LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI

ANALISIS AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DALAM SEDIAAN SUNSCREEN

Disusun Oleh : Afina Laras Smaranesha 09/280627/FA/08278

Golongan / Kelompok Kelas Tanggal Praktikum Asisten jaga Dosen pengampu

:I/2 : FSI 2009 : 14 Mei 2012 : Akbar, Lia : Dr.Rr.Endang Lukitaningsih, Apt.

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2012

ANALISIS AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SEDIAAN SUNSCREEN

I.

TUJUAN Menganalisis aktivitas antioksidan yang ada dalam sediaan lotion

II.

DASAR TEORI Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber pasangan elektron yang baik.Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit lainnya.Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas.Antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibedakan menjadi dua, yaitu

antioksidan alami dan sintetik. Antioksidan alami biasanya lebih diminati karena tingkat keamanan yang lebih baik dan manfaatnya yang lebih luas dibidang makanan, kosmetik dan kesehatan. Antioksidan alami dapat ditemukan dalam sayuran, buahbuahan dan tumbuhan berkayu. Misalnya saja metabolit sekunder dari golongan alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, tannin, dan steroid tripenoid pada daun Peumus boldus dapat berperan sebagai antioksidan. Dan juga tanin pada the dipercaya memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi.

Sedangkan berdasarka mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dibagi menjadi : 1. Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang berperan untuk mencegah pembentukan radikal bebas dengan memutus reaksi berantai dan

mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Contohnya adalah enzim superoksida dimustase (SOD), katalase dan glutation dimustase 2. Antioksidan sekunder, yaitu antioksidan yang berfungsi menangkap senyawa radikal serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contohnya adalah vitamin E, vitamin C, dan beta karoten. 3. Antioksidan tersier, yaitu antioksidan yang berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas. Contohnya adalah enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel yaitu metionin sulfoksida reduktase. Ada dua macam uji aktivitas antioksidan yang sering dilakukan, yakni dengan menggunakan metode CR dan menggunakan DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl). DPPH merupakan salah satu radikal nitrogen organic yang stabil dan berwarna ungu. Radikal ini tersedia dalam perdagangan dan tidak harus dihasilkan terlebih dahulu sebagaimana menggunakan radikal ABTS. Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode ini berdasarkan pada kemampuan suatu senyawa antioksidan untuk menurunkan intensitas warna radikal DPPH. Keuntungan penggunaan DPPH antara lain : Mudah digunakan Mempunyai tingkat sensitifitas yang tinggi Dapat menganalisis sejumlah besar sampel dalam waktu yang singkat

Parameter yang digunakan untuk aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah IC50 yaitu konsentrasi senyawa uji yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50%. Nilai ini diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi versus %penagkapan radikal. Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin poten senyawa tersebut sebagai antioksidan.

Vitamin C atau asam askorbat mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 100,5% C6H8O6. Berbentuk hablur atau serbuk putih atau agak kuning. Oleh pengaruh cahaya lambat launmenjadi berwarna gelap. Dalam keadaan kering stabil diudara, dalam keadaan larutan cepat teroksidasi. Mudah larut dalam air, agak

sukar larut dalam etanol ; tidak larut dalam kloroform, dalam eter dan dalam benzene. Struktur vitamin C :

Arbutin (quinon B-D-glucopyranoside) yang lebih kenal sebagai ekstrak Uva Ursi dan bearberry, mulberry mampu mengatasi pigmentasi kulit dengan cara

menghambat kerja enzim tyrosinare yang berperan dalam pembentukan melanin kulit serta memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Struktur arbutin :

III.

ALAT DAN BAHAN Alat : Labu takar Beker glass Neraca analitik Botol timbang Spektrofotometer UV-VIS Pro pipet Pipet tetes Tabung reaksi Plat KLT

Bahan : DPPH Etanol 95% Sampel (Body lotion) Arbutin Vitamin C

IV.

CARA KERJA ANALISIS KUALITATIF Buat larutan sampel pekat untuk penototolan

Setelah itu sampel ditotolkan pada plat KLT dengan pembanding vitamin C dan arbutin

Elusi dalam bejana yang telah dijenuhkan dengan jarak pengembangan 8cm dan fase gerak ethanol : etil asetat (40:60)

Setelah selesai, keringkan hasil elusi

Amati dibawah sinar uv 254nm dan 366nm

Semprot dengan DPPH

Amati perubahan warna yang terjadi

ANALISIS KUANTITATIF Preparasi Timbang 1gram sunscreen, vitamin C, dan arbutin

Larutkan dalam etanol 100mL

Ultrasonifikasi selama 5 menit

Saring

Analisis sampel Buat seri kadar dari larutan stok larutan stok (0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 mg/mL)

Tambahkan 1 mL etanol Tambahkan 0,78 mL DPPH, lalu ad 5mL dengan etanol

Diamkan 30 menit dalam tempat gelap Ukur absorbansi pada =515 nm

Hitung % penangkapan radikal

Hitung IC50 Lakukan hal yang sama untuk pembanding (arbutin dan vitamin C)

Blanko 0,78mL DPPH dimasukkan kedalam labu takar 5mL, lalu ad 5mL etanol Baca absorbansi pada =515 nm

V.

DATA DAN PERHITUNGAN : Viva sunscreen foundation : Krim : 0.5% 2-ethylhexyl p-methoxy-cinnamate : CD. 1101293289 : PT Vitapharm, Surabaya-Indonesia : - Warna : Putih - Bau : Harum

Sampel Bentuk sediaan Kandungan No. Reg. Produksi Organoleptis

Analisis Kualitatif Metode : KLT

Jarak elusi : 8 cm Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1) Polar Etanol-Etil asetat (40:60) Rf Sampel = 7,6/8 = 0.95 Rf kojic acid = 7,7/8 = 0.9625 Rf arbutin = 7,4/8 = 0.925

Analisis Kuantitatif ARBUTIN Absorbansi blanko Absorbansi arbutin : 0.395 : x 100% kadar (g/ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 Absorbansi 0.042 0.020 0.018 0.220 0.014 % Penangkapan radikal 89.37% 94.94% 95.44% 44.30% (rejected) 96.46%

Tabel 1. Data penangkapan radikal pada arbutin

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = 88.61 b = 10.885 r = 0.8824 Persamaan y = 10.885x + 88.61 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 10.885x + 88.61 x (IC50) = -3.5471 mg/ml

VITAMIN C Absorbansi vitamin C : x 100%

Konsentrasi (ppm) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

Absorbansi 0.300 0.267 0.313 0.256 0.225

% Penangkapan radikal 0% 2.91% 0% (Reject) 6.91% 18.18%

Tabel 2. Data penangkapan radikal pada vitamin C

A = -7.7114

; B = 464,8571

; r = 0.8968

y = 464,8571x 7.7114 Perhitungan IC50 y = 464,8571x 7.7114 x= x= = 0.1241 ppm nilai IC50 vitamin C adalah 0.1241 ppm

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = -7.7114 b = 464,8571 r = 0.8968 Persamaan y = 464,8571x 7.7114 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 464,8571x 7.7114 x (IC50) = 0.1241 ppm

SAMPEL Absorbansi sampel : x 100% Sampel 1 kadar (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 absorbansi 0.443 0.385 0.343 0.366 0.316 penangkapan radikal (%) 0 2.53 13.16 (direject) 7.34 20

Tabel 3. Data penangkapan radikal pada sampel sunscreen sampel 1

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = -7.4592 b = 28.4319 r = 0.8805 Persamaan y = 28.4319x - 7.4592 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 28.4319x - 7.4592 x (IC50) = 2.0209 mg/ml Sampel 2 kadar (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 absorbansi 0.436 0.332 0.333 0.295 0.288 penangkapan radikal (%) 0 15.95 (direject) 15.70 25.32 27.09

Tabel 4. Data penangkapan radikal pada sampel sunscreen sampel 2

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = -9.7211 b = 46.5193 r = 0.9862 Persamaan y = 46.5193x - 9.7211 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 46.5193x - 9.7211 x (IC50) = 1.2838 mg/ml

Sampel 3 kadar (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 absorbansi 0.298 0.282 0.277 0.230 0.221 penangkapan radikal (%) 24.56 28.61 29.87 41.77 44.05

Tabel 5. Data penangkapan radikal pada sampel sunscreen sampel 3

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = 16.1461 b = 32.6405 r = 0.9133 Persamaan y = 32.6405x + 16.1461 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 32.6405x + 16.1461 x (IC50) = 1.0372 mg/ml

Sampel 4 kadar (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 absorbansi 0.277 0.292 0.257 0.252 0.210 penangkapan radikal (%) 29.87 26.08 (direject) 34.94 36.20 46.84

Tabel 6. Data penangkapan radikal pada sampel sunscreen sampel 4

Regresi linier konsentrasi (x) vs % penangkapan radikal (y) a = 23.8380 b = 22.8253 r = 0.8418 Persamaan y = 22.8253x + 23.8380 Jika % penangkapan radikal = 50 %, maka : 50 = 22.8253x + 23.8380 x (IC50) = 1.1462 mg/ml Tabel 7. Data IC50: Bahan Arbutin Vitamin C Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 IC50 -3.5471 0.1241 2.0209 1.2838 1.0372 1.1462

Rata-rata IC50 sampel = 1.3720 mg/mL

VI.

PEMBAHASAN Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat menetapkan aktivitas

antioksidan suatu sediaan kosmetik secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif aktifitas antioksidan suatu sediaan kosmetik dapat dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis, sedangkan analisis secara kuantitatif menggunakan nilai IC50 yang diperoleh dari sediaan tersebut. Sediaan kosmetik yang digunakan dalam percobaan penetapan aktifitas antioksidan kali ini berupa sunscreen dengan merk dagang Viva Sunscreen Foundation yang diproduksi oleh PT. Vitapharm. Pada praktikum ini dilakukan analisis kualitatif penentuan aktifitas antioksidan sunscreen menggunakan metoda KLT. Analisis kualitatif digunakan untuk mengetahui ada tidaknya senyawa berkhasiat antioksidan dalam sampel yang dianalisis. Prinsip dari metode ini adalah bercak hasil penotolan pada lempeng KLT dapat merubah warna senyawa radikal yang disemprotkan setelah didiamkan pada tempat gelap dan tanpa O2. Pereaksi semprot yang digunakan adalah DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) yang merupakan suatu senyawa radikal bebas yang stabil berwarna ungu. Sehingga ketika direduksi oleh senyawa antioksidan akan berubah menjadi senyawa yang lebih stabil yang berwarna kuning (difenilpikrilhidrazine).

Gambar 1. Struktur DPPH Metode DPPH berfungsi untuk mengukur elektron tunggal seperti aktivitas transfer hidrogen sekaligus juga untuk mengukur aktivitas penghambatan radikal bebas. Pada uji dengan DPPH, penangkapan radikal diikuti dengan monitoring penurunan absorbansi yang terjadi karena reduksi oleh radikal. Sebagai akibatnya maka penambahan senyawa yang bereaksi sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH ini. Adanya penurunan konsentrasi DPPH akan menyebabkan penurunan absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang tidak diberi dengan senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antiradikal. Untuk analisis secara kualitatif dan kuantitatif digunakan senyawa pembanding yaitu vitamin c dan arbutin. Keduanya telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Vitamin C

Arbutin Gambar 2. Struktur Vitamin C dan Arbutin

Vitamin C adalah salah satu jenis vitamin yang larut dalam air dan memiliki peranan penting dalam menangkal berbagai penyakit. Sehingga vitamin C termasuk golongan vitamin antioksidan yang mampu menangkal berbagai radikal bebas ekstraselular. Vitamin ini juga dikenal dengan nama kimia dari bentuk utamanya yaitu asam askorbat. Secara teoritis vitamin C memiliki nilai IC50 sebesar 16.9 0.5 M (Lopez et al, 2003). Hal ini berarti pada konsentrasi tersebut vitamin C mampu megurangi keradikalan senyawa radikal bebas hingga 50%. Sedangkan arbutin (4-Hydroxyphenyl-D-glucopyranoside) merupakan suatu senyawa sintetik yang berfungsi sebagai bahan aktif pencerah kulit yang terdiri dari alfa arbutin dan beta arbutin. Arbutin bekerja dengan mengeblok biosintesis melanin melalui penghambatan oksidasi enzimatik tirosin dan DOPA. Berdasarkan penelitian secara in vitro pada human cell lysate diperoleh nilai IC50 sebesar 1.0 mMol untuk alfa arbutin dan untuk beta arbutin sebesar 9.0 mMol. Pada praktikum ini, hal yang pertama kali dilakukan ialah melakukan analisis kualitatif antioksidan. Jika dalam analisis kualitatif ini bercak tidak mampu merubah warna ungu dari DPPH menjadi kuning maka dapat dimungkinkan di dalam sediaan kosmetik yang dianalisis tidak terdapat senyawa yang berkhasiat sebagai antioksidan atau mungkin preparasi sampel yang dilakukan terlalu sedikit, sehingga dalam analisis kuantitatif jumlah sampel dapat ditingkatkan. Hal pertama yang dilakukan ialah menimbang sunscreen, vitamin c dan arbutin. Masingmasing kemudian dilarutkan dalam etanol dan ditotolkan pada lempeng klt. Lempeng klt tersebut kemudian dielusi kedalam chamber yang telah dijenuhkan sebelumnya dengan fase gerak yaitu etanol : etil asetat (40:60). Tujuan chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak adalah untuk menyamakan tekanan uap di dalam chamber. Sehingga nantinya kecepatan elusi fase gerak membawa analit pada masing-masing tempat adalah sama. Setelah elusi berakhir lempeng klt selanjutnya dibiarkan kering terlebih dari dahulu untuk menghilangkan sisa-sisa fase gerak yang masih tertinggal. Kemudian lempeng klt tersebut disemprot dengan pereaksi semprot DPPH dan didiamkan terlebih dahulu selama 15 menit untuk memberi kesempatan sampel dan pembanding yang kita totolkan untuk bereaksi

dengan DPPH. Penyimpanan idealnya dilakukan di eksikator terlindung cahaya. Hal ini dilakukan untuk meminimalisisr terjadinya oksidasi yang disebabkan oleh cahaya dan oksigen yang nantinya akan mengakibatkan hasil yang diperoleh menjadi bias. Berdasarkan percobaan diperoleh hasil bahwa sampel yang akan dianalisis mengandung senyawa yang berkhasiat antioksidan. Hal ini ditunjukkan dengan perubahan warna pada bercak yang ditotolkan setelah penyemprotan dengan DPPH. Pada saat disemprot bercak akan berwarna ungu yang merupakan warna dari DPPH. Kemudian setelah didiamkan selama beberapa waktu bercak tersebut berubah menjadi kuning. Perubahan warna dari ungu menjadi kuning disebabkan karena senyawa radikal tersebut dinetralkan oleh senyawa antioksidan melalui pemberian elektron bebas sehingga DPPH menjadi tidak lagi radikal. Rf yang didaptkan pun saling mendekati, yaitu 0.95, 0.9625, serta 0.925. Untuk analisis kuantitatif pertama-tama menimbang sebanyak 1 g sunscreen, vitamin C dan arbutin. Masing-masing selanjutnya dilarutkan dengan sedikit etanol hingga terlarut. Lalu menyaring bagian yang tidak larut menggunakan kertas saring yang telah dijenuhi sebelumnya dengan pelarut. Hal ini dimaksudkan agar kertas saring sudah jenuh sehingga tidak menyerap sampel atau pembanding yang akan disaring. Sisa sampel yang tertinggal di kertas saring selanjutnya dibilas menggunakan etanol hingga diperoleh volume 25 ml untuk sampel, 10 ml untuk vitamin c dan 1 ml untuk arbutin. Larutan ini selanjutnya disebut sebagai larutan induk dengan kadar 4g/100ml untuk sampel dan 1mg/ml untuk pembanding. Alasan digunakannya etanol sebagai pelarut karena etanol ini mampu melarutkan sistem dengan baik karena sifatnya yang merupakan pelarut universal, sehingga diharapkan seluruh zat yang terdapat didalam sistem dapat terlarut termasuk senyawa yang berkhasiat sebagai antioksidan. Kemudian ke dalam labu takar 5 ml ditambahkan etanol sebanyak 1 ml dan DPPH sebanyak 0,789 ml. Banyaknya DPPH yang ditambahkan disesuaikan dengan nilai serapan yang dihasilkan yaitu disekitar 0,8. Jika terlalu besar dikhawatirkan akan sulit memenuhi nilai absorbansi 0,2-0,8, karena pada rentang tersebut linearitas antara kadar dan absorbansi cukup baik. Campuran tersebut selanjutnya divorteks hingga homogen dan dimulai untuk menjalankan stopwatch. Campuran pelarut dan DPPH tersebut kemudian ditambahkan sampel sebanyak volume tertentu sehingga nantinya akan diperoleh variasi kadar dengan pengenceran tertentu. Setelah ditambahkan sampel kemudian campuran tersebut

ditambahkan etanol hingga batas tanda yaitu 5 ml. Adapun banyaknya kadar sampel yang digunakan adalah sebesar 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 mg/mL. Setelah 30 menit campuran sampel dan DPPH tersebut dibaca intensitas serapannya pada panjang gelombang 515 nm yang merupakan panjang gelombang bagi DPPH. Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 30 menit untuk memberikan kesempatan sampel dapat bereaksi dengan DPPH sehingga jumlah radikal bebas menjadi berkurang karena terjadi penambahan elektron oleh senyawa di dalam sampel. Disamping itu pembacaan dilakukan pada panjang

gelombang maksimal karena pada panjang gelombang maksimum sensitivitas yang diberikan sangat besar sehingga perubahan kecil kadar pada sampel akan memberikan perubahan nilai absorbansi yang cukup besar. Adanya senyawa antioksidan dalam sampel akan mampu mengurangi intensitas serapan absorbsi. Nilai absorbansi yang dipeoleh selanjutnya diubah menjadi % penangkapan radikal dengan rumus : x 100%

Kemudian dilakukan regresi linear antara kadar (sumbu x) dengan % penangkapan radikal (sumbu y) sehingga diperoleh persamaan garis yang berbeda baik untuk sampel ataupun pembanding. Nilai absorbansi yang diperoleh harus mencapai nilai absorbansi yang memberikan penurunan senyawa radikal hingga 50%. Hal ini agar nilai IC50 yang dicari berada didalam rentang persamaan regresi yang dihasilkan (intrapolasi). Dari persamaan tersebut selanjutnya digunakan untuk mencari nilai IC50 dari sampel yang dianalisis. IC50 merupakan besarnya konsentrasi antioksidann yang diperlukan untuk menurunkan atau menangkap senyawa radikal sehingga tinggal 50%. Berdasarkan percobaan besarnya nilai IC50 yang diperoleh adalah untuk arbutin sebesar -3.5471 mg/mL, vitamin C sebesar 0.1241 ppm dan sampel sebesar 1.3720 mg/mL. Dari data yang dipeoleh, terlihat bahwa arbutin memiliki nilai IC50 terkecil. Hal ini berarti arbutin sangat poten dalam menangkap senyawa radikal bebas, baru kemudian sampel dan terakhir sampel.

VII.

KESIMPULAN

1. Analisis kuantitatif aktivitas antioksidan sediaan sunscreen dapat dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. 2. Analisis kualitatif aktivitas senyawa antioksidan dapat dilakuakan dengan kromatografi lapis tipis yang disemprot dengan pereaksi semprot DPPH. 3. Pada percobaan, sediaan sunscreen yang dianalisis mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai antioksidan. 4. Pada percobaan, diperoleh urutan nilai IC50 dari yang terbesar adalah Arbutin > Vitamin C > sampel. 5. Sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel uji yang digunakan memiliki kemampuan sebagai antioksidan, dengan pebanding yang digunakan vitamin C dan arbutin.

VIII. DAFTAR PUSTAKA Antolovich, Michael, Paul D. Prenzler, Emilios Patsalides, Suzanne McDonald, Kevin Robards, 2002, Methods for Testing Antioxidant Activity, Analyst. 127: 183-198 Gordon I, 1994, Functional Food, Food Design, Pharmafood, Champman dan Hall, New York Lachman. Leon, dkk, 1989, Teori dan Praktek Farmasi Industri Jilid 2, UI-Press, Jakarta Molyneux, Philip, The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol. 26(2): 211-219 Packer L, 1995, Nutrition, Lipids, and Desease, Hlmn 1-7, ISBN:0935315640. Illnois: AOCS Champaign Pr Yulianita, Ervin, 2008, Panjang Umur dengan Antioksidan, http://ervin.staff.uii.ac.id, diakses 27 Mei 2001

Yogyakarta, 26 Mei 2012 Praktikan,

Afina Laras Smaranesha (FA/08278)