Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan

bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk : 1. 2. 3. 4. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan : 1. 2. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. 3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acidfast(tahan asam) untuk genus Mycobacterium.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium

diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan

apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu :

A. PEWARNAAN SEDERHANA
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri bakteri. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

Prinsip

Preparat bakteri akan menyerap zat warna yang digunakan. Pengamatan mikroskopik 100X (objektif) akan teramati bentuk dan susunan bakteri.

Prosedur Kerja
1. 2.

Preparat yang telah difiksasi, diletakkan pada rak pewarnaan. Preparat lalu ditetesi dengan Karbol Gentian Violet. Lalu didiamkan selama 2-3 menit.

3. 4. 5.

Cat dibuang, lalu preparat dibilas dengan air mengalir. Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan mengering sendiri. Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop 100X (objektif).

Contoh Bakteri pada Pewarnaan Sederhana : Staphylococcus aureus

B. PEWARNAAN NEGATIF
Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak langsung. Kita hanya mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengambil zat-zat warna. Pada negatif staining pada umumnya tidak dilakukan fiksasi, maka praktis bakteri tidak mengalami perubahan-perubahan, tidak mengerut. Dengan demikian pewarnaan negatif berguna untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk pengukuran-pengukuran bakteri. Pada pewarnaan bakteri ini sel-sel kuman kelihatan transparan (terang jernih) sedangkan latar belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina).

Prinsip

Zat warna akan diserap oleh latar belakang dari bakteri sehingga latar belakang berwarna gelap sedangkan sel-sel bakteri tidak mengambil zat warna dan kelihatan tidak berwarna (transparan). Pengamatan mikroskopik 100X (objektif) akan teramati bentuk, susunan dan ukuran bakteri.

Prosedur Kerja

1. Pada pinggir sebelah kanan objek gelas yang bersih, diteteskan 1 tetes tintacina. 2. Disamping tetesan tinta-cina tersebut, diteteskan 1 tetes bahan yang diperiksa. 3. Dengan objek gelas yang lain, campuran itu diratakan pada objek gelas hingga merupakan lapisan tipis dengan jalan seperti membuat preparat hapus pada pemeriksaan malaria. 4. Keringkan pada suhu kamar. 5. Kemudian dilihat dengan mikroskop. Dengan pewarnaan ini latar belakang preparat kelihatan agak gelap dan abu-abu, sedangkan spirochaetanya sendiri tidak mengambil zat warna dan kelihatan tidak berwarna (transparan), berkilat putih. Contoh Bakteri pada Pewarnaan Negatif :

C. PEWARNAAN DIFERENSIAL
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan warna utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Prinsip

Preparat bakteri akan menyerap zat warna berdasarkan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif akan menyerap zat warna ungu (Karbol Gentian Violet), sedangkan bakteri gram negatif akan menyerap zat warna merah (Air Fuksin).

Prosedur Kerja
1.

Preparat yang telah difiksasi diletakkan pada rak pewarnaan.

2. 3. 4.

Preparat ditetesi Karbol Gentian Violet, didiamkan selama 2-3 menit. Lalu dibilas dengan air mengalir. Preparat ditetesi lagi dengan Lugol, didiamkan selama 45-60 detik sebagai penguat.

5. 6.

Lalu Lugol dibuang. Kemudian ditambahkan Etanol 70 % , didiamkan selama 1 menit sebagai pambilas dari Lugol.

7. 8. 9.

Ditetesi lagi dengan Air Fuksin, didiamkan selama 2-3 menit. Lalu dibilas dengan air mengalir. Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan mengering sendiri.

10. Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop 100X (objektif).

Contoh Bakteri Gram Posittif :

Contoh Bakteri Gram Negatif :

Pewarnaan BTA (Basil Tahan Asam)

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu

dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

Metode

1) Ziehl-Neesen

Prinsip :
Pemanasan lampu spiritus akan membuka lapisan lilin (pori-pori) BTA sehingga Karbol Fuksin dapat terserap sehingga berwarna merah. Bakteri selain BTA akan menyerap Menthilen Blue dan berwarna biru.

Prosedur Kerja

1. Dibuat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi hingga pijar. 2. Sediaan ditetesi dengan Karbol Fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan diatas api kecil sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit. 3. Sediaan dibilas dengan air mengalir. 4. Sediaan lalu ditetsi dengan HCl 3 %, selama 1 menit. 5. Lalu dibilas dengan air mengalir. 6. Sediaan lalu ditetesi dengan Menthilen Blue hingga tergenang, didiamkan selama 2-3 menit. 7. Lalu dibilas dengan air mengalir. 8. Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan mengering sendiri.

9. Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop 100X (objektif).

2) Kinyoun Gabbet

Prinsip :
Pemanasan lampu spiritus akan membuka lapisan lilin (pori-pori) BTA sehingga larutan Kinyoun dapat terserap sehingga berwarna merah. Bakteri selain BTA akan menyerap Larutan Gabbet dan berwarna biru.

Prosedur Kerja

1. Dibuat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi hingga pijar. 2. Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3-5 menit. 3. Lalu dibilas dengan air mengalir 4. Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit 5. Lalu dibilas dengan air mengalir 6. Preparat diletakkan dengan posisi vertikal dan dibiarkan mengering sendiri. 7. Setelah kering, preparat diamati dibawah Mikroskop 100X (objektif). Bakteri Tahan Asam (Merah) Dan Bakteri Tidak Tahan Asam (Biru)

D. PEWARNAAN STRUKTURAL
Pewarnaan Flagella Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

Metode
1) Gry

Larutan-larutan yang diperlukan :

Kalium aluin 10% dalam air : 5 ml. Sublimat 20% dalam air : 2 ml.

Asam tanine 20% dalam air : 2 ml. Basic-fuchsin 3% dalam : 0,1 ml.

Prosedur Kerja

1. Di dalam sebuah tabung reaksi dibuatlah suspensi kuman dari tanaman (lebih baik diambil dari media zwerm agar yaitu media untuk bulu cambuk), 1 ose penuh disuspensikan dengan 1 ml air garam faal steril. 2. Simpan dalam inkubator 37C selama 2 jam (lebih). 3. Satu ose dari suspensi ini diapuskan di atas objek gelas yang bersih, keringkan dan fiksasi di atas api 3x. 4. Pulas dengan larutan pewarnaan Gray : 10 detik. 5. Cuci bersih dengan aquadest, kemudian dipulas dengan larutan carbolfuchsin selama 10 detik. 6. Cuci dengan aquadest, keringkan dengan kertas saring atau pada suhu kamar.
7. Lihat dengan mikroskop

Interpretasi Hasil :

Flagella (bulu cambuk) berwarna : merah jambu.

2) Leifson (Leifson : J. Bact, 20: 203, 1930) Larutan pulas Leifson, terdiri dari

Basic fuchsin NaCl Asam tanine

: 1 gram. : 1 gram. : 2 gram.

Ketiga zat ini dicampur baik-baik, kemudian 1,7 gram campuran dilarutkan dalam 35 ml alkohol 95% + 65 ml aquadest. Larutan pulas ini disimpan beberapa minggu dalam botol bertutup rapat, baru dipakai.

Prosedur Kerja :
1. Sediakan suspensi bakteri dalam air sampai sedikit keruh, yang diambil

dari tanaman agar atau sediment dari bouillon. 2. Satu tetes dari suspensi diteteskan pada objek gelas sedemikian rupa sehinggga tetesan mengalir pada objek. 3. Keringkan (biarkan) kering pada suhu kamar, kemudian bubuhi larutan pulas, biarkan 10 menit. 4. Cuci dengan air, bubuhi dengan borax-methylen biru yang encer (1,0 g borax + 0,1 g methylen biru dalam 100 ml aquadest), biarkan 5-10 menit. 5. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring, lihat dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Flagella Badan bakteri : merah jambu : agak kebiru-biruan

Pewarnaan Kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

Metode
1) Hiss

: :

Prosedur Kerja

1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari lemak. 2. Buat sediaan dari biakan yang ada secara aseptik. 3. Preparat tersebut dikering uadarakan. 4. Lakukan fiksasi di atas lampu spirtus. 5. Letakkan preparat smear pada rak pengecatan lalu tetesi dengan 2-3 tets basic fuchin dan lalu dipanaskan di atas nyala lampu spirtus sampai timbul uap, jaga jangan sampai mendidih atau menjadi kering, lalu dinginkan. 6. Cuci dengan larutan CuSO4 .5H2O 20%. 7. Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap air yang tersisa pada permukaan preparat dengan kertas serap. 8. Amati preparat dengan perbesaran kuat (pakai minyak

imersi)menggunakan mikroskop.

Interpretasi Hasil

Sel vegetative : ungu merah tua Kapsul : biru pucat.

2) Buri

Prosedur Kerja

1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari lemak. 2. Buat pengecatan negatif dari bikan yang tersedia. 3. Tetesi dengan cat blue metilen atau kristal violet selama 2 menit. 4. Cuci dengan air mengalir dan tiriskan. 5. Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap dengan kertas serap. 6. Amatai preparat dengan perbesaran kuat (memakai minyak imersi).

Interpretasi Hasil :
Sel Kapsul Background : biru/ungu : transparan : hitam

Pewarnaan Spora Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .

Prinsip

Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan berwarna merah.

Metode
1) KLEIN

: :

Prosedur kerja

1. 1 ml suspensi bakteri yang umurnya 24 jam dalam bouillon atau suspensi kuman yang dibUAT dari tanaman pada agar-miring yang telah berumur 48 jam, dicampur dengan Carbolfuchsin Ziehl Neelsen yang sama banyaknya di dalam tabung reaksi. 2. Campuran ini dimasak (direndam) pada penangas air 80C kira-kira 10 menit, gunanya untuk membunuh bakteri-bakteri yang tidak membentuk spora. 3. Satu ose dari campuran dibuat sediaan pada satu objek gelas yang bersih dan bebas dari lemak, keringkan dan fiksasi 3x di atas api Bunsen. 4. Celupkan dalam Asam Sulfat 1% selama 1-2 detik. 5. Cuci dengan air kran dan diwarnai dengan Methylen Blue 1%, kira-kira selama 2-3 menit. 6. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.

Intarpretasi Hasil :
Spora Bakteri : berwarna merah : berwarna biru

2) MULLER

Prosedur Kerja

1. Buat sediaan dari biakan kuman yang umurnya 2 hari dalam bouillon (dari agar miring), sesudah dilidah apikan (rekatkan) 3x, tetesi dengan Chloroform selama 2 detik. 2. Cuci dengan air, tetesi dengan Asam Chromat 5% selama 2 detik. 3. Cuci dengan air kran, bubuhi dengan Carbol fuchsin Z. Neelsen, uapkan (jangan mendidih) biarkan menguap selama 5 menit. 4. Cuci dengan Asam Asetat 5%, kemudian dengan air. 5. Bubuhi dengan Methylen Blue 1% kira-kira 2 detik. 6. Methylen Blue dibuang dan keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah.

Bakteri : berwarna biru.

3) FLEMING

Prosedur kerja

1. Buat sediaan, keringkan, kemudian fiksasi 3x di atas api Bunsen. 2. Warnai dengan Carbol-Fuchsin Z. Neelsen, panaskan sampai menguap dan biarkan menguap selama 5 menit. 3. Cuci dengan air kran sampai warna Fuchsin tidak luntur lagi, bubuhi Natrium-sulfit 5% selama 20-30 detik. 4. Cuci dengan air, tetesi dengan larutan Methylen Blue 1% (dengan larutan Nigrosin 10%), kemudian apuskan di atas objek gelas. 5. Keringkan pada temperatur kamar dan lihat dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah

Bakteri

: berwarna biru

4)

SCHAEFFER DAN FULTON

Prosedur Kerja

1. Buat sediaan dari suspensi kuman yang akan diperiksa, keringkan, kemudian fiksasi di atas api 3x. 2. Tetesi dengan larutan Malachiet hijau 5%, uapkan perlahan-lahan, biarkan menguap 1 menit. 3. Cuci dengan air kran, kemudian bubuhi dengan larutan Safranin 0,5% selama 1 menit. 4. Cuci lagi dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna hijau

Bakteri : berwarna merah