, Hrdit des mutations de chromosomes (aberrations chromosomiques) : Mongolisme, bec de livre, Hrdit relie aux chromosomes sexuels Schmatiquement, les chromosomes sexuels peuvent tre subdiviss en rgions d'appariement (homologue) et diffrentiel. Les rgions d'appariement des chromosomes X et Y sont considrs comme homologues. Les rgions diffrentielles portent des gnes qui n'ont pas d'quivalent sur l'autre type de chromosome sexuel. Les gnes dans la rgion diffrentielle du X prsentent un schma hrditaire appel liaison l'X; ceux de la rgion diffrentielle de l'Y prsentent une liaison l'Y. Les gnes dans la rgion d'appariement prsentent ce qu'on pourrait appeler une liaison l'X et l'Y. Outre le rle qu'ils jouent dans la dtermination du sexe, les chromosomes sexuels, et en particulier les chromosomes X, portent les gnes de nombreux caractres totalement indpendants du sexe. Chez l'humain, le terme li au sexe dsigne habituellement des caractres ports par le chromosome X. Le pre transmet les allles lis au chromosome X ses filles mais aucun ses fils alors que la mre peut transmettre les allles lis au sexe aussi bien ses filles qu' ses fils. Hrdit reli l'Y Lorsqu'un caractre est situ sur le chromosome Y et qu'il n'a pas d'homologue sur le chromosome X, ce caractre ne peut apparatre que chez le mle, ce caractre est dit holandrique. Un tel caractre ne peut se transmettre que de pre en fils. Exemple : hypertrichose des oreilles, Homme porc-pic

Hrdit relie l'X Un caractre hrditaire peut tre reli aux chromosomes X et ne pas avoir d'homologue sur le chromosome Y. Dans un tel cas, une femelle a deux chromosomes portant le caractre et un mle n'a qu'un chromosome portant le caractre. Un tel caractre peut tre dominant ou rcessif. S'il est rcessif, il sera plus frquent chez les mles que chez les femelles. En effet, les femelles doivent recevoir deux allles rcessifs pour avoir la maladie hrditaire alors que le mle ne doit recevoir qu'un allle de la mre portant le caractre rcessif. Exemple : hmophilie, daltonisme et myopathie de Duchenne Hrdit relie X et Y Peu d'informations sont connues sur les caractres hrditaires se retrouvant dans cette rgion. C'est la seule partie commune au X et au Y o il peut avoir des allles pour les caractres se retrouvant cet endroit. Hrdit relie aux gnes ou aux super-gnes autosomiques Hrdit relie aux autosomes Les gnes autosomiques sont situs sur les 22 paires de chromosomes communs aux deux sexes. Ils sont trs nombreux, plusieurs centaines de mille : couleur des yeux, forme des cheveux, groupes sanguins... Quelques-uns de ces gnes portent des dfauts hrditaires comme l'albinisme, la brachydactylie Hrdit reli aux super-gnes Lorsqu'un caractre hrditaire n'est pas li un seul gne, mais plusieurs, c'est une hrdit que l'on pourrait souvent qualifier de cumulative. Plus il y a de gnes favorisant le caractre considr, plus ce caractre est accentu. Dans de tels cas nous ne pouvons parler de dominance ou rcessivit, mais plutt de tendance. Cette hrdit rgit plusieurs caractres connus et elle est en troite relation avec les conditions du milieu. Parmi ces caractres, on retrouve la taille, l'intelligence, la mmoire,

I.1) Nomenclature, vocabulaire et analyse des arbres gnalogiques

Les lois originellement dcrites par Mendel sont la consquence de la rpartition quitable, ou disjonction rgulire, du matriel chromosomique dans les gamtes au cours de la miose, et donc des copies d'un gne portes par les chromosomes homologues et de l'union de deux gamtes rduits qui lui fait suite, au cours de laquelle se reconstitue l'quipement diplode du matriel gntique. Le dimorphisme frquent des chromosomes sexuels, leur comportement particulier au cours de la miose et la dissymtrie des gnes qu'ils portent ne font que confirmer la rgle, mais conduisent distinguer les modes hrditaires autosomiques et les modes lis au sexe. Ces observations empiriques ont constitue le fondement de la thorie chromosomique de l'hrdit.

La rgle de base est trs simple: tout individu qui porte la mme information sur ses deux chromosomes produit un seul type de gamtes, tandis que tout individu portant sur les deux chromosomes homologues une information diffrente produit des gamtes de deux types, en quantit gale. L'union des gamtes des deux parents produit des proportions de zygotes conformment des distributions statistiques simples. Dans ce cours consacr l'homme, les lois fondamentales de la gntique des organismes diplodes sont supposes connues. Dans ce qui suit, on se limite rappeler la dfinition de quelques termes, le symbolisme en vigueur et les proportions classiques de l'hrdit monognique.

I.1.1) Vocabulaire gntique

L'unit hrditaire d'information est appele le gne. II occupe sur le chromosome un emplacement particulier, qui est son locus. Locus dsigne aussi l'emplacement d'un groupe de gnes apparents adjacents sur les chromosomes, d'une squence non codante, d'un marqueur ou l'un des divers sites que peut occuper une squence mobile. En outre, le terme locus est souvent utilise comme synonyme de gne. L'unit d'information peut exister sous deux ou plusieurs tats appels tats alllomorphes, formes allliques ou simplement allles. Les individus qui portent sur les deux chromosomes homologues la mme information, le mme allle, sont qualifies d'homozygotes. Les individus portant deux informations diffrentes, deux allles diffrents, un sur chacun de leurs chromosomes, sont qualifies d'htrozygotes. L'hmizygote ne porte qu'une copie du gne. Le mot gnotype dsigne la constitution gntique du gamte, du zygote, du clone cellulaire ou de l'individu, pour un ou plusieurs gnes (ou locus). La succession des gnes sur un chromosome ou sur un fragment de chromosome constitue une syntnie, qui ne tient compte que de la nature de ces gnes, et l'on appelle haplotype la succession des formes allliques de ces gnes sur un chromosome donn. En fait, les gnes n'ont nullement besoin d'tre situs sur le mme chromosome pour que l'on parle d'haplotype (par exemple, dans un gamte), mais cet usage nest pas en vigueur dans lespce humaine, ou l'haplotype dsigne le plus souvent la succession des marqueurs ou des allles sur un secteur chromosomique de petite taille. On utilise aussi, dans les tudes de liaison gntique, lexpression phase alllique pour designer les associations entre les allles de locus morbides et/ou des marqueurs sur les chromosomes. Pour un locus donn, il existe en principe autant d'tats homozygotes possibles que d'allles. Ne sont cependant accessibles ltude formelle que ceux d'entre eux qui modifient les caractristiques observables des individus (caractres morphologiques, biochimiques, physiologiques, etc.) ou phnotypes. L'htrozygote peut prsenter un phnotype semblable celui de l'un des homozygotes. Le caractre, ou l'allle de l'homozygote correspondant au phnotype visible chez lhtrozygote est appel dominant et l'autre rcessif. Un tat composite de l'individu htrozygote, porteur simultan des deux caractres prsents chez les deux homozygotes, traduit une codominance (cas de certains marqueurs molculaires), tandis qu'un tat intermdiaire est une dominance incomplte. Pour un gne donn, le gnotype individuel est le mme pour toutes les cellules, mais le phnotype ne s'observe que sur certains organes. L'observation peut tre effectue a divers niveaux (organisme, histologie, molcules) et les rapports de dominance peuvent varier en fonction de ces niveaux (dominance au niveau de l'expression d'une maladie, alors qu'il y a

codominance des squences nuclotidiques, par exemple). En outre, le phnotype individuel peut varier en fonction du milieu et du gnotype prsent d'autres locus. Une maladie ou un caractre congnital est un trait prsent la naissance ; la cause peut tre gntique ou non. Par exemple, les malformations dues la rubole sont prsentes la naissance mais sont d'origine virale. Les maladies gntiques peuvent tre ltales avant la naissance, prsentes la naissance (elles sont alors gntiques et congnitales) ou se dclarer plus tard.

I.1.2) Modes hrditaires des maladies gntiques

Le nombre de maladies hrditaires connues va croissant. McKusick, dans son catalogue Mendelian Inheritance in Man (MIM), recensait 1 487 maladies en 1966 et 6678 en 1994. Parmi ces 6 678, 4 458 taient dominantes autosomiques, 1 730 rcessives autosomiques, 412 lies au chromosome X, 19 au chromosome Y et 59 associes une mutation mitochondriale. Or on estime que le gnome humain contient environ 30 000 gnes. Le mode de transmission d'une maladie se dduit de la rpartition familiale des sujets sains et atteints. L'arbre gnalogique rsume cette information, qui doit tre la plus prcise possible. En particulier, l'examen mdical doit porter sur le plus grand nombre possible de sujets. Certaines anomalies du phnotype, semblables celles d'origine gntique, peuvent tre dues des facteurs environnementaux. Ces phnocopies sont importantes reconnaitre, puisqu'elles excluent l'intervention d'une cause gntique dans la ralisation de la maladie considre. Les arbres gnalogiques sont tracs en utilisant les symboles utilises par la plupart des gnticiens. Ces diffrents symboles sont reproduits figure 1

Des symboles noirs ou indiquent les sujets porteurs de la maladie tudie chez l'homme et la femme respectivement. Une flche ( ) dsigne le propositus (ou proposant, ou cas index), c'est--dire le sujet permettant de recenser la famille; une famille peut avoir plusieurs propositus. Des symboles plus complexes sont utilises en cas d'unilatralit des lsions ( ) ou chez les sujets atteints d'une autre affection ( , ). En cas de maladie lie au sexe, les femmes conductrices, c'est-a-dire htrozygotes, sont reprsentes par . Les sujets htrozygotes, pour le gne d'une maladie rcessive, sont parfois indiqus par les symboles ( , ) . La figure 2 montre un exemple d'arbre gnalogique. Les diffrentes gnrations sont numrotes en chiffres romains, le chiffre I dsignant la plus ancienne reprsente. Les diffrents individus d'une gnration sont numrots en chiffres arabes en partant de la gauche. Parfois, les individus d'une gnalogie sont numrots uniquement avec des chiffres arabes utiliss d'une faon squentielle: les individus d'un arbre gnalogique comprenant n individus sont numrots de I n. On tudie successivement les diffrents modes hrditaires.

I.2) Les modes classiques dhrdit humaine

I.2.1) Hrdit autosomique dominante (AD): Cas le plus frquent : Aa x AA (mariage d'un sujet htrozygote atteint et d'un sujet normal).

Les sujets atteints naissent toujours d'un parent porteur du mme caractre (sauf mutation). Le caractre apparat chaque gnration (ne saute pas de gnration, sauf lorsque la pntrance est rduite) Il y a autant de filles que de garons atteints. Il y a en moyenne dans les fratries autant de sujets atteints que de sujets sains. Un sujet atteint a la moiti de ses descendants atteints (statistiquement). Un sujet sain a tous ses enfants indemnes. On nobserve pas particulirement de consanguinit. Le caractre peut apparatre par mutation, puis se transmettre, ou, si les tares sont svres, tre limin rapidement.

Remarques :

La plupart du temps, on ignore ce que serait un sujet homozygote pour le caractre dominant. Certaines observations suggrent quil aurait une atteinte plus svre, plus tt, ou des troubles plus rapidement volutifs. Notion de pntrance et dexpressivit. Si une maladie n'est pas compatible avec la reproduction, sa frquence est celle de son taux de mutation.

Exemples de maladies AD :

Achondroplasie

Aniridie, Maladie de Marfan Myotonie de Steinert Polydactylie Polypose colique multiple

I.2.2) Hrdit autosomique rcessive (AR): Cas le plus frquent : Aa x Aa (mariage de 2 sujets htrozygotes bien portants). Gnotype parental: Aa * Aa

Pour une maladie rare, les sujets atteints naissent en gnral de parents normaux. Il y a autant de filles que de garons atteints. Il y a en moyenne dans les fratries un sujet atteint pour trois sujets sains. Un sujet atteint qui se marie un sujet normal non apparent donne habituellement naissance des enfants normaux. La maladie peut se rvler par rencontre inopine de gnes muts lors d'un mariage, et du fait de la faible dimension des familles humaines, ne toucher qu'une personne dans une famille. Le cas isol ne signifie donc pas ncessairement cas de novo. On observe frquemment une consanguinit (les chances de rencontre de copies d'un mme gne anctre mut augmentent), d' autant plus souvent que la maladie est plus rare. Quand une mutation se constitue, elle ne sexprime pas chez les sujets qui la portent.

Remarques :

Les mariages entre homozygotes existent, car souvent leur affection les rapproche (surdit, ccit...): centres spcialiss, comportements identiques.. Les maladies par dficits enzymatiques se transmettent en gnral sur ce mode. En fait, peu de gnes sont compltement rcessifs, et souvent les htrozygotes peuvent tre dpists : l'htrozygote est diffrent des deux types d'homozygote: hrdit intermdiaire ; la dtection des htrozygotes permet de leur donner un conseil gntique. Souvent les sujets homozygotes atteints dcdent, ou ne procrent pas. Parfois, le sujet homozygote atteint survit et se reproduit (albinisme par ex.). Sil pouse un sujet htrozygote phnotype normal, leur descendance paratra faussement de type dominant. Mme lorsqu'une maladie est rare, les htrozygotes sont frquents (mucoviscidose: frquence de la maladie : 4/10 000; --> frquence des htrozygotes : 4 /100). Notion de pntrance et d'expressivit parfois.

Exemples de maladies AR:

Les VI types de glycognose. Les intolrances aux sucres : galactose, fructose, saccharose, lactose. Les VI types de mucopolysaccharidoses, sauf la II (Maladie de Hunter : RLX) La plupart des troubles du mtabolisme des acides amins : phnylctonurie, tyrosinose, cystinose, leucinose, diffrents types d'albinisme (sauf lalbinisme oculaire : RLX) etc... De nombreuses anomalies du mtabolisme des lipides. Maladie de Wilson. De nombreux troubles de l'hormonosynthse, thyrodienne et surrnalienne surtout. Drpanocytose, thalassmies. Dficits en facteurs I, II, V, VII, XII, XIII. Mucoviscidose. etc...

Particularits de l'hrdit AR La consanguinit Le terme d'union consanguine est incorrect : on doit parler d'union entre sujets apparents, c'est dire entre deux individus ayant au moins un anctre commun. Dans cette situation, lhomme et la femme ont un risque plus grand d'avoir reu de leur anctre commun, un locus donn, un allle identique et d'avoir des enfants homozygotes. Le coefficient de consanguinit dfinit la probabilit que les enfants de cette union reoivent effectivement deux fois le mme allle.

I.2.3) Hrdit dominante lie au chromosome X Descendance d'une femme atteinte Xa XXa XaY (grave) (les X XX XY garons de manire plus grave).

X Y

La moiti des enfants sont atteints La moiti des enfants sont indemnes. Descendance d'un homme atteint Xa XXa XXa

X X Les garons sont toujours indemnes. Toutes les filles sont atteintes.

Y XY XY

Caractristiques de l'hrdit dominante lie l'X L'allle morbide se comporte comme un caractre dominant : les manifestations apparaissent aussi bien chez les hommes hmizygotes que chez les femmes htrozygotes (moins grave chez les femmes). Les deux sexes peuvent tre touchs par la maladie. Les femmes htrozygotes sont moins svrement atteintes que les hommes (parfois ltal chez les garons). Les femmes atteintes peuvent transmettre leur maladie aux deux sexes : risque de 1/2. Toutes les filles d'un homme atteint sont malades. Il n'y a pas de transmission pre-fils. La pntrance est incomplte et l'expressivit variable. (voir hrdit autosomique dominante) Exemples de pathologies Le syndrome de l'X fragile Rachitisme vitamino-rsistant hypophosphatmique Incontinentia pigmenti Dficit en ornithine transcarbamylase (OCT) I.2.4) Hrdit rcessive lie au chromosome X (RLX): Cas le plus frquent: Femme htrozygote, donc bien portante et conductrice, pousant un homme normal

Les sujets atteints naissent gnralement de parents normaux. Dans la parentle du pre, tous les sujets sont normaux. Dans la parentle de la mre il existe souvent des frres ou des ascendants masculins atteints. Les sujets atteints sont pratiquement toujours des garons. Dans la fratrie des atteints, un garon sur deux est malade, et une fille sur deux est conductrice.

Cas particuliers a) Mariage femme normale / homme atteint: Gnotype parental: XX * xY

Tous les garons sont normaux et indemnes de la mutation. Toutes les filles sont normales mais htrozygotes conductrices.

b) Mariage femme htrozygote / homme atteint: Gnotype parental: Xx * xY

Situation rare si la mutation est svre

La moiti des garons sont atteints. Les filles normales sont htrozygotes. Il existe des filles malades (1/2).

Situation peu probable pour un gne rare, mais usuelle pour certains gnes frquents (ex. daltonisme). L'atteinte exclusive des garons n'est pas un caractre absolu de l'hrdit lie l' X. Le critre de non transmission d'un pre son fils est plus fiable. (permet la diffrence avec les maladies dominantes autosomiques avec limitation au sexe). Remarques : dpistage des htrozygotes conductrices pour le conseil gntique. Exemples de maladies RLX:

Daltonisme

Hmophilies A et B Angiokratose diffuse (Maladie de Fabry) Myopathie type Duchenne Incontinentia pigmenti Agammaglobulinmie type Bruton Dficit en G6PD. etc...

Particularits de l'hrdit RLX Inactivation de l'X Dans chacune des cellules somatiques des femmes, les allles d'un seul chromosome X sont fonctionnels; ceux ports par l'autre chromosome X sont pratiquement tous inactivs. Linactivation d'un des chromosomes X se fait au hasard, un stade prcoce de lembryogense. Chez une femme htrozygote pour une maladie RLX, l'inactivation peut toucher soit le chromosome porteur de l'allle mut soit celui porteur de l'allle sain. La rpartition alatoire des X actifs dans tous les tissus explique la variabilit d'expression de l'allle mut qui peut entraner des anomalies biologiques (voire cliniques) chez les conductrices. Dtection des femmes conductrices (htrozygotes) Dans une famille touche par une maladie RLX, le dpistage des conductrices est essentiel en raison du risque de transmission et des possibilits ventuelles de diagnostic prnatal. Cette dtection peut se faire: - en recherchant des signes cliniques ou biologiques mineurs de l'affection en cause (dosage sanguin des enzymes musculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne ou dosage de lactivit du facteur VIII dans l'hmophilie A). Ce type de dtection nest possible que pour certaines maladies et toutes les conductrices nexpriment pas danomalie. - par la biologie molculaire quand le gne ou sa localisation sont connus. Mutations de novo Comme pour les maladies dominantes, une mutation sur le chromosome X peut survenir au cours de la miose d'un individu totalement sain et non porteur de la mutation. Une mutation survenue au cours de la miose masculine peut donner naissance une fille conductrice; une mutation survenue au cours de la miose fminine peut donner soit une fille conductrice soit un garon atteint.

I.3) Facteurs affectant les modes de transmission

Facteurs susceptibles de modifier le phnotype I.3.1) Htrognit gntique L'htrognit gntique intresse tous les modes de transmission mais est particulirement illustre par les maladies AR. On distingue : L'htrognit alllique ou intralocus qui rend compte du fait qu'une maladie peut tre due des mutations diffrentes (allliques) dans le mme gne (une maladie / plusieurs allles morbides). C'est ainsi que l'on connat plus de 700 mutations diffrentes du gne CFTR impliqu dans la mucoviscidose. Un individu malade portant deux mutations diffrentes au mme locus est appel htrozygote composite. L'htrognit interlocus se traduit par le fait qu'un phnotype apparemment identique peut tre cause par des mutations dans des gnes diffrents (une maladie / plusieurs gnes).

On a, par exemple, identifi actuellement plus de 40 loci impliqus dans les rtinites pigmentaires (AD, AR et RLX) qui sont des affections dgnratives de la rtine. L'htrognit des mutations conduit des manifestations variables. I.3.2) Pntrance Certains individus possdant le gne dltre (d'une maladie autosomique dominante, par exemple), ne prsentent pas le phnotype attendu : on dit alors que la pntrance est incomplte. Le nombre d'individus porteurs de la mutation ne correspond pas au nombre d'individus ayant un phnotype anormal. Il s'agit d'une valuation quantitative. Dans la neurofibromatose de type-I la pntrance est d'environ 80% mais il est cependant parfois difficile d'liminer toute forme frustre de la maladie. Une meilleure connaissance du type de mutation dans ces familles nous permettra de mieux cerner cette notion de pntrance. par pntrance incomplte et un cas sporadique par mutation. La pntrance incomplte Lorsquun gne dominant n'entrane aucune manifestation, il est dit non pntrant

Le coefficient de pntrance est la probabilit de manifestation du gne Dans une maladie pntrance variable, il peut y avoir des sauts de gnration. La pntrance peut varier :

avec lge : Exemple : dans la maladie de Huntington

30 ans 20 % des sujets ont des signes de la maladie 40 ans 40 % 50 ans 60 % 60 ans 80 %

avec la qualit des moyens mis en uvre Exemple : dans la polykystose rnale, la pntrance nest pas la mme selon que lon utilise des moyens de diagnostic clinique ou le dpistage chographique Aprs dpistage chographique :

o o

0 - 9 ans : 22 % (avant 10 ans, 22% des individus porteurs de la mutation ont des kystes rnaux) 20 - 30 ans : 86 %

I.3.3) Expressivit Par ailleurs, le phnotype peut tre plus ou moins svre selon les individus; il y a alors une expressivit variable du gne dltre. Il s'agit d'une valuation qualitative. Lexpressivit peut concerner : -Le nombre de tissus atteints Exemple : maladie de Marfan : affection dominante lie une mutation dans le gne de la Fibrilline. Dans le syndrome de Marfan, pour une mutation familiale identique, certains individus atteints auront une forme svre touchant les systmes cardio-vasculaire, oculaire et squelettique alors que pour d'autres individus seule la grande taille et l'arachnodactylie, sans luxation du cristallin ou anvrysme aortique, seront observes.

Latteinte est PLEIOTROPIQUE : concerne plusieurs organes et plusieurs tissus : o Squelette : grande taille, scoliose o il : luxation du cristallin o Cardiovasculaire : augmentation du diamtre de laorte, risque de dissection aortique et de mort subite.

-La svrit de latteinte Pntrance : Phnomne quantitatif Expressivit : Phnomne qualitatif

maladies autosomiques dominantes. I.3.4) Homozygotie pour un caractre dominant

Situation exceptionnelle. En gnral lhomozygote pour la mutation est plus svrement atteint que lhtrozygote

EXCEPTION : CHOREE DE HUNTINGTON : lhomozygote a le mme phnotype que lhtrozygote

I.3.5) Anticipation/ ge du dbut de la maladie Bien que prsentes la naissance plusieurs maladies ne se manifesteront que plus tard dans la vie. Un examen physique normal chez une personne de 20 ans, risque de dvelopper une maladie de Huntington, n'exclut pas la possibilit que cette personne soit effectivement atteinte de la maladie ne famille, l'analyse molculaire pourra confirmer ou exclure la prsence d'une mutation avant l'ge du dbut de la maladie chez l'individu risque.

gnration l'autre accompagne de manifestations plus svres. Le phnomne est observ surtout, mais non exclusivement, dans les maladies autosomiques dominantes, en prsence d'une rptition plus marque de triplets d'une gnration l'autre, comme dans la dystrophie myotonique (CTG) et la maladie de Huntington (CAG). Dans l'ataxie de Friedreich, une maladie autosomique rcessive, la littrature fait mention de plusieurs familles o la rptition plus importante de triplets (GAA) d'une gnration l'autre s'accompagne d'une apparition plus prcoce de la maladie et d'une symptomatologie plus svre. Cependant on retrouve aussi dans le syndrome du X Fragile (CGG), un syndrome li au chromosome X, sil y a rptition plus marque de triplets, une svrit accrue de la maladie sans qu'on puisse ncessairement parler ici d'un phnomne d'anticipation. I.3.6) Pliotropie L'expression de certains gnes peut se limiter un seul organe (ex : les rtinites pigmentaires AD qui comportent uniquement des anomalies ophtalmologiques); dautres maladies touchent de nombreux organes (ex : la sclrose tubreuse de Bourneville donne des signes cutans, neurologiques, rnaux, cardiaques, etc...). On appelle ce phnomne l'effet plotropique du gne. Aussi dans le syndrome Moon-Biedl, une maladie autosomique rcessive, des malformations sont observes au niveau des systmes nerveux, endocrinien, squelettique et oculaire. Le gne mutant peut agir plusieurs stades du dveloppement.

I.3.7) Interaction des gnes co-facteurs La fonction d'un gne est parfois rgie par un ou d'autres gnes agissant titre de rgulateurs. Ainsi le gne en cause peut avoir une structure normale mais d'autres gnes ailleurs dans la chane mtabolique ou l'absence de co-facteurs peuvent-tre responsables de l'inhibition de l'activit de la protine et l'apparition d'une maladie gntique. -Pour certains individus le rachitisme est d une simple carence en vitamine D qui sera corrige par l'ajout d'un supplment vitaminique dans l'alimentation. Pour d'autres il est d l'absence de la forme active de la vitamine D, une maladie autosomique rcessive ou d'autres mutations touchant le mtabolisme de la vitamine D. -On retrouve des mutations de gnes suppresseurs du cancer, rgulateurs de protines (enzymes) ou de rparation de l'ADN. titre d'exemples ces mutations seront l'origine de maladies mtaboliques telles les mucopolysaccharidoses, les cancers de l'ovaire et du colon, et les dfauts de rparation de l'ADN comme dans l'ataxie tlangiectasique. I.3.8) Gnes de susceptibilit au cancer et malformations Un certain nombre de gnes susceptibles d'tre l'origine d'un cancer peuvent simultanment tre l'origine d'un syndrome malformatif. -Le gne WT1 situ sur le chromosome 11 qui l'habite subirait une dltion dans la rgion 11p13 entranant une tumeur de Wilms et une nphropathie. Le syndrome WAGR (W : Wilms ;A : aniridie ; G :malformation gnito-urinaire, R : retard mental ) serait une consquence de cette dltion impliquant la fois des gnes contigus de la rgion11p13 11p14. -Un autre exemple est celui du syndrome de Beckwith-Wiedemann galement situ sur le chromosome 11, dans la rgion 11p15.5 qui impliquerait plus d'un gne contigu de cette rgion. Le syndrome se manifeste par de lobsit, macroglossie, nphroblastome (hpatoblastome, neuroblastome), gigantisme et omphalocle. Le facteur de croissance IGF-2 ( Insulin-like growth factor 2') un gne imprim (expression paternelle) serait impliqu dans la pathognse de la macrosomie; une mutation d'autres gnes, tel que le gne CDKNIC (p57K1P2) (expression maternelle), peut tre responsable pour d'autres aspects du phnotype. sont essentielles pour prciser les mcanismes tiologiques de ces syndromes malformatifs avec susceptibilit au cancer. 1.3.9) Hrdit multifactorielle

Multialllique : il existe pour 1 mme locus toute une srie d'allles possibles; chaque sujet n'en possde que 2 et la transmission se fait sur le mode monognique. Multifactoriel :
o

Il existe pour un caractre donn, toute une srie de gnes (et donc de loci) qui concourent son tablissement (synonymes: systme polygnique, hrdit quantitative, facteurs multiples). Leur tude gntique est complexe et mathmatique.

Rle adjuvant de facteurs environnementaux. - exemples : taille d'un sujet, cardiopathies congnitales, pilepsie.

Exemples de maladies hrditaires multifactorielles:

o o o o o o o o o o

Fente palatine Bec de livre Maladies cardio-vasculaires Epilepsie Schizophrnie Diabte Goutte Luxation de la hanche Strabisme Psoriasis, etc... etc...

I.4) Modes non classiques dhrdit humaine

I.4.1) Hrdit mitochondriale Les mitochondries proviennent d'anciennes bactries anarobies; elles ont leur propre ADN. Il existe donc un ADN extra nuclaire dans nos cellules. ADN mitochondrial :

ADN circulaire de 16 kb, dont la squence est entirement connue. 37 gnes codant pour 13 protines, des ARN ribosomiques, et des ARN de transfert. Avec un code diffrent du code universel : Mito. Univ. UGA Trp STOP AUA Met Ile AGA/AGG STOP Arg .(voir tableau ci-dessous) Les mitochondries sont prsentes dans lovocyte (en trs grand nombre) : Hrdit non mendlienne: hrdit purement maternelle. Il existe des maladies hrditaires dues des gnes mitochondriaux dfectueux. Les cytopathies mitochondriales sont souvent des pathologies symptomatologie pliotropique (multiple), car le dficit touche de nombreux organes; ex: syndrome de Pearson: insuffisance pancratique exocrine, insuffisance mdullaire/mylodysplasie, dficit musculaire, troubles hpatique, rnal, gastrointestinal ...

Variation du code gntique Les mitochondries utilisent un code gntique diffrent du code gntique universel, utilis par la trs grande majorit des organismes vivants. En fait il existe 17 codes gntiques diffrents, dont 11 pour les mitochondries de diffrents organismes. Il faut noter que les associations entre espces et code gntique mitochondrial sont en constante volution au gr des squenages de nouveaux gnomes mitochondriaux. Par exemple le code n5 appel "code mitochondrial des invertbrs" est confirm pour des espces comme Caenorhabditis elegans ou la drosophile (avec l'exception de l'absence de codon AGG), mais par exemple, ce n'est pas le cas pour les oursins qui ont leur propre code (n9).

Exceptions au code gntique universel chez diffrentes mitochondries Organisme Codon Standard Variation AGA, Arginine Stop AGG Vertbr AUA Isoleucine Methionine UGA Stop Tryptophane AGA, Arginine Serine AGG Invertbrs AUA Isoleucine Methionine UGA Stop Tryptophan AUA Isoleucine Methionine Levure UGA Stop Tryptophane CUA Leucine Threonine

Une maladie due un gne mitochondrial dfectueux est transmise : 1. Uniquement par les femmes, 2. A tous ses descendants. Souvent lanomalie gntique nest pas prsente dans toutes - mais dans une partie seulement- des mitochondries transmises la gnration suivante; alors, selon le taux de mitochondries mutes 3. Expressivit variable - Note: Le terme "cytopathie mitochondriale" peut tre ambigu: les cytopathies mitochondriales incluent non seulement les pathologies dues aux mutations des gnes mitochondriaux, mais aussi celles dues aux mutations des gnes nuclaires codant pour les protines intervenant dans le mtabolisme mitochondrial (enzymes de la chane respiratoire). Exemples de maladies hrditaires mitochondriales:
o o o

Atrophie optique de Leber Myopathies mitochondriales Syndrome de Pearson ....

I.4.2) Mosaque germinale Le mosacisme germinal est dfini par la prsence d'une double population de cellules germinales, certaines tant porteuses d'une mutation, d'autres tant sauvages. Par dfinition, le parent porteur d'une mutation germinale en mosaque peut la transmettre sa descendance. Si cette mutation est absente des cellules somatiques, la maladie ne s'exprimera pas chez le parent porteur mais pourra tre transmise sa descendance. Ce concept est d'une grande importance en conseil gntique puisqu'il signifie que des parents indemnes peuvent avoir plus d'un enfant porteur d'une apparente no-mutation. L'ostogense imparfaite est une affection autosomique dominante habituellement associe des mutations htrozygotes dans

les gnes COL1A1 ou COL1A2 codant pour les chanes 1 et 2 du collagne de type 1. La transmission du trait peut alors ressembler, dans certaines familles, une hrdit autosomique rcessive avec plusieurs enfants issus de parents sains. Ce mosacisme germinal a t dcrit dans diverses affections dont la NF1 et la dystrophie musculaire de Duchenne.

I.4.3) Empreinte parentale ou Empreinte gnomique oUn gne est soumis empreinte lorsque l'expression de ce gne dpend de son origine parentale (maternelle ou paternelle). oUn gne peut tre soumis empreinte seulement dans un tissu particulier (par exemple uniquement dans le placenta) ou un moment particulier (par exemple au cours du dvelopement embryonnaire). oLes gnes soumis empreinte sont le plus souvent regroups dans des domaines chromatiniens contrls par un centre d'inactivation. On connat actuellement chez l'homme plus de 30 gnes soumis empreinte parentale, et on estime qu'il en existe probablement dix fois plus. Au cours du dveloppement les gnomes d'origine maternelle et paternelle ne sont pas quivalents mais complmentaires suite un phnomne pigntique survenu en gamtognse La fonction d'un gne peut varier selon qu'il est dorigine maternelle ou paternelle. -Une dltion sur le chromosome 15 (15q11-13) originant du complment chromosomique paternel va donner un syndrome de Prader Willi diffrent du syndrome d'Angelman observ si la dltion origine de la mre. -Dans certaines maladies le sexe du parent atteint peut influencer le degr de svrit chez la personne qui le gne mutant est transmis. Dans la dystrophie myotonique la maladie sera plus svre, souvent congnitale si c'est la mre atteinte qui transmet la maladie alors que dans la maladie de Huntington la maladie sera plus svre et de manifestation prcoce si c'est le pre qui l'a transmise. Dans ces deux exemples le rle d'autres facteurs soit d'empreinte parentale ou de mutation mitochondriale n'est pas exclu.

haplode a subi une duplication ou par une dispermie, serait responsable de la mle hydatiforme. I.4.4) Disomies Uniparentale (DUP) Il existe, chez un individu diplode, une disomie uniparentale (DUP) pour un chromosome ou un segment de chromosome lorsque les deux exemplaires de ce matriel ont t hrits d'un seul et mme parent. -On parle d'isodisomie ou d'htrodisomie uniparentale selon que les deux exemplaires du matriel considr chez l'individu sont la copie d'un mme exemplaire ou des deux exemplaires diffrents du matriel parental, respectivement. -La mise en vidence des DUP repose sur des techniques de biologie molculaire : en effet, l'utilisation de marqueurs polymorphes microsatellites d'un locus donn, comparativement chez le sujet et ses deux parents, permet de mettre en vidence la double contribution de l'un des parents et la non-contribution de l'autre parent au gnotype du sujet, pour ce locus. I.4.4.1) Mcanismes conduisant aux disomies uniparentales Parmi les mcanismes invoqus pour expliquer l'apparition d'une DUP, trois semblent plus probables : (1) la fcondation d'un gamte disomique pour une paire chromosomique donne par un gamte nullosomique pour le mme chromosome (complmentation gamtique) (2) la duplication d'un chromosome dans un zygote monosomique (3) la "correction (ou rduction) de trisomie", c'est--dire la formation d'un zygote trisomique suivie de la perte d'un des 3 chromosomes intresss par la trisomie. Ce mcanisme de correction de trisomie pourrait tre le plus frquent. Si la correction d'une trisomie se fait au hasard, c'est une fois sur trois que les deux chromosomes homologues conservs proviennent d'un mme parent et qu'il en rsulte une DUP . Ce mcanisme est observ en particulier dans les trisomies confines au placenta, en mosaque ou non, qui peuvent conduire une DUP par rduction de trisomie. Les consquences phnotypiques des DUP sont varies et en rapport avec des mcanismes divers. A-Les mcanismes 1. Une isodisomie uniparentale peut faire apparatre une maladie rcessive autosomique alors que seul l'un des parents est htrozygote pour l'allle mutant. Cette situation a t dmontre dans de rares cas de mucoviscidose, o, chaque fois, les enfants atteints ont hrit des deux copies maternelles du chromosome 7.

2. Lorsqu'elle porte sur un territoire chromosomique soumis empreinte parentale, une disomie uniparentale peut engendrer une pathologie lorsqu'elle exclut le chromosome parental normalement actif. o Ainsi, 30% des cas de syndrome de Prader-Willi sont dus une DUP maternelle de la rgion q11-q12 du chromosome 15 ; en effet, c'est l'exemplaire paternel qui est actif. o La DUP d'une rgion voisine du chromosome 15 d'origine paternelle est, quant elle, responsable d'environ 5% des cas de syndrome d'Angelman : c'est l'exemplaire maternel qui est normalement actif. o Dans le syndrome de Beckwith-Wiedemann, une DUP des chromosomes 11 d'origine paternelle a t mise en vidence dans environ 10% des cas. B-Consquences phnotypiques 1-Retard de croissance intra-utrin o Les enfants atteints de mucoviscidose par DUP maternelle cits plus haut prsentaient en outre un retard de croissance intra-utrin (RCIU) ce qui est inhabituel dans cette maladie. Le gne de la mucoviscidose (CFTR) est situ sur le chromosome 7. Or d'autres cas de DUP du chromosome 7 d'origine maternelle ont t rapports chez des enfants sans mucoviscidose mais ayant un RCIU qui se prolonge par une petite taille post natale. o Des DUP du chromosome 14 d'origine maternelle ont t dcrites chez des patients ayant un RCIU, un retard de croissance statural post natal et une pubert prcoce. o Des DUP obtenues chez la souris en utilisant des lignes pures porteuses de translocations rciproques quilibres ont montr, dans un grand nombre de cas, qu'un RCIU important semblait tre la seule consquence, tmoignant ainsi de l'importance d'une contribution biparentale pour un dveloppement foetal harmonieux. Il est donc possible qu'une certaine fraction des RCIU inexpliqus de l'homme rsulte d'une DUP. I.4.4.2) Phnotype non pathologique o Chez l'homme comme chez la souris, certaines DUP ne s'accompagnent d'aucun retentissement phnotypique, ce qui permet d'exclure la prsence de gnes soumis empreinte parentale dans les rgions tudies (c'est le cas par exemple pour les DUP maternelles et paternelles des chromosomes 13 et 21, les DUP maternelles des chromosomes 4 et 22 et les DUP paternelles du chromosome 6). L'incidence des DUP n'est pas connue mais le nombre d'observations dj publies justifie leur recherche systmatique dans diverses situations cliniques, et en particulier : o l'association, une maladie autosomique rcessive rare d'un RCIU ou d'autres anomalies malformatives, o l'association d'une translocation quilibre, hrite ou de novo, un phnotype anormal, o un RCIU svre et isol inexpliqu,

o une pathologie connue de l'empreinte parentale. La dcouverte d'une DUP peut contribuer la localisation et l'identification de gnes soumis empreinte gnomique parentale. Plusieurs maladies sont en rapport avec des gnes soumis empreinte :

Syndrome de Prader-Willi Syndrome d'Angelman Syndrome de Silver-Russel Diabte nonatal Syndrome de Beckwith-Wiedemann

II) ANALYSE GENETIQUE

Une analyse gntique est une technique d'analyse du gnome des cellules d'un organisme. Les analyses gntiques se pratiquent sur tout type d'organisme. Chez les humains elles sont utilises dans un cadre mdical ou juridique (enqute criminelle) Diffrents types d'analyse Ce peut tre :

une empreinte gntique pour tablir une identit ; une analyse de l'ADN mitochondrial pour mettre en vidence une filiation ; un test de paternit ; un diagnostic gntique pour dpister une ventuelle maladie gntique ou pour valuer un risque ; Une analyse de gnome pour comparer l'ADN en phylognie molculaire. Le sexage ADN consiste dterminer le sexe d'un individu par analyse d'un gne dterminant le sexe, quand le sexe n'est pas dterminable (organisme jeune...).

II.1) Techniques d'analyse gntique

Les tests gntiques Les tests gntiques englobent deux grandes catgories d'application : d'une part, le test prdictif, le dpistage des porteurs de gnes dltres et le test diagnostique, et d'autre part, les empreintes gntiques. Le test prdictif, le dpistage des porteurs et le test diagnostique sont dcrits ci-aprs. Les empreintes gntiques sont dcrites en fin de chapitre. On sait que les maladies hrditaires sont associes des anomalies dans certains gnes ou chromosomes particuliers. Ainsi, on sait que plusieurs maladies sont lies des mutations gntiques particulires, comme la maladie Tay-Sachs et la fibrose kystique (ou mucoviscidose) Le test prdictif, le dpistage des porteurs et le test diagnostique permettent d'valuer l'ampleur de ces anomalies dans chaque gnome. Avant d'examiner comment les techniques de dpistage gntique sont employes pour dceler ces maladies et d'autres, il nous faut comprendre comment les gnes dfectueux peuvent dclencher la maladie. II.1.1) Gnes dfectueux et maladie gntique De nombreux gnes sont transcrits en ARN messager, qui, en fin de compte, synthtise les protines. Ce sont les protines qui sont responsables d'importants processus cellulaires. Si un gne particulier est dfectueux, son produit protique ne sera peut-tre pas fabriqu ou encore il fonctionnera mal ou de manire trop agressive. Les symptmes d'une maladie gntique sont le rsultat de l'interruption de processus cellulaires vitaux provoque par l'absence ou le mauvais fonctionnement de protines. Par exemple, la fibrose kystique est gnralement provoque par l'absence d'un segment de gne1 qui donne lieu une malformation de la protine de transport membranaire de la cellule. Cette malformation entrane en fin de compte l'accumulation d'un pais mucus dans les poumons et les voies ariennes du corps. Les cancers sont provoqus par des cellules qui se

divisent et prolifrent de manire incontrlable. Les gnes dfectueux, que l'on appelle oncognes, peuvent donner lieu une prolifration cellulaire. L'absence ou le mauvais fonctionnement d'une protine peut tre le rsultat d'une mutation gntique. Une mutation gntique est simplement une altration des nuclotides qui constituent un gne. Elle peut prendre la forme du remplacement d'un nuclotide par un autre, ce qui entrane la substitution d'un acide amin par un autre sur la chane protique qui en rsulte. Par exemple, la squence d'ARN UGC code pour un acide amin appel cystine dans la chane protique rsultante. Si le nuclotide guanine (G) tait remplac par un nuclotide adnine (A), la nouvelle squence UAC coderait pour la tyrosine, un acide amin diffrent. La protine produite pourrait prendre une forme diffrente, car la cystine peut former des liaisons particulires avec d'autres segments de la chane protique (appele liaisons disulfures), ce qui n'est pas le cas de la tyrosine.

La perte ou le gain d'un nuclotide dans une squence gntique constitue un autre type de mutation, qui peut entraner la production d'une protine tout fait diffrente, car la phase de lecture est modifie. Envisageons l'exemple suivant : supposons que la version normale d'un brin d'ARN messager renferme ce qui suit :

La chane d'acides amins code pour cette squence est

Ceci se produit, car UUG code pour la leucine, CGA et CGG codent pour l'arginine, et GGG code pour la glycine. Imaginons maintenant qu'on ajoute une adnine (A) supplmentaire aprs la premire uracile (U) :

Comme les nuclotides sont toujours lus en triplet par un ribosome lors de la fabrication d'une protine, ils seront lus comme suit :

Maintenant, la squence d'acides amins sera :

car UAU code pour la tyrosine, GCG code pour l'alanine et AGG code pour l'arginine. En consquence, l'ajout d'un seul nuclotide donne lieu une squence compltement diffrente d'acides amins (et donc de protine), car la phase de lecture est dcale d'un seul nuclotide! D'autres types de mutations entranent la suppression ou la multiplication de longs segments d'ADN. En d'autres termes, ou les protines associes ne sont pas du tout fabriques, ou elles sont beaucoup plus courtes ou plus longues, ce qui rduit leur capacit de faire leur travail correctement. II.1.2) La mutation gntique Les mutations gntiques peuvent soit tre hrditaires soit tre acquises pendant la vie d'une personne. Une mutation hrditaire sera prsente dans toutes les cellules d'une personne et sera transmise sa descendance, car les cellules reproductrices de la personne (sperme ou ovule) renferment la mutation. Les mutations acquises peuvent se produire dans l'ADN de cellules individuelles sous l'action de nombreux facteurs possibles. Par exemple, des mutations dans l'ADN des cellules de la peau peuvent tre provoques par l'exposition aux rayons ultraviolets du soleil.. Les mutations gntiques dans d'autres cellules peuvent tre provoques par des erreurs qui se produisent juste avant la division cellulaire, pendant laquelle une cellule rplique son ADN avant de se diviser en deux. En gnral, les mutations qui se produisent sont rapidement rpares, avant que la mutation ne soit transmise aux cellules des descendants, par une batterie d'enzymes qui scrutent constamment l'ADN pour dceler les erreurs. Toutefois, parfois, ces enzymes de rparation chouent, ce qui entrane des mutations non corriges susceptibles de provoquer des troubles. Il convient de noter que 90 95 p. 100 de tous les cancers sont attribuables des mutations acquises2 et non hrditaires. En consquence, l'absence de mutations cancrognes avant la naissance ou un jeune ge ne garantit pas qu'une personne nait pas un cancer plus tard dans sa vie par suite d'une ou de plusieurs mutations acquises. II.1.3) Tests gntiques en recherchant des mutations dans un chantillon d'ADN Habituellement, on effectue les tests prdictifs et diagnostiques et le dpistage des porteurs pour dceler des mutations gntiques en examinant l'ADN d'une personne. Cependant, il ne

s'agit pas de la seule mthode employe pour dterminer si l'ADN d'une personne a subi une mutation particulire. Il existe un autre moyen de dceler la prsence de mutations. Lorsqu'on constate l'absence ou le mauvais fonctionnement d'une protine -- et quand on peut les attribuer une mutation (ou plusieurs mutations) d'un simple gne - on parle de test gntique fonctionnel. Le test fonctionnel a l'avantage de pouvoir dmontrer non seulement la prsence d'un gne mut, mais aussi qu'il fabrique une protine anormale ou encore qu'il ne fabrique aucune protine. Si l'on peut dceler des mutations dans l'ADN d'une personne en examinant ses protines, c'est parce que des gnes particuliers codent pour un ARN messager particulier qui, son tour, code pour des protines distinctes. En consquence, une analyse de l'ARN ou des protines d'une personne (ou leur absence, si un gne dfectueux empche leur production!) peut rvler la prsence d'une mutation gntique particulire dans l'ADN d'une personne. II.1.4) Tests gntiques l'aide de l'ADN : a) Test direct de l'ADN Le test direct vise dceler une mutation gntique particulire (ou plusieurs mutations) que l'on sait l'origine de maladie. Pour ce faire, on peut examiner l'ADN d'une personne, l'ARN, les protines ou d'autres produits d'expression gnique. Le test direct de l'ADN est ralis comme suit : o Tout d'abord, on prlve un chantillon des cellules de l'individu tester. En gnral, on utilise des cellules sanguines, car ce sont les plus faciles prlever. o Ensuite, on extrait l'ADN des cellules. Presque toutes les cellules du corps d'une personne contiennent une srie identique et complte d'ADN. En consquence, l'ADN obtenu d'une cellule, quelle qu'elle soit, peut tre utilise pour dceler une mutation. o L'ADN est rompu l'aide d'enzymes appels endonuclases de restriction. Ces enzymes coupent l'ADN en des sites prcis. o Les morceaux sont ensuite tris selon leur taille l'aide d'une technique appele lectrophorse en gel, comme suit : l'ADN est plac dans un gel d'agarose (produit semblable de la gele fabriqu partir d'algues marines) et on applique un potentiel lectrique. Comme l'ADN est charg ngativement, il se dplacera travers le gel vers le ple positif. Mais les morceaux plus petits rencontreront moins de rsistance que les plus gros, ce qui signifie qu'ils se dplaceront plus rapidement dans le gel. o Aprs quelques heures, les fragments d'ADN auront t organiss en fonction de leur taille, les fragments les plus petits ayant t le plus loin, alors que les plus longs auront peut-tre peine boug par rapport leur position de dpart. o Ensuite, les fragments d'ADN sont transfrs sur une feuille de nylon. Le nylon, plac au-dessus du gel, absorbe l'ADN, de sorte que tous les brins d'ADN sont transfrs tout en gardant leur position relative en fonction de leur taille. Pendant ce processus d'absorption, l'ADN bicatnaire est spar en brins uniques. o La feuille de nylon laquelle l'ADN s'est fix est place dans une solution avec des sondes spciales d'ADN. Les sondes d'ADN ont t conues en laboratoire pour se lier un fragment de gne porteur d'une maladie connue. Une sonde repre son image symtrique sous la forme du gne infect et s'y lie. o Les sondes d'ADN sont radioactives, de sorte que toute sonde qui se lie la feuille de nylon (et donc un gne porteur de maladie) peut tre dcele3. On superpose une pellicule photographique sur la feuille de nylon aux fins de dtection. Les gnes porteurs de la maladie qui se sont lis aux sondes d'ADN apparatront sur le film comme une srie de bandes

fonces. Par consquent, les bandes fonces sur le film l'endroit prvu (souvenez-vous que l'emplacement de la bande indique la taille du fragment d'ADN) rvleront la prsence d'un gne porteur de la maladie. Le test direct est actuellement possible pour des maladies comme la fibrose kystique, la chore de Huntington (affection qui survient chez les personnes d'ge moyen et qui provoque la dmence, puis la mort2), la dystrophie myotonique (l'affection musculaire hrditaire la plus courante chez les adultes qui entrane un affaiblissement et une atrophie musculaire4) et l'achondroplasie (affection provoquant des difformits osseuses pendant l'enfance et entranant le nanisme). Il convient de noter que le test direct ne prdit pas infailliblement avec prcision le dbut d'un trouble gntique. Les personnes touches par une certaine mutation gntique ne connatront pas toutes la maladie et certaines personnes atteintes ne prsenteront pas la mutation recherche. Le dclenchement d'un trouble gntique peut aussi dpendre de l'exposition certaines conditions dans l'environnement d'une personne, ou la maladie peut tre provoque par une autre mutation non recherche. Par exemple, bien que l'on ait constat que de nombreuses mutations soient l'origine de la fibrose kystique, il serait trs onreux et laborieux d'effectuer les tests pour toutes les dceler. On recherche plutt les 13 mutations les plus courantes, qui reprsentent environ 88 p. 100 de tous les cas (ce pourcentage varie en fonction de l'origine ethnique). De toute vidence, une personne prsentant l'une des mutations plus rares non recherches pourrait tre atteinte de la maladie mme si son test gntique tait ngatif. Comme ces tests ne sont pas prdictifs 100 p. 100, l'information obtenue doit tre interprte en tenant compte des antcdents familiaux et, dans certains cas, du diagnostic tabli par le spcialiste au terme de l'examen physique. (b) Analyse de liaison Il est galement possible de dceler les maladies gntiques sans rechercher les mutations gntiques particulires qui les provoquent. Il est possible de dceler les maladies gntiques en recherchant les marqueurs gntiques chez les membres de familles ayant dj prsent une affection donne. On appelle ce type de test analyse de liaison. Les marqueurs gntiques sont des segments d'ADN dont hritent systmatiquement les personnes porteuses de la maladie mais qu'on ne retrouve pas chez les membres de la famille qui en sont exempts. Ces segments gntiques sont grands et peuvent contenir de nombreux gnes, ce qui signifie que l'anomalie gntique responsable de l'affection n'aura peut-tre pas t dtermine. Dans le cadre de la recherche de marqueurs gntiques, il convient de comparer l'ADN du candidat avec des chantillons d'ADN provenant de membres de sa famille qui sont porteurs de la maladie et de membres en bonne sant. On peut utiliser l'analyse de liaison pour dceler plusieurs maladies hrditaires, y compris le cancer du sein et l'hmophilie. Il convient de noter que l'analyse de liaison n'est pas exacte 100 p. 100 et n'a de sens que lorsqu'on examine l'information sur un patient en tenant compte de ses antcdents familiaux. Une analyse de liaison positive pour le cancer du sein o une rgion chromosomique appele BRCA-1 est examine pourrait signifier que les risques de cancer du sein sont de l'ordre de 80 p. 100, mais uniquement si le rsultat est corrobor par les rsultats des tests effectus sur d'autres membres de la famille porteurs et non porteurs.

II.1.5) EMPLOI DU TEST DIRET OU DE LANALYSE DE LIAISON GENETIQUE TEST PRDICTIF Le test direct et l'analyse de liaison gntique peuvent tre employs pour identifier les personnes qui risquent d'attraper une maladie, et ce, avant l'apparition des symptmes. On appelle ce genre de test un test prdictif. On l'effectue afin d'examiner les troubles familiaux attribuables une anomalie gntique connue. Mais que vous rvle un test prdictif? Un test prcis vous indiquera si vous prsentez ou non une mutation gntique lie la maladie. Vous contracterez ou non la maladie selon le mode d'interaction de la mutation avec plusieurs autres facteurs. En d'autres termes, ce n'est pas parce qu'il y a mutation que la personne contractera obligatoirement la maladie, bien que dans de nombreux cas, les risques soient relativement levs Par ailleurs, un test ngatif ne garantit pas la personne qu'elle n'aura pas la maladie en question, mais qu'elle court le mme risque de contracter la maladie par une mutation acquise que d'autres personnes n'ayant pas hrit de la mutation. Souvenez-vous que plus de 90 p. 100 des cancers sont provoqus par des mutations acquises. De plus, un membre d'une famille ayant des antcdents concernant un trouble gntique donn peut avoir hrit d'un gne de susceptibilit diffrent et inconnu non dcel par le test. a) DPISTAGE DES PORTEURS Parfois, les gens sont porteurs d'une partie du patrimoine gntique d'un trouble hrditaire, mais ne sont pas affects par la maladie elle-mme. C'est pourquoi, au sein d'une mme famille ayant des antcdents d'une maladie hrditaire donne, des membres bien portants peuvent avoir des enfants atteints du trouble en question. On peut avoir recours au dpistage des porteurs pour aider les couples en bonne sant dont l'un ou les deux conjoints ont des antcdents familiaux d'un certain trouble hrditaire. Le test peut permettre de dterminer si l'un d'entre eux est porteur d'une partie du patrimoine gntique du trouble et donc si le risque de donner naissance un enfant affect est lev. Les tests directs ou l'analyse de liaison peuvent tre effectus pour des maladies comme la fibrose kystique, la drpanocytose (prsence dune hmoglobine anormale, et problmes sanguins) b) TEST DIAGNOSTIC Examen du nouveau-n Il est possible de vrifier la prsence de mutations gntiques, l'absence de protines et de produits gniques ou encore la prsence de protines ou de produits gniques anormaux dans le sang prlev de nouveau-ns. Ainsi, on peut effectuer des tests pour dceler la prsence d'un enzyme appel phnylalanine hydroxylase. L'absence de cet enzyme entrane une affection rare mais traitable appel phnylctonurie (trouble de la transformation de la phnylalanine). Le test direct et l'analyse de liaison pour d'autres affections peuvent galement tre effectus, entre autres le test pour le syndrome de Down (plus connu sous le nom de trisomie 21 ou mongolisme), provoqu par la prsence d'un chromosome 21 surnumraire Test prnatal Il est possible d'effectuer des tests directs et des analyses de liaison sur un ftus avant sa naissance afin de prdire et de diagnostiquer des troubles hrditaires. Pour ce faire, on analyse l'ADN tir des cellules ftales comme on isole et analyse l'ADN de cellules humaines adultes. Il est cependant plus difficile de prlever des cellules ftales que des cellules sur un adulte. Dans ce dernier cas, on peut utiliser les globules blancs obtenus d'un prlvement sanguin. Actuellement, on obtient les cellules ftales en procdant une amniocentse ou un prlvement des villosits choriales. Ces deux techniques prvoient l'extraction de

cellules ftales du liquide amniotique ou du placenta l'aide d'une aiguille enfonce dans l'utrus de la mre. Malheureusement, ces deux procdures prsentent un faible risque de fausse couche. C'est pourquoi l'on recherche actuellement des mthodes plus sres. On pourrait par exemple tirer parti du fait que les cellules ftales s'coulent dans le courant sanguin de la mre -- raison d'une cellule sur un million de cellules sanguines de la mre. En novembre 1996, les scientifiques de l'Universit de Californie ont annonc qu'ils avaient russi isoler des globules rouges ftaux immatures du courant sanguin de la mre, qui pourraient servir pour des tests gntiques. II.1.6) Dpistage gntique de maladies
1. Prlvement

de cellules de la personne.

2. Extraction

de l'ADN des cellules.

3. L'ADN est

coup en fragments bicatnaires.

4. lectrophorse en

gel des fragments d'ADN.

5. Les

morceaux d'ADN courts ont parcouru une plus grande distance dans le gel que les fragments longs.

La membrane de nylon est place au-dessus du gel et absorbe l'ADN. Au cours du processus, la double hlice d'ADN se droule en simples brins.
6.

7. Ajout

de sondes d'ADN radioactives.

8. La

pellicule photographique dtecte l'ADN li aux sondes radioactives.

II.2) Les empreintes gntiques

La squence complte d'ADN d'une personne est compose de plus de trois milliards de nuclotides. Bien que la squence soit identique dans une proportion de 99,9 p. 100 celle des autres tres humains, il reste 0,1 p. 100, soit quelque trois millions de nuclotides, qui est propre la personne en question. Par consquent, l'exception des jumeaux monozygotes, dont les squences d'ADN sont pareilles, personne n'a exactement le mme ADN que son voisin. Cette distinction gntique peut s'avrer un puissant outil pour identifier des personnes, au mme titre que les empreintes digitales propres d'une personne. Comme presque toutes les cellules du corps d'une personne contiennent la mme srie complte d'ADN, l'ADN isol de sang sch, de sperme ou mme d'un cheveu retrouv sur les lieux d'un crime peut tre compar l'chantillon d'ADN prlev d'un suspect et permet de prouver si ce dernier tait prsent sur les lieux du crime, de la mme faon que le permettraient les empreintes digitales. Guy Paul Morin, de l'Ontario, au Canada, a t condamn tort pour meurtre, puis disculp grce au test d'ADN plus de 10 ans plus tard.1 l'aide d'une procdure appele amplification en chane par la polymrase (ACP), qui reproduit rapidement l'ADN, on peut analyser l'ADN sur de minuscules quantits de tissus, ce qui rend la tche difficile au criminel qui veut faire disparatre toute preuve des lieux d'un crime. Les empreintes gntiques peuvent galement tre utilises dans les tests de paternit pour identifier les parents biologiques d'un enfant ou la suite d'accidents graves, de catastrophes ou de guerres pour identifier les morts. Cette puissante technologie n'est pas seulement utile pour identifier les humains. Le Service canadien des forts en Colombie-Britannique met actuellement au point des mthodes pour tablir les empreintes gntiques d'arbres prcieux de sorte pouvoir les retracer en cas de vol. II.2.1) Minisatellites En thorie, on peut tablir les empreintes gntiques en squenant des gnomes entiers et en les comparant pour voir s'ils correspondent. Mais il faudrait des annes pour dterminer la squence exacte des trois milliards de nuclotides qui composent l'ADN d'une personne, procdure qui serait par ailleurs extrmement coteuse. Heureusement, la diffrence entre les gens se concentre dans des rgions particulires de leur ADN. Ces rgions, constitues de courts segments de 15 nuclotides hautement rpts, s'appeles minisatellites.

L'emplacement et le nombre de rptitions de tout minisatellite particulier sont fort variables. La probabilit que deux personnes sans liens familiaux aient un minisatellite possdant le mme emplacement et le mme nombre de rptitions est d'environ 1 sur 10 milliards. Lorsque plusieurs minisatellites sont analyss en mme temps, la probabilit diminue encore et est toutes fins pratiques de zro. Il nous suffit donc de localiser certains de ces minisatellites et d'en dterminer la longueur. Celle-ci donne une indication du nombre de rptitions de la squence de 15 nuclotides. La technique employe dans le dpistage gntique de maladies est similaire celle des empreintes gntiques. II.2.2) RFLP Tout d'abord, l'ADN est dcoup l'aide d'enzymes appels endonuclases de restriction, qui coupent l'ADN en des sites distinctifs. Comme l'emplacement de ces sites varie d'une personne l'autre, il en sera de mme pour la longueur des fragments qui en rsultent. Dans l'illustration ci-aprs, l'enzyme utilis, l'Eco R1, reconnat la squence GAATTC (sa squence complmentaire CTTAAG correspond GAATTC l'envers!) et coupe entre le G et le premier A. Les fragments sont ensuite classs selon leur taille, puis incubs avec des sondes d'ADN. Les sondes ont t conues de sorte se lier des minisatellites particuliers. En gnral, on utilise simultanment cinq dix types de sondes qui reconnaissent diffrents minisatellites. Lorsqu'une sonde se lie un fragment d'ADN, elle permet de le dceler.

On compare les fragments dtects des deux chantillons. Si les fragments sont tous de la mme taille, on peut conclure que les deux chantillons proviennent du mme individu. Enfin, on utilise des ordinateurs pour calculer la probabilit que cette correspondance soit le fruit d'une pure concidence. Ce calcul peut tre trs compliqu, puisque la frquence de diffrentes compositions d'ADN de diffrents gnes varie selon la population. En gnral, les probabilits d'une telle concidence sont de 1 sur plusieurs milliards, ce qui fait des empreintes gntiques une mthode d'identification des personnes extrmement fiable.

II.2.3) PUCE dADN : Des diagnostics immdiats La puce mise au point par Affymetrix Santa Clara (Californie), la Genechip ou puce ADN devrait bouleverser les mthodes de travail de tous ceux qui, un titre ou un autre, s'occupent des questions de sant. Aprs-demain, ds demain peut-tre, ce petit bijou pas plus grand qu'une bote d'allumettes qui combine les trouvailles des technologies de l'information et les acquis des sciences de la vie permettra de diagnostiquer en un temps record, de quelques heures quelques minutes, la prdisposition ou le dveloppement de maladies gntiques chez des patients, de reprer l'volution prvisible de leurs fondamentaux hrditaires (tendances l'obsit, calvitie, etc.) mais aussi de dtecter la prsence de virus dans l'eau, dans l'air, dans les aliments, ou bien l'intrusion des fameux organismes gntiquement modifis (OGM) dans les produits issus de l'industrie agroalimentaire. Le matriel de fabrication de cet outil de rve ou de cauchemar ressemble grosso modo celui des classiques semi-conducteurs de l'informatique, mais en lieu et place des circuits, les puces sont graves avec du vivant, des morceaux d'ADN, le support du programme gntique humain.

a) Fonctionnement des biopuces Les plus courantes utilisent les techniques de la photolithographie.
La surface des puces ADN excde rarement quelques millimtres de ct avec un support en verre ou en silicium. On y fixe, par raction chimique, des sondes, c'est--dire de courts brins d'ADN dont on connat la squence (soit l'agencement particulier des quatre bases, A-T, C-G). On peut fixer des sondes synthtises l'avance ou, comme Affymetrix, les synthtiser in situ, directement sur la puce. Il faut alors dposer les couches successives des quatre bases sur les sites correspondant aux squences gntiques souhaites. La technique est celle de la photolithographie: grce un masque on claire la zone activer alors que les autres sont opaques. L'opration est rpte pour chaque base et autant de fois qu'il y a de sondes.

b) Le dveloppement des puces ADN dans l'avenir

L'existence des biopuces renforce le processus d'industrialisation des outils de la biologie. L'avance technologique est telle qu'on pourra bientt mettre le gnome entier d'un mammifre sur une seule puce. Cela rend brutalement caducs les arguments rassurants qui avaient cours dans les dbats biothiques, postulant qu'il tait impossible d'obtenir le profil gntique complet d'un individu et qu'au pire, en cas de ralisation, le cot en serait bien trop lev pour tre gnralis. Une fois de plus, comme pour le clonage, comme pour la procration mdicalement assiste, la technique prend l'thique de court. L'utilisation de ces outils en gntique humaine va amplifier une vision dterministe du tout gntique selon laquelle nos prdispositions aux maladies communes (cancer, diabte, maladies cardio-vasculaires...), notre faon de rpondre diffremment aux mdicaments, nos troubles mtaboliques mais aussi nos comportements (sociaux, culturels, sexuels) ont un fondement gntique. Tout se jouerait sur le 0,1 % de diffrence en squence que deux humains ont entre eux. Les biopuces permettent de dterminer au moins l'essentiel, sinon la totalit, de cette diffrence. La perspective semble exaltante : enfin des diagnostics et des traitements la carte ! Or il n'est pas sr qu'il y ait des gnes majeurs dans ces maladies communes, les gnes de susceptibilit ont un risque relatif trs faible et les mutations ont des variabilits de pntrance. Vu la trs grande variabilit interindividuelle qui rsulte de l'interaction permanente entre les trois domaines le terrain gntique, les facteurs pigntiques et les facteurs dits environnementaux, rien ne dit que les biopuces puissent discerner des catgories

d'individus diffrentes et d'valuer de faon fiable un risque. La physiopathologie et la pratique de la mdecine n'ont pas forcment gagner cette vision de la gntique. La dfinition du profil gntique individuel va gnrer une masse d'informations, et l est bien la question : comme pour les tests gntiques, dont certains sont inutiles et d'autres mal interprts, que fera-t-on de cette information dmultiplie ? Comment va-t-on analyser les rsultats, valuer leur utilit, leur porte ? Quelles seront les consquences de cette nouvelle connaissance et les droits pour la personne et son entourage sur ces informations ? Ne risque t-on pas de dvelopper des pratiques discriminatoires qui seront prsentes comme un lment de mdecine prventive, autrement dit dans l'intrt de la personne ? Ce dveloppement technique explosif ne fait qu'aggraver la question de la confidentialit des donnes gntiques. Sans doute, en France, un cadre juridique existe, qui devrait permettre d'empcher l'usage individuel de l'information gntique et interdire la ralisation de tests prdictifs des fins de discrimination conomique ou sociale. Mais comme le souligne le Conseil d'Etat (1) : Aprs la lutte contre les ingalits sociales, comment prvenir une prise en compte dangereuse des ingalits biologiques ? C'est dans la mise en oeuvre des superbes principes (droit la non-discrimination et la protection de la confidentialit des donnes gntiques) que le bt blesse. Quant au principe de confidentialit des donnes gntiques, il est sans doute reconnu par l'article 7 de la Dclaration universelle sur le gnome humain et les droits de l'homme, mais avec une porte trs relative, puisque l'article 9 prvoit que la loi peut limiter la confidentialit pour des raisons imprieuses. L'Histoire nous l'a appris : les Etats ont une imagination sans bornes pour dcouvrir ces raisons imprieuses.

II.3) Les marqueurs gntiques

Dans ce cours, le terme marqueur sera pris dans le sens de marqueur gntique, c'est--dire qu'il sera toujours synonyme de locus marqueur. Un locus marqueur est un locus polymorphe qui renseigne : - sur le gnotype de l'individu qui le porte ; c'est ce titre que les marqueurs sont utiliss en gntique des populations ; . - sur le gnotype d'un (de) locus voisin(s) ; les applications vont ici du clonage positionnel la slection assiste par marqueurs. Les plus courants de ces marqueurs gntiques sont, selon une terminologie consacre, les marqueurs morphologiques, les marqueurs molculaires (au niveau de l'ADN) et les marqueurs biochimiques (isozymes, protines). Ce dernier terme est malheureusement ambigu, puisqu'il dsigne dans d'autres contextes des molcules dont la prsence indique un stade de diffrenciation ou un tat physiologique. Nous ne l'emploierons ici que dans l'acception gntique. Nous supposerons connus les grands principes de l'analyse des isozymes, et traiterons essentiellement des marqueurs molculaires. Les marqueurs issus de l'lectrophorse bidimensionnelle des protines (EBD) seront toutefois voqus. Qu'est-ce qu'un bon marqueur gntique ? Un marqueur gntique idal est : - polymorphe : la matire premire du gnticien est la variabilit ; - multialllique ; - codominant : l'htrozygote prsente simultanment les caractres des deux parents homozygotes ; il peut donc tre distingu de chacun des homozygotes parentaux ;

- non pistatique : son gnotype peut tre lu partir de son phnotype quel que soit le gnotype aux autres locus. La codominance et la non-pistasie peuvent tre respectivement dfinies comme l'absence d'interactions intra et interlocus ; II.3.1) Les Marqueurs molculaires - neutre : les substitutions allliques au locus marqueur n'ont pas d'autres effets phnotypiques (et donc ventuellement slectifs) que ceux qui permettent de dterminer son gnotype. Dans leur trs grande majorit, les polymorphismes molculaires sont neutres ; - insensible au milieu : le gnotype peut tre infr partir du phnotype quel que soit le milieu. Les marqueurs morphologiques rpondent mal ces critres. Peu polymorphes, en gnral dominants, ils interfrent souvent avec d'autres caractres, et peuvent tre influencs par le milieu. En outre, mme s'ils sont trs nombreux chez certaines espces (plusieurs centaines chez le riz ou le mas), peu d'entre eux peuvent tre conjointement polymorphes dans une descendance donne. En revanche les marqueurs biochimiques ou molculaires ont, pour la plupart, toutes ces qualits. Les limitations majeures des isozymes sont le faible nombre de locus susceptibles d'tre rvls (rarement plus de 30 40 locus chez le riz et le mas, et tous ne sont pas polymorphes dans un fonds gntique donn), et le fait qu'il y ait une certaine spcificit d'organe : tous les enzymes ne sont pas prsents ou actifs dans tous les organes. Les protines polymorphes rvles en EBD peuvent tre plus nombreuses, mais dpendent galement de l'organe considr. Au contraire, les marqueurs au niveau de l'ADN sont en nombre quasiment illimit et sont indpendants du stade ou de l'organe analys, puisque l'ADN est le mme dans tous les tissus. De plus ils ont l'avantage d'tre plus directement utilisables pour les applications ultrieures en biologie molculaire. Caractristiques Selon Bretting et Widrlechner (1995), les conditions idales d'un marqueur gntique sont les suivantes:

tre polymorphe, afin de pouvoir facilement diffrencier les individus ou les lignes ; tre relativement neutre, que ce soit au niveau de la valeur du caractre tudi que de la valeur slective ; tre codominant, afin de pouvoir distinguer les htrozygotes des homozygotes ; tre un caractre mendlien hrdit simple ne pas tre pliotropique ou pistatique tre dispers le long du gnome ne pas tre li un autre marqueur tre stable quel que soit le stade du dveloppement ne pas avoir d'impact sur la croissance ou la reproduction sexue tre facilement observable, sans ambigut possible tre peu coteux

a) Les variations nuclotidiques frquentes Les SNP (single nuclotide polymorphisme). Les SNP sont des mutations faux-sens non ponctuelles retrouvs sur la squence nuclotidique de l'ADN (dans les rgions introniques et exoniques). La diffrence entre les SNP et les mutations faux-sens, rside

dans le fait que la substitution entrane ou non un changement de l'acide amin et que cette variation est trs frquente dans la population. Il est important de retenir que les SNP expriment une variabilit intra-population. - Les squences rptes. Les gnes humains sont noys au milieu d'une masse considrable de squences d'ADN rptes. Une manire de classer les types de squences d'ADN rptes est de considrer b) Les marqueurs de squences d'ADN rptes en tandem Les marqueurs rpts en tandem sont utiliss pour lanalyse de liaison gntique (Schuler et al. 1996, Vance et al. 1998). Les premiers marqueurs utiliss taient reprsents par des polymorphismes de restriction ou RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) (Kan et al. 1978, Botstein et al. 1980). Ils reposent sur le fait que le changement d'une paire de base peut crer ou liminer le site de coupure d'une enzyme de restriction. La digestion par l'enzyme de restriction rvle donc les diffrences existantes entre les individus. Cette mthode, longue et fastidieuse a t utilise avec succs dans la maladie de Huntington (Gusella et al. 1983). Par la suite, l'identification en 1985 des mutations de rptition ou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) a permis de dtecter un pourcentage d'htrozygotie beaucoup plus lev que celui des RFLP (Nakamura et al. 1987). Les VNTR sont dus des diffrences dans le nombre de copies de squences rptes en tandem, dont le motif de base est suprieur 10 nuclotides. Ils se sont rvls trs intressants par leur localisation disperse sur plusieurs chromosomes et par leur haut degr de variation. Ils sont cependant largement supplants prsent par une autre catgorie de mutations de rptition, o le motif de base rpte en tandem est plus court (1 5 nuclotides) : ce sont les microsatellites ou STR (Short Tandem Repeats). Les plus frquents et les plus tudis sont les microsatellites 2 nuclotides (CA)n et (GT)n dont la variation consiste en une srie dallles de taille comprise entre 24 et 80 paires de bases (Weber 1990). Ils sont remarquablement abondants (25 000 130 000 sur lensemble du gnome humain) et uniformment distribus sur les chromosomes, avec un exemplaire tous les 25 100 kb dADN gnomique. La dernire carte tablie par le Gnthon fait tat de 5264 microsatellites de type (CA)n rpertoris et localiss de faon trs prcise sur les chromosomes (Dib et al. 1996). D'autres microsatellites largement utiliss sont constitus de rptitions de motifs de 4 paires de bases le plus souvent de type (GATA) n (Edwards et al. 1991). Ils proviennent pour la majorit du "Cooperative Human Linkage Center" (CHLC). c) Les marqueurs de squences d'ADN rptes disperses Dans un objectif de synthse des connaissances acquises sur ces squences d'ADN rptes disperses, nous ne dcrirons que les deux familles les plus reprsentatives. Le premier type de squence rpte disperse appartient la catgorie des SINEs (Short INterspersed Elements), l'archtype tant constitu par la famille Alu. Cette famille est reprsente par plusieurs centaines de milliers de copies par gnome haplode. Elles sont prsentes dans l'ensemble du gnome, avec en moyenne une copie Alu tous les 5 kpb. Il s'agit de squences rptes courtes (environ 300 pb) ayant probablement pour anctre volutif un petit ARN. Les lments Alu ont une structure dimrique et sont insrs dans le gnome avec duplication du site d'insertion (quelques nuclotides). Ils se terminent par une queue riche en rsidus dsoxy-adnyliques (dA) leur extrmit 3'. Dans 5 10% des cas, ils sont associs des microsatellites (de types di, tri ou ttranuclotides). Il s'agit d'lments rtrotransposables,

ou mobiles, ce qui en fait une source considrable de polymorphisme potentiel pour le gnome humain. Leur frquence et leur caractre rptitif permettent parfois des vnements de recombinaison illgitime intrachromosomique conduisant des dltions, avec ou sans consquence phnotypique. Parfois les lments Alu qui sont prsents dans les introns sont transcrits en mme temps que les exons des gnes o ils rsident. Leur analogie de structure avec les petits ARN explique qu'ils contiennent parfois les lments promoteurs internes, ce qui les rend transcriptibles galement par l'ARN polymrase III. D'o leur tendance se rpandre dans le gnome comme des rtropseudognes par transcription inverse partir d'ARN et insertion de l'ADNc ainsi form. Le second type de squences rptes disperses appartient la catgorie des LINEs (Long INterspersed Elements). Il s'agit de la famille L1Hs (Hs pour homo sapiens). Cette fois-ci, les lments dans leur version la plus longue reprsentent environ 7 kb. Plus de 100 000 copies par gnome humain sont dtectables et apparatraient au cours de la transcription inverse de l'ARN en ADNc. Beaucoup des caractristiques des squences Alu peuvent tre rptes leur propos (queue poly dA, duplication du site d'insertion). Mais la diffrence des lments Alu, ils comportent deux longues phases ouvertes de lecture qui codent apparemment pour des protines assurant la retrotransposition des squences L1. Les squences Alu et L1Hs reprsentent prs de 10% du gnome humain et sont reprsentatives de nombreuses autres familles de rptitions qui ont des frquences de ritration gnralement beaucoup plus faibles, mais qui n'en constituent pas moins une masse considrable de squences d'ADN susceptibles d'engendrer des polymorphismes dans le gnome. On ne citera, que les nombreux rtrognes que l'on trouve un peu partout dans le gnome humain et qui sont le rsultat, comme leur nom l'indique, de la transcription inverse en ADNc d'ARN messagers. Il s'agit gnralement de pseudognes. On peut ajouter la famille THE-1 (Transposons-like Human Element), qui fait partie de la catgorie des LINEs. Ces squences, toutes catgories confondues, se trouvent dans les rgions intergniques et galement dans les introns. La prsence de centaines de familles de squences rptes disperses des centaines de milliers de loci pose videmment, en dehors de leur intrt comme source de mutations, un certain nombre de questions qui n'ont pas encore reu de rponses. La mise en vidence de nouvelles mutations (mutations ponctuelles) ou de mutations connues (SNP ou squences rptes), utilise des mthodes de diagnostic diffrentes. d) Les mthodes de dtection des variations nuclotidiques De nombreuses mthodes ont t mises au point pour la dtection des mutations. Cependant on peut diffrencier deux types de mthode permettant soit la recherche de nouvelles mutations soit le criblage de variations nuclotidiques connues. Dans un soucis de clart nous sparerons ces deux types de mthodes, mais il est important de noter que les mthodes d'identification des nouvelles mutations sont aussi applicables au criblage de mutations connues (l'inverse n'tant pas envisageable). De plus, nous dvelopperons la mthode de dtection des mutations lies aux squences rptes en tandem et plus prcisment les marqueurs microsatellites. Nous ne dvelopperons pas dans ce manuscrit les mthodes permettant l'analyse des RFLP ou des squences rptes disperses.

Mthodes d'identification de nouvelles mutations Les plus courantes consistent rechercher dventuelles mutations sans chercher la localiser prcisment : ce sont les mthodes utilises avant le squenage qui ont lavantage dtre rapide, mais qui ne permettent pas la dtection de 100% des mutations. Ces mthodes et leurs principes gnraux sont : La SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) (Kim et al. 1992). Cette technique consiste analyser deux molcules simple brin produites par la dnaturation de lADN, qui adoptent chacune en se renaturant une structure secondaire (conformation) qui est dpendante de leur squence nuclotidique. Ainsi, entre deux ADN dont les squences ne diffrent que d'une seule paire de base, il peut apparatre des changements de structure secondaire. La SSCP est une mthode dlectrophorse dont le but est de rvler la migration anormale dun ADN mutant. Il est noter que la SSCP devient une mthode efficace lorsque diffrentes tempratures de migration sont testes dans des conditions optimises (Dianzani et al. 1993, Cotton et al. 1997). la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Barbetti et al. 1992). Cette mthode repose sur la mise en vidence dune diffrence de stabilit dun fragment dADN tmoin par rapport un ADN mut. Les deux brins dADN tmoin sont parfaitement complmentaires (homoduplex). Par contre la prsence dune mutation sur un des brins provoque un msappariement dans cette squence dADN (htroduplex). Cet ADN est moins stable que les brins dADN parfaitement complmentaires (sa temprature de fusion est infrieure). LADN normal et lADN mut migrent dans un gel soumis un gradient de concentration en formamide (gel dnaturant). Ensuite, les ADN pourront tre diffrencis par la technique de Southern. LADN normal reste stable et ne se dissocie qu de fortes concentrations de formamide sa dnaturation provoquant larrt de la migration. Par contre, lADN mut est dnatur plus rapidement ralentissant ainsi, sa migration. L'analyse des htroduplex (Kourkine et al. 2002). L'analyse d'htroduplex permet de dtecter la prsence de msappariements dans la molcule hybride dADN (htroduplex) forme partir dun brin normal dun sujet normal et dun autre brin contenant la mutation. La prsence de msappariements est dtecte soit laide de produits chimiques (carbodiimide, ttroxyde dosmium ou hydroxylamine) qui vont couper spcifiquement lhtroduplex au niveau des msappariements partir d'enzyme comme la R Nase. La carbodiimide va ragir avec un G ou T mal appari, lhydroxylamine avec un C, le ttroxyde dosmium avec un C ou un T. Il est donc possible didentifier la prsence dune mutation et mme, dans certains cas, de dterminer la modification nuclotidique de la mutation. Cependant, cette mthode ne semble pas optimale du fait de la faible spcificit de coupure de ces agents. Ces techniques, bien que rapides, ncessitent dans tous les cas une vrification de la prsence de la mutation par squenage. Pour cette raison et depuis lapparition des squenceurs automatiques, de nombreuses quipes prfrent utiliser cette technique de dtection des mutations sans passer par la premire tape de criblage des gnes. Le squenage reprsente en effet un moyen trs efficace de dtection des mutations et est devenu aussi rapide que les prcdentes. Le seul dsavantage du squenage automatique reste son cot relativement lev.

La DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) est un nouvel outil de dtection de mutations inconnues (Kuklin et al. 1997/98, Wagner et al. 1998, Yokomizo et al. 1998, Hecker et al. 1999). La dtection des SNP par DHPLC est ralise par la discrimination des htro et homoduplexes prsents dans lchantillon PCR tester. Le principe de la mthode repose sur une chromatographie ionique en phase reverse par appariement d'ion. Les ions phosphates des molcules d'ADN sont chargs ngativement. La phase stationnaire de la colonne de la DHPLC est lectriquement neutre et hydrophobe. Afin d'aider l'absorption des fragments d'ADN la phase stationnaire, une molcule jouant le rle d'agent d'appariement, le triethylammonium actate (TEAA), est utilis. Ainsi la matrice hydrophobe est convertie en une matrice changeuse d'ions, le TEAA faisant un pont avec l'analyte. Les ions positifs du TEAA interagissent avec les charges ngatives des ions phosphates de l'ADN, tandis que la chane alkyl de la molcule de TEAA interagit avec la surface hydrophobe de la colonne (Billes hydrophobes). Plus le fragment d'ADN est grand, plus il est riche en charges ngatives, en consquence les grands fragments d'ADN vont interagir avec un plus grand nombre de molcule de TEAA, et seront plus fortement absorbs la phase stationnaire. Dans un mme temps, des conditions dnaturantes en temprature sont installes. Les fragments d'ADN portant un ou plusieurs SNP sont plus instables vis--vis de la fixation la phase stationnaire que ceux qui n'en ont pas. Leur dtection par les UV ou par fluorescence ncessite leur dcrochage de la phase stationnaire. Pour favoriser cela un autre ractif charg ngativement l'actonitrile (ACN) est ajout afin d'entrer en comptition avec l'ADN fix. De ce fait, l'interaction hydrophobe entre la phase stationnaire et l'ADN est rduite avec l'augmentation du pourcentage d'actonitrile. Les fragments htrozygotes rendus instables par les conditions dnaturantes sont relargus plus tt que les fragments homozygotes plus stables dans leurs interactions avec la molcule de TEAA. L'analyse par DHPLC ncessite l'tablissement d'un gradient grant le pourcentage des deux tampons (le TEAA, et l'ACN), et la dtermination fine du Tm des fragments tudis. Le squenage automatique d'ADN. Les mthodes actuelles de dtermination de la squence d'une molcule d'ADN reposent sur la production d'un ensemble de fragments aussi complets que possible, possdant une extrmit en commun et dont l'autre extrmit correspond un nuclotide dfini (A, C, G ou T) marqu par un fluorochrome spcifique de chacun des nuclotides (ds l'incorporation du fluorochrome l'extension est arrte). Ces fragments sont ensuite spars selon leur taille (par lectrophorse) et la squence est ensuite dduite en fonction de leur ordre de dtection. La dtection des fragments par squenage automatique est base sur l'analyse des fragments marqus par des molcules fluorescentes (fluorescine, NBD (4-chloro-7-nitrobenzo-2oxa-1-diazole), rouge Texas et ttramthylrhodamine). Les squenceurs automatiques possdent un laser et un systme de filtres tournants permettant la fois lexcitation et lmission des longueurs d'ondes des fluorochromes. Cette rotation des filtres est organise de telle sorte quun fluorochrome particulier est dtect spcifiquement lors de chaque balayage par le laser du gel. Au bout de quatre balayages successifs, un ensemble de donnes dcrivant le contenu de chacune des pistes dlectrophorse est ainsi obtenu. La frquence de balayage est telle quen moyenne une trentaine de points par fragment est obtenue. Dans la stratgie de notre laboratoire, le squenage automatique sest avr le moyen le plus prcis et rapide pour la recherche de nouvelle mutation mais aussi pour le criblage de certaines mutations connues (ou variations nuclotidiques frquentes).

e) Mthodes de criblage des variations nuclotidiques frquentes Comme nous l'avons expliqu auparavant la dtection des variations nuclotidiques frquentes peut tre ralise en utilisant les mmes techniques que celles utilises pour la recherche de nouvelles mutations. Cependant, trois autres techniques spcifiques l'identification de ces variations dj identifies sont couramment utilises. La digestion enzymatique. Les enzymes de restriction sont des endonuclases coupant de manire reproductible lADN double brin, quel que soit son origine. La proprit qui les caractrise est de reconnatre une squence spcifique dADN. Laction de lenzyme dpend de son type. Il existe trois types denzymes diffrents : 1) les enzymes qui reconnaissent une squence et qui sarrtent de manire alatoire 1000 -5000 pb en aval en librant quelques dizaines de nuclotides (enzymes de Type I). 2) les enzymes qui coupent lADN au niveau de la squence reconnue (enzymes de Type II). 3) les enzymes qui coupent lADN une vingtaine de paires de bases en aval aprs avoir reconnu la squence (enzymes de type III). Tous les SNP ne sont pas localiss un site de restriction d'une enzyme de type II, donc cette technique reste complmentaire au squenage automatique. Les ASO (oligonuclotidiques allles-spcifiques). Cette technique fait appel lhybridation classique de Southern avec comme sonde des oligonuclotides (polynuclotides simple brin synthtiques). Elle est utilise pour analyser rapidement un grand nombre dindividus pour une mutation bien prcise. Quand la squence nuclotidique dun locus polymorphe a t dtermine, des oligonuclotides homologues chacun des allles sont synthtiss, do le nom doligonuclotides allles-spcifiques ou ASO. Le SNaPshot. Cette nouvelle technique a t mise au point pour identifier spcifiquement les mutations faux-sens et les SNP dont la localisation est connue. Cette technique est base sur l'extension d'un oligonuclotide choisit un nuclotide en amont du site mut et consiste l'incorporation du ddNTP correspondant la base considre comme site variable (ds l'incorporation du ddNTP l'extension est arrte). f) Dtection des squences rptes en tandem (microsatellites) Les marqueurs microsatellites permettent d'impliquer un gne dans une maladie par la recherche d'une association alllique significative entre un marqueur polymorphe situ prs du gne candidat et le trait morbide (Haines 1998). Ceci repose sur le postulat que les dsquilibres de liaison (c'est--dire une association plus frquente que ne le voudrait le hasard) ne sobservent que dans des limites de proximit troite (0,1 cM). Par consquent il est ncessaire de connatre la localisation chromosomique du gne suspect et de trouver un marqueur trs proche du gne en question (Thompson et al. 1991, Sten-Linder et al. 1991). La dtection des allles pour chaque individu un marqueur est base sur la variation de taille du marqueur microsatellite (le nombre de rptition augmente ou diminue selon les individus). D'un point de vue technique, ces polymorphismes sont tudis par la technique damplification par des squences rptes en utilisant des amorces marques situes dans les rgions flanquantes les rptitions. Les chantillons amplifis par PCR sont analyss par un squenceur automatique (lectrophorse en gel de polyacrylamide), le seul capable de distinguer des variations de 2 paires de bases. L'utilisation des microsatellites (GATA) n est peut-tre plus facile que celle des polymorphismes (CA)n car une diffrence de 4 paires de

bases est plus facile lire qu'une diffrence de 2 paires de bases (Vance et Ben Othmane 1998). Ces diffrentes mthodes d'identifications des variations nuclotidiques du gnome font appels diffrentes stratgies ou hypothses d'investigation, que nous allons prsenter dans le prochain chapitre.

II.4) Diagnostic Prnatal

Le diagnostic prnatal rpond un besoin d'identifier tt durant la grossesse un certain nombre d'anomalies foetales ou maladies gntiques. Ralisable depuis les annes soixante, le diagnostic prnatal des maladies gntiques n'est devenu pratique courante de l'valuation des grossesses risque qu'au cours des trois dernires dcennies. Ds 1976 trois tudes multisites, ralises en Amrique et en Europe, ont confirm que le prlvement de liquide amniotique au second trimestre de la grossesse, en vue d'une tude des cellules ftales (amniocytes), tait une technique fiable et peu risque pour la mre et le ftus. On value environ 3% le nombre de ftus viables qui prsenteraient une anomalie svre la naissance. L'impact du diagnostic prnatal commence tre peru sur la frquence des anomalies congnitales graves puisque plusieurs d'entre elles sont dpistes ds la fin du premier trimestre. Si, de par l'anamnse familiale ou l'histoire obsttricale, la femme est reconnue comme tant risque de concevoir un enfant atteint d'une anomalie gntique, un diagnostic prnatal peut alors tre envisag. Ce diagnostic peut tre ralis en imagerie mdicale avec ou sans prlvement de liquide amniotique ou autre tissu d'origine ftale selon la nature de l'anomalie recherche. Avant de procder toute intervention, ou technique invasive, le sine qua non est de s'assurer qu'il y a possibilit de dpister ou d'exclure le dfaut gntique qui toucherait le sujet atteint. Le diagnostic prnatal permet aux couples risque d'envisager une grossesse puisqu'une alternative leur est maintenant offerte. II.4.1) Familles risque a) Age maternel avanc Les femmes ges de 35 ans et plus l'accouchement ont un risque plus lev de donner naissance un enfant porteur d'une anomalie chromosomique par non disjonction. Ce risque accru serait d en partie au vieillissement ovulaire. Le risque augmente avec l'ge (fig 1) et touche particulirement la trisomie 21 (syndrome de Down) qui est la plus frquente des anomalies autosomiques observes. Plusieurs autres, dont les trisomies 13 et 18, et les anomalies des chromosomes sexuels XXY et XXX sont galement diagnostiques plus frquemment dans ce groupe d'ge maternel. D'un pays l'autre les critres de slection pour une valuation antnatale est variable et l'amniocentse est gnralement suggre aux femmes enceintes qui auront 35 ans ou plus l'accouchement. Selon les disponibilits en matire de mdecine prventive l'examen antnatal peut tre prcd d'un test de dpistage en particulier pour la trisomie 21 l'aide de marqueurs sriques maternels (voir marqueurs sriques). Ce test de dpistage peut permettre d'identifier dans une certaine mesure les personnes qui sont plus risque de porter un enfant trisomique et rassurer celles qui prfreraient ne pas subir d'amniocentse si ce test de dpistage s'avrait ngatif.

Figure 1 - Incidence de la trisomie 21 la naissance selon l'ge maternel b) Rcidive des anomalies chromosomiques de nombre et de structure Tout accident chromosomique rsultant d'une erreur de division cellulaire, ou non disjonction, entrane un risque de rcidive de plus de 1% lors d'une grossesse subsquente et ce risque peut tre beaucoup plus lev qu'attendu chez une femme ge de 30 ans ou moins. vingt ans le risque de trisomie 21 est d'environ 1/2000, de 1/1200 25 ans, 1/ 900 30 ans, 1/300 35 ans, 1/100 40 ans et 1/40 45 ans. Ce risque signifie galement que l'aneuplodie peut toucher d'autres chromosomes que le chromosome surnumraire. Par exemple une femme qui aurait conu un ftus prsentant une trisomie 21 pourrait, lors d'une grossesse subsquente, concevoir un enfant qui aurait une trisomie 13 ou 18, ou encore une aneuplodie impliquant un chromosome X soit un syndrome XXX ou XXY. Il est galement possible qu'une trisomie impliquant un autre autosome soit non viable et se termine en fausse couche au tout dbut de la grossesse. Translocation chromosomique familiale : un des parents est porteur d'une translocation chromosomique quilibre et il y a risque, des pourcentages variables, selon 1-le type de translocation, 2- l'importance des segments impliqus et 3- la sgrgation des chromosomes lors de la miose, -de fausse couche spontane, par dsquilibre majeur du complment chromosomique de donner naissance un enfant malform ayant un complment chromosomique non quilibr -que le ftus ait un complment chromosomique quilibr, mais tout en tant porteur sain comme un des parents -que le ftus ait un caryotype tout fait normal.

Ds qu'on identifie un remaniement chromosomique chez un individu la rgle, dans la mesure du possible, est d'analyser le caryotype des parents et si indiqu de la fratrie, d'abord pour prciser la nature et l'origine du remaniement et par la suite prvenir les individus porteurs, mais sains, du risque de reproduction On conseille aussi aux couples une analyse de leur caryotype si ils ont une histoire personnelle ou familiale de pertes ftales rptition ou de naissance d'enfants avec retard mental avec ou sans dysmorphie. c) Syndrome du chromosome X fragile et retard mental -Ce syndrome se caractrise chez l'enfant atteint par un facis particulier et un retard mental de svrit variable. Sur le plan chromosomique le signe caractristique est une hypodensit de la chromatine dans la rgion Xq28 identifiable en microscopie optique : on parle alors de fragilit du chromosome X Le dfaut gntique a t identifi comme tant une amplification anormale (> 60 fois) du triplet CGG au locus Xq27.3. Si l'enfant est atteint, la mre peut tre porteuse (on parle alors de pr-mutation) du syndrome elle mme ayant une amplification anormale du triplet CGG (60-200). L'amplification inhibe l'expression du gne FMR-1. Les individus des deux sexes peuvent tre atteints mais les mles le sont gnralement de faon plus svre. Le syndrome du X fragile est une des causes de retard mental la plus frquente aprs le syndrome de Down. -Dans une histoire familiale de retard mental li au X, on procdera une tude molculaire qui permettra d'identifier les individus atteints du syndrome X fragile et, si indiqu, un diagnostic prnatal pourra tre envisag. d) Instabilit chromosomique Certains syndromes, appels syndromes dinstabilit chromosomique se manifestent par une instabilit de la structure des chromosomes. On parle ici, titre d'exemple, de maladie de Fanconi caractrise par une anmie, un retard staturo pondral, des anomalies squelettiques et du syndrome de Bloom caractris par une anmie, un nanisme, une hypersensibilit la lumire. En effet il s'agit de maladies autosomiques rcessives et le risque de rcidive est de 25 % aprs la naissance d'un enfant atteint. Tous deux ont un taux lev de cassures chromosomiques et une prdisposition au cancer. Les changes chromosomiques sont frquents dans la maladie de Fanconi alors que les changes entre chromatides soeurs sont plus frquents dans le syndrome de Bloom. En appliquant les techniques appropries de mise en culture des cellules ftales et de coloration des chromosomes, ces syndromes peuvent parfois se prter un diagnostic prnatal dans les familles risque o les parents ont t identifis comme tant htrozygotes ou porteurs sains. Toutefois la dmonstration de mutations spcifiques dans ces maladies rares n'est pas toujours ralisable. Si un diagnostic prnatal est envisag on ne peut compter sur l'tude molculaire des cellules ftales que si des mutations parentales ont t mises en vidence au pralable. e) Maladies mtaboliques hrditaires -Maladie mtabolique diagnostique chez un enfant et mise en vidence d'un dficit enzymatique ou d'une mutation qui serait dcelable par l'tude des cellules ftales lors d'une grossesse subsquente. -Maladie mtabolique familiale connue: le dpistage chez le couple dmontre que les deux parents sont porteurs (htrozygotes) et ont un risque de 25 % de concevoir un enfant atteint comme dans la mucoviscidose. L'incidence leve de cette maladie est l'origine de programmes de dpistage d'individus porteurs d'une mutation, surtout dans les populations risque.

f) Anomalies du tube neural : Les anomalies du tube neural sont d'origine multifactorielle et leur incidence est trs variable. Elles taient plus frquentes dans les les Britanniques, au Canada, en Chine et d'autres pays comme la Hongrie et atteignaient un taux de 5 pour 1000 naissances avec un risque de rcidive de 5%. Aux tats Unis et en France cette frquence tait plutt de 1 pour 1000 naissances avec un faible risque de rcidive. Il a t dmontr, d'abord en Grande Bretagne, que l'acide folique favorise la fermeture du tube neural et rduit le taux de rcidive dans les grossesses risque. La prise d'acide folique ds la planification d'une conception et durant les deux premiers mois pour toute grossesse, et en particulier dans les grossesses risque, a rduit considrablement l'incidence et le risque de rcidive des anomalies du tube neural dont la fermeture se complte dans les 4 premires semaines de l'embryogense. Il est donc fortement recommand, lorsqu'il y a une histoire familiale d'anomalie du tube neural, de procder une chographie pour s'assurer de l'intgrit du dveloppement de la vote crnienne et du rachis. Dans les populations risque il est trs important d'encourager la prise d'acide folique ds que la personne envisage une grossesse ou abandonne tout moyen de contraception.

II.5) chographie ftale

L'chographie est une technique qui fait appel aux ultrasons pour examiner les tissus et les organes. L'examen se ralise ds le premier trimestre mais ce n'est qu'au second trimestre que l'on peut valuer la morphologie ftale de faon optimale et de prfrence vers la 18me semaine de gestation. L'chocardiographie ftale, permettant la visualisation des gros vaisseaux et des chambres cardiaques, est pratique de faon optimale vers la 20me semaine. Signes d'appel en chographie Les signes d'appel en chographie sont des variations, notes au cours de l'examen, qui alertent l'examinateur la possibilit d'un dveloppement ftal anormal ou d'une maladie gntique. Ces signes d'appel peuvent suggrer une anomalie chromosomique telle une trisomie 21, une trisomie 13, une trisomie 18 ou encore une chondrodysplasie. Malformations ftales dpistables par chographie au second trimestre de la grossesse -Malformations du Systme nerveux -Malformations cardiaques -Malformations thoraciques -Malformations gastro-intestinales -Malformations urognitales -Malformations musculo-squelettiques Autres malformations

II.6 Techniques de prlvement de tissus ftaux

II.6.1) L'amniocentse L'amniocentse ou ponction de liquide amniotique est dite prcoce si elle est ralise vers la 12me semaine de gestation. Bon nombre de cliniques favorisent l'amniocentse entre la 14me et 16me semaine. Des tudes randomises ont dmontr une incidence leve de perte de liquide amniotique si le prlvement est ralis avant la 12me semaine et un risque accru de malformations squelettiques en particulier de pieds bots secondaires l'oligoamnios. On prlve de faon strile de 10 30 ml de liquide selon l'ge de la grossesse. Des cellules ftales d'origine de la voie digestive haute et du systme urinaire, de la peau et des membranes baignent dans ce liquide et sont rcupres par centrifugation du spcimen. Elles sont mises en culture pour une priode de 5 10 jours en prsence de srum ftal et d'un milieu nutritif favorisant la croissance cellulaire. La multiplication cellulaire est alors suffisante pour permettre la prparation des lames sur lesquelles on retrouve des cellules au stade de mtaphase. La numration des chromosomes au microscope et l'tude de leur structure est alors complte. Un traitement du matriel cellulaire, lors de la prparation des lames, met en vidence des zones plus ou moins claires correspondant au marquage chromosomique. Ces zones sont le reflet du ratio variable de nuclotides A-T ;G-C sur les chromatides. Au besoin des analyses enzymatiques ou molculaires peuvent tre prescrites sur ces chantillons cellulaires.

Schma illustrant la procdure d'amniocentse II.6.2) Biopsie choriale ou choriocentse Le prlvement de villosits choriales par voie vaginale donne accs des cellules ftales dont plusieurs sont en voie de division et peuvent tre analyses dans les heures qui suivent le prlvement. Un risque plus lev de pertes ftales et de contamination du spcimen par des cellules maternelles a convaincu plusieurs cliniciens d'abandonner ce type de prlvement ralis avant la 12me semaine. Quelques rapports ont fait tat du risque d'anomalie de rduction des membres si la biopsie est faite vers la fin du premier trimestre. Dans certaines circonstances, pour lesquelles le risque de rcidive est lev comme par exemple dans les maladies mtaboliques hrditaires ou encore si un des parents est porteur d'une translocation chromosomique quilibre, cette approche permet alors l'obtention d'un rsultat en quelques jours vers la 11me ou 12 me semaine de grossesse.

Schma illustrant la procdure de biopsie choriale II.6.3) Cordocentse On peut prlever du sang du cordon sous guidage chographique. Cette voie d'accs permet une analyse court terme du complment chromosomique ou mtabolique vers la fin du second trimestre lorsqu'il y a urgence de prciser un diagnostic : rsultats non concluants des premires analyses, menace d'accouchement L'analyse cytogntique rapide, partir des lymphocytes, permet la confirmation ou l'exclusion d'une anomalie chromosomique suspecte l'tude des amniocytes. Cette approche peut galement tre utile pour prciser une mosaque comme par exemple la trisomie 20 en mosaque dont le pronostic est gnralement favorable ou identifier un marqueur chromosomique qui serait confin aux annexes. Cette voie a t favorise pour l'tude de dficits immunitaires svres entre autres pour la mesure de l'adnosine daminase et l'examen des cellules T.

II.6.4) Ftoscopie La foetoscopie consiste visualiser le ftus, de prfrence vers la fin du second trimestre, en introduisant dans l'utrus, par voie transabdominale et sous guidage chographique, un tube muni de fibres optiques permettant de pratiquer une biopsie ou d'autres manipulations chirurgicales. Pour des raisons videntes de scurit cette technique invasive n'est que rarement utilise en clinique. II.6.5) Cellules ftales en circulation La prsence de cellules ftales en circulation dans le sang maternel pourrait nous renseigner sur le complment chromosomique ou le gnotype du ftus. Des recherches en ce sens sont en cours depuis plusieurs annes et n'ont date donn que peu de rsultats sur l'efficacit de cette technique non invasive de diagnostic prnatal. Les embches sont multiples soit la raret des cellules nucles, leur isolation, leur identification et l'analyse gntique. L'apport du FISH et autres techniques d'identification chromosomique et le PCR pour l'analyse molculaire ont rcemment encourag les chercheurs ne pas abandonner cette voie qui pourrait rvolutionner l'approche du diagnostic prnatal des maladies gntiques. II.6.6) Marqueurs sriques maternels Les marqueurs sriques sont des protines normales en circulation chez la mre et dont la mesure permet de dpister un certain nombre de pathologies ftales au dbut de la grossesse. Ainsi l'efficacit du dpistage est augmente si les deux approches, chographie ftale et marqueurs sriques, sont compltes simultanment.

Figure 6 - Valeurs d'AFP dans le liquide amniotique au second trimestre

II.6.7) Hybridation in situ en fluorescence ( FISH) L'hybridation in situ en fluorescence consiste en l'utilisation de sondes molculaires marques en fluorescence et correspondant un gne ou une squence d'ADN donnant un signal visible au microscope la lampe UV un endroit prcis d'un chromosome. Le FISH peut s'appliquer dans un premier temps aux cellules ftales au stade d'interphase ds le prlvement du liquide amniotique et confirmer la prsence d'un complment euplode ou aneuplode entre autres pour les chromosomes X,Y, 13,15,18, 21.Cette technique s'applique l'tude de marqueurs chromosomiques qui, si marqus, peuvent tre dcels dans les amniocytes. En d'autres circonstances le FISH peut tre utilis pour identifier l'origine de segments supplmentaires ou confirmer la perte de squences prcises ou dltion sur un chromosome donn. II.6.8) Perspectives d'avenir a) Diagnostic pr-implantatoire (DPI) Le diagnostic pr-implantatoire consiste en l'analyse d'une cellule prleve d'un uf fcond qui se trouve para exemple au stade de 8 cellules. Le diagnostic pr-implantatoire a t introduit dans les techniques de procration assiste en 1989 mais on considre qu'il s'agit d'une manuvre qui est toujours au stade de recherche et dveloppement et dont on ne connat pas encore la fiabilit et la scurit bien qu' date les quelques douzaines de nouveauns, issus de cette pratique, semblent avoir un dveloppement normal. Seulement quelques laboratoires en Europe et en Amrique ont les facilits et le savoir faire pour dvelopper cette technique et l'offrir comme moyen de diagnostic. b) Le dpistage pr-conceptionnel (DPC) Le dpistage pr-conceptionnel est une avenue nouvelle dans le domaine de la prvention. Il implique la recherche d'anomalies au niveau des gamtes et de faon plus spcifique au niveau de l'ovule. Des publications rcentes font tat de diagnostic pr-conceptionnel en utilisant le premier corps polaire d'ovules en voie de maturation : les corps polaires tant l'image du complment chromosomique et du gnotype de l'ovule qui pourrait tre utilis pour une fcondation in vitro. Dans un exemple cit dans la littrature une mre tant porteuse d'un gne dominant pour une forme svre de maladie d'Alzheimer on slectionna chez elle un ovule normal et indemne de mutation ce qui lui aurait permis de rendre terme un enfant normal. La voie est donc ouverte aux interventions diagnostiques, qui font appel l'tude des gamtes, mais des dilemmes thiques dcouleront de toute tentative de manipulation des cellules germinales.

III) CONSEIL GENETIQUE

Plus de 6000 maladies hrditaires (gniques) sont connues et 0,7 % des naissances comportent une anomalie chromosomique dsquilibre. Les fausses couches rptition ou la strilit d'un couple peuvent galement tre dues une cause gntique. Au total, environ 4 % des sujets ns vivants prsentent une anomalie qui relve peu ou prou de la gntique.

III.1) Motifs de demande de conseil gntique

III.1.1) Couple avant procration vec notion de maladie hrditaire chez l'un ou chez les deux partenaires, ou dans leur famille. ouple consanguin. xposition un possible mutagne physique ou chimique, toxique ou mdicamenteux. III.1.2) Couple constitu ilan d'une strilit (recherche d'une anomalie chromosomique). ausses couches spontanes rptition: 15 % des grossesses aboutissent une fausse couche; mais le caryotype du couple est indiqu en prsence de deux (ou plus) fausses couches. xposition un agent tratogne (rubole, toxoplasmose...) au cours d'une grossesse. otion d'un enfant atteint dans la fratrie (mort n, dcd aprs la naissance, vivant malform, ou chez lequel sont apparues aprs la naissance des manifestations d'une gnopathie). ge maternel avanc. vlation plus ou moins tardive d'une affection dgnrative dans le couple.

III.2) Consultation de conseil gntique

III.2.1) Climat d'anxit. limat d'anxit. entiment d'engager l'avenir. nterrogatoire dlicat sur les "tares familiales" avec parfois accusations de la belle-famille. ecrets (adultres, incestes) conduisant parfois des renseignements errons. La consultation devra tablir une tude minutieuse de l'arbre gnalogique et un diagnostic prcis de l'affection afin d'en dterminer le mode de transmission et les retentissements. III.2.2) Arbre gnalogique L'arbre gnalogique: doit tre complet, inclure les sujets dcds et les grossesses interrompues, les causes de dcs. III.2.3) Diagnostic de l'affection es sujets atteints doivent tre examins soigneusement, les examens biologiques ncessaires pratiqus.

sujets htrozygotes sains doivent tre dpists si cela est possible, les htrozygotes obligatoires nots. n foetus ou un nouveau-n dcd doit tre soigneusement examin: compte-rendu morphologique et photographies, radiographies du squelette, prlvements biologiques avec, entre autres, caryotype sur sang intracardiaque ou fibroblastes, autopsie minutieuse avec l'accord des parents. --> Un diagnostic prcis de l'affection doit tre obtenu car des maladies cliniquement trs proches peuvent avoir des modes de transmission diffrents. III.2.4) Le conseil Il se fera en fonction: u risque encouru (mode de transmission, pntrance et expressivit, coefficient de parent, frquence du gne dans la population). e la gravit de l'affection et de l'existence ou non d'un traitement. n tenant compte de la composition de la famille (sujets dj atteints, nombre d'enfants normaux). our une affection grave, risque de rcurrence lev, sans traitement efficace et sans diagnostic prnatal (ou devant le refus des parents de le pratiquer), il sera conseill aux parents de ne plus avoir d'enfants [mais les progrs rcents sont tels dans le domaine de la gntique, que le couple doit rester en contact avec le gnticien]. Le conseil gntique emande du temps et de la disponibilit (voir ventuellement les partenaires sparment si l'on suspecte des renseignements errons, des secrets cachs). eaucoup de psychologie ne bonne connaissance des maladies gntiques. III.2.5) Evaluation du risque -Caractre autosomique dominant -Caractre autosomique rcessif -Caractre rcessif li l'X -Caractre multifactoriel -Anomalies chromosomiques -Consanguinit Elle augmente la probabilit d'affection autosomique rcessive ou multi-factorielle. Calculer le coefficient de parent. Risque important en cas de maladie familiale connue.

-Exposition aux agents mutagnes isque faible mais un diagnostic prnatal doit tre propos souvent pour rassurer les parents si l'un ou l'autre a subi un traitement anticancreux dans les mois qui ont prcd la fcondation. Un diagnostic prnatal doit tre propos, lorsqu'en existe la possibilit, pour des naissances ultrieures, dans chacun des cas de figure exposs. III.2.6) Rle des units de gntique Le rle des units de gntique l'gard des cliniques spcialises est d'assurer la coordination de l'enseignement et la prise en charge des malades et des familles. L'unit de gntique est souvent responsable des analyses diagnostiques dans le cadre de ces investigations et doit s'assurer que l'information pertinente est transmise tous les individus concerns. III.2.7) Corollaires au conseil gntique a) Traitement Le conseil gntique doit galement offrir aux individus et familles des informations et avis sur le traitement des maladies gntiques soit en leur offrant une prise en charge ou encore en les orientant vers d'autres cliniques spcialises telles la dittique, l'orthophonie, la physiothrapie et autres qui sont aptes recevoir ces patients. b) Suivi des patients Le conseil gntique ne se limite pas une session d'information et on doit souvent prvoir un contact ou une rencontre ultrieure pour vrifier la comprhension des informations transmises, la mise jour du dossier et trs souvent informer les individus concerns de la mise au point de nouveaux examens de laboratoire ou d'ajouts aux protocoles de traitement c) Suivi des familles Le diagnostic et le conseil doivent tre complments par le suivi des familles. Il est frquent pour les cliniques de gntique d'assurer le suivi de plusieurs membres d'une famille particulirement dans les translocations chromosomiques familiales, les maladies monogniques autosomiques dominantes ou lies au chromosome X comme l'hmophilie. d) Dossiers et fichier des patients La confidentialit des informations nominatives doit videmment tre respecte selon les normes tablies. Des formulaires de consentement adapts aux situations cliniques sont consigns aux dossiers. On recommande aux patients d'aviser la clinique de gntique d'une nouvelle adresse postale surtout si un contact ultrieur est souhaitable. e) Divulgation des rsultats Il est frquent dans le cadre des investigations familiales qu'un ou des individus acceptent de subir l'examen mais refusent d'tre informs des rsultats : une situation des plus frquentes dans les preuves de susceptibilit ou encore dans le dpistage de maladies dgnratives pour lesquelles il n'existe aucun traitement. Toute information concernant le risque de reproduction doit videmment tre donne aux personnes concernes.

f) Programmes de dpistage -Nouveau-n Toute forme de dpistage de maladies gntiques soit pour identifier les malades ou les porteurs sains doit s'accompagner la fois d'un consentement clair et d'un conseil gntique applicable aux circonstances. Ainsi un dpistage systmatique de maladie mtabolique chez le nouveau-n aura un suivi si le test de dpistage est anormal ou demande un contrle. -Enfant ou adulte Tout dpistage ralis dans le cadre de l'valuation d'une population risque doit se munir d'un plan de conseil gntique qui doit prvoir une information de base pour l'ensemble de la population vise et d'une approche individuelle et confidentielle dans l'ventualit de rsultats positifs. Le dpistage des hmoglobinopathies dans les pays mditerranens ou de la maladie de Tay Sachs chez les juifs Ashknases sont des exemples de populations qui se prtent un dpistage systmatique de par l'incidence leve de certaines maladies hrditaires.