UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Engenharia de Alimentos

APOSTILA DE AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Disciplina: Microbiologia dos Alimentos (ZEA-0463) Docente: Prof. Dr. Eliana Setsuko Kamimura

Tcnica de laboratrio: Roice Eliana Rosim Colaboradores(as): Dra. Helena Fagundes Dra. Evelise Andreatta Doutoranda Luciane Tavares da Cunha

2008 2008

SUMRIO NORMAS DE CONDUTA EM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA.................................03 NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS ..........................................................................04 UTILIZAO DO BICO DE BUNSEN...................................................................................04 PREPARO DA AMOSTRA ...................................................................................................05 PREPARO DE MEIO DE CULTURA ....................................................................................05 CLASSIFICAO DE AGENTES BIOLGICOS POR NVEL DE SEGURANA.................08 NORMAS PARA ELABORAO DOS RELATRIOS .........................................................09 1 Aula Prtica: CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS MESFILOS (CONTAGEM PADRO EM PLACAS) .................................................................................10 2 Aula Prtica: CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS .................................14 3 Aula Prtica: CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NOFILAMENTOSOS (LEVEDURAS) ........................................................................................23 4 Aula Prtica: CONTAGEM DE BACTRIAS LCTICAS ..................................................27 5 Aula Prtica: CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA........................29 6 Aula Prtica: CONTAGEM DE Bacillus cereus EM ALIMENTOS .....................................32 7 Aula Prtica: CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTOR ....................................34 8 Aula Prtica: VERIFICAO DA PRESENA DE Salmonella .........................................36

NORMAS DE CONDUTA EM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

1. No laboratrio, usar obrigatoriamente avental (jaleco branco) de manga, pois protege os braos e o vesturio de contaminao e de manchas provocadas pelos reagentes, bem como usar cala comprida e sapatos fechados para proteo individual e usar cabelos presos. 2. Colocar vesturio, livros e outros objetos de uso pessoal, no necessrios ao trabalho prtico, em locais apropriados, nunca nas reas de trabalho. 3. No comer, beber ou fumar no laboratrio de Microbiologia. 4. No levar boca o material de trabalho (lpis, canetas, etc.) e evitar colocar as mos na boca, nos olhos e no nariz. 5. Lavar cuidadosamente as mos antes e depois do trabalho prtico. 6. Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminao microbiana. 7. Limpar as bancadas de trabalho com lcool a 70 antes e depois do trabalho prtico. 8. Transportar os meios de cultura nos suportes prprios. 9. No pipetar produtos com a boca, usar sempre os dispositivos mecnicos. 10. No levar o material usado nas aulas prticas para fora do laboratrio. 11. Evitar a contaminao das bancadas de trabalho, cho e cestos de papis. O material contaminado nunca deve ser esquecido em locais desapropriados, nem colocado inadvertidamente em cima das bancadas de trabalho. 12. Colocar o material contaminado (pipetas, esptulas, alas, lminas e outros) aps a sua utilizao em recipientes prprios contendo desinfetante. 13. Esterilizar no bico de Bunsen os utenslios (ala de platina e ala de Drigalsky) antes e aps a sua utilizao. 14. O material a analisar deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis e nunca com as mos. 15. Identificar as amostras antes de iniciar a anlise e em geral, no descartar at obter os resultados. 16. Relatar imediatamente ao docente qualquer acidente que provoque leso corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura. 17. No final da sesso, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado. Verificar se o microscpio fica desligado, limpar as objetivas e colocar a capa protetora.

18. Verificar ainda se o gs ficou desligado. 19. O material utilizado deve seguir a seguinte seqncia de tratamento: esterilizao, lavagem, secagem, esterilizao e armazenamento. 20. Analisar produtos esterilizados somente em cmaras asspticas e fluxos laminares. NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS 1. Se possvel as amostras devem ser enviadas ao laboratrio em sua embalagem original para evitar modificaes e resultados errneos. 2. As amostras para exame microbiolgico devero ser acondicionadas em recipientes estreis e ntegros (sem perfuraes, rachaduras, etc.) na quantidade mnima de 400 gramas. Quando o peso unitrio for menor, devero ser colhidas tantas unidades quantas necessrias para se obter este valor quantitativo. 3. Amostras de produtos facilmente alterveis devero ser acondicionadas em recipientes isotrmicos, acompanhadas de gelo ou outra substncia refrigerante, cuidando-se para que no haja contatos deste com a amostra, para evitar qualquer alterao nas mesmas at sua chegada ao laboratrio. 4. O tempo decorrido entre a colheita da amostra e sua chegada ao laboratrio deve ser o mais breve possvel para que os resultados das anlises sejam vlidos. UTILIZAO DO BICO DE BUNSEN A funo do bico de Bunsen formar uma barreira contra contaminao atravs do calor; Sempre que manipular algum material infectado faa-o prximo do bico de Bunsen acesso; O bico possui uma regulagem que torna possvel selecionar a chama ideal para o trabalho; A chama utilizada em microbiologia a chama azul, pois esta atinge maior temperatura e no forma fuligem; A chama apresenta trs zonas (Figura 1): Zona neutra: zona fria (prximo ao bico) no se utiliza para a flambagem; Zona redutora: meio da chama, boa para flambagem;

Zona oxidante: extremidade da chama, boa para flambagem.

Zona oxidante oxidante Zona redutora Zona neutra

Figura 1. Desenho esquemtico da chama em um Bico de Bunsen. PREPARO DA AMOSTRA Produtos slidos: com o auxlio de pina estril, pesar assepticamente 10 g representativos da amostra em copos homogeneizador, adicionar 90 mL de gua peptonada a 0,1%, homogeneizar. Esta a diluio 10-1. Homogeneizar e pipetar 1 mL para um tubo contendo 9 mL de mesmo diluente (diluio 10-2). E assim, preparar as diluies desejadas, segundo o tipo de anlise a ser realizada. Produtos congelados devem ser descongelados em refrigerador 2-5oC, por um tempo mximo de 18 h antes da anlise. Produtos lquidos e gua: agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, pipetar assepticamente 1 mL da amostra, transferindo para um tubo contendo 9 mL de gua peptonada a 0,1% (diluio 10-1). Homogeneizar e pipetar 1 mL para um tubo contendo 9 mL de mesmo diluente (diluio 10-2). Preparar assim as diluies sucessivas necessrias s anlises a serem efetuadas. Produtos em p, granulado, pastoso, etc.: com auxlio de esptula ou colher estreis, pesar assepticamente 10 g da amostra em copos de homogeneizador, adicionar 90 mL de gua peptonada a 0,1%, homogeneizar e preparar as diluies necessrias. PREPARO DE MEIO DE CULTURA Existem trs tipos de meio: os lquidos que so obtidos pela dissoluo de nutrientes em gua; os slidos obtidos pela adio de um agente solidificante sendo o agar-agar

geralmente preferido (funde-se 80-100oC e se solidifica 40-45oC, com um concentrao em meios slidos de 1,5 a 2%). No comrcio h diferentes meios de cultura sintticos e sua composio depende das exigncias nutritivas do microrganismo em estudo (Tabela 1). Meios em p, por exemplo, so solveis em gua, dissolvidos e esterilizados para uso.

Tabela 1. Exemplos de meios de cultura e seus respectivos microrganismos relacionados.

MEIOS DE CULTURA Agar-agar de ovo Agar batata ou Potato dextrose agar (PDA) + cido tartrico Agar Chapman Agar citrato de Simons Agar contagem padro/Agar plate count (ACP/APC) Agar EMB-Levine Agar glicosado Agar lisina-ferro (LIA) Agar manitol Agar motilidade para cereus Agar nutritivo/nutriente Agar Salmonella-Shigella Agar seletivo para cereus Agar TCBS Agar trs acares e ferro (TSI) MICRORGANISMOS RELACIONADOS Agente gelificante para meios de cultura coagulase positiva Fungos, bolores e leveduras. Adiciona-se cido tartrico ao PDA para tornar o meio seletivo Seletivo para isolamento de Staphylococcus Prova bioqumica Padro para contagem de bactrias Base para deteco de coliformes e outros bacilos entricos Vrios microrganismos Prova bioqumica Isolamento de Staphylococcus patognicos Diferenciao entre as espcies de Bacillus cereus Para cultura de microrganismos pouco exigentes Isolamento e identificao de bacilos entricos, em especial Salmonella e Shiguella Isolamento de Bacillus cereus (gema de ovo e polimixina B) Isolamento e cultivo de Vibrio cholerae e outros vbrios enteropatognicos Prova bioqumica para identificao de bacilos

Agar Baird Parker com telurito e gema Deteco e enumerao de Staphylococcus

entricos Gram-negativos Agar XLD Isolamento e diferenciao de enterobactrias patognicas, em especial Salmonella e Shiguella coliformes

Caldo verde brilhante e bile bovina 2% Para enriquecimento seletivo e numerao de (brila) Caldo BHI (Brain heart infusion broth) Diversos microrganismos Caldo E. C. Caldo enriquecido para Listeria Caldo lactosado Caldo lauril sulfato Caldo lisina-descarboxilase Caldo MR-VP (vermelho de metila Voges Proskauer) Caldo nitrato Caldo prpura de bromocresol dextrose Caldo tetrationato Caldo triptona Caldo uria Caldo selenito-cistina D-glicose anidra P.A. Extrato de carne Frutose purssima (levulose) LPM agar base Manitol P.A. Oxford medium base Peptona de carne Sacarose P.A. Isolamento de coliformes em materiais lquidos Seletivo para Listeria monocytogenes Enriquecimento para salmonelas/Prova bioqumica Seletivo para isolamento e enriquecimento para coliformes Bactrias que descarboxilam lisina Prova bioqumica Prova bioqumica

Enterobacteriaceae
Enriquecimento seletivo de Salmonella Substrato para a produo de indol Prova bioqumica Deteco e identificao de Salmonella Enriquecimento e prova bioqumica Enriquecimento Prova bioqumica Isolamento de Listeria monocytogenes Enriquecimento e prova bioqumica Isolamento de Listeria monocytogenes Enriquecimento Enriquecimento e prova bioqumica

desidratados: : Possveis erros no preparo de meios de cultura desidratados Escurecimento do meio devido ao superaquecimento na dissoluo ou na esterilizao do gar; Problemas de gelificao do meio devido mistura de forma ineficiente, peso errado do p desidratado, pH do meio muito cido, excesso de inculo no gar tornando-o diludo, recipiente muito pequeno para uma boa homogeneizao do lquido e/ou fuso do meio repetidas vezes. CLASSIFICAO DE AGENTES BIOLGICOS POR NVEL DE SEGURANA Segurana nvel 1: Microrganismos que tm baixo risco de provocar doenas em seres humanos e de alterar o meio ambiente; No so necessrios equipamentos especiais de proteo; O trabalho feito com bancada aberta; Exemplos: bactrias da microbiota normal e fungos no patognicos. Microrganismos que apresentam risco moderado para o pessoal do laboratrio; necessria a utilizao de barreira individuais de proteo; Neste nvel esto includos todos os patgenos comuns que podem ser encontrados no meio ambiente, bem como no homem e nos animais; Exemplos: todas as espcies de

Segurana de nvel 2:

Escherichia,

Clostridium,

Streptococcus,

Treponemas, Neisseria e outros.

Segurana de nvel 3: 3: Microrganismos que apresentam risco infeccioso elevado e potencialmente letal; A manipulao exige a utilizao da capela de fluxo laminar e todas as barreiras de proteo individual; Exemplos: Todas as espcies de

Bortonella,

Brucella,

Pseudomonas,

Mycobacterium, Francisella tularensis, Yersina pestis, os fungos Coccidioides immitis

e Histoplasma capsulatum, dentre outros. Segurana de nvel 4: 4: Microrganismos que apresentam risco grave em humanos e podem se propagar facilmente de um indivduo a outro; A manipulao exige a utilizao da capela de fluxo laminar e de todas as barreiras de proteo individual e ambiental; Exemplos: vrus ebola, vrus da febre hemorrgica, vrus da encefalomielite.

NORMAS PARA ELABORAO DOS RELATRIOS De um modo geral, os relatrios so escritos com os objetivos de divulgar os dados obtidos e analisados, e registr-los em carter permanente. Os relatrios devero se constituir dos seguintes elementos: Formatao do relatrio: relatrio: margem superior 2,5 cm, margem inferior 2,5 cm, margem direita 2,5 cm, margem esquerda 3,5 cm, entre linhas (espao) 1,5 cm, tipo de letra Times New

Roman ou Arial, tamanho de fonte 12 e formato de papel A4 (210 X 297 mm). Paginar a
partir da segunda folha, no incio ou fim da pgina direita. Capa: deve conter nome da instituio responsvel; ttulo; autor(es); local e ano, em algarismo arbico. Introduo: apresentar o assunto como um todo, sem detalhes, contendo no mximo uma folha. Objetivos: em um pargrafo curto relacionar os objetivos a serem alcanados em cada aula. Evite copiar simplesmente o roteiro. Reviso bibliogrfica: parte mais extensa que visa mostrar a importncia do trabalho e as abordagens de outros autores sobre o referido tema. Citar os autores no texto*. Deve conter, em mdia, de 3 a 4 folhas. Material e Mtodos: relacionar o material utilizado e descrever, de modo sucinto e sem copiar do roteiro, os procedimentos realizados durante a aula. No mximo uma folha. Resultados e discusso: discusso: comunicar os resultados obtidos na forma de texto, tabelas, grficos, etc., e tambm comparar os resultados encontrados com os de outros autores (citar os autores no texto*). Deve conter o nmero de pginas necessrio para haver coerncia do contedo. Concluses: escrito em um nico pargrafo, ressaltar o alcance e as conseqncias do estudo. Referncias bibliogrficas: bibliogrficas: relacionar as fontes bibliogrficas utilizadas. Todas as obras citadas no texto devero obrigatoriamente figurar nas referncias bibliogrficas. A padronizao das referncias seguida de acordo com a NBR-6023/ago.1989 da ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas (www.abnt.org.br).
* Ver em Diretrizes para Elaborao de Dissertaes e Teses, Biblioteca, em www.fzea.usp.br.

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1 Aula Prtica CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS MESFILOS (CONTAGEM PADRO EM PLACAS) Introduo As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao da formao de colnias a partir de um nmero "fixo" de clulas viveis. So utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colnias (UFC) presentes na amostra sob anlise. Pode ser usado para: Contagem de grandes grupos microbianos como aerbios mesfilos, aerbios psicrotrfilos, bolores e leveduras, e outros; Gneros e espcies em particular como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, e outros. Variando-se o tipo de meio de cultura e as condies de incubao possvel selecionar o grupo, o gnero ou a espcie que se deseja contar. A contagem padro de microrganismos aerbios mesfilos detecta, em um alimento, o nmero de bactrias aerbias ou facultativas e mesfilas presentes tanto sob forma vegetativa quanto esporulada. Essa contagem tem sido usada como indicador da qualidade higinica dos alimentos. Sua presena em grande nmero indica: Matrias-prima excessivamente contaminadas; Limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; Higiene inadequada na produo; Condies inadequadas de tempo/temperatura durante a produo ou a conservao dos alimentos, ou uma combinao dessas circunstncias. A aplicao das tcnicas de contagem tem por base o uso de diluies seriadas, obtidas a partir da homogeneizao de amostras slidas e semi-slidas ou de inoculaes diretas de amostras lquidas e de suas diluies. A partir das diluies so cultivados os microrganismos para seu isolamento (Figura 2). Material: Material Tubos de diluio contendo 9 mL de gua peptonada a 0,1% Pipetas de 1 ou 2 mL estreis Placas de Petri estreis vazias Meio de cultura gar Padro para Contagem (PCA) esterilizado Estufa incubadora a 35C

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Procedimentos Procedimentos: AMOSTRAS LQUIDAS: Pipetar assepticamente 1 mL da amostra; Transferir para um tubo de diluio contendo 9 mL de gua peptonada (diluio 10-1); Preparar diluies subseqentes da mesma forma, transferindo-se 1 mL da diluio 10-1 para um segundo tubo de gua peptonada (diluio 10-2), e assim sucessivamente. AMOSTRAS SLIDAS: Pesar 10 g da amostra em copo homogeneizador; Acrescentar 90 mL de diluente gua peptonada e homogeneizar (diluio 10-1); Preparar a segunda diluio transferindo-se 1 mL da diluio 10-1 para um tubo contendo 9 mL de gua peptonada (diluio 10-2), e assim sucessivamente. Proceder aps o preparo das amostras: Transferir assepticamente 1 mL de cada diluio preparada para Placas de Petri devidamente identificadas com a diluio (10-1, 10-2,...); Adicionar cada placa cerca de 15 mL do gar previamente fundido e aquecido a 45C; Homogeneizar cuidadosamente deslizando as placas sobre uma superfcie plana fazendo movimentos circulares em forma de 8; Deixar em repouso para solidificar o gar e incubar as placas, na posio invertida, invertida em estufa a 35C, por 48h; Aps a incubao, retirar as placas e proceder a contagem das colnias formadas (em placas com 25-250 colnias); Realizar o clculo, de acordo com a diluio preparada, do nmero de colnias por mL de amostra, usando a expresso:

n de colnias/mL ou g = n de colnias na placa x 1/diluio

Calcular a mdia dos valores obtidos em cada diluio e expressar o resultado em unidades formadoras de colnias por mL ou g de amostra (UFC/mL ou g). Usar notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula, na apresentao dos resultados.

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Figura 2. Diluies decimais seriadas da amostra e cultivo em meio de cultura.

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Bibliografia consultada consultada SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. alimentos Varela. So Paulo, 2001. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Alimentos EMBRAPA, MERCK, Braslia DF, 1995. Pesquise e responda 1) Qual a diferena entre microrganismos fototrficos e quimiotrficos? E entre os autotrficos e os heterotrficos? 2) Quais as vantagens do uso de meios sintticos em Microbiologia? Quais so suas desvantagens? 3) Quais so as etapas envolvidas na preparao de um meio bacteriolgico? Por que so necessrios meios diferentes? 4) Como se classificam as bactrias de acordo com suas temperaturas timas de crescimento? 5) Compare a eficcia do calor seco e do calor mido como mtodos de esterilizao. 6) Qual a significao da presso na eficincia da autoclavagem como mtodo de esterilizao.

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2 Aula Prtica
CONTAGEM CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS

Introduo Introduo
Na avaliao microbiolgica de uma amostra importante determinar a ausncia ou presena de um microrganismo, chamado indicador, e sua respectiva populao que esteja presente, devendo ser levado em considerao que, nem todos os microrganismos patognicos encontrados so de origem fecal. A espcie Escherichia coli est presente na flora intestinal do homem e nas fezes (cerca de 3,0 x 108/g) sem causar nenhum sintoma, entretanto existem alguns sorotipos enteropatognicos. A presena de E. coli na amostra pode ser um indicador microbiolgico de contaminao fecal pertencendo ao grupo dos coliformes. coliformes No grupo dos coliformes pode haver presena de espcies de origem no fecal e os mtodos de deteco podem estar sujeitos a falsos resultados negativos por interferncia de

Pseudomonas, e falsos positivos por ao sinergstica de outras bactrias.

H basicamente trs mtodos que podem ser utilizados para a deteco e/ou contagem de coliformes em gua, leite e outros alimentos, com variaes na escolha dos meios de cultura de forma a selecionar a microbiota alvo, so eles: Tcnica dos tubos mltiplos (NMP), Teste de presena/ausncia (P/A) e Tcnica da membrana filtrante. 1. Tcnica dos tubos mltiplos (NMP) A tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP) um mtodo que permite estimar a densidade de microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise. Esta tcnica no permite a contagem "fixa" de clulas viveis ou de unidades formadoras de colnias (UFC), como acontece com a tcnica de contagem em placas. A anlise por NMP recomendada quando: esperado, no alimento em anlise, um baixo nmero do microrganismo alvo (<100/g ou mL) ou quando, em funo de limitaes do mtodo e das diluies necessrias para o alimento especfico, o padro de aceitao/rejeio no pode ser atendido por meio de provas de contagem. Quando, devido ao processo tecnolgico sofrido pelo alimento, as clulas presentes estejam lesadas fisiologicamente (clulas estressadas), no tendo, portanto condies de formar colnias em meios slidos seletivos. A tcnica de NMP deve ser realizada incluindo as seguintes etapas analticas: Teste presuntivo: leitura dos resultados obtidos na srie de tubos mltiplos. Teste confirmativo: subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de maior impedincia ou em gar seletivo diferencial para o microrganismo pesquisado.

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Teste completo: identificao bioqumica da(s) espcie(s) microbiana(s) presente(s). Esta tcnica tem por base a probabilidade estatstica relacionada com a freqncia

da ocorrncia de resultados positivos mais provveis em funo do nmero real de microrganismos presentes. necessrio que a amostra seja preparada de modo que as bactrias no se encontrem agrupadas, que estejam aleatoriamente distribudas na amostra; e que os meios e condies de incubao permitam a recuperao e deteco de ao menos uma clula vivel do organismo alvo. Para a determinao do NMP, a amostra dever ser diluda tantas vezes quantas necessrias para que a ltima diluio de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados negativos. Quanto maior o nmero esperado do microrganismo pesquisado, maiores devero ser as diluies usadas. Quando no se pode estimar qual a diluio da amostra que oferecer essa situao, so inoculadas mais de 3 sries com diluies decimais (por exemplo 100 at 10-4, ou mais diluies). Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas somente as 3 diluies mais significativas. Como esse procedimento aumenta em muito o volume de trabalho e de material a ser usado, normalmente so utilizadas apenas trs diluies, considerando a estimativa do nmero esperado do microrganismo em estudo. Ento, o nmero de clulas viveis presentes obtido por meio de 3 diluies decimais sucessivas e transferncia de alquotas determinadas (tambm decimais, como 10 e 1 mL) de cada diluio em sries de tubos. O nmero de tubos por srie varivel, podendo ser de 2 a 10. Mais comumente so usadas sries de 3 ou 5 tubos por diluio. Quando houver necessidade de inocular grande volume (10 mL) da amostra diluda ou no, na primeira srie de tubos, estes devero conter meio em concentrao dupla. O arranjo de nmero de tubos positivos das 3 diluies (ou as mais significativas) transposto para tabelas estatsticas que informam o NMP para as diferentes combinaes de tubos positivos e que tambm incluem os limites de confiana dos nmeros mais provveis dos microrganismos pesquisados em funo da tabela em questo. Os intervalos de confiana 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informao de que, em pelo menos 95% das vezes, h a chance da concentrao real do microrganismo alvo estar includo no intervalo de confiana calculado para cada arranjo de tubos positivos. Por exemplo, o arranjo de tubos positivos 3-1-0 oferece como NMP o valor 43/g. Nesse caso, o intervalo de confiana 95% corresponde aos valores compreendidos entre 9 e 180. Isto significa que a chance do nmero real presente na amostra estar includo no intervalo de valores entre 9 e 180 UFC/g de 95%. A expresso do NMP feita somente por meio do nmero mais provvel que corresponda ao arranjo de tubos positivos por srie. Em geral, as tabelas j esto corrigidas considerando g ou mL (e conseqentemente, as diluies), para a obteno do NMP.

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Procedimento Procedimentos imentos de Anlise pela Tcnica dos Tubos Mltiplos usando meios de fermentao da lactose AMOSTRA (100) Preparar as diluies seriadas: 1 mL 9 mL de diluente* (10-1) 1 mL 9 mL de diluente (10-2) 1 mL 9 mL de diluente (10-3) ...... (10-n)

* Diluente = meio de cultura Teste presuntivo: presuntivo Inocular 1 mL de cada diluio em uma srie de 3 tubos contendo meio de acordo com o esquema abaixo: Inoculao de 1,0 mL da diluio 10-1 na 1 srie 1,0 mL da diluio 10-2 na 2 srie 1,0 mL da diluio 10-3 na 3 srie de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL (Tabela 2). Meios que podem ser utilizados para semear: Caldo lactosado (CL) com tubos de Durham; Caldo Lactosado com Prpura de Bromocresol (CL-BCP); Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham [ou Caldo Lauril Sulfato Triptose com Prpura de Bromocresol (LST-BCP)]. Incubar os tubos a 35C/24h e observar se h tubos com turvao e produo de gs dentro dos tubos de Durham, ou produo de cido (nos meios contendo prpura de bromocresol evidenciado pela viragem do indicador de prpura para amarelo). Em casos positivos passar aos itens subseqentes. Em caso negativo, reincubar at completar 48h e repetir a leitura, passando para os itens subseqentes em caso de crescimento com produo de gs. A no ocorrncia de cido e/ou gs aps 48h de incubao indica ausncia de coliformes (totais, fecais ou E. coli) nos 100 mL da amostra. Confirmao de coliformes totais Transferir de cada tubo positivo uma alada bem carregada da cultura para respectivos tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile (VBB). Quantidade de amostra inoculada em cada srie 0,1 g ou mL 0,01 g ou mL 0,001 g ou mL

A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para inculos

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Incubar os tubos a 35C por 24-48h e observar se h crescimento com produo de gs, confirmativo de coliformes totais. Anotar o nmero de tubos de VBB com gs e determinar o NMP de coliformes totais/100 mL em uma tabela de NMP apropriadas s diluies inoculadas (Tabela 2). A no ocorrncia de gs aps 48h de incubao indica ausncia de coliformes totais na amostra. Confirmao de coliformes fecais Transferir de cada tubo positivo uma alada bem carregada da cultura para respectivos tubos contendo Caldo E. coli (EC). Incubar os tubos a 44,5C por 24h e observar se h crescimento com produo de gs, confirmativo de coliformes fecais. Anotar o nmero de tubos de VBB com gs e determinar o NMP de coliformes fecais/100 mL em uma tabela de NMP apropriadas s diluies inoculadas (Tabela 2). A no ocorrncia de gs aps 24h de incubao indica ausncia de coliformes fecais na amostra. Confirmao bioqumica de E. coli Se houver interesse na confirmao de presena/ausncia de E. coli atravs de provas bioqumicas tradicionais, tomar uma alada da cultura obtida em cada tubo de Caldo EC com produo de gs e estriar em respectivas placas de Agar Eosina Azul de Metileno (EMB). Incubar as placas a 35C por 24h e observar se h desenvolvimento de colnias tpicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem brilho verde metlico). Havendo colnias tpicas, transferir duas colnias bem isoladas para tubos de Agar Nutriente (NA) ou outro meio adequado para inculo de provas bioqumicas, inclinados, e incubar os tubos a 35C/24h. A partir das culturas puras de NA, fazer colorao de Gram, prova de oxidase e inocular os meios teste para realizao de provas bioqumicas de indol, VM, VP e citrato (IMVC). Exemplo de clculo do NMP Suponha que foram selecionadas as sries de tubos 10-2, 10-3 e 10-4 para as inoculaes e que aps incubao tenha sido encontrado os seguintes resultados: 10-2 = 3 tubos positivos, 10-3 = 1 tubo positivo e 10-4 = nenhum tubo positivo, teramos como resultado o nmero 3 1 0 , que na Tabela do NMP corresponderia 40. Como na tabela o NMP

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calculado partir da diluio 1/10 (0,1), o resultado dever ser multiplicado por dez, ou seja, o NMP seria igual 400 microrganismos/g ou mL, ou ainda 4,0 x 102/ g ou mL. Tabela 2. Nmero Mais Provvel por grama ou mL, para sries de 3 tubos com inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiana 95%. Nmero de Tubos Positivos 0,1 (10-1) 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0,01 (10-2) 1 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 3 0,001 0,001 (10-3) 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 3 NMP/g ou mL 3 4 7 7 11 9 14 15 20 21 23 40 40 70 90 150 210 200 500 1100 >1100 Intervalo Confiana (95%) Inferior <1 1 2 2 4 2 5 5 8 8 7 10 20 20 30 50 80 100 200 300 Superior 17 21 27 28 35 38 48 50 61 63 129 180 210 280 390 510 640 1400 2400 4800

Obs: Para calcular o NMP de diluies maiores que as apresentadas na tabela, multiplicar o NMP pelo fator adequado: 10, 100, 1000, etc. Por exemplo, se os tubos selecionados correspondem s diluies 10-2, 10-3 e 10-4, multiplicar por 10; se as diluies so 10-3, 10-4 e 10-5, multiplicar por 100.

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2. Teste de presena/ausncia (P/A) uma simplificao do teste anterior, que NO objetiva quantificar os coliformes nas amostras, mas SIM verificar a presena num determinado volume. A principal aplicao anlise de guas destinadas ao consumo humano, para as quais a legislao brasileira estabelece como padro a ausncia de coliformes totais e fecais em 100 mL de amostra. Pode ser realizado com meios de cultura que utilizam a produo de cido a partir da fermentao de lactose como caracterstica diferencial presuntiva (Caldo P-A, Caldo Lactosado com Prpura de Bromocresol ou Caldo Lauril Sulfato Triptose com Prpura de Bromocresol). 3. Teste da membrana filtrante um mtodo de anlise quantitativo, permitindo determinar o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) dos microrganismos alvo na amostra, baseado na filtrao de um determinado volume atravs de um filtro membrana com poro de 0,45 m. As bactrias, que possuem dimenso maior que os poros, ficam retidas na membrana, que transferida para uma placa de Petri contendo meio de cultura seletivo e diferencial para visualizao de colnias tpicas. A tcnica no restrita anlise de coliformes, podendo tambm ser aplicada na anlise de Pseudomonas aeruginosaa, Enterococcus e Clostridium perfringens. Porm sua principal aplicao a anlise de gua destinada ao consumo humano (filtrao de 100 mL da amostra). O que determina o microrganismo a ser contado a seleo do meio de cultura, que no caso dos coliformes, apresenta as seguintes opes, consideradas oficiais no Brasil: Agar m-Endo: seletivo diferencial para coliformes totais; Agar m-FC: seletivo para coliformes fecais; Agar m-TEC; Agar m-TEC Indoxil. Procedimento de Anlise pela Tcnica da Membrana Filtrante Preparao do conjunto de filtrao: filtrao Preparar o conjunto ajustando a membrana no porta-filtro (com face quadriculada para cima) e o copo de filtrao sobre a membrana. Conectar o kitasato de coleta do lquido filtrado bomba de vcuo. O conjunto deve ser montado prximo a chama de um bico de Bunsen ou no interior de uma cmara de fluxo laminar. Preparao da amostra: amostra Homogeneizar a amostra por agitao, invertendo o frasco 25 vezes em ngulo de 45. Medir 100 mL numa proveta estril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtrao, evitando respingos. Se o copo do conjunto de filtrao for

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graduado e a escala contiver a marcao de volume requerida, o volume da amostra pode ser medido diretamente sem a utilizao da proveta. Filtrao: Filtrao: Ligar a bomba de vcuo e proceder filtrao. Aps passagem da amostra, ainda com a bomba ligada, enxaguar as paredes do copo com 20 a 30 mL de gua de diluio (Tampo Fosfato com cloreto de magnsio), para recolher eventuais contaminantes aderidos. Repetir esse procedimento mais uma vez. Desligar a bomba de vcuo antes que a membrana seque excessivamente. Transferncia e incubao incubao da membrana: membrana: Retirar o copo e com uma pina flambada e resfriada, transferir a membrana para uma placa com meio de cultura adequado contagem que se deseja efetuar, com a face quadriculada para cima. Ao colocar a membrana no meio de cultura importante que toda a superfcie fique completamente aderida ao meio, para que haja contado dos microrganismos com os nutrientes. Se houver formao de bolhas, deve-se levantar a borda da membrana mais prxima da(s) bolha(s) e recoloc-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). Contagem das Colnias: Colnias: Proceder contagem das colnias com o auxlio de um microscpio estereoscpico, com aumento de 10 a 15 vezes e iluminao fluorescente perpendicular ao plano da membrana. Contar apenas as colnias tpicas e selecionar para contagem as placas com nmero total de colnias inferior a 200 e nmero de colnias tpicas entre 20 e 80 (20 e 60 no caso do gar m-FC, no qual as colnias so um pouco maiores). Clculo dos Resultados 1- Nas situaes normais, em que so filtrados 100 mL da amostra, o nmero total de colnias na placa no ultrapassou 200 e o nmero de colnias tpicas manteve-se na faixa recomendada, o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC)/100mL da amostra dado diretamente pelo nmero de colnias presentes. 2- Se foi filtrado um nmero diferente de 100 mL, mas o nmero total de colnias na placa no ultrapassou 200 e o nmero de colnias tpicas ainda se manteve na faixa recomendada, considerar o volume no clculo do resultado, lembrando que, se foram utilizadas diluies, 1 mL da diluio 10-1 corresponde a 0,1mL da amostra original 1mL da 10-2 corresponde a 0,01mL da amostra original e assim subseqentemente. Nesse caso, o nmero de UFC/100 mL dado pela seguinte frmula:

UFC/100 mL =

N colnias tpicas Volume da amostra original que foi filtrado

x 100

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3- Se houve necessidade de confirmar as colnias de coliformes totais no gar m-Endo ou gar m-Endo-LES, utilizando-se o mtodo quantitativo, calcular o nmero de UFC/100 mL em funo do volume filtrado e da porcentagem de colnias confirmadas, utilizando a frmula abaixo, porm, ateno: se a confirmao foi feita pelo mtodo qualitativo, reportar o resultado como presena ou ausncia no volume filtrado.

UFC/100 mL = N colnias tpicas x % de colnias confirmadas x 100 Volume filtrado

Onde

% colnias confirmadas =

N colnias confirmadas x 100 N colnias submetidas confirmao

4- Se foi filtrado mais de um volume da amostra e placas correspondentes a mais de um volume se apresentaram em condies adequadas para contagem, considerar a soma das colnias nas vrias placas e a soma dos respectivos volumes no clculo do resultado, de acordo com a frmula abaixo:

UFC/100mL =

Soma colnias tpicas nas vrias placas Soma volumes correspondentes s placas contadas

x 100

5- Se no houver desenvolvimento de colnias tpicas em nenhuma placa, expressar o resultado como ausncia ou menor que 1/100 mL. 6- Se nenhuma placa apresentar contagem acima de 20 colnias tpicas, utilizar o nmero obtido no clculo de resultado. 7- Se as placas apresentarem mais de 80 colnias tpicas, fazer a contagem desde que o nmero total de colnias na placa no exceda 200. 8- Quando a placa contiver um nmero de colnias superior a 200, impedindo a contagem, relatar o resultado como presena ou ausncia, dependendo da presena de colnias tpicas ou da confirmao observada.

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Bibliografia consultada consultada AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA).

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, arquivo capturado em 12/10/2002. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for the

microbiological examination of foods. 3rd ed. Washington, APHA, 1992. MINISTRIO DA AGRICULTURA. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. I Mtodos microbiolgicos. Braslia, MA, 1981. ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L.R.; AZEVEDO, J.L. Tratado de Microbiologia. Microbiologia So Paulo:Manole,1987, v.1, 183p. SILVA, N. da; NETO, R.C.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica da gua. gua. Campinas:ITAL/Ncleo de Microbiologia, 2000. 99p. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Alimentos EMBRAPA, MERCK, Braslia DF, 1995.

Pesquise e responda 1) Quais so as principais condies que devem ser consideradas no cultivo de microrganismos? 2) Descrever as vrias fases de uma curva tpica de crescimento de uma cultura microbiana em um sistema fechado.

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3 Aula Prtica
CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS (BOLORES) E NONO-FILAMENTOSOS (LEVEDURAS) Introduo Os fungos encontram-se amplamente distribudos em todos os habitats, podendo ser parasitas, simbiontes ou saprfitos. Crescem onde existe matria orgnica disponvel, viva ou morta, geralmente exigindo calor e umidade. gua, solo, troncos, folhas, frutos, sementes, excrementos, insetos, alimentos frescos e processados, txteis e inmeros outros produtos fabricados pelo homem constituem substratos para o desenvolvimento de fungos. O reino dos fungos inclui uma grande diversidade de microrganismos que podem ser microscpicos ou no. Os grupos mais importantes so os bolores conhecidos como mofos, as leveduras e os cogumelos (Figura 3).

Figura 3. Reino Fungi: a) Bolores; b) Leveduras; c) Cogumelos.

Caractersticas fisiolgicas dos fungos: Faixa de temperatura de crescimento: 0 35C Temperatura tima: 25 30C Faixa de pH de crescimento: 2,0 - 8,5 (pH timo: 4,5 - 5,5)

Necessidades hdricas: Bolores < Leveduras < Bactrias Aw (atividade de gua) menor que 0,70 inibe o crescimento da maioria dos bolores que causam a deteriorao de alimentos. Aw = estima a proporo de gua disponvel no sistema para reaes biolgicas, bioqumicas e qumicas. Os fungos podem ser: a) Fungos Filamentosos: BOLORES (Figura 4a)

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So fungos filamentosos, multicelulares, obtm sua alimentao de matria orgnica inanimada ou nutrem-se, como parasitas, de hospedeiros. Alguns destes fungos so benficos aos homens, auxiliando na indstria alimentcia (maturao de queijos) bem como na indstria farmacutica (produo de penicilina). Outros so
prejudiciais, causando doenas em vegetais, animais e homens, e dentro deste grupo h ainda aqueles produtores de micotoxinas como as aflatoxinas. b) Fungos no-Filamentosos: LEVEDURAS (Figura 4b) As leveduras so fungos como os bolores, mas se diferenciam deles por se apresentarem predominantemente sob forma unicelular. Por serem clulas mais simples, elas crescem e se reproduzem mais rapidamente do que os bolores. Uma levedura tpica consta de clulas ovais, que se multiplicam assexuadamente por brotamento ou gemulao. A maioria das leveduras, no vive no solo, mas adapta-se a ambientes com alto teor de acares, tal como nctar das flores e a superfcie de frutas.

Figura 4. (a) bolores

(b) leveduras

Como os fungos filamentosos, certas leveduras so benficas (produo de cervejas, vinho, etc leveduras fermentativas), sintetizam certas vitaminas e/ou outros produtos. Existem ainda as leveduras que deterioram os alimentos ou provocam doenas nos vegetais e animais. As leveduras so classificadas em todas as trs classes de fungos superiores:

Basidiomicetos os e Fungos Imperfeitos. O principal agente da fermentao Ascomicetos, Basidiomicet

alcolica a levedura ascomictica Saccharomyces cerevisae. As leveduras de interesse em alimentos so: 1. Top yeast: leveduras de superfcie; 2. Botton yeast: leveduras de profundidade. Significado nos nos alimentos A presena de fungos filamentosos e leveduras viveis e em ndice elevado nos alimentos pode fornecer vrias informaes: Condies de higiene deficientes nos equipamentos;

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Matria-prima com contaminao excessiva; Multiplicao no produto em decorrncia de falhas no processamento e/ou estocagem.

Material: gar batata dextrose 2%; L(+) cido tartrico 10%; Soluo de gua peptonada 0,1%. Placas de Petri Ala de Drigalsky

Procedimentos: Preparo da amostra Pesar 10 g e adicionar 90 mL de soluo de gua peptonada 0,1% ou pipetar 1 mL da amostra e colocar no tubo com 9 mL de gua peptonada. Homogeneizar. A partir da diluio inicial 10-1 proceder as diluies 10-2 e 10-3.

Inoculao Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas em placas de Petri contendo o gar PDA acidificado j solidificado. Com o auxlio de uma ala de Drigalsky espalhar cuidadosamente o inculo na placa at sua completa absoro. Incubao Leitura Transcorrido o perodo de incubao, considerar para contagem somente as placas que apresentarem de 15 a 150 colnias. Multiplicar o nmero de colnias obtido por 10 para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado na placa. OBSERVAES: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos. Bolores - colnias arredondadas, com bordas difusas. Leveduras colnias ovaladas, bordas definidas, pequenas, de aparncia cremosa. Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias.

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Bibliografia consultada AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA). Mtodos analticos oficiais para anlises microbiolgicas para controle de produtos de origem animal e gua. http://www.anvisa.gov.br AZEVEDO, J.L. de Fungos. http://www.biotecnologia.com.br/bio01/1hp_5.asp Texto

capturado em 19/09/2003. MINISTRIO DA AGRICULTURA. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem origem animal e seus ingredientes. I Mtodos microbiolgicos. Braslia, MA, 1981. PEREIRA, M.S.V. O Curioso Mundo dos Fungos.

http://www.biologianaweb.com/micro/fungi.ht http://www.biologianaweb.com/micro/fungi.htmL ngi.htmL Texto capturado em 19/09/2003. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Alimentos EMBRAPA, MERCK, Braslia DF, 1995.

Pesquise e responda 1) Quais as caractersticas dos meios para cultivo de fungos? 2) Quais as diferenas entre as colnias de leveduras e as colnias de fungos filamentosos? 3) Esquematize e explique o ciclo de vida de um bolor.

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4 Aula Prtica CONTAGEM DE BACTRIAS LCTICAS Introduo Um dos mais importantes grupos de bactrias produtoras de cidos em alimentos industrializados o das bactrias lcticas, constitudos pelos principais gneros:

Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc Pediococcus

Significado nos alimentos As bactrias lcticas so importantes nas indstrias de laticnios, de produtos crneos e de vegetais, por participarem no processamento de diversos alimentos tais como: leite fermentado, queijos, salames, produtos fermentados de soja e outros vegetais. Tambm podem provocar alteraes como acidificao, turvao, estufamentos, modificaes de odor e sabor. A contagem de bactrias lcticas importante em determinados alimentos, especialmente naqueles em que a conservao est baseada no abaixamento do pH (acidificados) e nos produtos cidos. Esta contagem fornece indicaes sobre a higiene na produo bem como permite estimar o tempo de vida de prateleira dos alimentos. Meios de Cultura gar soro de laranja: Indicado para a contagem de microrganismos deteriorantes, cidos tolerantes, em suco de frutas e frutos ctricos. Por conter extratos de laranja, este meio oferece boas condies para crescimento da microflora existente no suco ctrico tais como Bacillus,

Lactobacillus, Leuconostoc, fungos filamentosos, leveduras e outros, sendo recomendado

para o controle de fabricao de sucos de frutas e refrigerantes. gar seletivo para o Lactobacillus (meio Rogosa): Este meio recomendado para o isolamento e contagem de Lactobacillus de carne e produtos crneos, leite e produtos lcteos bem como outros alimentos. A seletividade do meio est baseada na elevada concentrao de acetato e o pH baixo, os quais inibem a microbiota acompanhante. gar para Lactobacillus de Man, e Sharpe (gar gar MRS): M , Rogosa R S Este meio utilizado para contagem dos lactobacilos em todos os alimentos e em virtude da pouca seletividade deste meio, podem crescer tambm espcies de Pediococcus,

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Leuconostoc, dentre outras. A seletividade deste meio deve-se ao poli-sorbato, acetato,

magnsio (fatores estimulantes do crescimento de Lactobacillus) da formulao, que rica em nutrientes. Metodologia: AMOSTRAS LQUIDAS: Pipetar 1mL; Colocar 9 mL de diluente gua peptonada (diluio 10-1). Pesar 10 g da amostra em copo homogeneizador; Acrescentar 90 mL de diluente gua peptonada e homogeneizar (diluio 10-1).

AMOSTRAS SLIDAS:

Proceder aps preparo das amostras: Preparar as diluies, sendo que para leites fermentados e iogurtes pode-se utilizar 10-6, 10-7 e 10-8. Lembre-se de agitar os tubos entre uma diluio e outra. Plaquear por profundidade (colocando 1 mL da amostra e vertendo o meio MRS em cima). Homogeneizar amostra e meio de cultura fazendo movimentos na forma de 8. Depois que o meio estiver solidificado colocar as placas invertidas na estufa, a 37oC por 48 horas. OBS: Incubar placas 10-6, 10-7 e 10-8. Resultados: Valor da Contagem Mnima Ser utilizado A contagem mnima destas bactrias deve ser de 106 UFC/mL de clulas viveis no alimento durante o tempo de vida de prateleira do mesmo. Bibliografia consultada Siqueira, R. S. Manual de Microbiologia Microbiologia de Alimentos, Alimentos Embrapa-MERCK, 1995. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA). Mtodos analticos oficiais para anlises microbiolgicas para controle de produtos de origem animal e gua. http://www.anvisa.gov.br

Pesquise e responda 1) O que cultura "starter" e d suas aplicaes.

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5 Aula Prtica

CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA POSITIVA Introduo

Staphylococcus so cocos Gram positivos, agrupados em forma de cacho de

uva, esporulados, imveis, produtores de toxina (algumas cepas), patognicos, anaerbios facultativo, mas crescem melhor em condies aerbias. Sua faixa de pH para crescimento de 4,2-9,3 (timo entre 7,0 e 7,5), faixa de temperatura tima para crescimento de 30 e 37C e atividade de gua mnima 0,86. Seu habitat natural so as cavidades nasais, garganta e trato intestinal. Estes cocos incluem S. aureus (Figura 5), espcie que o agente causador de vrias sndromes patolgicas no homem, incluindo as gastroenterites transmitidas por alimentos. Esta bactria produz toxina, enterotoxinas, enterotoxinas que so protenas simples, facilmente solveis em gua e em solues salinas, resistentes a ao de enzimas e termorresistentes. Nos alimentos no so totalmente inativadas pela coco normal, pasteurizao e outros tratamentos trmicos correntes. Estima-se que, para produzir intoxicao no homem, seja necessrio de 0,015 a 0,357g de enterotoxina por kg de peso corporal. O perodo de incubao, geralmente, de 2 a 4 horas aps a ingesto do alimento contaminado, apresentando nuseas, vmitos, diarria, contraes abdominais e cefalia, com durao de 1 a 2 dias.

Figura 5.Staphylococcus aureus Os alimentos propcios para crescimento so produtos de origem animal industrializados, carnes, ovos, leite, pescado, massas alimentcias, cremes, maionese, doces de confeitaria com ou sem recheio. A presena de S. aureus nos alimentos interpretada, em geral, como indicativo de contaminao a partir da pele, boca e das fossas nasais dos manipuladores de alimentos, bem como da limpeza e da sanificao inadequada dos materiais e dos equipamentos. No geral, possvel que os estafilococos vivam, mesmo que em nmero escasso, em qualquer ou em todos os produtos alimentcios de origem animal ou

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aqueles manipulados diretamente por pessoas, a no ser que seja aplicado tratamento trmico aos produtos. Meios de cultura gar BairdBaird-Parker Neste meio, as colnias de S. aureus so negras, lustrosas, convexas, 1 a 5mm de dimetro, rodeados por halo claro de 2 a 5 mm de largura. gar VogelVogel-Johnson Este meio tem colorao vermelha, devido ao vermelho fenol, onde as colnias de S. aureus apresentam-se negras, pequenas e com halo amarelo ao redor. gar gar Chapman meio para Staphylococcus nmero 110 Neste meio crescem apenas microrganismos que possuam elevada tolerncia ao NaCl. Entre estes, o S.

aureus so diferenciados pela formao de pigmento amarelo dourado (as no

pigmentadas so brancas), e desenvolvimento de uma zona clara ao redor das colnias. Procedimentos para anlise Triturar a amostra slida, pesar 10 g da amostra de forma assptica; OBS: As amostras de maionese sero pesadas (10 g) e misturadas em recipiente com rosca e agitadas manualmente.

Misturar as 10g em 90 mL Considerado 10-1

de gua peptonada (0,1%);

Homogeneizar bem durante alguns minutos; Preparar as demais diluies decimais seriadas (10-2 e 10-3) adicionando 1 mL em 9mL de gua peptonada (0,1%); Retirar de cada diluio, alquotas de 0,1mL e coloc-las em placa de Petri contendo o meio gar Baird-Parker;

10 g amostra + 90 mL gua peptonada (10 10-1)

10-2

10-3

placa de Petri com gar + 0,1 mL da diluio 10-2

placa de Petri com gar + 0,1 mL da diluio 10-3

Fazer o espalhamento do inculo na placa com auxlio da ala de Drigalsky;

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Incubar, invertendo as placas, a 35-37C/48 horas; Como resultado prvio obtm:

Transcorrido este tempo, transferir um nmero representativo de colnias tpicas, para caldo BHI (um tubo para cada colnia); Incubar a 35-37C/24 horas; Transcorrido o tempo, comprovar bioquimicamente, utilizando-se os testes: DNAse, coagulase (enumerao e confirmao de colnias tpicas de estafilococos), catalase.

Bibliografia consultada

AGNCIA

NACIONAL

DE

VIGILNCIA

SANITRIA arquivo

(ANVISA). em

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, 30/09/2003.

capturado

JAY, J.M. Microbiologa moderna de los alimentos. Ed. Acribia S.A.: Zaragoza. 3ed., 804p. MINISTRIO DA AGRICULTURA. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. I Mtodos microbiolgicos. Braslia, MA, 1981. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Alimentos EMBRAPA, MERCK, Braslia DF, 1995. Pesquise e responda 1) O que um microrganismo coagulase positiva? 2) Relacione os principais teste bioqumicos para a diferenciao de espcies bacterianas.

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6 Aula Prtica CONTAGEM DE Bacillus cereus EM ALIMENTOS Introduo O microrganismo Bacillus cereus o agente causador da doena gastroenterite que produz exoenterotoxina e seu modo de transmisso ocorre atravs da ingesto de

alimentos mantidos em temperatura ambiente por longo tempo, depois de cozidos, o que permite a multiplicao dos microrganismos. Surtos com vmitos predominantes so mais comumente associados ao arroz cozido que permaneceu em temperatura ambiente. Uma variedade de erros na manipulao de alimentos tem sido apontada como causa de surtos com diarria.
Os alimentos associados com este microrganismo so aqueles implicados em surtos tais como carnes, leite, vegetais e peixes. Os surtos por vmitos esto mais associados a produtos base de arroz; entretanto, outros produtos tm sido implicados em surtos como batatas, massas e queijos. Misturas com molhos, pudins, sopas, assados e saladas tm sido implicadas. Uma variedade de mtodos de anlise recomendada para a recuperao, identificao e confirmao do B. cereus em alimentos. Mais recentemente, um mtodo sorolgico foi desenvolvido para identificao da enterotoxina diarrica do B. cereus para alimentos suspeitos. Estudos recentes sugerem que a toxina do vmito pode ser detectada por modelos em animal (gatos, macacos) ou possivelmente por cultura de clulas. O perodo de incubao da doena de 8 a 16 horas e os sintomas so nuseas, espasmos abdominais, diarria aquosa, e s vezes vmitos. Nos perodos de incubao mais curtos a nusea e os vmitos predominam, semelhante intoxicao por S. aureus, com durao de um dia ou menos. Como medidas de controle tm-se procedimentos como resfriar alimentos rapidamente em pequenas pores, manter os alimentos em temperatura superior a 55C, reaquecer os alimentos em temperaturas de no mnimo 75C, praticar higiene pessoal e manipulao em condies sanitrias, e evitar sobras, principalmente, de arroz, milho e pur de legumes. Material Estufa bacteriolgica regulada a 301C; Basto de vidro em L ou ala de Drigalski; Placas de petri contendo gar base para Bacillus cereus suplementado com gema de ovo e polimixina B; Pipetas de 1 ou 2 mL; Tubos para diluio contendo 9 mL de gua peptonada;

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Copos homogeneizadores e frascos com 90 mL de gua peptonada para amostras slidas

Procedimentos Procedimentos Plaqueamento Spread Plate Inoculao Preparar trs diluies da amostra (10-1, 10-2 e 10-3); Semear em superfcie as duas ltimas diluies (colocar 0,1 mL de cada diluio na respectiva placa contendo o meio de cultura e espalhar com a ala de Drigalsky previamente flambada e esfriada). Incubao Incubar as placas invertidas em estufa a 30C durante 24 a 48 horas. Contar as placas contendo de 10 a 100 colnias. As colnias tpicas de B. cereus so esfricas, com bordas perfeitas, planas, secas e cerosas, rodeadas por um grande halo de precipitao devido reao com a gema de ovo. OBS: Multiplicar o resultado obtido por 10. Exemplo: diluio 10-2 = 12 colnias => 12 X 102 X 10 Contagem das colnias

Bibliografia consultada AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA).

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_01rdc.htm, arquivo capturado em 30/09/2003. JAY, J.M. Microbiologa moderna de los alimentos. Ed. Acribia S.A.: Zaragoza. 3ed., 804p MINISTRIO DA AGRICULTURA. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. ingredientes. I Mtodos microbiolgicos. Braslia, MA, 1981. SIQUEIRA, R.S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Alimentos EMBRAPA, MERCK, Braslia DF, 1995.

Pesquise e responda 1) Que forma latente a gnero Bacillus pode produzir? 2) Esquematize e explique as alteraes estruturais que ocorrem na clula bacteriana quando o microrganismo produz sua forma latente.

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7 Aula Prtica CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTOR Introduo Microrganismos anaerbios so organismos que toleram baixas concentraes ou nenhum oxignio livre e no o utilizam para obteno de energia. Durante anos as bactrias anaerbias foram cultivadas na camada profunda de um meio solidificado, pois podiam crescer no fundo desses tubos onde a camada de gar da superfcie exclui o oxignio atmosfrico. Posteriormente foram desenvolvidas tcnicas, como a adio de um agente redutor ao meio que remove o oxignio para produzir o que se chama de meio reduzido. O tioglicolato de sdio comumente utilizado como um agente redutor; que se combina quimicamente com o oxignio dissolvido em um meio e torna-o no disponvel para os microrganismos. Para o cultivo de bactrias anaerbias, o oxignio deve ser eliminado da atmosfera. Podem ser realizados cultivos em Tubos de gar em cama da alta; atravs de incubadoras chamadas Cmara de anaerobiose ou Glove box, onde a atmosfera dentro da cmara uma mistura de hidrognio, dixido de carbono e nitrognio; e tambm em meios inoculados em uma jarra de anaerobiose juntamente com um envelope que contm substncias qumicas que geram hidrognio e dixido de carbono propcio para o crescimento de anaerbios. Existem vrios meios de cultura para enumerao de C. perfringens em alimentos, sendo que o gar TSC (gar Triptose Sulfito Cicloserina) tem sido o mais utilizado no plaqueamento direto. Os clostrdios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro, produzindo colnias pretas. importante ressaltar que os meios de cultura utilizados nessa tcnica permitem o crescimento e produo de toxina de C. botulinum, devendo ser observados cuidados durante a execuo dos testes para garantir a segurana pessoal e do laboratrio. Material: Material: Diluente para amostras slidas: frascos com 90 mL de gua peptonada a 0,1%; Tubos de diluio com 9 mL de gua peptonada a 0,1%; Pipetas de 1 e 2 mL; Cmaras de anaerobiose e geradores de anaerobiose; Placas de Petri; gar TSC.

Procedimentos Procedimentos: Preparar duas diluies 10-1 e 10-2;

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Colocar 1 mL de cada diluio nas placas devidamente identificadas; Colocar o gar TSC e homogeneizar cuidadosamente; Esperar solidificar totalmente e cobrir com mais uma fina camada do gar TSC; Incubar as placas em anaerobiose a 37C por 18 a 20 horas; Contar as colnias; Selecionar colnias tpicas para realizao das provas bioqumicas; Repicar as colnias tpicas para o caldo tioglicolato, incubar a 37C por 24 horas.

Prova da fermentao da lactose e hidrlise da gelatina A partir do tubo contendo o caldo tioglicolato, inocular uma alada em um tubo contendo o meio lactose gelatina e incubar a 37C por 24 horas; Observar se houve viragem cida do indicador vermelho de fenol alterando a cor do meio para amarelo e se houve hidrlise da gelatina. OBS: as cepas de C. perfringens fermentam a lactose e hidrolisam a gelatina. Bibliografia consultada SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. alimentos Varela. So Paulo, 2001.

Pesquise e responda 1) Explique o modo de ao da toxina produzida por Clostridium. 2) Explique as caractersticas de um alimento enlatado deteriorado por Clostridium.

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8 Aula Prtica VERIFICAO DA PRESENA DE Salmonella A tcnica tradicional de deteco de Salmonella em alimentos um mtodo cultural clssico, desenvolvido com a finalidade de garantir sua deteco mesmo em situaes extremamente desfavorveis, como o caso de alimentos com uma microbiota competidora muito maior do que a populao de Salmonella; e/ou alimentos em que as clulas de

Salmonella se encontram em um nmero muito reduzido; e/ou alimentos em que as clulas

se encontrem injuriadas pelo processo de preservao, como a aplicao de calor, o congelamento e/ou secagem, por exemplo. A metodologia segue basicamente quatro etapas que podem ser aplicadas em qualquer tipo de alimento. PrPr-enriquecimento enriquecimento em caldo no seletivo Objetiva a recuperao de clulas injuriadas e conseguida pela incubao da amostra em condies no seletivas por pelo menos 18 horas. Homogeneizar 10 mL da amostra lquida com 90 mL de soluo de gua peptonada a 1%. No caso de amostra slida, pesar 10 g em copos autoclavados, juntar gua peptonada a 1% e utilizar o homogeneizador. Incubar a 35C por 24 horas.

Enriquecimento seletivo Objetiva inibir a multiplicao da microbiota acompanhante e promover a elevao preferencial do nmero de clulas de Salmonella, incubando-se a amostra pr-enriquecida em caldo seletivo por 18 a 24 horas. Recomenda-se a utilizao de dois meios de enriquecimento diferentes porque a resistncia de Salmonella aos agentes seletivos varia de cepa para cepa. Transferir 1 mL do caldo pr-enriquecido para 1 tubo contendo caldo tetrationato e 1 mL para um tubo contendo caldo selenito-cistina. Incubar a 41C por 24 horas, em banho-maria.

Plaqueamento seletivo diferencial Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colnias de Salmonella, com caractersticas tpicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmao bioqumica e sorolgica. Tambm nessa etapa recomenda-se a utilizao de mais de um tipo de meio de cultura para o plaqueamento.

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A partir dos caldos terationato e selenito-cistina, repicar para placas de gar bismutosulfito e gar Hectoen; Incubar a 35C por 24 horas; Verificar a presena de colnias tpicas: o o gar bismuto-sulfito: colnias marrons, cinzas ou negras, com brilho metlico. gar Hectoen: colnias transparentes, verde azuladas, com ou sem centro preto. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose podem apresentar-se de cor salmo e no transparentes.

Confirmao Objetiva verificar se as colnias tpicas obtidas nas placas so realmente colnias de

Salmonella, atravs de provas bioqumicas e sorolgicas.

Repicar as colnias tpicas em gar TSI (trplice acar ferro); Incubar por 24 horas a 35C; Reao tpica de Salmonella em TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo) com ou sem produo de H2S (escurecimento do gar).

Bibliografia consultada SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. Livraria Varela. So Paulo, 2001.

Pesquise Pesquise e responda

1) Quais os fatores intrnsecos e extrnsecos ideais para crescimento de Salmonella? 2) Qual a dose infectante e o perodo de incubao do microrganismo causador da salmonelose? 3) Como feito o diagnstico laboratorial em pacientes acometidos por Salmonella?