Lucrarea practic nr.

5 Biotehnologie Industrial

Evidenierea producerii de antibiotice. Metode de testare a spectrului antimicrobian

1. Generaliti Antibioza reprezint inter-relaia biologic ce se stabilete ntre dou tulpini de microorganisme aflate pe acelai habitat i const n producerea unor compui chimici (metabolii secundari) de ctre una dintre ele care va inhiba dezvoltarea sau va distruge pe cea de-a doua aflat n competiie pentru accesul la resursele nutritive din mediu. Primul antibiotic a fost descoperit n anii 40 de ctre Alexander Fleming penicilina i s-a dovedit a avea iniial aciune n distrugerea bacteriilor Gram (+). Tulpina productoare s-a dovedit a fi Penicillium notatum, a crei selecii de tulpini cu randamente mari de producie a permis obinerea pe cale biotehnologic a unor producii semnificative de antibiotic. Antibioticele pot fi produse de ctre: bacterii (gramicidina S, polimixina, bacitracina); Bacillus polymyxa; Bacillus colistinus; Bacillus licheniformis; Micromonospora purpurea.

actinomicete (streptomicina, actinomicina, neomicina, tetraciclinele); Streptomyces griseus; Streptomyces erythreus; Streptomyces aureofaciens.

fungi (penicilinele, cefalosporinele). Penicillium chrysogenum; Cephalosporium acremonium.

Din punct de vedere chimic, antibioticele pot fi: nuclee -lactamice, aminoglicozide, polipeptide ciclice, lactone macrociclice, chinone, nuclee aromatice etc. Efectul antibiotic se poate realiza prin mai multe mecanisme: inhibiia sintezei peretelui celular bacterian; distrugerea membranei celulare bacteriene i alterarea permeabilitii acesteia; inhibarea sintezei proteice bacteriene; inhibarea sintezei acizilor nucleici. Continua dezvoltare a produciei de antibiotice precum i apariia rezistenei la acestea impun dezvoltarea cercetrilor n vederea descoperirii de ali compui i a altor mecanisme de aciune antimicrobian. Selecia productorilor de antibiotice Se realizeaz prin aplicarea a dou metode: 1. 2. testarea unui singur microorganism presupus productor de antibiotice fa de mai multe microorganisme test; testarea mai multor microorganisme productoare fa de un singur microorganism test. Metoda 1. drept microorganism test se recomand culturi de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Sarcina lutea .a. n plci Petri sterile se repartizeaz mediul de cultur cu agar n care se inoculeaz productorul de antibiotice i microorganismul test. Dup termostatare pentru fiecare microorganism test se msoar mrimea zonei de inhibiie. Interpretarea rezultatelor: Microorganismul test nu crete n imediata apropiere a agentului productor dac acesta produce antibiotic activ. Diametrul zonei de inhibiie este cu att mai mare cu ct antibioticul este mai activ. Sensibilitatea microorganismului test la antibiotic se apreciaz astfel: foarte sensibil cnd = 20 30mm (-diametrul de inhibiie); sensibil cnd = 12 20mm; 2

puin sensibil cnd = 8 12mm; nesensibil cnd < 8mm.

Metoda 2. este folosit cnd se utilizeaz un singur microorganism test i mai muli productori de antibiotic. n mediul de cultur cu agar fluidificat i temperat se inoculeaz microorganismul test. Mediul se repartizeaz ntr-o plac Petri i dup solidificare se inoculeaz n punct celule aparinnd posibililor productori de antibiotice. Se determin raportul de inhibare ca raport dintre diametrul zonei de inhibare i diametrul coloniei.. Selecionm pe cele care au raportul cel mai mare. Un alt mod de a testa de data aceasta sensibilitatea microorganismului test la aciunea antibioticelor caz n care poart numele de antibiogram i este utilizat mai ales n sectorul medico-sanitar. Metoda const n aplicarea de discuri impregnate cu antibiotice diferite direct pe mediul solid agarizat inoculat cu microorganismul ce trebuie testat urmat de termostatare i la final msurarea diametrului de inhibiie a creterii tulpinii test n jurul microcomprimatului antibiotic. Cu ct diametrul este mai mare cu att microorganismul este mai sensibil la antibiotic. 2. Materiale necesare: Culturi: bacterii: Sarcina sp., Bacillus subtilis, Streptomyces sp. fungi: Penicillium expansum, Aspergillus repens, Asp.niger Medii de cultur: MMA must de mal agar, BCA bulion de carene agar 3. Materiale i aparatur: eprubete, plci Petri, ans, bec de gaz, termostat, rigl 4. Mod de lucru: Mediul de cultur cu agar este fluidificat i meninut la 35 400 C. Se recolteaz celule din cultura test (Sarcina sp., Bacillus subtilis) cu ajutorul ansei, care ulterior este trecut pe mediul fluidificat. Dup inoculare i uniformizare, coninutul eprubetei se repartizeaz pe o plac Petri. Dup solidificarea mediului cu agar, cu ajutorul unei anse cu firul drept se va inocula prin nepare cultura de testat cu posibila activitate antimicrobian (Streptomyce sp., Penicillium expansum, Aspergillus repens, Asp.niger). Se noteaz pe reversul plcii Petri cu ajutorul unui marker punctele de inocul i codul culturii.

5. Interpretarea rezultatelor: Dup finaliazarea perioadei de incubare la termostat (5 zile pentru fungi, 10 zile pentru streptomicete), culturile se inspecteaz privitor la apariia zonelor de inhibiie a creterii n jurul coloniilor aprute n punctele de inoculare prin nepare. Se msoar diametrul de inhibiie cu ajutorul unei rigle. Se evalueaz sensibilitatea microorganismului test la substana antibiotic, astfel: foarte sensibil cnd = 20 30mm (-diametrul de inhibiie); sensibil cnd = 12 20mm; puin sensibil cnd = 8 12mm; nesensibil cnd < 8mm.

Se calculeaz raportul de inhibare RI ca parametru de evaluare a activitii antimicrobiene. Datele se trec n urmtorul tabel: Cultura de bacterii test 1 2 Streptomyce sp Cod Penicillium expansum Cod Aspergillus repens Cod Aspergillus niger Cod Tulpina de testat compui antibiotici (raport de inhibare, RI)

Se determin raportul de inhibare RI dup relaia:

RI =
unde: RI raport de inhibare;

Di Dc

Di diametrul zonei de inhibare; Dc diametrul coloniei. 4