Lucrare practic nr.

1
Disciplin: Biotehnologii Industriale II

Particulariti privind obinerea culturilor starter, conceperea mediilor de cultur i alegerea sistemelor de cultivare n biotehnologie

Creterea i nmulirea celulelor procariote sau eucariote pe mediu artificial (in vitro) poart numele de cultur. n sens larg, cultura starter mai poart numele de inocul i reprezint catalizatorul care asigur declanarea i derularea proceselor fermentative. Succesul fiecrui bioproces depinde n mare msur de calitatea i cantitatea de inocul. Pentru alegerea unei culturi starter se ine cont de o serie de caracteristici pe care trebuie s le ndeplineasc acestea: culturile sarter trebuie s prezinte stabilitate metabolic; cultura starter trebuie s conin celule n stare activ i s fie pur; cultura starter nu trebuie s prezinte specii degenerate; tulpina din care este constituit cultura starter trebuie s prezinte rezisten fa de fagi (lizorezisten); innd cont de faptul c cultura starter are o utilitate direct n producia industrial este necesar s fie selecionate numai acele culturi capabile s creasc n instalaii industriale. Desfurarea n bune condiii a unui bioproces depinde de cantitatea i calitatea inoculului. Sursa cea mai important de microorganisme utilizate n industrie drept culturi starter pentru amorsarea diferitelor procese fermentative o reprezint tulpinile performante pstrate n coleciile de culturi. Aceste culturi din coleciile de microorganisme sunt culturi pure. Cultura pur reprezint cultura care rezult prin multiplicare dintr-o singur celul aflat pe un mediu adecvat ntr-un volum limitat.

Ea conine celule ce aparin unei singure specii sau unei singure tulpini. Exemplu de cultur pur este pe mediu solidificat colonia ce rezult dintr-o celul sau o unitate formatoare de colonii. Scopul izolrii culturilor pure const n obinerea de culturi individuale ce vor fi utilizate n scop de cercetare sau producie prin prelucrarea lor din microbiota mediilor naturale unde se afl sub form de populaii heterogene i trecerea n laborator sub form de culturi individuale. Mediile din care se face izolarea se aleg n funcie de cunotinele teoretice privind existena microorganismelor cutate n mediile respective, respectiv rezistena lor, proprietile lor fiziologice. Metodele de izolare pot fi: a. metoda izolrii n plci (Metoda Koch); b. metoda n striuri; c. metoda izolrii n picturi (Metoda Lindner). Metoda izolrii n plci (Metoda Koch) reprezint metoda de rspndire prin care celulele aflate n suspensie (ntr-un mediu lichid sau ser fiziologic) sunt rspndite n medii de cultur fluidificate i temperate la t = 420 C, mediu aflat n eprubete (trei eprubete). Coninutul eprubetelor se transfer n trei plci Petri sterile i dup omogenizare plcile se termostateaz corespunztor urmnd ca din placa n care s-au obinut colonii izolate s se fac studiul morfologic al acestora iar culturile care intereseaz s fie repicate n eprubete cu mediu nclinat obinndu-se astfel culturi pure.

Metoda n striuri sau metoda scarificat: n plci Petri sterile se repartizeaz mediu de cultur cu agar i dup solidificarea acestuia pe suprafaa lui se terge firul

sau ansa ncrcat cu celule recoltate din medii naturale. Drumul parcurs de fir sau de ans trebuie s fie ct mai sinuos nct s se asigure o rspndire a celulelor pe suprafaa mediului i n final s se asigure izolarea de culturi pure.

Conservarea i ntreinerea culturilor pure n laborator Dup izolarea culturilor pure, pstrarea acestora n laborator trebie s asigure urmtoarele: a) S se menin viabilitatea culturii; b) S se menin puritatea culturilor c) S se pstreze constante proprietile genetice ale tulpinilor izolate. Metodele de conservare urmresc ncetinirea reaciilor metabolice, adic meninerea culturilor ntr-o stare latent n care i ntre-in funciile vitale fr s se reproduc, prin ncetinirea reaciilor metabolice. 1. Repicarea periodic transferul periodic al culturilor de pe medii vechi pe medii proaspete, intervalul de transfer depinde de tipul microorganismului. Dezavantajul const n degenerarea culturii n timp i timp de lucru imens. 2. Reducerea temperaturii prin refrigerare i congelare. Aceste dou metode se aplic n funcie de natura microorganismului. Regimul de temperatur i timpul de pstrare depind de tipul microorganismului.

3.

Privarea de oxigen reduc accesibilitatea oxigenului la celule. Dopul de vat de la gura eprubetei este nlocuit cu dop de cauciuc, sau dopul de vat se acoper cu tifon mbibat n parafin (parafinarea dopului de vat) sau pstrarea culturilor sub ulei de parafin steril. Prin aceast metod se pstreaz bine culturile de mucegai, actinomicete chiar i drojdii.

4.

Reducerea umiditii se poate face prin uscare controlat sau natural, liofilizare, pstrarea pe nisip steril. n timp ce apa se evapor bacetriile rmn fixate pe granulele de nisip.

n laboratoare culturile se pstreaz n colecii de microorganisme, colecii care pot fi organizate la nivel de laborator, la nivel de instituie, la nivel naional sau internaional. Pentru a evideniona i seleciona microorganisme cu performane fermentative superioare se supun unor tehnici de screening calitativ. Acesta reprezint prima etap n preselecia tulpinilor izolate i permite n primul rnd evidenierea tulpinilor active.Metoda aleas trebuie s fie o metod simpl de cultivare, s nu presupun un volum mare de munc, s asigure un rspuns rapid i promt. De obicei, screeningul calitativ se realizeaz pe medii de cultur cu agar sau medii lichide i se pune n eviden unul din parametri: creterea colonial (diametrul coloniei, viteza de cretere etc.); viteza de consum a substratului; viteza de formare a produsului de fermentaie; Culturile selecionate n aceast etap urmeaz a fi triate pentru a evidenia cele mai performante tulpini prin aplicarea tehnicilor de screening cantitativ. Practic se vor evidenia tulpinile productoare de: enzime (amilolitice, proteolitice); antibiotice;

 cu proprietatea de a fermenta anaerob maltoza. Selecia productorilor de amilaze Se utilizeaz un mediu de cultur ce conine surse de azot, minerale, agar i 1% amidon ca unic surs de carbon. Mediul se repartizeaz n plci Petri iar dup solidificare pe suprafaza lui se inoculeaz n punct culturile de testat. Dup termostatarea corespunztoare, se inund suprafaa mediului cu Soluie Lugol 0,1 n i se apreciaz potenialul de biosintez astfel: se msoar diametrul coloniei Dc i diametrul zonei de amiloliz Dza (zona clar ce se formeaz n jurul coloniilor active ca urmare a hidrolizei amidonului comparativ cu restul mediului colorat n albastru). Se determin raportul de amiloliz:

Ra =

Dza Dc
amiloliz

Cele mai active tulpini vor fi cele care cresc puin i au o zon de mare. Mediul general recomandat este urmtorul: bacterii. Evidenierea productorilor de proteaze Pepton...........1 g KH2PO4..........0,5 g Amidon...........1 g Agar................1,5 g Ap distilat....100 ml.

PH-ul se corecteaz la 4,5 5,5 pentru drojdii i mucegaiuri i 7 pentru

Intereseaz proteazele care au ca substrat cazeina i proteazele care lichefiaz gelatina. Se prepar mediul de baz alctuit din: Pepton........................8 g Extract de drojdie........3 g Gelatin.....................12 g Ap distilat.............100 g

Mediul se repartizeaz n eprubete mici sub forma unor tuburi de gelatin. Din cultura de testat se inoculeaz central (prin nepare) tubul de gelatin. Probele se menin la 200C i selecia se va face funcie de capacitatea microorganismului de a lichefia gelatina, astfel:

+++ +++-

lichefiere total; lichefiere 1/2 din tub; lichefiere 1/3 din tub; lichefiere la suprafaa mediului; lips lichefiere.

Dac cultivarea microorganismelor impune o temperatur mai mare de 300C atunci nainte de analiza probele se menin cteva ore la frigider. Evidenierea drojdiilor fermentative Selecia se poate face pentru a diferenia drojdiile care au capacitatea de a fermenta glucidele n anaerobioz de cele care nu au aceast proprietate. Produii finali ai fermentaiei glucidelor simple sunt alcoolul etilic, CO2, i H2. Prin inocularea drojdiilor n mediu lichid aflat n eprubete cu tub Durham i termostatare corespunztoare la probele pozitive se va observa o tulburare a mediului i o acumulare de gaze n acest tub. Dac se pleac de la aceeai concentraie de celule cu care s-a inoculat mediul iniial se poate face i o apreciere semicantitativ prin msurarea volumului de gaze acumulat n tubul Durham. Aprecierea se poate face astfel: + + + tub Durham plin cu gaze deci cu proprieti fermentative superioare; +++---gaze pe 1 / 2 din nlimea tubului Durham- putere fermentativ medie; gaze pe 1 / 3 din nlimea tubului Durham- putere fermentativ slab; absent capacitatea de a fermenta anaerob glucidele.

Un mediu de cultur reprezint amestecuri de substarturi care asigur microorganismului sursa de hran i energie. n compoziia mediilor de cultur ntr o surs de carbon care poate fi un glucid sau un poliglucid (amidon, celuloz etc.) n cazul n care microorganismul dispune de un echipament enzimatic bogat. Tot ca surs de carbon se poate folosi un acid sau un alcool. Apoi este obligatoriu ca mediul de cultur s conin o surs de azot care n funcie de microorganism poate fi din surs de natur anorganic sau organic. n cazul surselor de azot organic ca i la glucide pot fi folosite substane mai simple sau mai complexe: aminoacizi, peptide, proteine. O alt component a mediului de cultur este sursa de sruri minerale cum sunt fosfaii, azotaii, sulfai ai diverselor elemente. Mediul de cultur trebuie s conin Ca, Mg, K, Na.

Drept surs de factori de cretere sunt folosite vitaminele sau alte substane care asigur dezvolatrea microorganismului. Dup starea de agregare mediile du cultur pot fi:

medii lichide; medii solide; medii solidificate. medii naturale; medii sintetice. medii de cultur de laborator; medii de cultur industriale.

Dup natura substanelor care intr n compoziia mediului de cultur:

Dup locul unde sunt utilizate aceste medii de cultur avem:

n biotehnologie se utilizeaz n mod curent mediile naturale avnd la baz subproduse agroalimentare: rot de floarea soarelui, de soia, fin de porumb, tre de gru, extract de porumb. Aceste medii conin, n general, elemente nutritive care sunt imperios necesare dezvoltrii i reproducerii microorganismelor la care se adaug o anumit cantitate de sruri minerale. Compoziia mediului nutritiv ce se va utiliza pentru un anume microorganism se determin n laborator prin variaia cantitativa i calitativ a componenilor lui n final obinndu-se mediul optim de cultivare. Scopul oricrui bioproces este influenat pe lng productor i de condiiile optime de desfurare a fermentaiei i de tipul de cultur ales. Alegerea procedeului de cultivare va depinde de proprietile morfologice i fiziologice ale agentului utilizat ca productor precum i de metabolitul ce se dorete s se obin i de cile de biosintez. 1. Culturi statice (staionare) de suprafa n funcie de mediul de cultur pot fi: pe mediul lichid mucegaiuri n vase Roux. n vasul Roux stratul de mediu are nlime mic, mucegaiul se dezvolt la suprafa formnd o derm groas care n timp se cuteaz pentru a mri suprafaa de contact cu mediul de cultur. n aceste culturi mucegaiurile pot sporula;. bacteriile acetice n vase Fernbach;

 drojdiile peliculare (oxidative) sunt drojdii care oxideaz substratul n prezena oxigenului, se dezvolt la suprafaa mediului formnd un voal subire; drojdiile pentru fermentaia anaerob a glucidelor simple (vasele sunt vase Erlenmayer sau vase rotunde cu fundul plat, vase n care stratul de mediu are nlime mare pentru a asigura condiii de anaerobioz). medii semisolide pe care au loc fermentaiile n sistem SSF (Solid State Fermentation). Este un tip de fermentaie care s-a dezvoltat recent pentru biosinteza de enzime, pigmeni, proteine. Vasele de cultur sunt plcile Petri; pe medii dense (solide sau solidificate). Se fac culturi n eprubete pentru culturi pure, pentru inocul sporifer, pentru culturi stoc, culturi n plci Petri pentru evaluarea creterii celulelor prin metode culturale, de asemeni pentru izolarea culturilor pure, analiza microbiotei (calitativ) a anumitor produse. 2. Culturi submerse Sunt culturi n care celulele sunt n contact direct cu ntreg volumul de cultur, cultivarea avnd loc n condiii controlate de agitare i aerare. n laborator avem: culturi pe agitator cultivarea se face pe mediul lichid n vase Erlenmayer. Trebuie s existe un raport ntre volumul vasului i volumul de mediu. De exemplu, la un vas de 500 cmc se adaug max. 150 ml mediu; culturi n bioreactor (SmF Submersible Fermentation) cnd agitarea se face cu sistem de agitare.