IMOBILIZAREA BIOCATALIZATORILOR

- Celule - Enzime

SUSPENSII CELULARE

BIOCATALIZATORI NATIVI/NATURALI

CELULE - Viabile - Uscate ENZIME - Liofilizate - Solutii

purificate partial purificate

BIOCATALIZATORI IMOBILIZATI SOLUTII AMESTECURI ETEROGENE

FAZA SOLIDA: BIOCATALIZATORUL IMOBILIZAT

FAZA LICHIDA: AMESTECUL DE COMPUSI

Avantajele biocatalizatorilor imobilizati

Posibilitatea recuperarii/recircularii Simplificarea etapelor de izolare/purificare a produsului util Cresterea stabilitatii (mecanice, termice, operationale) a biocatalizatorului Posibilitatea realizarii procesului in regim continuu, deci capacitati de productie superioara

Metode de imobilizare

Istoric
1. 2. faza iniial (1916-1940): adsorbia invertazei pe oxid de aluminiu i pe crbune activat faza subdezvoltat (1950): legarea fizic, nespecific a unor enzime prin adsorbie pe crbune, bentonit sau argile si prin legturi ionice specifice pe suporturi de fosfoceluloz respectiv includerea unei enzime ntr-o matrice formata prin tehnica solgel faza n curs de dezvoltare (1960): perfecionarea tehnicilor de imobilizare noncovalent, precum adsorbia i includerea si a biocatalizatorilor reticulati cu glutaraldehid faza dezvoltat (anii 1970): perfecionarea tehnicilor precedente faza post-dezvoltare (anii 1980): dezvoltarea tehnologiilor cu enzime imobilizate a fost accelerat de creterea cererii de compui bioactivi n form enantiopur faza de proiectare raional a preparatelor imobilizate (dup 1990): preparate reticulate, coimobilizate, modificari/functionalizari specifice ale suporturilor anterior utilizate

3.

4. 5.

6.

Forme ale preparatelor imobilizate

a) imobilizate n mas: o mas omogen macroscopic, care ia forma vasului n care s-a realizat imobilizarea; pierderi de presiune la trecerea soluiei b) imobilizate sub form de bile: - bile poroase sau compacte - pierderi minime de presiune

A. METODE DE LEGARE PE SUPORT

- CEA MAI VECHE METODA DE IMOBILIZARE - BIOCATALIZATORUL SE LEAGA DE UN SUPORT SOLID PRIN LEGATURI: - FIZICE/ADSORBTIE - IONICE - COVALENTE - ACTIVITATEA DEPINDE DE - SUPORT - Dimensiunea particulelor - Suprafata specifica - Compozitia chimica - Raportul intre gruparile hidrofobe/hidrofile - ENZIMA - TIPUL DE LEGATURI IMPLICATE IN LEGARE

ataarea de un suport insolubil care va dobndi astfel funcii catalitice. Tria legturii afecteaz stabilitatea operaional a preparatului imobilizat, dar i activitatea sa.

SUPORTURI
CONDITII: - s fie inert chimic i biochimic - Zonele de legare a biocatalizatorului trebuie s aib o densitate superficial i o suprafa volumetric ct mai mare. Forma fizic a suporturilor : filme, fibre, suprafee plane, sfere etc.

Suporturile organice: - naturale: celuloz, agaroz, alginat, chitosan, dextran, gelatin - Sintetice: polimeri sau copolimeri ce conin poliacrilamid, polimetacrilamid, poliacetat de vinil, polistiren, poliamide, etc
Suporturi anorganice: - sticla cu pori controlai (CPG controlled glass pores), - silicagel, - Alumina - Carbune activ

1. IMOBILIZAREA PRIN ADSORBTIE FIZICA

1. SE APLICA DOAR ENZIMELOR, proteine solubile care se fixeaza prin legaturi slabe pe suprafata suporturilor solide/insolubile in apa 2. Legaturi slabe (H, van der Waals): modificari conformationale minime ale enzimei, deci pastrarea activitatii acesteia 3. Simpla si ieftina daca se utilizeaza suportul adecvat 4. Dezavantaje: - legarea slaba duce la desorbtia enzimei in timpul procesului si dificultati de separare ale acesteia - Intensitatea legarii depinde de pH, tarie ionica, temperatura - Legarea nu este specifica: pot fi adsorbite si alte proteine prezente in solutie 5. Avantaje: nu sunt necesari reactivi suplimentari/ numar mic de etape de activare prealabila 6. SUPORTURI: compusi naturali anorganici (alumina, silicati, C activ, sticla, etc) si organici (chitozan, acrilamida, celuloza, amidon, etc)

Exemplu: adsorbtia invertazei

Suport

% legat la

DEAESephadex (SDI anionic)

CM-Sephadex (SDI cationic)

pH 2.5
pH 4.7 pH 7.0

0
100 100

100
75 34

2. LEGAREA IONICA PE SUPORT

- Suporturi insolubile in apa care contin grupari ionice (polimeri naturali si sintetici functionalizati) - polizaharide functionalizate: celuloza, chitozan, amidon, kieselgur - polistiren - Legaturile ionice formate determina modificari ale conformatiei enzimei, deci si ale situsului activ al acesteia, ceea ce determina scaderea activitatii enzimatice - Pierderile enzimei apar doar la variatii mari ale pH-ului sau tariei ionice - Legaturile cu suportul: LEGATURI IONICE, mult mai puternice decat la adsorbtia fizica: - Grupari functionale de pe suprafata biocatalizatorului Cat+ sau An- Grupari functionale ale suportului: An- sau Cat+

BIOCATALIZATOR An- Cat+ SUPORT

3. LEGAREA COVALENTA PE SUPORT

Cea mai utilizata metoda de imobilizare a enzimelor Se pot utiliza gruparile functionale neimplicate in mecanismul de actiune enzimatica Avantaje: - Legatura cea mai puternica, deci pierderi minime, activitate constanta, productivitate stabila - Legarea la suprafata suportului permite si interactia cu molecule mari ale substratului

Dezavantaje 1. Pot sa apara reduceri semnificative ale activitatii 2. Este necesara optimizarea conditiilor de realizare a imobilizarii
Pentru evitarea interaciunii cu suportul, se poate intercala ntre biocatalizator i suport, un aa-numit bra de distanare (spacer arm) de lungime optima

Atasarea covalenta a enzimei la suport

1 enzima ataat fr spacer arm ; interaciuni puternice ntre suport, pe de o parte i substrat i enzim, pe de alt parte. 2 enzima ataat printr-un spacer arm scurt. ntre suport i substrat sau enzim pot avea loc interaciuni care deranjeaz activitatea principal a enzimei. 3 enzima ataat printr-un spacer arm de lungime optim. 4 enzima ataat printr-un spacer arm de lungime prea mare. Datorit mobilitii spacer arm-ului enzima poate veni n vecintatea suportului, cu care poate interaciona. La fel i substratul n curs de interaciune cu enzima. 5. spacer arm-ul ataat la distan maxim de situsul catalitic; activitate enzimatic maxim. 6. punctul de ataare al spacer arm-ului apropiat de situsul catalitic; posibil afectare a activitii enzimatice. 7 - ataarea se face n situsul catalitic. Legtura cu substratul este imposibil.

Grupari utilizate la legarea covalenta pe suport a biocatalizatorilor

Aminoacizii cu grupari polare si reactive, situati la suprafata exterioara a moleculei proteice dizolvate in apa
Abundenta (%)
7.0 3.4 3.4
+ NH3 Lysine (Lys)

CH2

CH2 SH
CH2
OH

Cysteine (Cys)
Tyrosine (Tyr)

HN
CH2 O
CH2 C O

Histidine (His)

2.2 4.8

Aspartic Acid (Asp)

O CH2 CH2 C O
CH2
3

Glutamic Acid (Glu)

4.8
3.8

NH C NH2 Arginine (Arg) +NH2

CH2
N H

Tryptophan (Trp)

1.2

Tehnici de atasare covalenta

Activarea cu bromcian a gruparilor OH din structura suportului (polizaharide, bile de sticla) cu formarea imidocarbonatului reactiv:

Activarea cu cloroformiat a gruparilor OH din structura suportului cu formarea carbonatilor ciclici:

Activarea sticlei cu 3-aminopropiltrietoxisilan

Activarea gruparilor amino ale suportului (poliamide) prin diazotare:

Activarea gruparilor carboxil sau amino pentru reactii de condensare cu formare de lagaturi peptidice

B. METODE DE RETICULARE
Se realizeaza in prezenta sau absenta suportului. Prin reticularea enzimei, aceasta devine insolubila in apa. Reticularea se poate face si in amestec cu un suport. Prin reticularea celulelor, suspensia devine solida. Sunt necesari reactivi bifunctionali si grupari reactive adecvate. Activitatea scade foarte mult Stabilitatea creste foarte mult

Glutaraldehida

Diizocianati

Reducerea drastica a activitatii daca sunt implicate grupari functionale ale aminoacizilor implicati in actul catalitic

C. METODE DE INCLUDERE IN SUPORT

microcapsule retele Enzima este localizata (fizic) in interiorul matricii unui gel polimeric (retea sau membrana), care permite accesul substratului fara a modifica enzima. Exemplu: poliuretani obtinuti prin policondensare in prezenta enzimei

Particule Membrane Tuburi Fibre

Imobilizarea celulelor si enzimelor in gel de alginat

Aplicaii industriale ale enzimelor imobilizate

1. Separarea DL-aminoacizilor aminoacilaza L-specific din Aspergillus oryzae (E.C. 3.5.1.4.) Procesul Tanabe: aminoacilaza imobilizat DEAE-Shepadex n proces continuu. Degusa, pe de alt parte, utilizeaz acilaz liber ntr-un bioreactor membran. 2. Tratarea laptelui - prepararea brnzeturilor cu renina microbiana imobilizata in proces continuu - stabilizarea enzimatic laptelui: tratarea laptelui cu tripsin imobilizat, fara modificari ale gustului sau oxidari timp de 2-3 saptamani - extracia lactozei din zer cu lactaza imobilizata pentru valorificarea integrala a laptelui 3. Epurarea apelor industriale cu celule imobilizate: eliminarea ionilor metalici, inclusiv metale grele din apele industriale

Bioreactorul cu amestecare

Este foarte simplu i uor de utilizat Poate fi folosit pentru o gam larg de procese: solutii sau suspensii celulare Enzima se adaug fie n form solubil n amestecul de reacie, fie n stare imobilizat, dispersat n amestec; o al variant o reprezint introducerea enzimei imobilizate n dispozitive speciale, fixate pe amestector, caz n care rezistena la transferul de mas scade. Poate fi utilizat atunci cnd apare inhibarea enzimei de ctre substrat, prin utilizarea unor soluii diluate de substrat adugate continuu Dezavantajul major al acestui tip de reactor este necesitatea golirii sale la sfritul procesului, ceea ce conduce la timpi mori i determin scderea productivitii reactorului.

Bioreactorul continuu cu amestecare perfect

Reactorul se utilizeaz pentru concentraii reduse ale substratului. Permite avantajul major al controlrii facile i eficiente a pH-ului i temperaturii.

Bioreactorul cu strat fix

Ca urmare a circulaiei ascendente n coloan, enzima situat la baza coloanei este expus unor concentraii mai mari de substrat, n timp ce enzima situat la partea superioar este n contact cu o soluie concentrat n produs. Din aceste motive, reactorul nu este recomandat pentru efectuarea reaciilor n care apare inhibiia de substrat a enzimei. Problema major a reactorului o constituie meninerea constant a debitelor i temperaturii.

Bioreactoarul n strat fluidizat

Au un comportament intermediar ntre reactorul cu strat fix i cel continuu cu amestecare. Caracteristica sa este fluidizarea catalizatorului solid, prin alimentarea reactorului cu substratul pe la baz.

Sunt utilizate n special n reacii care utilizeaz sau conduc la formarea unui gaz. Principalul dezavantaj al reactorului sunt dificultile legate de transpunerea la scar mai mare (scale-up), motiv pentru care este utilizat n special pentru cantiti mici de produse foarte valoroase.

Bioreactoare cu membran
Conin o membran ce ncorporeaz n structura sa enzima, de obicei sub form de fibre (hollow fibres) cu diametru de circa 0.2 mm . Aceste tipuri de reactoare pot fi operate fie in varianta cu amestecare, fie n cea cu deplasare

Avantajul principal al acetui tip de utilaj este exploatarea lui foarte facil i faptul c nu implic imobilizarea suplimentar a enzimei. Se utilizeaz la scar mic, n special n procese ce implic sisteme multienzimatice, cum ar fi de exemplu cele care necesit regenerarea cofactorilor. Dezavantajul este preul ridicat al membranei.