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RODRIGUES OLIVEIRA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS UFMG INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS ICEx DEPARTAMENTO DE QUMICA DQ
DISSERTAO DE MESTRADO
SNTESE, ESTUDOS DE RELAES ESTRUTURA-ATIVIDADE E DA ATIVIDADE ANTIFNGICA DE NOVOS AGENTES QUIMIOTERPICOS PARA TRATAMENTO DE DOENAS INFECCIOSAS EMERGENTES
ORIENTADOR: PROF. Dr. CLAUDIO LUIS DONNICI Co-orientador: Prof. Dr. Ado Aparecido Sabino BELO HORIZONTE JULHO de 2008
SNTESE, ESTUDOS DE RELAES ESTRUTURA-ATIVIDADE E DA ATIVIDADE ANTIFNGICA DE NOVOS AGENTES QUIMIOTERPICOS PARA TRATAMENTO DE DOENAS INFECCIOSAS EMERGENTES
Dissertao apresentada ao Departamento de Qumica do Instituto de Cincias Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para a obteno de grau de Mestre em Qumica Qumica Orgnica
O48s 2008
D
Oliveira, Sheila Rodrigues. Sntese, estudos de relaes estrutura-atividade e da atividade antifngica de novos agentes quimioterpicos para tratamento de doenas infecciosas emergentes / Sheila Rodrigues Oliveira. 2008. xv, 95 f. : il. Orientador: Claudio Luis Donnici. Co-orientador: Ado Aparecido Sabino. Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Qumica. Inclui bibliografia. 1.Qumica orgnica - Teses 2. Relao estrutura atividade Teses 3. Agentes quimioterpicos Teses 4. doenas Infecciosas emergentes I. Donnici., Claudio Luis, Orientador II. Sabino, Ado Aparecido, Coorientador III. Ttulo. CDU 043
A presente dissertao de Mestrado foi realizada sob orientao do Professor Doutor Claudio Luis Donnici, co-orientao do Professor Doutor Ado Aparecido Sabino e com a colaborao de: Professora Doutora Maria Aparecida Resende Departamento de Microbiologia, ICB-UFMG, Professor Doutor Carlos Alberto Montanari, Instituto de Qumica - USP de So Carlos e da Professora Doutora Mriam Lopes do ICB-UFMG
No apenas devo agradecer como tambm dedicar este trabalho s pessoas que muito me apoiaram: A Deus por ter me dado a vida e por ter me concedido sade, fora e oportunidades de conhecer pessoas muito especiais. Aos meus pais, Lourdes e Nestor, pelo apoio e amor incondicional. Agradeo minha irm, Michelle, pela sinceridade, pelos conselhos e pela torcida. Ao meu irmo Talmer a quem eu amo muito. Ao Lucas pelo carinho, ateno, pela convivncia... Ao Professor Claudio Luis Donnici, no h palavras que possam traduzir o meu imenso agradecimento a esta figura humana de carter e sensibilidade mpares, quem sempre me ajudou e me inspirou a continuar. minha amiga de todas as horas Helga, pelo apoio de todos os dias. Aos meus amigos do laboratrio 252: Luris, Viviane, Henrique, Marianne, Marcos Roberto, Marcelle, Bruno, Priscilla e Marilda pela amizade e ajuda... e ao Thiago s Professoras Maria Aparecida, Mriam Lopes do ICB-UFMG e Cleide e Ana Cndida pela generosidade e pacincia. Ao professor Ado Sabino pela co-orientao. Aos Professores ngelo de Ftima, Fernando Carazza, Ana Luiza de Quadros e Lucenir Pains pelas dicas e pela amizade. Agradeo s funcionrias da Secretaria de Ps-Graduao do Departamento de Qumica da UFMG (Paulete, Llian e Ktia) pela ateno e disponibilidade constantes. Agradeo aos funcionrios do Departamento de Qumica da UFMG pela ateno e pelo constante trabalho em prol de nosso ambiente de trabalho. Em especial um agradecimento carinhoso funcionria Arlete por proporcionar um ambiente agradvel pelo seu trabalho e pela sua pessoa. Agradeo tambm ao CNPQ pela bolsa concedida e FAPEMIG (Processos: CEX 817/06 e CEX APQ4911-5.02/07) pelos investimentos financeiros que foram essenciais para a realizao deste projeto.
ndice Geral
I- INTRODUO ................................................................................................. 24 I.1-DESENVOLVIMENTO DE FRMACOS: DO RANDMICO AO BIOISOSTERISMO, DO XAM AO QUMICO MEDICINAL .. 24 I.1.A-FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE DE UM COMPOSTO-PROTTIPO- TIPOS DE MODIFICAO MOLECULAR ................................................................................. 26 I.1.a.1-Lipofilia:.......................................................................................... 26 I.1.a.2-Rigidez x Flexibilidade ......................................................................... 29 I.1.a.3-Tamanho do Anlogo............................................................................ 30 I.1.a.4-Alterao dos Substituintes Bioisosterismo ............................................... 31 I.1.a.5-Modificaes Moleculares e Relaes Quantitativas Estrutura-Atividade (QSAR) ..... 32 I.2 NEOPLASIAS E COMPOSTOS QUE INTERAGEM COM DNA ............................................. 39 I.2.a.HBRIDOS: NOVOS COMPOSTOS-PROTTIPO ANTINEOPLSICOS ............................. 42 I.3-DOENAS INFECCIOSAS EMERGENTES - MICRORGANISMOS FUNGOS E BACTRIAS.............. 46 I.3.a-Algumas das Principais Infeces Causadas por Fungos ...................................... 48 I.3.a.1-Aspergilose: ...................................................................................... 48 I.3.a.2-Candidase........................................................................................ 49 I.3.a.3-Paracoccidioidomicose.......................................................................... 50 I.3.a.4- Esporotricose.................................................................................... 51 I.3.a.5- Criptococose: ................................................................................... 52 I.3.B. AGENTES QUIMIOTERPICOS ANTIMICROBIANOS ANTIBITICOS .......................................... 52 I.4-ESTUDO DE PRECURSORES DENDRMERICOS .......................................................... 58 I.4.a - Estudo da Atividade Antifngica de Precursores Dendrmericos.......................... 58 I.4.b- Determinao do log kw de Precursores Dendrmericos ..................................... 61 II.JUSTIFICATIVA E RELEVNCIA DO TRABALHO ............................................................ 65 III. OBJETIVOS .................................................................................................. 67 IV-RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................. 68 IV.1- CONSIDERAES GERAIS .................................................................................. 68 IV.2- OBTENO E CARACTERIZAO DOS COMPOSTOS TIOUREIDO-SUBSTITUDOS ............................... 69 IV.2.a-Obteno de 2,2,2-triclorotrietilamina e N,N,N,N-Tetrakis(2-cloroetil)etilenodiamina ........................................................................................................ 70 IV-2.b-Obteno de tris(2-tioureidoetil)-(P1) e tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)aminas (P2) . 74 IV-2.c-Obteno de tris(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina (P3) e N,N,N,N-tetrakis(2-1,3dimetil-tioureido-etil)etileno-diamina (P6). ........................................................ 79 IV-2.d- Obteno de N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil)etilenodiamina (P4). .............. 86 IV.2.e-Obteno de N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina (P5)........... 89 IV.2.f- Obteno de 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano (P7) ................. 92 IV.3- DETERMINAO DO LOG KW PARA OS COMPOSTOS P1 A P7................................................. 95 IV.4- AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIFNGICA DOS COMPOSTOS P1 A P7 ....................................... 96 IV.4.a- Resultados de Atividade Antifngica......................................................... 96 IV.4.b- Teste de Atividade Fungicida ................................................................. 98 IV-5- Avaliao da Atividade Antitumoral dos Compostos P1 e P2............................... 100 V. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... 101 V.1. PREPARAES EFETUADAS .............................................................................. 101 V.1.2.1 Preparao do N,N,N, N- Tetrakis (2-cloroetil)etilenodiamina (PB) ............... 73 V.1.3 PROCEDIMENTO GERAL PARA OBTENO DE TRIS-TIOUREIDO-DERIVADOS: Preparao de tris(2-tioureidoetil)amina (P1) em EtOH ......................................................... 74 V.1.3.1-Preparao de tris(2-tioureido)etilamina (P1) em i-PrOH ............................... 75 V.1.3.2-Preparao de tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2) em EtOH .................... 75 V.1.3.3 - Preparao de tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2) em i-PrOH ................ 76 V.1.3.4 Preparao de tris(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina (P3) em i-PrOH .............. 76
V.1.4 PROCEDIMENTO GERAL PARA OBTENO DE TETRA-TIOUREIDO-DERIVADOS: Obteno de N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil) etilenodiamina (P4) em presena de Carbonato de sdio ....................................................................................................... 77 V.1.4.1 - Obteno do N,N,N,N-Tetrakis(2-tioureidoetil) etilenodiamina (P4) sem carbonato de sdio....................................................................................... 78 V.1.4.2 - Obteno do N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina (P5)........ 79 V.1.4.3 - Obteno do N,N,N,N-tetrakis(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)etileno-diamina (P6) 80 V.1.5 Obteno de 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano (P7)................. 81 V.2 - DETERMINAO DO LOG KW PARA OS COMPOSTOS P1 A P7....................................... 81 V.3 ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTIFNGICA ............................................................. 84 V.3.1-Consideraes Gerais............................................................................. 84 V.3.2 Tcnica da microdiluio ...................................................................... 84 V.3.3 Solventes utilizados na solubilizao ........................................................ 85 V.3.4 Meio de cultura.................................................................................. 85 V.3.5 Origens dos microrganismos utilizados nos ensaios ........................................ 85 V.3.6- Avaliao da Atividade Antifngica dos Compostos P1 a P7............................... 85 V.3.7- Teste de Atividade Fungicida .................................................................. 87 V.3.7.a- Preparao das Placas de Petri .............................................................. 87 V.3.7.b- Avaliao da Atividade Fungicida ........................................................... 87 V.4 - ESTUDOS DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DETERMINAO DA CONCENTRAO INIBITRIA DE 50% DA POPULAO CELULAR (IC50) ....................................................................... 87 V.4.1 - Meio de Cultura Celular........................................................................ 88 V.4.2 - O Soro Fetal Bovino (SFB) (Cultilab) ......................................................... 89 V.4.3 - Os Reagentes Utilizados........................................................................ 89 V.4.4 - Aparelhos......................................................................................... 89 V.4.5 Estudo da Atividade Antitumoral ............................................................. 89 VI. CONCLUSES E PERSPECTIVAS............................................................................ 91
ndice de Tabelas Tabela 1: Dados de Coeficiente de Partio (log P e de P) de Alguns Compostos Devido Introduo de Grupamentos Metila................................................................................26 Tabela 2: Percentagem de Incidncia de Casos de Candida spp. Relatadas 127 Instituies de 39 Pases do Mundo entre 1997 e 2003, para as Cinco Espcies que mais Causam Infeces ..........50 Tabela 3: Alguns Antibiticos em Uso Atualmente........................................................54 Tabela 4: Alguns dos Compostos com Atividade Antifngica Testada por Supuran e colaboradores.................................................................................................................57 Tabela 5: Derivados Tipo Precursores Dendrimricos Funcionalizados com Grupo Tioureido......58 Tabela 6: Nomenclatura Oficial dos Compostos Preparados nesta Dissertao.......................68 Tabela 7: Valores De Log K para as Diferentes Concentraes de Compostos de P1 a P7 .........96 Tabela 8: Valores de Log Kw e Log P Calculados para P1 a P7..........................................96 Tabela 9: Concentrao Inibitria Mnima dos Compostos que Apresentaram Atividade Inibitria.................................................................................................................97 Tabela 10: Concentrao Fungicida Mnima dos Compostos P6 e P7..................................98 Tabela 11: Dados gerais da Atividade antifngica dos compostos estudados nesta dissertao (P1 a P7) e em trabalhos anteriores (A-L) ......................................................................99
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Tabela 12: Concentraes de Atividade Anticancergena dos Compostos P1 e P2.................100 Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C e IV de PA..........................................................102 Tabela 17: Dados de RMN de 1H, Tabela 19: Dados de RMN de 1H, Tabela 21: Dados de RMN de 1H, Tabela 23: Dados de RMN de 1H,
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Tabela 24: Dados de IV de P3...............................................................................106 Tabela 25: Dados de RMN de 1H,13C e Dept de P4.......................................................107 Tabela 26: Dados de IV de P4 ..............................................................................107 Tabela 27: Dados de RMN de 1H, Tabela 29: Dados de RMN de 1H, Tabela 31: Dados de RMN de 1H,
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Tabela 32: Dados de IV de P7...............................................................................110 Tabela 33: Valores de log K para os padres utilizados para diferentes porcentagens de metanol...............................................................................................................111 Tabela 34: Valores do log Poct obtidos na literatura e log kw para todos os padres cromatogrficos.............................................................................................................112 Tabela 35: Valores calculados de fatores de capacidade (K) para as diferentes concentraes de compostos de P1 a P10.......................................................................................113 Tabela 36: Correlao entre log K e concentrao de metanol.......................................113 ndice de Figuras Figura 1: Representao Esquemtica da Teoria Chave-Fechadura.....................................24 Figura 2: Estrutura de Algumas Sulfas com Atividade Antibacteriana...................................25 Figura 3: Estruturas da Isoniazida e cido 2-Metilisonicotnico..........................................29 Figura 4: Estruturas da Imipramina (= 65o, Antidepressivo) e Clorpromazina (= 25o, Neurolptico) ...............................................................................................................29 Figura 5: Linolato de Quinino e seu Anlogo Octadecatrienato..........................................30 Figura 6: Compostos Aromticos Bis-amidnicos com Atividade Antimicrobiana......................31 Figura 7: Estruturas da 4-Metil-Benzenossulfonamida e da Astromicida................................32 Figura 8: Robin Ganellin, Graham J. Durant, Michael E. Parsons e James W. Black no Evento Comemorativo Promovido pelas Sociedades Britnica e Americana de Qumica dos 25 Anos da Cimetidina.........................................................................................................35 Figura 9: Tautmeros da Histamina (16 e 17); Tautmeros da Metil-histamina (18 e 19);
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intermedirios da Cimetidina (20 a 23)......................................................................35 Figura 10: Visualizao Esquemtica De Ligaes De Hidrognio, Doadores E Receptores Nas Extremidades Das Bases A:T E G:C Segundo O Modelo De Watson-Crick ...............................37 Figura 11: Visualizao do Potencial Eletrosttico da Superfcie da Dupla Estrutura Cristalina do Oligo-nucleotdeo ...............................................................................................37 Figura 12: Estruturas de Distamicina, Netropsina e Hoechest 33258...................................39 Figura 13: Visualizao da Estrutura Cristalina da Netropsina Complexada com d(CGCGAATTCG CG)(NDB Cdigo GDLB05) ......................................................................................39 Figura 14: Compostos Nitrogenados que Apresentam Atividade Antitumoral..........................40 Figura 15: Agentes Antitumorais do Grupo dos Alquilsulfonatos.........................................41 Figura 16: Equilbrios Qumicos da Hidratao da cis-Pt..................................................41 Figura 17: Complexos de Platina com Bis-Aminas..........................................................42 Figura 18: Alcalides indlicos vimblastina, vincristina, catarantina e vindolina.....................43 Figura 19: Estruturas do hbrido (42) formado por taxol (43) e camptotecina (44)..................43 Figura 20: Composto hbrido 45 que apresenta seletividade para clulas de cncer de mama.....44 Figura 21: Estruturas nitrogenadas mistas tipo espermidina-clorambucil 48 e 49; tipo intercalante-clorambucil 50 e 52................................................................................45 Figura 22: Estrutura de misto polifuncionalizado tipo clorambucil U...................................45 Figura 23: Alguns dos tiazis 2,4-dissubstitudos estudados por El-Subbagh e Obaid.................46 Figura 24: Alguns dos heterocclicos sulfonamdicos tiouredo-substitudos estudados por Supuran e colaboradores..............................................................................................46 Figura 25: Os miclios de A. fumigatus denominados aspergilomas....................................49 Figura 26: Colnia de C. albicans, a principal espcie patognica do gnero Candida spp.........50 Figura 27: Aparncia microscpica da colnia de P. brasiliensis em cultura de agar................51 Figura 28: Colnia de S. schenkii ............................................................................52 Figura 29: Esporos de C. neoformans........................................................................52 Figura 30: Frmacos que interagem com o DNA: Metalaxyl e LY214352................................54 Figura 31: Novos agentes antifngicos.......................................................................55 Figura 32: Compostos estudados por Cameron e colaboradores ........................................56 Figura 33: Alguns dos compostos com atividade antifngica testada por Supuran e colaboradores .................................................................................................................57 Figura 34: Estrutura geral dos compostos testados contra o vrus da herpes por Grandi e colaboradores............................................................................................................57 Figura 35: Estrutura e atividade antifngica contra Candida spp. de derivados tioureido estudados com a variao do grau de alquilao...................................................................58 Figura 36: Alinhamento molecular das estruturas dos derivados tipo tioureido estudados.........59 Figura 37: Anlise de PCA obtida pelo programa TSAR.................................................60 Figura 38: Representao esquemtica da medida de parmetro de lipofilia por RP-HPLC, da medida de valor de log k e da extrapolao para obteno de log kw ................................63
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Figura 39: Correlao entre log kw e Poct para os padres cromatogrficos............................64 Figura 40: Estrutura geral do composto com atividade antitumoral....................................65 Figura 41: Retrossntese para obteno dos compostos estudados......................................66 Figura 42: Estrutura geral dos compostos preparados.....................................................67 Figura 43: Reao geral para a sntese de tioureidos......................................................69 Figura 44: 2,2,2-triclorotrietilamina (PA) e N,N,N, N-Tetrakis (2-cloroetil) etilenodiamina (PB).................................................................................................................70 Figura 45: Espectro na regio do infravermelho de PB....................................................71 Figura 46: Espectro de RMN 1H de PA ........................................................................71 Figura 47: Espectro de RMN 1H de PB........................................................................72 Figura 48: Espectro RMN 13C PA.............................................................................72 Figura 49: Espectro RMN 13C PB..............................................................................73 Figura 50: DEPT de PB..........................................................................................73 Figura 51: Tris(2-tioureidoetil)amina (P1) e tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2).............74 Figura 52: Espectros na regio do IV de PA (acima) e de P1 (abaixo) ..................................75 Figura 53: Espectros na regio do IV de PA (acima) e de P2 (abaixo) ..................................75 Figura 54: Espectros de RMN 1H de P1.......................................................................76 Figura 55: Espectros de RMN 1H de P2.......................................................................77 Figura 56: Espectro de RMN 13C de P1........................................................................77 Figura 57: Espectro de RMN de 13C P2........................................................................78 Figura 58: Espectros de DEPT de P1..........................................................................78 Figura 59: Espectros de DEPT de P2..........................................................................79 Figura 60: Tris(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina (P3) e N,N,N,N-tetrakis(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)etileno-diamina (P6)................................................................................79 Figura 61: Espectro na regio do IV de PA (acima) e P3 (abaixo).......................................80 Figura 62: Espectro na regio do IV de P6...................................................................81 Figura 63: Espectro de RMN de 1H de P3....................................................................82 Figura 64: Espectro de RMN de 1H de P6 (D2O).............................................................82 Figura 65: Espectro de RMN 13C de P3 (D2O) ...............................................................83 Figura 66: Espectro de RMN 13C de P6 (DMSO)..............................................................84 Figura 67: DEPT de P3..........................................................................................85 Figura 68: DEPT de P6 (DMSO)................................................................................85 Figura 69: N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil)etilenodiamina (P4)..................................86 Figura 70: Espectro na regio do IV de P4...................................................................86 Figura 71: RMN 1H de P4 em D2O..............................................................................87 Figura 72: RMN 13C de P4 em D2O.............................................................................88 Figura 73: A presena do terceiro tomo de carbono da estrutura molecular de P4 foi confirmada pelo DEPT......................................................................................................88 Figura 74: Estrutura de N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina (P5).............89
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Figura 75: Espectro na regio do IV de P5..................................................................89 Figura 76: Equilbrio do grupo terminal metil-tioureido..................................................90 Figura 77: Espectro de RMN de 1H de P5....................................................................90 Figura 78: Espectro de RMN de 13C de P5...................................................................91 Figura 79: DEPT de P5.........................................................................................91 Figura 80: 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano (P7)...................................92 Figura 81: Espectro na regio do infravermelho de 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tiaheptano (P7).....................................................................................................92 Figura 82: Espectro de RMN de 1H em D2O..................................................................93 Figura 83: RMN 13C de P7......................................................................................94 Figura 84: DEPT de P7.........................................................................................94 Figura 85: Resultado do teste de ao fungicida..........................................................98 Figura 86: Estrutura geral dos compostos estudados em trabalhos anteriores .......................99 Figura 87: Correlao entre log kw e Poct para os padres cromatogrficos..........................112 Figura 88: Placa de elisa utilizada para teste em microdiluio.......................................113 Figura 89: Reduo do MTT e do XTT a formazana.......................................................117
Tabela de esquemas Esquema 1: Mecanismo geral de preparao de derivados tioureidos com tioureia..................69 Esquema 2: Mecanismo geral de preparao dos haletos de alquila desta dissertao .............70 Esquema 3: Diluio seriada das amostras ................................................................115 Esquema 4: Placa de petri subcultivada em duplicata para diferentes concetraes em g/mL.116
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LISTA DE ABREVIATURAS
: ngulo entre Ligaes : Constante de Hammett : Constante Lipoflica : Contribuio Polar : Deslocamento Qumico em ppm : Parmetros eletrnicos GR: Variao da Energia Livre de Gibbs para a Reteno [MeOH]: Porcentagem de metanol vol/vol g: Micrograma (10-6 g) L: Microlitro (10-6 L) = Angstron (10-9) a0, a1, a2: Constantes obtidas a partir do mtodo do least squares A:T, G:C: Pares de Bases Nitrogenadas (Adenina: Tinina, Guanina: Citosina) AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome ARPI: Antimicrobial Resistance Prevention Initiative ASD: Agar Sabouraud Dextrose ATCC: American Type Culture Collection C: Concentrao Molar CBM: Cromobalastomicose CCD: Cromatografia de Camada Delgada CFM: Concentrao Fungicida Mnima cis-Pt: cis-Platina D: Dendrmeros d: Dupleto DE50: Dose efetiva DEPT: Transferncia de Polarizao Acentuada sem Distoro DIEs: Doenas Infecciosas Emergentes DL50: Dose Letal para 50% de Inoculo DNA: Deoxyribonucleic Acid IFIs: Infeces Fngicas Invasivas ITC: Isothermal Titration Calorimmetry IV: Espectrometria na Regio do Infravermelho Jn: Constante de Acoplamento k: Fator de Capacidade
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K1, K-1, k2, k-2, KR: Constantes de equilbrio LASELORGQUIM:Laboratrio de Sntese e Eletrossntese Orgnica e Qumica Medicinal LD50: Dose Letal log P: Coeficiente de Partio LY214352: 8-cloro-4-(2-cloro-4-fluorofenoxi)quinolina MGBs: Minor groove binders MIC: Concentrao Inibitria Mnima MOPS: cido-2-(N-morfolino)-propanossulfnico NC: Ncleo Central NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards NCE: New Chemical Entity OMS: Organizao Mundial de Sade PCA: Anlise de Componentes Principais (Principal Component Analysis) PD: Precursor Dendrimrico PF: Ponto de fuso pKa: Logartimo da constante de acidez ppm: Partes por Milho py: Piridina q = quarteto QSAR: Relaes Quantitativas Estrutura-Atividade (Quantitative Structure Activity Relation Ship) R: Constante dos gases rf: Fator de Reteno RMN 13C: Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear de carbono treze RMN 1H: Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear de hidrognio RP-HPLC: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia em fase Reversa RPMI: Roswell Park Memorial Institute s: singleto spp.: Vrias espcies T: Temperatura absoluta t: Tripleto t0: Tempo de Reteno da Fase Mvel TMS: Tetrametilsilano tr: Tempo de Reteno do Soluto Retido V : Fator Estrico VDP: Voltametria por Pulso Diferencial vol/vol: Volume por Volume
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X1: Flexibilidade Molecular X2: ndice Topolgico de Balaban X3: Coeficiente de Partio ou log P : Composio da Fase Mvel
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APRESENTAO
No presente trabalho so apresentados os resultados obtidos no laboratrio do LASELORGQUIM (Laboratrio de Sntese, Eletrossntese Orgnica e Qumica Medicinal) durante a realizao das atividades de pesquisas no Mestrado entre o perodo de Agosto de 2006 a Junho de 2008. Este trabalho est inserido no projeto de pesquisa inter- e trans-institucional - entre o Departamento de Qumica-ICEx/UFMG e os Departamentos de Microbiologia, Farmacologia e BioqumicaICB/UFMG intitulado Sntese de novos compostos com Atividade Antitumoral e Antimicrobiana para Doenas Infecciosas Emergentes (DIEs) - fomentado pela FAPEMIG (Proc. CEX 817/06) que visa pesquisa inter-, multi- e trans-disciplinar (Qumica, Farmacologia, Micologia, Microbiologia e Bioqumica) para o desenvolvimento de novos agentes quimioteraputicos para cncer e para o tratamento de doenas infecciosas emergentes (DIEs) ou infeces fngicas invasivas (IFIs), problemas de sade pblica com grande relevncia nos ltimos tempos. Em trabalhos anteriores que se basearam no estudo de compostos do tipo bisfuncionalizados por grupos tioureido (I) foram pesquisados tanto a avaliao da interao destas molculas com o DNA como a inibio fngica contra candidase. A influncia da lipofilia foi constatada, por estudos de QSAR (Relaes Quantitativas Estrutura-Atividade), o que nos levou, no presente trabalho, a estudar outras classes de compostos com maior grau de alquilao, maior nvel de ramificao (tris- e tetra-substitudos) e com outros bioissteros (II). Assim, neste projeto de Mestrado, sintetizaram-se novos precursores dendrimricos bis-, tris- e tetra-funcionalizados (IIa e IIb). Os compostos sintetizados so referentes a molculas simtricas de tioteres e aminas do tipo dendrons funcionalizadas com grupos especficos, como a seguir: S-tioureido, N-metil-S-tioureido e N,N-dimetil-S-tioureido (aminas trifuncionalizadas e tetra funcionalizadas, quase todas inditas); alm destas aminas, o sulfeto bis-funcionalizado, indito, N-dimetiltioureido (IIc) foi preparado. A lipofilia tambm foi avaliada atravs do estudo do coeficiente de partio e investigou-se a atividade antifngica contra Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Criptococus neoformans e Saccharomyces cerevisae.
X ( )n
I X = S-C(=NH)NH2.HCl; Y = O, NH/Me, S X= S-C(=NH)NMe.HCl; Y = O, NH/Me, S
X
n
( )n
X
n
X
n
X
n
N
n
N
n
IIa
IIb
( )n
Y
IIc
( )n
X
Y=S
X = SC(NMe(NHMe); n = 2
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Nesta Dissertao de Mestrado, devido multi-disciplinaridade desta pesquisa, para melhor contextualizao geral, no captulo de Introduo sero abordados os principais tpicos relacionados, tais como: o desenvolvimento de frmacos desde o randmico at a modificao molecular por bioisosterismo, abordando os fatores que influenciam no planejamento racional de um frmaco: lipofilia, rigidez, flexibilidade, alterao de substituintes e relaes quantitativas estrutura-atividade; em seguida, tambm se contextualiza a importncia dos graves problemas de sade pblica como o das neoplasias (ou cncer) - especialmente relatando os compostos que interagem com o DNA e o das doenas infecciosas emergentes (DIEs) e infeces fngicas invasivas (IFIs); ao final deste captulo, abordaremos uma breve discusso sobre dendrmeros e precursores dendrimricos. No segundo captulo mostraremos a justificativa e a relevncia do trabalho e os objetivos so mostrados no terceiro captulo. No quarto captulo, apresentaremos as discusses dos resultados obtidos: Preparao, caracterizao espectromtrica e respectivos espectros dos precursores dendrimricos (P1 a P7); Estudos de lipofilia, atravs da medio do logartimo de partio (log P) utilizando cromatografia lquida de alta eficincia em fase reversa (RP-HPLC); Estudos de atividade antifngica contra Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Criptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisae. Estudos de atividade antitumoral contra algumas linhagens: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF-7) e glioma de rato (C6). No quinto captulo, apresentaremos a parte experimental dos estudos efetuados e dos resultados apresentados. Finalmente, no sexto captulo concluiremos de maneira geral os resultados apresentados at ento e as perspectivas futuras com tais resultados.
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RESUMO
A presente dissertao apresenta os resultados obtidos a partir do estudo de sete derivados funcionalizados bis-, tris- e tetra-substitudos com os quais se analisou o efeito da variao da ramificao na cadeia e do grau de metilao. Cabe ressaltar que todos os compostos so simtricos, similares a precursores dendrimricos (ou dendrons) e foram nomeados genericamente como P. A atividade biolgica destes compostos foi investigada contra fungos patognicos do gnero Candida spp., Cryptococcus neoformans e Saccharomices cerevisae. O estudo da atividade citotxica contra algumas linhagens tumorais tambm descrito. Seis derivados anlogos s mostardas nitrogenadas, pela substituio nas extremidades ,-bis-S-tioureido substitudos com diferentes graus de ramificao e diferentes graus de metilao no grupo tioureido, foram sintetizados e estudados: tri(2-tioureidoetil)amina (P1), tri(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2), tri(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina (P3), N,N,N,Ntetrakis(2-tioureidoetil)etilenodi-amina(P4), N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina(P5) e N,N,N,N-tetrakis(2-1,3-dimetil-tioureido-etil) etileno -diamina (P6). Todos estes tioureido-amino derivados so inditos com exceo de P1 que j foi testado contra leucemia. Um anlogo tipo tio-ter tambm foi preparado: 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tiaheptano (P7). Todos estes compostos foram caracterizados pelos mtodos espectromtricos usuais (Infravermelho, RMN de 1H e de 13C). O derivado tri-ramificado e no-metilado P1 foi o agente antifngico mais potente mostrando atividade em baixas concentraes contra C. albicans e C. glabrata, podendo ser potencialmente um agente de uso tpico para tratamento de candidose. Os derivados tipo tioureido P3 e P6 apresentaram amplo espectro de ao antifngica contra C.albicans, C. glabrata, C. krusei, C. neoformans e S. cerevisae. P5 foi ativo somente contra C. glabrata (250 g/mL) e, P6 foi ativo contra C. glabrata (125 g/ml), mas, notoriamente, junto com P7 o sulfeto bis-N,N-dimethyl funcionalizado - foram os nicos agentes antifngicos eficientes na inibio de C. parapsilosis (125 e 250 g/mL). digno de nota que P7 tambm mostrou amplo espectro de ao inibindo C.albicans, C. glabrata, C. krusei, C. neoformans e S. cerevisae. Os derivados P2 - tri-ramificado e monometilado tanto quanto P4 derivado tetra-ramificado e no-metilado no se mostraram ativos contra as espcies investigadas. Seria esperado que P4 fosse mais ativo e talvez isto seja devido ao fato da ocorrncia de interaes tipo ligao de hidrognio muito fortes entre o tomo de nitrognio e os hidrognios de dois grupos tioureido diferentes, o que foi notado pela observao detalhada do espectro na regio do infravermelho. De fato, tais interaes intramoleculares so muito favorveis em compostos assim, como P4, com baixo nvel de alquilao, alta polaridade e alta simetria, pois P4 possui dois pares de ligaes NH para fazer ligaes de hidrognio intramoleculares. Assim, se os grupos tioureido esto envolvidos em fortes interaes intramoleculares no h disponibilidade para a interao biolgica necessria para a atividade antifngica. P1 e P2 foram tambm testados contra espcies tumorais: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF-7) e
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glioma de rato (C6) porm, a faixa de concentrao inibitria para 50% 10-4 to 10-5 mol/L - no boa o suficiente para tornar estas molculas promissoras como agentes antineoplsicos. Os estudos para avaliao da lipofilia atravs de medidas em RP-HPLC tambm so descritas e os resultados mostraram que a padronizao usual com compostos comuns e com coeficientes de partio conhecidos no so adequados para o presente estudo que lida com molculas mais ramificadas e polifuncionalizadas. As metodologias de cromatografia de camada delgada e shake-flask podem ser alternativas viveis e esto sendo testadas.
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SUMMARY The present dissertation presents the results obtained from synthesis of seven bis-, tri- and tetrabranched functionalized derivatives, the influence of the branching, the methylation levels at the nitrogen atoms of the thioureido moiety, on the antifungal activity was investigated. All compounds are symmetrical and similar to dendrimeric precursors or dendrons and they are named as P. The investigation of biological activity against pathogenic fungi from gender Candida spp., Cryptococcus neoformans and Saccharomices cerevisae are reported. The cytotoxic studies against several tumoral species are also described. Six ,`-bis-S-thioureido substituted nitrogen mustard analogues with different nitrogen methylation levels at thioureido moiety, were synthesized and studied: tri(2thiouredoethyl)amine (P1), tri(2-(1-methyl-2-thioureidoethyl)amine (P2), tri(2-(1,3-dimethyl)thioureidoethyl)amine (P3), N,N,N,N- tetrakis (2-thioureidoethyl)ethylenediamine (P4), N,N,N,N-tetrakis(2-methyl-thioureido -ethyl)ethylenediamine (P5) and N,N,N,N-tetrakis(2-1,3dimethyl-thioureido-ethyl)ethylene-diamine (P6). All of them are novel, but not P1, ever prepared and studied against leukemia. One novel thio-ether analogue was also prepared: 1,7-bis(2-1,3-dimethyl-thioureido-ethyl)-4-thia-heptano (P7). All prepared substances were characterized by spectrometric methods (Infrared, 1H and 13C -NMR). The tribranched and non-methylated derivative P1 was the most active antifungal agent showing activity in very low concentrations against C. albicans and C. glabrata. P1 might be potentially used as topical agent for the treatment of candidosis. The other thioureido derivatives P3 and P6 showed broad-spectrum of antifungal activity against C.albicans, C. glabrata, C. krusei, C. neoformans and S. cerevisae. P5 was active only against C. glabrata. Remarkably, P6 was active against C. glabrata, and such as P6 and P7 were the only agents enough efficient to inhibit C. parapsilosis. In fact, P7 also showed broad-spectrum of antifungal activity inhibiting C.albicans, C. glabrata, C. krusei, C. neoformans and S. cerevisae. The tri-branched and monomethylated amino analogue P2 was inactive against all species tested, such as P4, the tetra-branched and non-methylated amino analogue. It was expected that P4 would be more active than it really is and maybe this is due to the occurrence of intramolecular hydrogen bonds - between the nitrogen and the hydrogen atoms of two different thioureido groups - which were noticed only in the infrared spectra for P4. In fact, these intramolecular interactions are very favorable in compounds with low alkylation level, high polarity and high symmetry compounds such as P4, and besides P4 has two pairs of nitrogenhydrogen groups (NH) to make two mutual intramolecular hydrogen bond interactions. Therefore, if the thioureido groups are involved in very strong intramolecular interactions, there is no free thioureido group to make the biological interaction which is responsible for the antifungal activity.
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P1 e P2 were also tested against some tumor species - human gastric adenocarcinome (AGS), murin colon carcinome (CT26WT), female mamarian human carcinome (MCF-7) and mouse glioma (C6) but, the average found MIC 10-4 to 10-5 mol/L - in not good enough to make these molecules promising novel antineoplastic agents. The attempts for their partition coefficient (log P) measurements by RP-HPLC technique are also described and the results show that the usual standardization with common and ordinary compounds with well-known partition coefficients is not suitable for the present studied with high branched and polifunctionalized molecules. The thin layer chromatography or even the usual shake-flask methodologies might be alternatives and they are going to be tested.
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I- INTRODUO I.1-Desenvolvimento de Frmacos: do Randmico ao Bioisosterismo, do Xam ao Qumico Medicinal Nos povos antigos, atravs do instinto primitivo inconsciente ou da indicao determinada de xams, encontrava-se alvio para o tratamento de doenas com o uso de produtos naturais, em uma procura a princpio irracional, mas que gerava alguns mtodos teraputicos eficientes. Com o passar do tempo, estes mtodos foram transmitidos verbalmente por geraes at os raizeiros e com o desenvolvimento da cincia surgiram os cientistas especializados na rea de produtos naturais no sculo XX. Assim, foi descoberto que naqueles medicamentos primitivos havia a presena de compostos qumicos especficos e estes seriam os agentes responsveis pelo tratamento, os frmacos (do grego, pharmacon = droga ou medicamento, ou veneno, ou beberagem mgica). Paracelsus (1493-1541) contribuiu significativamente para o nascimento da Farmacologia no final da Idade Mdia, afirmando que cada doena deveria ser tratada por um tipo de medicamento e que a dose certa define se uma substncia qumica um medicamento ou um veneno1. Contudo, o cientista considerado o responsvel pelo nascimento da quimioterapia, Paul Ehrlich (1854-1915, ganhador do Prmio Nobel de Medicina em 1908), exaltava a importncia do uso de compostos qumicos para tratamento de doenas na famosa citao que relatava: o uso de frmacos para combater um organismo invasor sem prejudicar o hospedeiro iniciando-se o pioneirismo no tratamento farmacolgico2. De fato, Ehrlich notara durante o seu doutoramento que compostos especficos, ou mais especificamente corantes qumicos, interagiam com tecidos ou clulas especficas o que fez sugerir que h uma determinada afinidade que poderia levar ao desenvolvimento sonhado de magic bullets, ou seja, medicamentos muito eficientes que atingiriam seletivamente a doena, curando-a completamente. Ehrlich j acreditava na importncia da estrutura molecular de compostos com atividade farmacolgica nos processos biolgicos e que estes frmacos teriam que interagir com os compostos qumicos celulares para a ocorrncia do processo teraputico. Com a evoluo deste conceito, chegou-se ao desenvolvimento da Teoria da Chave-Fechadura, como hoje conhecida (Figura 1). Nesta teoria os compostos qumicos (chaves) conduzem a uma interao com o sistema bioqumico humano ou com o sistema do patgeno invasor (fechaduras) e o citado composto pode gerar ou bloquear a atividade biolgica considerada e no caso da doena, esta ou ao menos os sintomas desta, seriam tratados1,2.
1 2
Kremers, E.; Urdang, G. History of Pharmacy, J. P. USA, Lippincott Company, 1951. Riethmiller, S., Bull. Hist. Chem., 1999, 23, 28.
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Com o passar do tempo estabeleceu-se, de fato, um conceito preliminar de similaridade qumica e j se pressupunha que estruturas moleculares similares devem apresentar atividade farmacolgica similar3. Um exemplo clssico de descoberta de frmacos o das sulfas4, cuja atividade antibacteriana foi primeiramente descrita e comprovada, para a parasulfamidocrisoidina (1,Prontosil Rubrum, Figura 2), pelo patologista e bacteriologista alemo Gerhardt Domagk (ganhador do Prmio Nobel de Medicina em 1938). Entretanto, Forneau e colaboradores4 descobriram, pela anlise dos metablitos no sangue e urina de pacientes em tratamento com Prontosil, a presena de sulfanilamida, ou astromicida (2, Figura 2), substncia conhecida desde 1908. Assim, concluiu-se que a parte responsvel pela bioatividade da molcula (hoje chamada de farmacforo) era a sulfanilamida e que os vrios quimioterpicos antibacterianos at ento bem conhecidos, somente agiam devido presena do grupo farmacofrico sulfonamdico. A partir desta poca, com o conceito de modificao molecular ganhando espao na cincia, outras substncias antimicrobianas derivadas da sulfa - considerada como composto-prottipo - surgiram. Como por exemplo, em 1940, as sulfassubstitudas com ncleos pirimidnicos, dentre elas a sulfadiazina (3, Figura 2). As sulfas pirimidnicas foram utilizadas no combate contra infeces causadas por cocos e colibacilos. O sal de prata da sulfadiazina (4, Figura 2) foi introduzido na prtica mdica por Fox e colaboradores em 1968 5, e ainda hoje um medicamento tpico til para o tratamento de queimaduras e lceras varicosas, por proporcionar cicatrizao rpida.
N H2N NH2 N=N
+
Ag
NH2
SO2NH2 H N 2
SO2NH2
NH2
SO2NH
N
SO2N
N N
Assim, muito resumidamente, podem-se realizar modificaes moleculares atravs da mudana na estrutura de um composto-prottipo, que exibe determinada atividade farmacolgica, no sentido de aumentar a potncia da atividade biolgica estudada e quem sabe aumentar a seletividade e, assim, diminuir a toxicidade. As alteraes estruturais especficas, que podem ser efetuadas, podem ser classificadas como: (1) a dimenso e a conformao do esqueleto de carbono, (2) a natureza e o grau de substituio e (3) a estereoqumica da molcula. Tais alteraes influenciam na atividade do
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4
25
composto, alterando as caractersticas moleculares, entre as principais possvel destacar: grau de lipofilia, rigidez, tamanho e grupo funcional e que sero descritas a seguir.
I.1.a-FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE DE UM COMPOSTO-PROTTIPO- TIPOS DE MODIFICAO MOLECULAR I.1.a.1-Lipofilia: A lipofilia (do grego, como j citado, lipo = gorduroso, oleoso, phylis = afinidade; em ingls: lipofilicity ou lipophilicity) uma caracterstica fsico-qumica usualmente dada a substncias que possuem algum tipo de afinidade com ambientes orgnicos apolares, mas que pode ser matematicamente definida como o logaritmo do coeficiente de partio (log P)6. A lipofilia pode ser expressa quantitativamente pelo coeficiente de partio8-10 que pode ser definido como o logaritmo da concentrao de equilbrio de espcies monomricas de um composto na fase orgnica, dividido pela concentrao da mesma espcie na forma neutra, presente na fase aquosa. log P = log [composto]org / [composto]gua Assim, algumas vezes utiliza-se o aumento da cadeia de metileno com a finalidade de aumentar a lipofilia (Tabela 1). Quanto maior o valor de P maior o grau de lipofilia do composto. Como exemplo, os coeficientes de partio do benzeno e do tolueno foram medidos utilizando o sistema n-octanol/gua e os valores de P dos demais foram medidos a partir do sistema azeite/gua7. Na verdade, em relao a frmacos, o aumento da lipofilia pode possibilitar maior penetrao do composto pelas membranas celulares. Tabela 1: Dados de coeficiente de partio (log P e de P) de alguns compostos devido introduo de grupamentos metila. Composto Benzeno Acetamida Uria Estrutura C6H6 CH3CONH2 NH2CONH2 Log P - P 2,13 -135 1,92 - 83 1,18 - 15 Anlogo Tolueno Propionamida N-metiluria Estrutura C6H5CH3 CH3CH2CONH2 CH3NHCONH2 LogP P 2,69- 490 2,56 360 1, 64 44
A lipofilia tem sido o parmetro fsico-qumico mais estudado com relao sua influncia sobre a atividade biolgica8, pois a maior lipofilia do frmaco deve aumentar a lipossulubilidade e
6 7
SantAnna, C. M. R., Quim. Nova, 2002, 25(3), 505-512. Thomas, G. Qumica medicinal: Uma introduo. Rio de Janeiro 2003, Editora Guanabara. Traduo: Franklin David Rumjanek (Medicinal Chemistry An Introduction, 2000. John Wiley & Sons, Ltd.) Cap. 1. 8 Leo, A.; Hansch C.; Elkins D., Chem. Rev., 1971, 71, 525. Helmer, F.; Kiers, K.; Hansch C., Biochemistry, 1968, 7, 2858. Wermuth, C. G. The Practice of Medicinal Chemistry. Londres 1996, Academic Press, pp.676. Tute, M. S. Hystory and Objectives of Quantitative Drug Design. Em Hansch, C.; Sammes, P. G.; Taylor, J. B. Comprehensive Medicinal Chemistry, Quantitative Drug Design, vol.4. Nova Iorque 1990, pp. 1-31. Khalili, P.; Naimi, E.; Sun, W. Y.; Knaus, E. E.; Wiebe, L. I., Eur. J. of Pharm. Sci. 2003, 19, 305. Vrakas,
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a permeabilidade celular. Entretanto, a lipofilia pode ser avaliada e quantificada a partir da medida do coeficiente de partio pode ser efetuada de trs diferentes metodologias: a) por medida direta (exemplo mais comum: o mtodo shake-flask), b) por clculos tericos/ mtodos computacionais e c) por medida indireta (metodologia mais comum: mtodos cromatogrficos). Experimentalmente, j se ressalta aqui o uso de coeficientes de partio (log P) obtidos do sistema de partio octanol/gua que se tornou um modelo padro para quantificar a lipofilia dos compostos. O mtodo conhecido como shake-flask constituiu o primeiro e tambm o mais usado mtodo experimental para determinao do coeficiente de partio e consiste na determinao da concentrao de um determinado composto (atravs um mtodo analtico) distribudo em uma mistura bifsica de solventes. Porm, apesar de ser considerado padro na determinao de log P, ele apresenta diversos inconvenientes, entre os quais: elevado tempo para experimento, necessidade de pr-saturao, dificuldade de determinao de log P maior que quatro, formao de micelas e emulses na fase aquosa, etc. Cabe ressaltar que o uso de coeficientes de partio (log P) obtidos do sistema de partio octanol/gua tornou-se um modelo padro para quantificar a lipofilia dos compostos e mimetizar membranas biolgicas.9 Parmetros obtidos atravs de mtodos cromatogrficos (cromatografia lquida, em camada delgada ou em papel), tambm podem fornecer informaes quantitativas sobre a lipofilia das molculas. Tais parmetros j foram investigados por vrios autores sob diversos aspectos, envolvendo a discusso sobre a exatido de suas medidas, aspectos termodinmicos e a maneira como podem ser relacionados terica e experimentalmente com a energia livre de outros parmetros. Estes parmetros obtidos cromatograficamente tm uma larga aplicabilidade em estudos de relao estrutura-atividade.9 Realmente, as tcnicas cromatogrficas tm sido muito teis neste campo, fornecendo parmetros lipoflicos de grande importncia em estudos para o desenvolvimento de novos frmacos. 9 Cabe destacar, porm, que apesar da grande aplicao do uso da medida experimental do coeficiente de partio, alguns autores consideram que a lipofilia de uma molcula pode ser medida estruturalmente como uma composio de dois fatores, nomeados como estrico (V) e de contribuio polar (), sendo que o volume molar pode ser calculado (V) e o fator da polaridade pode ser obtido indiretamente de medidas de log P, sendo que = 0 para compostos apolares, especialmente sem ligaes de hidrognio8. Log P = a V -
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27
Contudo, divergncias a parte, a lipofilia atualmente, e de fato, um parmetro de fundamental influncia para a investigao da biodisponibilidade, permeabilidade e at toxidez de frmacos; por exemplo, a influncia da lipofilia j foi estudada com relao
10 11
s mais variadas
atividades farmacolgicas, tais como: antifngicas , anti-plaquetrias , anti-inflamatrias12, anti-cncer13, anti-virais14, anti-convulsivantes15, analgsicas16 e beta-bloqueadoras17. Alm disso, a importncia da lipofilia no desenvolvimento de frmacos tem sido muito valorizada no s dentro dos meios acadmicos, mas principalmente dentro da indstria farmacutica. Um pesquisador da Pfizer chamado Christhopher A. Lipinski chegou a estabelecer uma polmica regra geral para o planejamento de frmacos, relatada oralmente em 1995, que conhecida como regra de Lipinski (Lipinski rule) ou regra de cinco (fives rule ou rule of five);18 este nome adotado porque cada um dos quatro parmetros envolvidos usam valores que so mltiplos do nmero 5. Nesta regra o autor postula que, considerando-se as centenas de frmacos estudados, a baixa atividade farmacolgica devida sua baixa absoro e permeabilidade ocorre quando: (1) h mais do que 5 centros doadores de ligao de hidrognio, (2) h mais do que 10 aceptores de ligaes de hidrognio, (3) o peso molecular maior do que 500 unidades e (4) o log P calculado maior do que 5. Assim, por exemplo, dentro dos frmacos estudados e em uso clnico nos EUA: (1) menos de 12% deles possuem em sua estrutura mais do que 10 tomos de oxignio ou nitrognio (aceptores de ligao de hidrognio); (2) 8% possuem a soma acima de 5 grupos OH e NH (doares de ligao de hidrognio); (3) 11% deles tem massa molecular maior do que 500 unidades e finalmente (5) menos de 10% deles tinha log P maior do que 5. digno de nota que h, contudo, algumas classes de frmacos que no seguem esta regra. De qualquer forma, esta anlise geral feita por Lipinski considerada de grande relevncia e importncia e evidencia a importncia da lipofilia na atividade farmacolgica e no planejamento racional de qualquer frmaco39. Porm, nem sempre o aumento da lipofilia incrementa a bioatividade, algumas vezes a adio de grupo metila tambm pode diminuir a atividade biolgica como no caso do derivado metilado da isoniazida (cido isonictico) (Figura 3) que apresenta atividade antibacteriana inferior19. O MIC (concentrao inibitria mnima) da isoniazida 1,1 mol/L e o do cido 2metilsonictico 5,2 mol/L.
10
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11
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18
28
NHNH2
NHNH2
Isoniazida 5
cido 2-metilisonicotnico 6
I.1.a.2-Rigidez x Flexibilidade A interao frmaco-receptor pode ser influenciada pela alterao da rigidez ou da flexibilidade moleculares, pois se pode produzir um anlogo com atividade diferente devido conformao farmacofrica da molcula poder ser alterada e a interao ser diminuda ou impossibilitada. Isto o que acontece, por exemplo, com clorpromazina (8, Figura 4) um bioisstero da imipramina (7, Figura 4), um antidepressivo que apresenta em sua geometria molecular um ngulo = 65o entre os anis aromticos. No entanto, o bioisstero clorpromazina no apresenta tal atividade farmacolgica, pois este apresenta = 25o. O estudo de outros compostos anlogos20 tem mostrado que tal atividade pode ser comprovada em compostos que apresentem ngulos entre 55o 65o.
N Imipramina
7
o
N Clorpromazina
8
Figura 4: Estruturas da Imipramina (= 65 , antidepressivo) e clorpromazina (= 25o, neurolptico). Tem-se como outro exemplo, o aumento do nmero de ligaes duplas que aumenta a rigidez da molcula, o que pode facilitar a interao entre o composto e os stios receptores. Um caso a citar o dos derivados de quinino (9 e 10, Figura 5), no qual ocorre o aumento da atividade anticancergena do derivado octatrienoato em relao ao linolato de quinino21.
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21
20
29
N N MeO MeO N H O O
7
H O
O
7
Linolato de quinino
Cinchonan-9-ol, 6'-metxi-, 9-(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-octadecatrienoato
10
Contudo, compostos com mais ligaes duplas so mais susceptveis a oxidao metablica, o que pode tornar o frmaco mais txico do que o prottipo.
I.1.a.3-Tamanho do Anlogo O aumento do tamanho e da rigidez dos compostos pode ser efetuado pela introduo de anis aromticos, geralmente derivados de benzeno, ou pela introduo outros de sistemas heterocclicos. Tal insero pode tanto ampliar a capacidade de interao com o stio-alvo quanto torn-la impossvel. Alm disso, a introduo de sistemas anelares pode aumentar a resistncia do frmaco ao ataque enzimtico devido ao impedimento estrico. A literatura traz uma srie de compostos aromticos e heteroaromticos funcionalizados, por exemplo, por grupos amidnicos com atividade antimicrobiana22, dentre os quais trazemos os dados de Josef e col. (Figura 6) ilustrando a influncia da modificao molecular sobre a potncia. A atividade biolgica depende da extenso da molcula, assim, o aumento do tamanho global da molcula pode potencializar a atividade biolgica, preenchendo a fenda hidrofbica em um stio-alvo, ou pode alter-la completamente (Figura 6).
22
Anne, Jozef; De Clercq, Erik; Eyssen, Hendrik; Dann, Otto, Antimicrob. Agents Chemother., 1980, 18(2), 231-9. Kondo, Shigeo; Maekawa, Kazuyuki. J. Fac. Agric., Kyushu University (1976), 20(2), 97-104. Fleig, Oskar; Windel, Hermann. (Badische Anilin- & Soda-Fabrik Akt.-Ges.) 1960, GB 840211. Hall, James Edwin; Kerrigan, John E.; Ramachandran, Kishore; Bender, Brendan C.; Stanko, Jason P.; Jones, Susan K.; Patrick, Donald A.; Tidwell, Richard R., Antimicrob. Agents Chemother., 1998, 42(3), 666-674. Patrick, Donald A.; Hall, James Edwin; Bender, Brendan C.; McCurdy, Donald R.; Wilson, W. David; Tanious, Farial A.; Saha, Shankar; Tidwell, Richard R., Eur. J. Med. Chem. 1999, 34(7/8), 575-583. Rahmathullah, Syed M.; Hall, James Edwin; Bender, Brendan C.; McCurdy, Donald R.; Tidwell, Richard R.; Boykin, David W., J. Med. Chem., 1999, 42(19), 3994-4000.
30
NH H2N
HN N N N H
NH
H2N
NH N H
HN
N N H
NH NH2
NH2
NH2 H2N
11
HN H2N H N CO
12
H N CO NH NH2
13
14
Figura 6: Compostos aromticos bis-amidnicos com atividade antimicrobiana: Berenil(11) potncia, derivado tipo para-ftanildico(14), menor potncia. e seus derivados: derivado pirrlico(12) com maior potncia que o berenil, derivado imidazlico(13), menor
I.1.a.4-Alterao dos Substituintes Bioisosterismo A forma mais usual e sistemtica para formao de anlogos se d por modificao dos grupos funcionais da molcula. No incio do sculo XX, foi introduzido um estudo de compostos contendo o mesmo nmero de tomos com o mesmo arranjo de eltrons, porm com diferentes tomos, o qual foi denominado isosterismo23. Mais tarde, este conceito foi ampliado por Erlemeyer como sendo elementos, molculas ou ons com arranjos perifricos de eltrons que poderiam ser considerados idnticos24. O termo bioisosterismo, adotado por Friedman25 em 1952, foi utilizado para designao de compostos que no apenas apresentavam caractersticas fsicoqumicas semelhantes, como tambm semelhantes atividades biolgicas. A substituio bioisostrica segue a classificao de Burger26: 1- Bioissteros clssicos: tomos e grupos monovalentes (F, OH, NH2, CH3, etc.), tomos e grupos divalentes (CH2, O, S, etc.), tomos e grupos trivalentes (CH, N, P, As, etc.) e tomos tetravalentes (C, Si, N+, P+, As+, etc.). 2- Bioissteros no-clssicos: grupos interconversveis (ou intercambiveis) ((a) CO, CO2, SO, SO2NR, (b) COOH, SO3H, (c) H, F, OH, etc.) Todavia, deve-se sempre considerar que o emprego bem adequado e previamente racionalizado da modificao bioisostrica deve antecipar, ou prever a influncia destas alteraes sobre as propriedades fsico-qumicas da molcula. Assim, como exemplo: a astromicida, ou sulfanilamida (2, Figura 7), um importante agente clnico inibidor da enzima
23 24
Langmuir, I., J. Am. Chem. Soc., 1919, 41, 1543-1559. Erlenmeyer, H., Bull. Soc. Chim. Biol., 1948, 30, 792-805. 25 H. L. Friedman, Influence of Isosteric Replacements upon Biological Activity, National Academy of Sciences-National Research Council Publication No. 206. Washington 1951, pp. 295. 26 Burger, A., Pharm. Acta Helv., 1963, 38(10), 705-9.
31
carbonato hidrolase, quando modificada bioisostericamente no grupo amino pelo grupo metila, alm do aumento da lipofilia tambm acarreta no aumento da atividade biolgica.27
SO2NH2 SO2NH2
Me 4-metil-benzenosulfonamida
NH2 Astromicida
15
Figura 7: Estruturas da 4-metil-benzenossulfonamida e da astromicida Assim, o bioisosterismo leva em conta uma srie de fatores fsico-qumicos da substncia, entre os quais, os principais j foram explicados acima. Tais parmetros levam ao planejamento racional de frmacos e podem ser resumidos da seguinte maneira: (1) tamanho, volume e distribuio eletrnica do tomo, grau de hibridizao, polarizabilidade, ngulos de ligao, efeitos indutivos e mesomricos etc.; (2) lipofilia, pKa etc. (3) reatividade qumica, (objetivando prever as biotransformaes inclusive na alterao de toxicidade dos metablitos) etc.; (4) fatores conformacionais, possibilidade de ligaes de hidrognio inter- ou intramoleculares28. Cabe aqui ressaltar que h um outro mtodo de modificao molecular mais recente, o conhecido hbrido molecular que ser somente relatado posteriormente junto parte de antitumorais (item I.2).
I.1.a.5-Modificaes Moleculares e Relaes Quantitativas Estrutura-Atividade (QSAR) A investigao mais importante quanto s modificaes moleculares em compostos-prottipo com atividade biolgica comprovada o estudo da influncia desta alterao atravs de relaes estrutura qumica-atividade farmacolgica (SAR Structure-Activivity Relation Ships) levandose em conta no apenas as atividades dos compostos anlogos com estruturas semelhantes, como tambm as alteraes acarretadas nas propriedades fsico-qumicas dos compostos estudados e como estas alteraes influenciam a qumica e a atividade farmacolgica. O estudo quantitativo da atividade farmacolgica (QSAR Quantitative Structure-Activivity Relation Ships) s se tornou possvel com o desenvolvimento da cincia na rea de conhecimento da estrutura molecular e na possibilidade da quantificao destas correlaes entre estrutura e atividade. Em 1964 surgiu a primeira expresso quantitativa significativa da relao entre estrutura qumica e atividade farmacolgica com os estudos de Corwin Hansch e Toshio Fujita29, 30 que comprovaram a
Jaiswal, Mona; Khadikar, Padmakar V.; Supuran, Claudiu T. Bioorg. Med. Chem. Let. 2004, 14(22), 5661-5666. Barreiro, E. J.; Fraga, C .A. M. Qumica Medicinal: as Bases Moleculares da Ao de Frmacos. Porto Alegre 2001, Artmed ed, pp. 85-86.
28
29
27
Hansch, C.; Fujita, T., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 1616. Hansch, C.; Leo, A., Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. Nova Iorque 1979, Wiley. Hansch, C.; Steward, A. R.; Anderson, S. M.; Bentley D., J. Med. Chem., 1968, 11, 1-11. Muir, Robert M.;
32
influncia da lipofilia, e do coeficiente de partio octanol-gua (log P) na atividade farmacolgica. Isto ocorre devido ao processo de transporte de frmacos, pois vrios efeitos biolgicos do soluto, incluindo sua permeabilidade atravs da membrana celular que sofre um aumento ou reduo em funo de seus coeficientes de partio octanol/gua. Com estes estudos de Hansch e Fujita que realmente se iniciou a chamada nova era da Qumica Medicinal, a ERA QSAR e a partir dos trabalhos de Hansch vrias correlaes de sucesso envolvendo coeficientes de partio foram estabelecidas. Anteriormente at apareceram algumas tentativas31 de tal correlao mas, sem os mtodos matemticos relevantes usados por Hansch e Fujita. Cabe destacar que usualmente a correlao entre a lipofilia e a atividade farmacolgica geralmente exibe um comportamento parablico32 (Equao 1): Log 1/C = a0 + a1 log P + a2 (log P)2 Equao 1
Matematicamente, tal dependncia parablica entre log P e algum tipo de atividade biolgica medida atravs da concentrao molar C, provocando uma resposta biolgica padro, tais como DE50 ou DL50, pode ser obtida assumindo que a probabilidade de um frmaco atingir o stio ativo distribuda em relao ao log P. Entretanto, cabe ressaltar que Hansch e Fujita30-32,34, j em seus artigos pioneiros, avaliaram o reducionismo simplificador destas avaliaes, e observaram que seria possvel descrever diversos tipos de sistemas de correlao estrutura-atividade, no caso 5 (cinco) tipos na ordem relatada pelos autores: i) dependncia linear entre o log 1/C e (constante lipoflica) (log 1/C = a + b) observada na avaliao da citotoxicidade de cidos benzicos com larvas de mosquito e a atividade bactericida de fenis contra Micrococcus pyogenes var. aureus; ii) ordem secundria de complexidade (log 1/C = - a2 + b + c), como para a atividade de fenis contra Salmonella typhosa e na atividade carcinognica de dimetilaminobenzenos; iii) a lipofilia no apresenta maior importncia, mas outros parmetros como os eletrnicos () (log 1/C = + c) que so influentes, como no caso da atividade inseticida de molculas muito polares como os fsforo-steres fenlicos; iv) h influncia mista entre lipofilia e efeitos eletrnicos (log 1/C = a + + c), como no estudo da atividade de inseticidas em mosca domstica e de anestsicos locais; e v) situao de equao complexa tal como: log 1/C = - k2 + k k02 + + k , observada na atividade carcinognica de hidrocarbonetos aromticos e benzacridinas e no estudo da atividade tiroxnica de difenil-teres diversos.
Fujita, T.; Hansch, C., Plant Physiol., 1967, 42, 1519. Hansch, C., Drug Dev. Res., 1981, 1, 267. Hansch, C., Drug Infect. J., 1984, 18, 115. Craig, P. N., Drug Infect. J., 1984, 18, 123. Hansch, C., Acc. Chem. Res., 1993, 26, 147. 30 Fujita, T.; Iwasa, J.; Hansch, C., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 5175; Leo, A., Hansch C., Elkins D., Chem. Rev., 1971, 71, 525. Helmer, F.; Kiers, K.; Hansch C., Biochemistry. 1968, 7, 2858. 31 Tute, M.S.; Hystory and objectives of quantitative drug design Em: Hansch, C.; Sammes, P. G. e Taylor, J. B. (Eds) Comprehensive Medicinal Chemistr, vol. 4, Quantitative Drug Design. Nova Iorque 1990, Pergamon Press, pp.1-31. 32 Hansch, C; Steward, A. R.; Anderson, S. M.; Bentley, D. J., J. Med. Chem., 1968, 11, 1-21. Flynn, G. L.; Yalkovsky, S. N., J. Pharm. Sci., 1972, 61, 838-852. McCall, J. M., J. Med. Chem., 1975, 18, 549-554. Shoenwald, R. D.; Huang, H. S., J. Pharm. Sci., 1983, 72, 1266-1272. Hansch, C.; Clayton, J. M., J. Pharm. Sci., 1973, 62, 1-21.
33
Atualmente, com o estudo sistemtico e quantitativo da influncia da alterao da estrutura qumica sobre propriedades fsico-qumicas dos frmacos em planejamento, no s a lipofilia. A cincia consegue o planejamento racional de novos frmacos a partir de relaes estrutura-atividade biolgica de forma sistemtica, no ocorrendo mais a busca randmica, ou o achado ocasional (serendipity) de novos frmacos como na Antiguidade. Tambm no mais necessrio buscar novos derivados mais lipoflicos simplesmente pelo aumento da cadeia carbnica por homlogos superiores tipo metil, etil, futil, como diria um dos grandes especialistas desta rea, Van der Waterbeemd33, no nome de um de seus artigos mais conhecidos e polmicos. Na histria do desenvolvimento racional de frmacos destaca-se, em 1972, a descoberta por um grupo de pesquisadores da empresa farmacutica britnica SmithKline & French - da cimetidina (ou Tagamet)34,37 que considerada como um marco na histria da Qumica Medicinal (Figura 8)37 e cuja molcula foi totalmente planejada, sintetizada e desenvolvida considerando-se as correlaes entre as caracteristicas fsico-quimicas, como a lipofilia dentre outras, e a estrutura molecular utilizando-se a modificao molecular com base no bioisosterismo (Figura 9). A cimetidina (24, Figura 9) foi o primeiro antagonista seletivo de receptores histamnicos, principalmente do subtipo 2, (H2 antagonista neuroreceptor responsvel pela produo de secreo gstrica). Este frmaco vem sendo muito til at hoje, na clnica mdica para tratamento e preveno de lcera gstrica, alm de ser o composto prottipo para o desenvolvimento de novos frmacos da mesma classe. O principal desafio de Robin Ganellin e colaboradores no planejamento molecular da cimetidina (24) era introduzir na estrutura de um prottipo atributos de seletividade a receptores de histamina do tipo H1 e H2, sendo que este ltimo receptor foi o principal alvo teraptico. Como a topografia destes neuroreceptores no era conhecida, os pesquisadores decidiram adotar a histamina (tautmeros 16 e 17 Figura 9), que um agonista natural, como composto prottipo. A natureza imidazlica da histamina resulta em tautmeros, dependendo do tautmero predominante, a distncia (d1 ou d2) entre o grupo amino-terminal e o tomo de nitrognio no hidrogenado no anel imidazlico varia, podendo ser um critrio de reconhecimento molecular dos receptores H1 ou H2. Modificando este composto prottipo, Ganellin observou que a metilao do sistema imidazlico modificava o esquilbrio tautomrico favorecendo a forma tautomrica 19, necessria seletividade pelos receptores H2. A presena do grupo tioter na cadeia lateral da cimetidina (24) impede o equilbrio tautomrico do anel imidazlico e, alm disso, assegura as propriedades hidrofbicas adequadas para o frmaco. A funo ciano-guanidina foi introduzida, na cadeia lateral, por sucessivas modificaes na unidade N-aquil-uria (20) guanidina (21) ureia-guanidina (22) nitroguanidina (23). Apesar de esta ltima funo ter fornecido um derivado extremamente ativo, com excelente seletividade e mesmo padro tautomrico, este composto apresentou baixa solubilidade, com limitado ndice de excreo e risco de danos renais, o que motivou a sntese da cimetidina (24), com funo ciano-guanidina34, 35.
33 34
Van de Waterbeemd, H.; Smith, D. A.; Jones, B. C. ; J. Computer-Aided Molec. Des. 2001, 15, 273. Barreiro, E. J., Fraga, C. A. M., Qumica Medicinal: As Bases Moleculares da Ao dos Frmacos. Porto Alegre 2001, Artmed Editora, pp. 85-86. 35 Nogrady, T; Weaver, D.F. Medicinal Chemistry: A molecular and Biochemical Approach. 3rd. edition. Nova Iorque 2005, Oxford University Press, pp. 267.
34
Figura 8: Robin Ganellin, Graham J. Durant, Michael E. Parsons e James W. Black no evento comemorativo promovido pela sociedade britnica e Americana de Qumica dos 25 anos da cimetidina36.
d1
H
N N H
H N N
d2
N NH2 H N N H N
H N NH2
18
N S N H H N HN N H N S N H
19
H N N O H N NH2
N S N H
16
H N O
17
H N
N S N H
H N N
21
H N N H
N S
H N N
22
H N CN
NO2
24
Figura 9: Tautmeros da histamina (16 e 17); tautmeros da metil-histamina (18 e 19); intermedirios
Segundo Ganellin37, as interaes moleculares so determinadas fundamentalmente por tamanho da molcula, forma e distribuio de carga, mas quando se estuda molculas nestes termos preciso considerar as diferentes espcies em equilbrio, ou seja sua natureza dinmica tem que ser levada em conta. Entre os fatores que so necessrio para estudo esto os equilbrios conformacionais e prototrpicos o que leva ao esquema abaixo:
36 www.pomona.edu, www.biosolveit.de, http://pubs.acs. org/cen/coverstory/83/8325/8325tagamet.html Acessado em: 07/06/2008 37 Ganellin, R. , J. Med.Chem., 1981, 24(8), 913-920.
35
ESTRUTURAS DINMICAS
EQUILBRIO CONFORMACIONAL
EQUILBRIO PROTOTRPICO
MUDANDO A ESTRUTURA ALTERA-SE O EQUILBRIO RELACIONA-SE A ATIVIDADE MECANISMO DE AO MTODO DE DESIGN DE FRMACO
Este esquema sintetiza aquilo que Ganellin denominou Tcnica de Anlise da Dinmica Estrutura-Atividade37 (Dynamic Structure-Activity Analysis DSAA), que segundo ele, explica a natureza da dinmica das molculas estudadas, esta foi a tcnica utilizada para o planejamento da cimetidina. Atualmente, para o planejamento racional de novos frmacos potenciais, dentro da rea da Qumica Medicinal, possvel compreender indiretamente no s a maior (ou menor) biodisponibilidade, mas tambm as interaes frmaco-receptor em nvel molecular, graas ao desenvolvimento e esclarecimento das estruturas dos compostos envolvidos pelo uso das tcnicas de cristalografia de raios-X e de modelagem molecular. Assim, possibilita-se efetuar a sntese ou a modificao molecular de substncias bioativas de modo planejado e racionalizado atravs da descrio detalhada das molculas, desde a sua constituio atmica (passando por relaes entre a estrutura e propriedades fsico-qumicas) at suas caractersticas estruturais. Desta maneira, se leva em conta a(s) interao(es) com os diferentes sistemas biofases/biolgicos para a compreenso em nvel molecular de processos bioqumicos/farmacolgicos, toxicolgicos e farmacocinticos. Dentre vrios exemplos importantes e notrios no planejamento moderno de novos frmacos, com o uso de metodologias modernas de QSAR e de modelagem molecular, pode-se destacar o desenvolvimento de novos agentes antineoplsicos que interagem com o DNA38. Como j bem conhecido, o DNA apresenta na sua estrutura interna as bases nitrogenadas heteroaromticas neutras, tornando a fenda hidrofbica pela ocorrncia de ligaes de hidrognio (Figura 10), mas, ao redor do DNA h os grupos fosfatos aninicos, e sendo assim, dependendo-se
38
Almeida, V. L.; Leito, A., Donnici, C. L. , Lopes, M. T. P., Montanari, C. A., Quim. Nova, 2005, 25, 118.
36
do ligante, o DNA ter diferentes tipos possveis de interao. Tais interaes podem ser atualmente visualizadas e investigadas atravs da distribuio do potencial eletrosttico do DNA39, que tcnica de modelagem molecular usual (Figura 11), e dependendo da seqncia dos pares de bases possvel distinguir o potencial eletrosttico, negativo e positivo, obtendo-se um mapa de contorno que direciona os estudos prvios om eficincia. Assim de modo geral na parte mais externa das fendas h os grupos fosfatos gerando maior densidade de carga negativa (mostrando cor avermelhada) e na parte mais interna tem-se maior densidade de carga positiva (mostrando cor esbranquiada). Observam-se diferenas estruturais (forma e carga) em relao diferente composio de pares A:T e G:C, que so tambm facilmente avaliadas pelos mapas de contorno do potencial elestrosttico e assim os pares A:T exibem um potencial mais negativo e quando consecutivos geram fendas mais estreitas (3-4 ). Por sua vez, os pares G:C exibem um potencial mais positivo (Figura 11) gerando fendas mais largas; por isso quase todos os ligantes da fenda menor ricas em A:T possuem cargas catinicas, complementares ao potencial negativo da regio A:T. Essa estrutura e esses fatores eletrnicos contribuem para seqncias especficas de ligao de ligantes fenda menor40,41,42.
A:T
N N O H H N NH N O HN N
C:G
N N N
H
O NH NH HN N N O
25
26
Figura 10: Visualizao esquemtica de ligaes de hidrognio, doadores (em azul) e receptores (em verde) nas extremidades das bases A:T e G:C segundo o modelo de Watson-Crick. A existncia desta forma convexa de DNA leva a interaes seletivas com alguns frmacos bis-catinicos, conhecidos como bis-amidinas, que so conformacionalmente cncavos, apresentando conformaes ditas iso-hlicas, com a complementaridade adequada para a ocorrncia de interaes (isohelicity concept43). Incluem-se nessa classe de ligantes fenda menor molculas pequenas, que mostram seletividade por regies A:T como por exemplo o berenil (11, Figura 7) (atividade antiprotozoria, tripanossomicida e antimicrobiana44) e o composto conhecido como Hoechst 33258 (28, Figura 12) (atividade antitumoral45 e contra Pneumocistii carinii46). H muitos estudos comparativos que mostram a interao com o DNA e atividades
39 40
Neidle.S. , Nat .Prod .Rep., 2001, 18, 291 Sauers, R. R., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 2573. 41 Chang, D.; Cheng, S., Int. J. Biol. Mol., 1996, 19, 279. 42 Tabernero, L.; Bella, J.; Alemn, C., Nucleic Acids Res., 1996, 24, 3458. 43 Neidle.S., Nat .Prod. Rep., 2001, 18, 291. 44 Schmitz, H.; Hubner, W., Biophys. Chem., 1993, 48, 61. Pilch, D. S.; Kirolos, M.A.; Liu, X.; Plum, G.E; Breslauer, K. J., Biochemistry, 1995, 34, 9962. 45 Kraut, E. H.; Masspeis, L.; Bakerzark, S. ,Grever, M., Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., 1988, 7, 62. 46 Lombardy, R. L.; Tanious, F. A.; Ramachandran, K.; Tidewell, R. R and Wilson, W.D., Med. Chem., 1996, 39, 1453.
37
biolgicas de diversos outros compostos como distamicina e netropsina (27, Figura 13), sendo que todos estes se ligam mais firmemente as seqncias 5- AAAA e 5-AATT do que s seqncias 5TTAA e 5-TATA, sendo que, dentre estes, o Hoechest 33258 mostrou maior habilidade para discriminar estas seqncias47.
Figura 11: Visualizao do potencial eletrosttico da superfcie da dupla estrutura cristalina do oligonucleotdeo. (a) o dodecanucleotdeo d(CGCAAATTT-GCG) (NDB cdigo BDL038), mostrando o estreitamento A:T na fenda menor, no centro da seqncia. (b) mostrando o alargamento G:C na fenda menor da estrutura cristalina d( CCAGGCCTGG) )(NDB cdigo BDJ017).
27
28
Figura 12: Estruturas de distamicina, netropsina e Hoechest 33258. Um dos primeiros compostos a ser identificado como real ligante fenda menor (minor groove binders, MGBs) foi a netropsina (27, Figura 12), cuja energia de interao com o DNA da ordem de 10-12 Kcal mol-1, que mostrou elevada especificidade na interao com o DNA. A determinao experimental da estrutura cristalina da netropsina complexada com a dupla hlice do dodecanucleotdeo d(CGCGAATTCGCG)48 , confirmou a interao entre esse frmaco e as bases A:T (Figura 13)49. O dodecanucleotdeo amplamente adotado como um modelo geral para estudo de outras substncias que se ligam fenda menor50. Desta maneira, molculas que apresentam
47 A. Abudaya, P. M. Brown and K. R.Fox, Nucleic Acids Res., 1995, 23, 3385. A. Abudaya and K. R. Fox, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 4962. 48 M. L. Kopka, C. Yoon, D. Goodsell, P. Pjura; R. E. Dickerson, J. Mol. Biol., 1985, 183, 553. 49 Marky, L. A., Curry, J., Breslauer, K. J. Molecular basis of Cancer, Part B. Nova Iorque 1985, Alan R. Liss. 50 H. M. Berman, W.K. Olson, D. L. Beveridge, J. Westbrook, A. Gelbin, T. Demeny, S-H Hsieh, A. R. Srinivasan and B. Schneider, Biophys. J., 1992, 63, 751.
38
interaes especficas com a fenda menor do DNA tm despertado interesse, como potenciais agentes teraputicos em uma variedade de doenas humanas alm de cncer6,51.
Figura 13: Visualizao da estrutura cristalina da netropsina complexada com d(CGCGAATTCGCG) (NDB cdigo GDLB05)
I.2 NEOPLASIAS E COMPOSTOS QUE INTERAGEM COM DNA52 Cncer, tambm conhecido como neoplasia, o nome dado a um conjunto de mais de cem doenas que tm em comum o crescimento desordenado (maligno) de clulas que invadem os tecidos e rgos, podendo se espalhar (metstase) para outras regies do corpo. Esta uma doena que atinge quase todos os organismos multicelulares. Em pesquisa realizada pela Organizao Mundial de Sade (OMS), o cncer a terceira causa de bitos no mundo (12%), matando mais de 6,0 milhes de pessoas por ano. No Brasil a segunda causa de mortes por doena, estimando-se em 2008, 466.730 casos novos; mais especificamente na regio Sudeste, calcula-se que sero 120.330 novos diagnsticos53,19,54 Embora nenhum medicamento ou tratamento definitivo contra o cncer tenha sido encontrado, grande progresso na rea da medicina conhecida como oncologia tem sido obtido na compreenso das causas do cncer, no desenvolvimento de tratamentos efetivos e de novos anticancergenos55, 56. A quimioterapia o mtodo (geralmente usado por via oral) que utiliza compostos qumicos, chamados agentes quimioterpicos (ou antineoplsicos), no tratamento de doenas causadas por agentes biolgicos (patolgicos). Quando aplicada ao cncer, a quimioterapia chamada de quimioterapia antineoplsica ou quimioterapia antiblstica. Os primeiros registros de tratamento quimioterpico efetivo surgiram no final do sculo passado com a descoberta da soluo de Fowler (arsenito de potssio), por Lissaver (1885), e da toxina de Coley (combinao de produtos bacterianos), em 1890.
Henderson, D., Hurley, L. H., Nat. Med., 1995, 6525. Rajski, S. R., Williams, R. M., Chem. Rev., 1998, 98, 2723. 53 http://www.inca.gov.br/estimativa/2008/index.asp?link=tbregioes_consolidado.asp&ID=1 (Acessado em 13/06/2008) 54 Vasconcelos, A.C. Tpicos da Patologia; Instituto de Cincias Biolgicas-Laboratrio Apoptose. BeloHorizonte 1997, pp.31-34. 55 Ministrio da Sade: Mensagem aos mdicos. Cncer Fundamentos, Secretria de Asistncia Mdica-Diviso Nacional de Cncer. Braslia 1971, pp.7-47. 56 http://www.qmcweb.org Acessado em 13/06/08
52
51
39
Diferentemente da cirurgia e da radioterapia, a quimioterapia utilizada em tratamento sistmico, ou seja, que atua em todo corpo, base de frmacos que impedem a reproduo celular e, consequentemente, levam as clulas malignas morte. Estes frmacos podem ser ministrados isoladamente (monoquimioterapia) ou combinados (poliquimioterapia), sendo que a ltima apresenta resultados mais eficazes, pois consegue maior resposta a cada aplicao, diminuindo o risco de resistncia aos frmacos e conseguindo atingir as clulas em diferentes fases do seu ciclo58. Com isso, com a quimioterapia atual, pode-se obter maior expectativa de vida tendo-se em diversos casos at cerca de 66 % de pacientes livres do cncer por mais de 10 anos 57. A descoberta dos agentes alquilantes e dos seus efeitos teraputicos, que tm seu mecanismo de ao relacionado com o DNA58,
59
1943, um ataque areo alemo destruiu um depsito americano de gs mostarda (1,5-diclorotiopentano, Cl(CH2)2-S-(CH2)2Cl) em Bari, Itlia, dando origem a mielo-depresso intensa entre o grupo de indivduos contaminados, o que despertou a ateno de um grupo de farmacologistas clnicos a servio do Pentgono57-61. Com a finalidade de produzir resultados teraputicos, o frmaco foi ento administrado num doente portador de linfoma maligno avanado e foi constatada uma regresso tumoral importante, porm de curta durao. Dentre as vrias classes destes frmacos antineoplsicos muito usados clinicamente, podem-se destacar alguns agentes antitumorais cuja ao est ligada a interaes com o DNA128,52. A caracterstica mais interessante destes agentes que na maior parte dos casos trata-se de molculas simples e que costumam apresentar mecanismo de ao definido. Entre estes agentes destacam-se os compostos nitrogenados, que so os mais antigos e mais estudados agentes antitumorais que interagem com o DNA52,60 e que esto entre os compostos mais utilizados at hoje na clnica anticncer61; destacando-se a mecloretamina (29, Figura 16) e o clorambucil (30, Figura 14).
O OH O
n
Cl
Cl
29
Cl N Cl Cl N Cl
30
31
57
Foye, W. O.; Sengupta, S. K. Principles of Medicinal Chemistry. Baltomore 1996, Williams & Wilkins, pp. 822-845.
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40
Outra classe de agentes antitumorais composta por molculas simples e de alta atividade antitumoral para vrias linhagens de clulas cancerosas conhecida como classe dos alquilsulfonatos57-59. Dentre eles destacam-se os anlogos do busulfan (32, Figura 15)62, que mostra conclusiva atividade relacionada a interaes cruzadas com o DNA e o clomesone (33, Figura 15), que apresenta alta atividade contra leucemia P38863.
O S O O
nO
O S O
O S O O O
O S O Cl
32- n=4=9
33
Figura 15: Agentes antitumorais do grupo dos alquilsulfonatos H tambm o uso clnico do complexo conhecido como cis-platina, ou cis-Pt (34, Figura 16), descoberta h 150 anos atrs e que tem sido usada como eficiente agente antitumoral nos ltimos 30 anos.64 A ao da cis-platina tem sido enfatizada pela sua capacidade de formao de ligaes65 e de mutaes66 com o DNA. Outras evidncias52 sugerem que antes da sua ao biolgica, a cis-platina passe por processos de hidratao e que a converso da espcie neutra cisPt na espcie dicatinica do complexo bis-aquoso (35) torna esta espcie especialmente atrada pelo DNA por interaes eletrostticas (Figura 16).
cis-[Pt(NH3)2Cl2] k1 k-1
k2 k-2
cis-[Pt(NH3)2ClH2O]+
34
cis-[Pt(NH3)2ClH2O]+ cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]+2
35 Figura 16: Equilbrios qumicos da hidratao da cis-Pt (34). Uma outra recente classe de compostos (Figura 17) demonstra o possvel efeito sinrgico da funcionalizao mista de novos compostos planejados como antitumorais; a cis-platina foi complexada com bis-amina tipo espermidina (como em 36 e 37), sub-unidade tambm ativa, e obteve-se aumento da atividade antitumoral; assim, os anlogos dimricos da cis-platina com
Tong, W. P.; Ludlum, D.B., Biochem. Biophys. Acta, 1980, 608, 174. Hartley, J. A.; Gibson, N.W.; Kohn, K. W.; Mattes, W. B. Cancer Res., 1986, 46, 553 e 1943, 1986. Pegg, A. E.; Dolan, M. E.; Young, G. S. Cancer Res., 1986, 46, 4500. Pegg, A. E.; Dolan, M. E.; Young, G. S. Cancer Res., 1986, 48, 3603. Brent, T. P.; Lestrud, S. O.; Smith, D. G.; Remack, J. S. Cancer Res., 1987, 47, 3384. Struck, R. F.; Alexander, J. A .; McCain, D. M.; Shealy, Y. F.; Rose, L. M., Biochem. Pharmacol., 1991, 41, 457. 64 Reeddijk, J., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1996, 801. Shermnan, S. E.; Lippard, S. J., Chem. Rev., 1987, 87, 1153. Lippard, S. J. Em: Platinum and Other Metal Coordination Compounds in Cancer Chemoterapy. Nova Iorque 1991, Plenum Press, pp. 1-10. 65 Corda, Y.; Job, C., Anin, M. F.; Leng M.; Job, D., Biochemistry, 1993, 32, 8582. Brown, S. J.; Kellett, P.J., Lippard, S. J., Science, 1993, 261, 603. Treiber, D. K.; Zhai, X. Q., Jantzen, H. M., Essigmann, J. M., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 5672. Pil, P. M.; Lippard, S. J., Science, 1992, 256, 234. Kutyavin, I. V. e col.; J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9303. 66 Brouwer, J.; Vandeputte, P.; Fichtingerschepman, A. M. J., Reedijk, J.; J. Proc. Nat. Acad. Sci. Biol. U.S.A., 1981, 78, 7010. Bubley, G. J.; Ashburner, B. P., Teicher, B. A.; Mol. Carinog., 1991, 4, 397. Cariello, N. F.; Swenberg, J.., Skopek, T. R., Cancer Res., 1992, 52, 2866.
62 63
41
ligantes do tipo espermidina (Figura 17) no s tm mostrado muito ativos contra clulas tumorais67,68 mas, principalmente ativos com tumores resistentes cis-Pt69.
Cl Y Pt Y H2N Y Cl Pt Y NH2
36 Y = py; 37 Y= NH3 Figura 17: Complexos de platina com bis-aminas. Apesar do objetivo primrio da quimioterapia ser o de destruir as clulas neoplsicas, preservando as normais, a maioria dos agentes quimioterpicos, porm atua de forma noespecfica, lesando tanto clulas malignas quanto normais,
70,71
particularmente as clulas de
rpido crescimento, como as gastrointestinais, capilares e as do sistema imunolgico, o que explica a maior parte dos efeitos colaterais da quimioterapia: nuseas, perda de cabelo e suscetibilidade maior a infeces.72 Assim, o uso clnico desses frmacos exige que os benefcios sejam confrontados com a toxicidade na procura de um ndice teraputico favorvel. Por este motivo pesquisadores do mundo todo procuram desenvolver novos agentes quimioterpicos mais seletivos e menos txicos, ditos antitumorais. Hoje, apesar de inmeros agentes quimioterpicos usados para este tipo de ao, temos estimado que devem existir cerca de 350 novos compostos estudados e aplicados experimentalmente em mais de 20 mil pacientes em todo o mundo57,59,80.
I.2.a.HBRIDOS: NOVOS COMPOSTOS-PROTTIPO ANTINEOPLSICOS Uma abordagem recente e avanada para a descoberta de novos agentes antineoplsicos especialmente utilizveis para o tratamento de novos casos de cncer (resistentes aos frmacos atuais) o uso de compostos hbridos, ou o desenvolvimento de compostos-prottipos que sejam a combinao de dois ou mais produtos para formar um hbrido, uma nova espcie que talvez tenha a potncia da atividade antineoplsica como a soma, ou o sinergismo das duas espcies separadas73. H um exemplo da prpria natureza: os alcalides indlicos vimblastina (38, Figura 18) e vincristina (39, Figura 18) que so produtos naturais hbridos, como se fossem produtos da juno entre a catarantina (40) e a vindolina (41). A atividade anti-mittica da catarantina (41) -
67
van Boom, S. S. G. E.; Reedjik, J.; van Boom, J. H.; Farrell, N. Wang, A. H-J., Nat. Struct. Biol., 1995, 2, 577b. Farrell, N.; Soares Fontes, A. P.; Appleton, T.G.; Roberts, J.D., Biochemistry, 1995, 34, 15480. 68 Manzotti, C. ; Pezzoni, G.; Giuliani, F.; Valsecchi, M.; Farrell, N.; Tognella, S., Proc. AACR, 1994, 35, 2628. 69 van Houten, B.; Illeneye, S.; Qu, Y.; Farrell, N., Biochemistry, 1993, 132, 11794 70 Murad, A. M.; Katz, A. Oncologia Bases Clnicas do Tratamento. Rio de Janeiro, Guanabara, pp. 41.
71 Salmonm, S. E. Em: Farmacologa Bsica & Clnica, Katzung, B. G. Rio de Janeiro 1998, Guanabara Koogan S. A., pp. 629-655. 72 Spence, R. A. J.; Jonhston, P. G. Em: Oncology; Jonhston, P. G. Oxford 2001, Oxford University Press.
73
Tietze, L. F.; Bell, P. H.; Chandrasekhar, S., Angew. Chem. Int. Ed,. 2003, 42, 3996.
42
DL50 in vivo (P-388): >800 mg/kg - muito menor do que a atividade observada para a vinblastina (38) ou para a vincristina (39) - DL50: 17,2 e 5,3 mg/kg, respectivamente.74
40
41
Figura 18: Alcalides indlicos vimblastina, vincristina, catarantina e vindolina. Um outro exemplo (Figura 19) que demonstra a grande potencialidade da abordagem de modificao molecular a partir da formao de hbridos (tipo 42), entre o taxol (43, Paclitaxel) - frmaco anti-neoplsico dos mais utilizados no mundo - e a camptotecina (44) um potente inibidor da topoisomerase muito usado para o tratamento de cncer de estmago, do clon e do reto57 (Figura 19). Todas as novas espcies qumicas hbridas tipo 42 formadas so agentes antineoplsicos mais potentes do que as espcies 43 e 44 separadas ou do que a mistura destas.
43
44 Figura 19: Estruturas do hbrido (42) formado por taxol (43) e camptotecina (44). Croy e colaboradores prepararam com sucesso um composto hbrido (45, Figura 20) contendo estradiol e N,N-bis(2-cloroetil)anilina, com o objetivo de obter compostos que fossem
74
43
seletivos para clulas de cncer de mama devido a interao covalente com o DNA que o fragmento de N,N-bis(2-cloroetil)anilina apresenta.75 Da mesma forma, vrios pesquisadores vm estudando novos derivados bis-funcionalizados mistos/hbridos sendo digno de nota, que estes agentes foram compostos-modelo para o planejamento racional de novos anlogos com potencial atividade antineoplsica. Dentre os vrios estudos relatados, selecionaram-se os estudos de Cohen e colaboradores76, de Stark e Meadows77 sobre derivados mistos tipo espermidina-clorambucil (46 e 47, Figura 21) e de Prakash e colaboradores78 que estudaram derivados mistos tipo intercalantes-clorambucil (48 a 50, Figura 21), todos com alta potencialidade como agentes antineoplsicos. Pode-se notar que nestes casos deve ocorrer o efeito sinrgico da parte tipo alquilante (N-CH2-CH2Cl) com a outra parte adicionada: no primeiro caso, os grupos amino da parte espermidnica devem estar protonados e gerar interaes eletrostticas com o DNA; no segundo caso, h os anis heteroaromticos que devem adentrar na fenda do DNA por intercalao gerando interaes lipoflicas secundrias, mas importantes.
Estradiol OH
HO
H N
6 2
O O N H
2
bis(2cloroetil)anilina
Ligante
Cl
Cl
45 Figura 20: Composto hbrido 45 que apresenta seletividade para clulas de cncer de mama. H exemplos de compostos funcionalizados hbridos entre mostardas nitrogenadas e com presena e com a presena de grupos tioureido que tambm apresentam atividade antitumoral. Em 1995, Chen, Wang e Zhou79 relataram a baixa toxidez e a alta potncia antitumoral, alm de atividade viruscida de derivados tipo clorambucil U, mas polifuncionalizados com grupo Ntioureido e fosforoimidato (Figura 22).
Sharma, U.; Marquis, J.C; Dinaut, A.N.; Hillier, S.M.; Fedeles, B.; Rye, P.T; Essigmann, J.M.; Croy, R.G., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 38293833.
75
76 Cohen, G. M.; Cullis, P. M.; Harltey, J. A.; Mather, A.; Symons, M. C. R.; Wheelhouse,R. T., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1992, 298. Holley, J.
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78 Prakash, A. S.; Denny, W. A.; Gourdie, T. A.; Value, K. K.; Woodgate, P. D.; Wakelin, L. P. G., Biochemistry, 1990, 29, 9799.
79
Chen, R. Y.; Wang, H. L.; Zhou, J., Chem. J. Chin. Univ., 1995, 16, 1229.
44
Alm disso, o grupo tioureido (ou S-tioureido, S(C=NH)NH2) tem sido mostrado como grupo farmacolgico em alguns estudos, entre os quais, o de El-Subbagh e Obaid80, em 1996, reportaram que tiazis tioureido-substitudos (52, Figura 23) apresentam atividade antitumoral contra aproximadamente 60 linhagens de clulas tumorais, tais como: leucemia, pulmo, prstata, ovrio e mama entre outros. Os autores concluram que o grupo NHCSNH-R (ou R) em questo era essencial para atividade antitumoral dos compostos estudados.
Cl
NH2 H N O
Cl
Cl
H2N
Cl HN N
n
Cl
H2N
H2N
N H
H N O
N Cl
46
47
48
N N H
n
H N
n
O N Cl
Cl
Cl
Cl
49 intercalante-clorambucil 50 e 52.
Cl
50
N Cl
H N S
H N NHC6H5 P NHC6H5 O
80
45
O N H N R N H
52
H N N H
S H R'
S S
Figura 23: Alguns dos tiazis 2,4-dissubstitudos estudados por El-Subbagh e Obaid. Em 1998, Supuran e colaboradores81, baseados em clculos de QSAR, descreveram o estudo da inibio da anidrase carbnica (CA) por derivados heterocclicos sulfonamdicos tiouredo substitudos (Figura 24). As sulfonamidas por eles estudadas apresentavam os substituintes uredo ou tiouredo (H2NCXNH-; X = O, S) ligados ao anel aromtico e apresentaram potencial inibitrio contra as iso-enzimas hCA I, hCA II, e hCA IV (h= humano). Foi tambm observado que estas NCE podem ser usadas no tratamento do glaucoma e tambm podem atuar como agentes antibacterianos.
53 n= 0, R= H 54 n=2, R= H
56 R= H 57 R= CSNHPh
SO2NH2
55 n=0, R= CSNHPh
Figura 24: Alguns dos heterocclicos sulfonamdicos tiouredo-substitudos estudados por Supuran e colaboradores90. Como o grupo tioureido pode ser protonado, especialmente em pH fisiolgico, este grupo torna-se um possvel bioisstero do grupo bisamidina, ou seja, o grupo tioureido pode ser investigado como grupo funcional prottipo para investigao de novos agentes anti-neoplsicos e/ou anti-microbianos e que a princpio podem ter o seu mecanismo de ao relacionado interao com o DNA.
I.3-DOENAS INFECCIOSAS EMERGENTES - MICRORGANISMOS FUNGOS E BACTRIAS As infeces causadas por fungos82, quando limitadas superfcie dos tecidos, so relativamente fceis de serem curadas. Contudo, em pacientes cujo sistema imunolgico est comprometido, no caso de pacientes em tratamento de quimioterapia ou transplantados por
Supuran, C.T.; Scozzafava, A.; Jurca, B. C.; Ilies, M. A., Eur.J. Med. Chem. ,1998, 33, 83. Tortora, G. J.; Funke, B. R.; Case, C. L. Microbiologia, 6 ed., Porto Alegre 2000. Simmons, R.D.G. Medical Mycology. Amsterdam 1954, Lacaz, C. S. Porto, E.; Martins, J. E. C.; Heins-Vaccari, E. M.; Melo, N. T. Tratado de Micologia Mdica Lacaz, So Paulo 2001. SUGITA, T., Farumashia , 2008, 44(1), 27-31.
81
82
46
exemplo, as infeces causadas por fungos podem ser graves83. Nos ltimos anos tem ocorrido o aumento do nmero de pacientes em internao hospitalar prolongada e de pacientes imunologicamente vulnerveis (principalmente entre os muito jovens, os muito idosos, indivduos transplantados e portadores de doenas imunossupressoras) e tambm tem aumentado a freqncia de infeces por patgenos oportunistas tanto a fungos como a bactrias. Tais internaes propiciam uma maior exposio do paciente a patgenos multirresistentes, comumente presentes nos centros hospitalares e, alm do mais, h o agravamento da resistncia bacteriana pela limitao das opes teraputicas para as infeces envolvendo estes microrganismos84. Todavia, o que tem assustado a comunidade leiga e, principalmente a comunidade cientfica que, ao longo dos ltimos dez anos, a incidncia de infeces importantes causadas por fungos tem aumentado muito em nmero e em gravidade. No se restringindo ao tipo de pacientes portadores de HIV, neoplasias ou transplantes, mas tambm a pacientes com doenas respiratrias como asma, pneumonia e at com artrite reumatide85. Alm disso, o uso irracional de antibiticos de amplo espectro de ao tem levado ao surgimento de populaes de fungos resistentes a estes agentes antifngicos86, apesar da maior parte dos fungos patognicos ser muito bem conhecida tanto quanto o seu tratamento clnico. Este problema tem sido to srio e crescente mundialmente que os epidemiologistas no mundo inteiro vm alertando os rgos governamentais de sade pblica com o uso dos termos especficos: doenas infecciosas emergentes (DIEs) ou infeces fngicas invasivas (IFIs)93-108. Alguns cientistas especialistas na rea de Microbiologia e de sade vm indicando a necessidade de uma guerra contra estes microrganismos resistentes, visando necessidade urgente do desenvolvimento de novos frmacos mais eficientes contra estes fungos de alta patogenicidade84. O tratamento destas infeces fngicas invasivas (IFIs) e oportunistas permanece ainda insatisfatrio com o uso da maior parte dos agentes antifngicos usuais, tais como o voriconazol no qual um estudo relatou que em 47 a 68% dos pacientes no houve eficcia teraputica. Separando os agentes patognicos, os valores de ineficincia teraputica para o uso de voriconazol so os seguintes: 43,7% para aspergilose, 57,5% para candidase,
87,88
38,9%
para
criptococose,
45,5%
para
fusariose
30%
para
escedosporiose
diagnose e tratamento com o Comit Nacional de Padronizaes para Clinica Laboratorial - NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)89,90 .
Anaissie, E., Clin. Infect. Dis., 1992, 14, S43. Hadley, S.; Karchmer, A. W., Infect. Dis. Clin. N. Am., 1995, 9, 1045. Harbarth, S.; Samore, M. H., Emerg. Infect. Dis., 2005, 11, 794. McGowan, J. E. JR.; Tenover, F. C., Nat. Rev. Microbiol., 2004, 2, 251. 85 Garcia-Ruiz, J-C.; Amutio, E.; Ponton, J.; Revista Iberoamericana de Micologia : organo de la Asociacion Espanola de Especialistas en Micologia, 2004, 21(2), 55-62. 86 Sundriyal, S.; Sharma, R.K.; Jain, R., Curr. Med. Chem., 2006, 13, 1321. 87 Perfect, John R.; Marr, Kieren A.; Walsh, Thomas J.; Greenberg, Richard N.; DuPont, Bertrand; de la Torre-Cisneros, Julian; JustNubling, Gudrun; Schlamm, Haran T.; Lutsar, Irja; Espinel-Ingroff, Ana; Johnson, Elizabeth., Clin. Infect. Dis., 2003, 36(9), 1122-1131. 88 Espinel-Ingroff, A., J. Clin. Microbiol., 2001, 39(3), 954-958. 89 Moellering, Robert C., Jr.; Graybill, John R.; McGowan, John E., Jr.; Corey, Lawrence., Am. J. Med., 2007, 120(7), S4-S25. 90 Carrillo-Munoz, A. J.; Quindos, G.; Lopez-Ribot, J. L., Curr. Med. Chem., 2004, 3(4), 297-323.
84
83
47
Diante deste grave e crescente problema de sade mundial, o governo americano estabeleceu uma comisso nacional para a estudo e preveno das doenas microbianas resistentes - Antimicrobial Resistance Prevention Initiative (ARPI) cuja meta principal auxiliar no desenvolvimento de novos agentes anti-microbianos mais eficientes89,91. Assim, a pesquisa por novos agentes anti-microbianos e/ou a modificao molecular de compostos qumicos j existentes para descoberta de novos compostos-prottipo ou NCE com potencial atividade antifngica so importantes ferramentas para garantir-se o combate ao crescente nmero de fungos patognicos resistentes e proporcionar o uso clnico de compostos cada vez mais eficientes e menos txicos. digno de nota que acredita-se que mudanas climticas e ambientais sejam as responsveis por um aumento de 10 vezes nos casos de infeces por Coccidioides immitis na Califrnia. Atualmente, esto sendo investigadas novas tcnicas para diagnstico e tratamento de infeces fngicas92. Para solucionar esta crise, sero necessrias algumas medidas, entre elas, a intensificao das campanhas educacionais para promover o uso correto dos antibiticos existentes e, como j citado, o incremento dos esforos para o desenvolvimento de novos antibiticos. No caso do Brasil a problemtica tambm j foi constatada h tempos e j existem iniciativas para o estudo das implicaes sociais, cientficas e tecnolgicas para o tratamento de doenas infecciosas emergentes (DIEs)93 .
I.3.a-Algumas das Principais Infeces Causadas por Fungos Dentre as diversas doenas causadas por fungos, selecionaram-se as principais delas relacionadas a este trabalho.
I.3.a.1-Aspergilose: A aspergilose grave problema de sade pblica e de contaminao ambiental de plantaes de milho e de arroz, contudo neste texto tratar-se- especificamente do problema de sade pblica. A aspergilose uma doena pulmonar, ou uma micose, causada predominantemente pelo fungo Aspergillus fumigatus que geralmente benigna, mas assumindo
Pfaller, M. A.; Diekema, D. J., J. Clin .Microbiol., 2004, 42(10), 4419-4431. Walsh, Thomas J.; Petraitis, Vidmantas; Petraitiene, Ruta; Field-Ridley, Aida; Sutton, Deanna; Ghannoum, Mahmoud; Sein, Tin; Schaufele, Robert; Peter, Joanne; Bacher, John; Casler, Heather; Armstrong, Derek; Espinel-Ingroff, Anna; Rinaldi, Michael G.; Lyman, Caron A., J. Infec. Dis., 2003, 188(2), 305-319. Gurgui, M.; Munoz, P., Enf. Infec. Microbiol. Clin., 2007, 25(9), 587-97. Amlia, del Palacio; Almudena, Alhambra; Soledad, Cuetara Maria; Ponton J.; Revista Iberoamericana de Micologia : organo de la Asociacion Espanola de Especialistas en Micologia, 2007, 24(3), 187-197. 92 Drouhet, E. Historical introduction: Evolution of Knowledge of the fungi and mycoses from Hippocrates to the twenty-first century. Em: Ajello, L.; Hay, R. Medical Mycology. Vol. 4. Londres, 1998. 93 Marques, M. B. Emerging Infectious Diseases in the Realm of Complexity: lmplications for Scientific and Technological Policies. Cadernos de Sade Pblica., Rio de Janeiro, II (3): 361-388,1995. , 1995.
91
48
particular importncia clnica em infeces sistmicas malignas em doentes com o sistema imunolgico suprimido. Os miclios crescem no hospedeiro em forma de bolas, denominadas aspergilomas (Figura 25). As infeces oculares, devido s feridas no tratadas levam quase sempre perda desse rgo de viso, porm a doena geralmente controlada exceto, como j citado, nos imunossuprimidos. Nestes casos pode inclusive ocorrer aspergilose cerebral, cardaca ou da medula ssea resultam quase sempre em morte, se no tratadas a tempo, devido a hemorragias e enfartes mltiplos nos rgos. Usualmente ocorre a micotoxicose que devida ingesto de comida contaminada, cujos sintomas envolvem vmitos, diarria e nuseas. O Aspergillus pode ainda causar reaes alrgicas sem se multiplicar ou infectar a pessoa, como na asma e rinite alrgica. A constante exposio ao fungo pode causar reaes agressivas do sistema imunolgico na ausncia da sua multiplicao, por vezes resultando em problemas pulmonares aps muitos anos. Contudo, os casos mais graves so devidos formao de microrganismos resistentes, pois estes comeam a produzir micotoxinas de alta toxidez nos animais e em humanos94. Alm disso, a aspergilose considerada a maior responsvel pela mortalidade de pacientes transplantados95, sendo que a aspergilose pulmonar uma complicao grave em pacientes que realizaram transplante de pulmo e Aspergillus fumigatus a espcie mais comumente isolada destes pacientes96. O A. fumigatus apresenta resistncia a antifngicos do tipo azico (como o itraconazol)97 e mesmo a antifngicos polinicos e equinocandincos98 o que denota a inexistncia do conhecimento dos mecanismos de resistncia destes microrganismos e ressalta a urgncia no desenvolvimento de novos agentes anti-microbianos mais eficientes para tratamentos mais eficazes.99
Figura 25: Os miclios de A. fumigatus denominados aspergilomas100. I.3.a.2-Candidase O gnero Candida responsvel por cerca de 80% das infeces fngicas em ambiente hospitalar e constitui causa relevante de infeces de corrente sangnea, sendo o fungo mais
94 95
Varga, J., Fungi , 2007, 112-127. Pannuti, C.; Gingrich, R.; Pfaller, M. A.; Kao, C.; Wenzel, R. P., Cncer, 1992, 69, 2653. 96 Kanj, S. S.; Welty-Wolf, K.; Madden, J.; Tapson, V.; Baz, M. A.; Davis, R. D.; Perfect, J. R., Medicine, 1996, 75, 142; Walsh, T. J.; Pizzo, P. A. Annu. Rev. Microbiol. 1988, 42, 517. 97 Mellado, E.; Alcazar-Fuoli, L.; Garcia-Effron, G.; Alastruey-Izquierdo, A.; Cuencia-Estrella, M.; Rodriguez-Tudela, J. L., Med.l Mycology, 2006, 44(1), S367-S371. 98 Chamilos, G.; Kontoyiannis, D. P., Drug Resistance Updates, 2005, 8(6), 344-358. 99 Maertens, Johan; Theunissen, Koen; Boogaerts, Marc., Current Medicinal Chemistry: Anti-Infective Agents, 2002, 1(1), 65-81. 100 http://mais-saude.blogspot.com/2007/11/aspergillus-fumigatus-um-fungo.html (acessado em 13/06/2008).
49
comumente associado candidases101. As infeces por Candida so frequentemente causadas por Candida albicans (Figura 26) e podem ocorrer como candidase vulvovaginal (mais comum) ou infeces em mucosas, etc. Estima-se que os custos na rea da sade nos EUA para este tipo de patologia aumentam anualmente em mais de um bilho de dlares. Esta enfermidade atinge principalmente pacientes transplantados, portadores de imunodeficincia, diabticos, queimados, etc103. Entre os diversos fungos patognicos o gnero Candida um dos mais conhecidos e o alvo direto de nosso trabalho. Cabe ressaltar um importante artigo de reviso102 que relata o grave quadro epidemiolgico da candidase invasiva e resistente, com grande aumento do ndice de mortalidade - relacionada principalmente a infeces causadas por Candida spp. e Aspergillus spp. que aumentaram nos EUA, de 1.557 mortes em 1980 para 6.534 mortes em 1997. Existem mais de 17 espcies de Candida conhecidas como agentes patognicos em humanos, mas cerca de 90% das infeces relatadas se devem a cinco delas (Tabela 2)102 . Tabela 2: Percentagens de incidncia de casos de Candida spp. relatadas em 127 instituies de 39 pases do mundo entre 1997 e 2003, para as cinco espcies que mais causam infeces. Espcies 1997-1998 C.albicans C.glabrata C.tropicalis C.parapslosis C.krusei 73,3 11,0 4,6 4,2 1,7 % do Total de Nmero de Casos Relatados 1999 69,8 9,7 5,3 4,9 2,2 2000 68,1 9,5 7,2 5,6 3,2 2001 65,4 11,1 7,5 6,9 2,5 2002 61,4 10,7 7,4 6,6 2,6 2003 62,3 12,0 7,5 7,3 2,7
A candidase pode ser manifestada clinicamente por: candidoses nas mucosas (oral, vaginal ou esofagial), endocardites, meningites, peritonites, candidose hepatosplnica, candidose mucocutnea crnica103.
Figura 26: Colnia de C. albicans, a principal espcie patognica do gnero Candida spp. I.3.a.3-Paracoccidioidomicose A paracoccidioidomicose (PCM) infeco granulomatosa sistmica, causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (Figura 27)
101
104
Colombo, A.L.; Guimares, T., Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 2003, 36, 599.
J., Vrebos, M., Boogaerts, M., Eur. J. Cancer Care, 2001, 10, 56-62.
102 Pfaller, M. A., Diekema, D. J., Clin. Microbiol. Rev., 2007, 20(1), 133163. (e referncias relatadas)
103 Maertens,
50
(responsvel por 80% dos casos reportados mundialmente). Aps inalao dos esporos, as leveduras localizam-se nos pulmes, sendo fagocitadas pelos macrfagos, no interior dos quais sobrevivem e se multiplicam. Podem ocorrer sintomas de pneumonia, com febre, suores, tosse e expectorao e falta de ar e se houver disseminao do fungo, mesmo na ausncia de sintomas pulmonares, com infeco de rgos e formao de granulomas o que acarretar a formao de lceras vermelhas na pele e mucosas, particularmente na boca e nariz, que sero talvez os sintomas mais comuns da doena105. A crescente resistncia deste microrganismo e a sua patogenicidade tm sido constatadas sendo que, em cerca de 10% dos casos, h acometimento do sistema nervoso central (SNC)106 conduzindo a graves quadros clnicos que geralmente no so curveis com os antifngicos usuais e que j foram detectados em Belo Horizonte107. Este tipo de manifestao da doena provoca uma taxa de mortalidade de 53% nos casos relatados108.
I.3.a.4- Esporotricose Esta doena causada por fungo dimrfico, Sporothix schenckii (Figura 28) 109 que acomete o homem e os animais, sendo assim classificada como uma dermatozoonose. cosmopolita, podendo ser encontrada no mundo todo, mas h regies onde a incidncia de casos tem crescido muito nos ltimos anos, uma destas regies, no Brasil localiza-se no estado do Rio de Janeiro. Alm do acometimento de ces, gatos e seres humanos h relatos em eqinos, primatas, asininos, bubalinos e murinos110. O quadro epidemiolgico piora muito com a disseminao de fungos resistentes em pacientes imunossuprimidos.111
http://www.reviberoammicol.com/photo_gallery/Paraccocidioides/brasiliensis/ (acessado em 13/06/2008) Calich, V. L. G.; Blotta, M.; Souza Lima; H.; Fungal Immunol. 2005, 201-227. Yasuda, M. A. S., Expert Opinion on Pharmacotherapy, 2005, 6(3), 385-397. 106 Palmeiro, M., Cherubini, K.; Yurgel, L. S., Paracoccidioidomycosis Literature Review. Scientia Medica, 15(4), 2005. 107 Walter J. Fagundes-Pereyra, Arq. Neuropsiquiat., 2006, 64(2-A), 269-276. 108 Pl M.D.P., Hartung C., Mendoza P., Stukanoff A., Moreno, M.J., Mycopathologia, 1994, 127, 139-144. Nbrega, J.P.S., Mattosinho-Frana, L.C., Spina-Frana, A. Neuroparacoccidioidomicose. Em: Del Negro, G., Lacaz C.S., Fiorilho A.M. (eds). Paracoccidioidomicose. So Paulo 1982, Savier - Ed. da Universidade de So Paulo, pp.221-227. 109 http://www.microbelibrary.org/Fungi/details.asp?id=380&Lang=Brazilian%20Portuguese (Acessado em: 13/06/2008). 110 Scott, D.W.; Miller Jr. W.H.; Griffin, C.E.; Immune-Mediated Disorders, Muller and Kirks Small Animal Dermatology , 6 o ed. Philadelphia, Saunders, p.386-390, 2001 Greene, C. E.; Sporotrichosis, Infection Diseases of dog and cats , 3 ed. Philadelphia, Sauders, p. 608-612, 2006. 111 Stephensonb, D.R. Jenkinsa, Wiselkab, M.J., Hardmana,S., Johnson, E.M. , J. Infect., 2005, 51, e73e77.
104 105
51
I.3.a.5- Criptococose: Cryptococcus neoformans um fungo encapsulado (Figura 31) responsvel por cerca de 510% das infeces causadas em pacientes com AIDS. A mengite a manifestao mais comum da criptococose112 principalmente em indivduos imunodeprimidos (AIDS, neoplasias, diabetes, transplantados, etc.). Estudos tm comprovado a capacidade deste fungo de colonizar o trato intestinal de aves como pombos e papagaios,113,114 tendo assim relao com as infeces causadas por fezes destes animais. Devido adaptao dos pombos em centros urbanos, a presena deste fungo em suas fezes e a conseqente contaminao da poeira domiciliar115, a preocupao crescente, pois o contgio pode se dar por inalao ocorrendo, num primeiro estgio a criptococose nos pulmes. Alm disso, h outras formas de manifestao de contaminao por esta levedura, tais como: pneumonia, leses na pele e osteomielites103.
I.3.b. Agentes Quimioterpicos Antimicrobianos Antibiticos116 Os agentes quimioterpicos preparados de reagentes qumicos em laboratrios, so denominados frmacos sintticos; as substncias qumicas produzidas naturalmente por bactrias ou fungos, para atuar contra outros microrganismos, so chamados de antibiticos. O primeiro antibitico foi descoberto ao acaso por Alexander Fleming, um mdico e bacteriologista escocs, que quase estava descartando algumas culturas em placas que haviam sido contaminadas por
112 Bryan, R. A.; Huang, X.; Morgenstern, A.; Bruchertseifer, F.; Casadevall, A.; Dadachova, E., Antimicrob. Agents Chemother., 2008, 52(6), 2232-
2235. Franzot SP, Hamdan JS, Curie BP, Casadevall A., J. Clin. Microbiol., 19997, 35, 224351.
Fili, W. F. O., Wanke B., Aguena S. M., Vilela V. O., Macedo R. C. L., Lazera M., Rev. Soc. Bras. Med .Trop., 2002, 35(6), 591595. 114 Assato, A. T., Fortes, M. S., Lazera, S., Manke, M., Meningoencefalite por Cryptococcus neoformans var gatti- em Indgena HIV Negativo -relato de caso Fortes, 6o Congresso de neurocururgia, 1999. (http://neuroc99.sld.cu/text/meningoencefalite.htm acessado em 13/06/08.) 115 Passoni L.F.C. Revista Iberoamericana de Micologia : organo de la Asociacion Espanola de Especialistas en Micologia, 1999, 16, 77-81. Passoni, L. F. C., Wanke, B., Nishikawa, M. M., Lazera, M. S., Med. Mycol., 1998, 36, 305-311. 116 Dixon,G.K; Copping, L. G; Hollomon, D. W. Antifungal agents: discovery and modes of action, Oxford, 1995.
113
52
mofo91. Ele resolveu observar o padro de crescimento nas placas contaminadas e percebeu que havia uma rea ao redor do mofo, onde a cultura de bactria, Staphylococcus aureus, havia parado de crescer. Desta maneira Fleming observava um tipo de mofo, que podia inibir o crescimento da bactria. O mofo foi mais tarde, identificado como o fungo Penicillum notatume. Em 1928, Fleming nomeou o inibidor ativo do mofo como penicilina. Aps 1939, com o grande interesse na penicilina, Ren Dubos, um microbiologista francs, descobriu dois outros antibiticos chamados gramicidina e tirocidina91, ambos eram produzidos por uma bactria, Bacillus brevis, isolada do solo. Desde a primeira descoberta dos antibiticos, muitos compostos anti-microbianos foram estudados, mas so muito txicos para os seres humanos (matam os micrbios patognicos, mas tambm prejudicam o hospedeiro infectado). Alm disso, a resistncia a frmacos resulta de uma resposta adaptativa dos microrganismos; eles podem produzir enzimas que inativam os antibiticos. Os frmacos anti-microbianos tm diferentes aes, como: inibio da sntese da parede celular da bactria (penicilina); inibio da sntese protica atravs da atuao nos ribossomas 70S (cloranfenicol, eritromicina, tetraciclinas e estreptomicina); leso das membranas plasmticas (polimixina B); inibio da sntese de cidos nuclicos (Rifampicina e as quinolonas); atuao como antimetablitos pela inibio competitiva da atividade enzimtica (sulfanilamidas, Figura 2). Os antibiticos so utilizados comercialmente para outros fins que no o tratamento de doenas por exemplo como suplemento na alimentao de animais. Em comparao com organismos eucariontes, relativamente fcil encontrar ou desenvolver frmacos que so efetivos contra clulas procariticas (bactrias) e que no afetem as clulas eucariticas humanas. Porm o problema mais complicado quando o patgeno uma clula eucaritica, tal como um fungo, pois ao nvel celular, estes organismos assemelham-se clula humana mais do que clula bacteriana. O arsenal contra fungos patgenos, mais limitado do que o de frmacos antibacterianos. Alguns frmacos possuem um largo espectro de atividade antimicrobiana, isto, em relao ao nmero de tipos microbianos diferentes que eles afetam, a vantagem dessa condio a economia de tempo, mas em oposio, sua desvantagem que uma grande parte da microbiota normal do hospedeiro destruda pela ao destes anti-microbianos. Se determinados organismos na microbiota normal no so destrudos pelo antibitico, seus competidores sobreviventes podem aumentar suas populaes e tornarem-se patgenos oportunistas117. Um exemplo que acontece s vezes o supercrescimento do fungo C.albicans, o qual no sensvel aos antibiticos antibacterianos. Este supercrescimento denominado superinfeco, um termo que tambm aplicado ao crescimento de patgenos-alvo que desenvolvem resistncia ao antibitico. Os agentes anti-microbianos so bactericidas - matam o micrbio diretamente, ou bacteriostticos impedem o crescimento do micrbio (Tabela 3).
117
Colombo, A. L.; Guimares, T., Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 2003, 36, 599.
53
Tabela 3: Alguns antibiticos em uso atualmente41. Microrganismos Bacillus Gram-Positivos Bacillus subtilis Bacillus polymyxa Antibiticos Bacitracina Polimixina
Actinomicetos
Streptomyces nodosus Anfotericina B Streptomyces venezuelae Cloranfenicol Streptomyces aureofociens Clortetraciclina e Tetraciclina Streptomyces erythraeus Eritromicina Streptomyces fradie Neomicina Streptomyces griseus Estreptomicina Micromonospora purpurea Gentamicina Cefalotina Griseofulvina Penicilina
Fungos
Como o avano do conhecimento do mecanismo de ao dos frmacos, o planejamento racional de novos frmacos antimicrobianos pela compreenso da interao frmaco-receptor a nvel molecular realizado em computadores tende a ser cada vez mais efetivo e, portanto de grande importncia. Com relao ao desenvolvimento de novos tipos de agentes antifngicos h muitos exemplos118, tais como esterides; inibidores de acetil-CoA carboxilase de fungos; derivados antitubulnicos; derivados equinocandnicos; estrobilurinas; derivados aminopiridnicos e derivados fenilpirrlicos, todos esto ilustrados na Figura 31. Contudo, destacam-se, tambm, os exemplos de frmacos que interagem com o DNA como o Metalaxyl 119 (Figura 30), tpico agente de alquilao de DNA e o LY214352120 (8-cloro-4-(2cloro-4-fluorofenoxi)quinolina) (Figura 30), tpico agente intercalante de DNA, que mostram a potencialidade destes novos agentes, inicialmente usados como antitumorais para aplicao como antifngicos.
O O N
F O Cl N Cl
Metalaxyl
LY214352
58
59
Dixon, G. K.; Copping, L. G.; Hollomon, D. W. Antifugal Agents: Discovery and Mode of Action, Oxford, 1995.
http://www.inchem.org/documents/jmpr/jmpmono/2002pr09.htm (Acessado em: 13/07/08). 120 Gustafson, Gary. UK. Editor(s): Dixon, G. K.; Copping, Leonard G.; Hollomon, Derek W. Antifungal Agents: Discovery and Mode of Action, (Papers presented at the Conference The Discovery and Mode of Action of Antifungal Agents), Grantham, Reino Unido 1995, 11-12, 111-117.
54
Esteride
Estrobilurina A
Ergoste
60 61
Inibidor acetil-CoA
Soraf
62
63
Agentes anti-tubulnicos
Rizoxi na
64
65 DC
66 MD 67
Derivados aminopiridnicos
68 Pirimetanil 69 Ciprodi
70 Mepanipi
71 Andopr
Derivados Fenilpirrlicos
72 Pirrolnit
73 Fenpicio
74 Fludioxo
55
Alm disso, molculas que apresentam interaes especficas com a fenda menor do DNA tm despertado interesse como potenciais agentes teraputicos em uma variedade de doenas humanas alm de cncer121,122. Dentro deste tipo de molcula que interage com o DNA, destacamos os derivados simtricos e poli-funcionalizados com grupos amidnicos e bioissteros que interagem fortemente com o DNA por interaes eletrostticas e que tm sido estudados como potenciais antifngicos pelo nosso grupo de pesquisas19,57,58. Em particular o grupo funcional tiouredo, ou melhor, S-tiouredo (R-S-C(=NH)NH2.HCl) sendo este um grupo que est carregado positivamente em pH fisiolgico e considerado bioisostrico ao grupo amidina (R-C(=NH)NH2.HCl), tambm protonada nesse meio. Desde que se tornou de interesse o estudo da ao atimicrobiana de derivados tipo tioureido, uma investigao na literatura demonstrou que h vrios exemplos. Destaca-se o estudo feito por Cameron e colaboradores123 no qual descreveu a sntese e o estudo da atividade fungicida de compostos organofosforados substitudos por grupos bioisostricos de amidina (Figura 32). Estes pesquisadores sintetizaram derivados tiouredico-fosfnicos e testaram a atividade fungicida destes compostos contra fungos que atacam as plantaes de arroz obtendo atividade inibitria na faixa de 75% no controle de fungos das espcies Drechslera ssp. e Rhizoctonia solani.
O H2N R
75
O H2N P
n
OH OH
OH OH
HN
H N NH2
77
O P R OH OH HN H N NH2
78
O P
n
OH OH
76
H N
O P OH OH HO
O OH H P N n- C7H15 S
80
H N
O P OH OH
NH2 n-C7H15
79
n- C7H15
Figura 32: Compostos estudados por Cameron e colaboradores. O trabalho de Supuran e colaboradores124 destaca a atividade antifngica de derivados tiouredo-substitudos de 2-aminofenoxatiina (Figura 33 e Tabela 4). Estes compostos apresentaram potencial antifngico contra Aspergillus e Candida, sendo que foram estudadas duas espcies de Aspergillus spp. (A. niger e A. flavus) e uma de Candida spp. (C. albicans), onde o precursor 2-aminofeno xatiina no apresentou atividade antifngica contra nenhuma das trs espcies estudadas, enquanto os derivados uria/tioureia exibiram diferentes graus de atividade.
Neidle.S., Nat..Prod. Rep., 2001, 18, 291. Henderson, D.; Hurley, L. H. , Nat. Med., 1995, 6, 525. 123 Cameron, D. G.; Hudson, H. R.; Pianka, M., Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem., 1993, 83, 21. 124 Supuran, C. T.; Scozzafava, A.; Jurca, B. C.; Ilies, M. A., Eur. J. Med. Chem. ,1998, 33, 83. Supuran, C. T.; Scozzafava, A.; Briganti, F.; Loloiu, G.; Maior, O., Eur. J. Med. Chem.. 1998, 33, 821.
122 121
56
O S NH2
O S O S O N H
NHCYNHR
81 Aminofenoxatiina
82 ismero m, Y=S, R=alquila 83 ismero p, Y=S, R=alquila 84 ismero m, Y=S, R=3,4-Cl2C6H3 85 ismero p, Y=S, R=3,4-Cl2C6H3
Figura 33: Alguns dos compostos com atividade antifngica testada por Supuran e colaboradores. Tabela 4: Alguns dos compostos com atividade antifngica testada por Supuran e col. Composto 82 83 84 85 A. flavus C1150 (g/mL) 0,8 1,2 0,4 0,9 A. niger C418 (g/mL) 1,5 1,6 0,8 0,9 C.albicans C316 (g/mL) 1,4 1,1 0,5 0,6
Grandi e colaboradores125 descreveram a atividade de compostos tipo tiouria N,N-dialquilsubstituda na inibio de vrus da herpes. Eles estudaram e sintetizaram compostos que possuem trs anis aromticos com os grupo uria- e tioureia-derivados entre estes anis (Figura 34), esses compostos mostraram grande atividade contra o vrus da herpes.
CH3 Ar N H
S N H
86
N H O F
Figura 34: Estrutura geral dos compostos testados contra o vrus da herpes por Grandi e colaboradores.
Grandi, M. J. D.; Curran, K. J.; Feigelson, G.; Prashad, A.; Ross, A. A.; Visalli, R.; Fairhurst, J.; Field, B.; Blom, J. D., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 4157.
125
57
I.4-ESTUDO DE PRECURSORES DENDRMERICOS I.4.a - Estudo da Atividade Antifngica de Precursores Dendrmericos Trabalhos recentes em nosso grupo de pesquisa, o LASELORGQUIM (Laboratrio de Sntese e Eletrossntese Orgnica e Qumica Medicinal)126 tm comprovado que a atividade antifngica de compostos do tipo tiouredo influenciada pela insero de grupos metlicos na poro tioureido da cadeia (Figura 35). Y (CH2)n-X-(CH2)n-Y Y = S-C(=NH)NH2.HCl; X = O (87), NMe (88), S (89) Y= S-C(=NH)NMe.HCl; X = O (90), NMe (91), S (92) Potncia contra: Candida albicans: 90 > 87 , 91 > 88, 92 > 89 C. glabrata: 90 > 87 C. krusei: 92 > 89 Figura 35: Estrutura e atividade anti-fngica contra Candida spp. estudados com a variao do grau de alquilao. Nesses estudos tambm tm-se comprovado que a atividade antifngica de compostos funcionalizados do tipo tioureido aumentada pela diminuio da flexibilidade molecular126. Alm disso, anlises de QSAR realizadas comprovaram que os resultados obtidos sobre a atividade antifngica dos compostos tioureido e N-metil-tioureido substitudos estudados em duas dissertaes de mestrado anteriores estimularam uma anlise quimiomtrica geral. Para facilitar a compreenso dos resultados alterou-se a denominao dos compostos conforme a Tabela 5, a seguir. Tabela 5: Derivados tipo precursores dendrimricos (PD) funcionalizados estudados por PCA. ESTRUTURA GERAL PD1 (Me-NMe) PD2 (Me-S) PD3 (Me-SO2) PD4 (Me-SO) PD5 (Me-O) PD6 (O) PDA (S) PDC (NMe) PDD (SO2) PDE (SO)
126
de derivados tioureido
X2
Y = NCH3 Y=S Y = SO2 Y = SO Y=O Y=O Y=S Y = NCH3 Y = SO2 Y = SO
( )n
( )n
X2
n=2 n=3 n=3 n=3 n=2 n=2 n=3 n=2 n=3 n=3
X2: S-C=NH(NHCH3)
X2: S-C=NH(NH2)
X2: S-C=NH(NH2)
Silva, L. L.; Donnici, C. L.(coord.) Dissertao de Mestrado, Departamento de Qumica da UFMG, 2005; Nogueira, L. J.; Donnici, C. L.(coord.) Dissertao de Mestrado, Departamento de Qumica da UFMG, 2006.
58
As estruturas moleculares destes derivados (PD1 a PD6) foram sobrepostas e alinhadas segundo o momento de inrcia, conforme Figura 36. A partir da foram calculados 30 descritores fsico-qumicos presentes no programa TSAR (forma, flexibilidade, conectividade e ADME). Aps a anlise da matriz de correlao, os descritores altamente correlacionados foram eliminados. Ao final desta anlise, computacionalmente realizou-se uma Anlise de Componentes Principais (PCA) gerando uma matriz com 14 descritores que foi usada para estudos quimiomtricos e, ento, foi gerada uma matriz de dados que foi reduzida a trs variveis que foram usadas na gerao final do modelo quimiomtrico. O PCA realizado nos derivados PD1 a PD6 e PDA a PDE mostra o modelo final (Figura 37), que foi descrito com trs componentes que explicam 100 % da variao total dos dados (PC1: 56%, PC2:88% e PC3: 100%). O grfico de score e de pesos (crculo) (Figura 37) representa as duas primeiras componentes que apresentam uma maior explicao da variao total dos dados (88%), porm a PC1 a componente capaz de discriminar os compostos em dois grupos distintos: um ( esquerda) contendo os derivados menos lipoflicos (os derivados no-metilados) e o outro ( direita) com os derivados mais lipoflicos, tipo N-metil-S-tioureido. Os parmetros fsico-qumicos conhecidos como flexibilidade molecular (X1), ndice topolgico de Balaban (X2) e coeficiente de partio ou log P (X3) foram capazes de promover o reconhecimento molecular pela separao observada. Assim, o reconhecimento molecular expresso pela Equao 2, a seguir: PC1 = -0,36*X1 + 0,64*X2 + 0,88*X3 - 8.06 Equao 2 X1= Flexibilidade molecular; X2 = ndice Balaban, X3 = log P
Figura 36: Alinhamento molecular das estruturas dos derivados tipo tioureido estudados.
59
Figura 37: Anlise de PCA obtida pelo programa TSAR. A Equao 2 sugere que as modificaes moleculares efetuadas levem ao aumento da lipofilia (X3, log P positivo), ao aumento da rigidez ou diminuio da flexibilidade molecular (X1, flexibilidade molecular negativa), mas que no ocorram grandes alteraes na topologia molecular e que haja aumento no volume molecular (X2, ndice de Balaban positivo) para que haja aumento na atividade farmacolgica dos novos anlogos propostos. Alm disso, estes mesmos trabalhos comprovaram a interao com o DNA, por ITC (Isothermal Titration Calorimmetry)127 e por biossensor de DNA126 de PDA a PDE (Tabela 5). Desta maneira, estas novas entidades qumicas (NCE) se mostraram potenciais frmacos com aplicao como agentes antitumorais e antifngicos. Destaca-se, o composto PDC que demonstrou grande potencialidade como agente antitumoral, pois apresenta significativa interao com o DNA sinttico dodecmero d(CGCGAATTCGCG). Ademais, em mbito cientfico geral o LASELORG-QUIM tem se empenhado neste grande interesse da descoberta de novos agentes farmacolgicos ou NCE potencialmente bioativas para o tratamento de doenas diversas que vm apresentando crescente incidncia e resistncia aos frmacos usuais, tais como o cncer128 e as doenas infecciosas emergentes (DIEs) ou
127
Donnici, C. L. ; Silva, Luris Lcia da ; Goulart, Marlia Oliveira Fonseca ; Abreu, Fabiane Caxico de ; Montanari, Carlos Alberto ; Paula, Francine S de . Investigao eletroqumica da interao de agentes antitumorais eletroflicos e amidnicos com DNA. In: 28a. Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, 2005, Poos de Caldas. Livro de Resumos da 28a. Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica - MD, 2005. v. 1. p. 66-66. 128 Almeida, V. L.; Leito, A., Donnici, C. L. , Lopes, M. T. P., Montanari, C. A., Quim. Nova, 2005, 25, 118.
60
infeces fngicas invasivas (IFIs)129, doenas j foram apresentadas com breves textos introdutrios. O nosso interesse por compostos do tipo tioureido se deve a estes bons resultados de teste de atividade biolgica aliados aos estudos de QSAR. Alm disso, especialistas afirmam que estes compostos amidino-funcionalizados so excelentes modelos prottipos para o desenvolvimento de novos agentes farmacolgicos que tenham o seu mecanismo de ao relacionado com o DNA38,127. Na literatura s h um estudo publicado destacvel sobre a atividade antitumoral de derivados simtricos tipo amina polifuncionalizada com grupos bis-catinicos, amidinas bioisostricas, o estudo de Gergely e colaboradores130. Neste, foi relatada a inibio da apoptose (PCD) por um composto tiouredico S-alquil-substitudo, a tris-(2-tioureido)-S-etilamina (P1, Figura 49). Estes autores estudaram as propriedades reguladoras PCD deste composto, similar ao imunotiol (sdiodietil-ditiocarbamato), que se mostrou ativo contra clulas humanas com leucemia, HL-60 e U937, evidenciando a potencialidade destes derivados como antitumorais. Este trabalho, alm de corroborar a provvel potencialidade de nossos compostos-prottipos como antineoplsicos, mostra que molculas simtricas e simples e que podem ser caracterizadas como precursores dendrimricos tambm podem ser bioativas. Alm do mais, este estudo indica um bioisstero da amidina de sntese fcil: o grupo tiouredo, que muito comum em sntese de compostos organossulfurados, mas pouco estudado quanto atividade farmacolgica. Os compostos tipo PD estudados pelo nosso grupo so simtricos, polifuncionalizados por grupos bioissteros do grupo amidina (tais como o grupo tioureido) e presena de grupos catinicos, e, como j citado, tambm possuem grande potencialidade de interao com o DNA.
I.4.b- Determinao do log kw de Precursores Dendrmericos Visando-se a determinao experimental de log P, ou coeficiente de partio, possvel utilizar a tcnica usada internacionalmente e recomendada pela Organizao Mundial de Sade131, RP-HPLC. A reteno no HPLC considerada como um processo de equilbrio dinmico, na qual a constante de equilbrio KR para o processo, pode ser descrita como: ln KR = -GR/RT Equao 3 onde GR, R e T so a variao da energia livre de Gibbs para a reteno, a constante dos gases e a temperatura absoluta, respectivamente. A reteno quantitativamente descrita pelo fator de capacidade, k, dado pela reteno normalizada do tempo atravs da Equao a seguir: K = (tr t0) / t0 Equao 4 onde tr o tempo de reteno do soluto retido e t0 o tempo de reteno da fase mvel. O fator de capacidade um parmetro fundamental para a comparao dos dados de reteno e a quantificao do fenmeno fsico-qumico da lipofilia em termos de relao linear de energia
129 130
Lai, Chih-Cheng; Tan, Che-Kim; Huang, Yu-Tsung; Shao, Pei-Lan; Hsueh, Po-Ren., J. Infec. Chemother., 2008, 14(2), 77-85. Nagy, E.; Mihalik, R.; Hrak, A.; Vrtesi, C.; Gerlely, P., Immunopharmacology, 2000, 47, 25. 131 Tavares, L. C., Qum. Nova, 2004, 27, 63.
61
livre.
Deve-se
lembrar
que
coeficiente
de
partio
medido
pela
razo
da
solubilidade/concentrao do composto estudado na fase orgnica pela concentrao na fase aquosa, sendo assim se considera a quantificao da migrao do soluto da fase apolar para uma fase polar aquosa, que a base da metodologia shake-flask30,31. No caso da teoria envolvida na partio por HPLC investigada a influncia do aumento da polaridade do agente modificador (fase mvel) sobre o tempo de reteno de compostos-padro que j tm o log P determinado pelo shake-flask, ou seja, avalia-se a migrao deste da fase estacionria (apolar) para a fase mvel polar, como no shake-flask, o que deve ocorrer quando h 0% do agente modificador para 100% da fase aquosa. Assim, primeiramente feito uma srie de medidas experimentais com os tempos de reteno medidos em seis diferentes concentraes ou propores de metanol/tampo MOPS, variando de 75 : 25 (vol/vol) at 25: 75 (vol/vol), com a finalidade de determinar o tempo de reteno e, a partir deste, o fator de capacidade (K) de cada composto em um determinado comprimento de onda mximo. Com os diversos valores de log k obtidos em diversas concentraes do agente modificador tem-se a correlao entre log k e a composio da fase mvel () que fornece informaes a respeito destes efeitos seletivos e consequentemente sobre a lipofilia dos padres. Este , portanto, o processo responsvel pela reteno do soluto na fase estacionria apolar, que pode ser vista como um processo de associao reversvel entre as cadeias de hidrocarbonetos da fase estacionria e as partes apolares do soluto132. O agente modificador (solvente orgnico que compe a fase mvel juntamente com a gua),exerce um efeito seletivo, principalmente na reteno de solutos polares154. Neste intervalo de concentraes h um comportamento linear que pode ser vista como uma boa aproximao, como: log k = S + log kw Equao 6 Assim sendo, mediram-se os tempos de reteno dos vinte compostos padro estudados em soluo de metanol / tampo MOPS a pH 7,2, em seis diferentes propores, variando de 75 / 25 at 25 / 75. Desta forma, os efeitos seletivos das interaes entre soluto-solvente podem ser eliminados atravs da determinao do fator de capacidade em fase mvel isenta de agente modificador, log kw. Entretanto os tempos de reteno correspondentes para de log Kw so muito altos para serem obtidos experimentalmente, mas podem ser calculados usando tcnicas de extrapolao. Determina-se o log K para o soluto em diversas concentraes do agente modificador e o log Kw pode ser determinado na extrapolao para 100% de gua (Figura 38).
132 Wells, M. J. M; Randall C. C.; Patterson, R. M., J. Chromatogr., 1982 , 235, 43. Tanaka, N.; Goodel, H.; Karger, B. L., J. Chromatogr., 1978, 158,
233. Tanaka, N.; Sakagami K.; Araki, M., J. Chromatogr., 1980, 199, 327. Miyake K.; Misuno, M.; Terada, H., J. Chromatogr., 1988, 439, 227.
62
Figura 38: Representao esquemtica da medida de parmetro de lipofilia por RP-HPLC, da medida de valor de log k e da extrapolao para obteno de log kw A utilizao de Kw como parmetro lipoflico foi evidenciada pela primeira vez por Hulshoff133 para uma srie de benzodiazepinas. Recentes estudos mostram fortes evidncias que log kw est mais intimamente correlacionado com log P que os fatores de capacidade obtidos isocraticamente, pois assemelha-se mais ao mtodo de shake-flask. Assim, efetuou-se a construo de um grfico entre os valores de de log Kw obtidos e os valores de log Poct (dos padres) discutidos na literatura (Figura 39). Cabe ressaltar que Sinanoglu134 e Horvth e col.135 , de fato, estabeleceram fundamentos tericos sobre o fato do log k poder ser considerado como parmetro lipoflico e como j citado, obterem-se coeficientes de partio correlacionados atravs da equao de Collander, ou seja, se para os padres usados h correlao entre o coeficiente de partio conhecido na literatura e os parmetros lipoflicos determinados por HPLC, pode-se inferir que estes ltimos podem ser realmente usados como medida de avaliao de lipofilia. digno de nota que h diversos e bem sucedidos trabalhos correlacionando o parmetro hidrofbico (log K) com a atividade biolgica de um determinado composto136, incluindo a avaliao de influncia de log P na atividade antitumoral de compostos mesoinicos diversos realizadas pelo nosso grupo19, que justificam o uso da RP-HPLC como instrumento valioso em estudos de QSAR. Cabe destacar que os descritores fsico-qumicos log K e log P esto fortemente correlacionados137, como comprovado pelas relevantes correlaes entre log K e log P encontradas na literatura.
Hulshoff, A; Perrin, S.H., J.Chromtogr., 1976, 129, 263. Sinanoglu, O., Molecular Association in Biology, Nova Iorque, p.147, 168. 135 Horvth, C., Melander, W., Nahum, A., J. Chromtogr., 1979, 186, 371. Horvth, C., Melander, W., Molnar., J. Chromtogr. ,1976, 125, 129. 136 Baker, J. K.; Rauls, D. O.; Borne, R. F.; J. Med. Chem. 1979, 22, 1301; Bienganowska, M., J. Liq. Chromatogr., 1982, 5, 39. Bienganowska, M.; Chromatographia, 1984, 18, 456. Jinno, K., Anal. Lett., 1984, 17, 183. Wells, M. J. M.; Clark, C. R.; Patterson, R. M., J. Chromatogr. Sci., 1981, 19, 573. Henry, D.; Block, J. H.; Anderson, J. L.; Carlson, G. R., J. Med. Chem. ,1976, 19, 619.; Britto, M.M.; Montanari, C. A.; Donnici, C.L.; Cass, Q. B., J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 1999, 22, 357; Britto, M.M., Tese de doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais, Dezembro, 2000.
134
133
63
Obtendo-se com os padres estudados uma boa correlao entre os valores de log Kw e log P, estes dados sugerem que se pode utilizar esta metodologia e estes padres para a determinao experimental de log P de compostos desconhecidos.
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -2 -1 0 1 2 3
log kw
log Poct
64
A necessidade no mbito da sade pblica frente ao grave problema advindo do grande e crescente nmero de pacientes com cncer, alm do crescimento das DIEs e das IFIs justificam a constante busca de NCEs que possam ser compostos-lderes para gerarem possveis compostosprottipo para o desenvolvimento de novos agentes antitumorais e antifngicos. Nesta perspectiva, os compostos tioureido-funcionalizados, sintetizados e estudados dentro do LASELORG-QUIM - com o objetivo de desenvolvimento de novos agentes antineoplsicos e antifngicos mais eficientes e menos txicos - tm se mostrado como novos compostos-prottipo de potncia cada vez mais elevada. Cabe ressaltar que estes compostos com grupos S-tioureido so preparados facilmente a partir da reao de haletos de alquila (RX) com excesso de tiouria (NH2C(=S)NH2), ou derivados de tiouria, em etanol ou isopropanol, aquecidos a refluxo. Contudo, este grupo funcional tioureido geralmente usado s como intermedirio sinttico para obteno de grupos tiis (ou mercaptanas) pelo tratamento com hidrlise alcalina e acidificao. Desta forma de grande interesse cientfico a continuao de tais investigaes com a sntese e o estudo da atividade antifngica e antitumoral de novos derivados (Figura 40) lembrando que tais espcies devem ter similaridade molecular, maior grau de alquilao, maior lipofilia e menor flexibilidade molecular. Assim, pode-se tambm investigar a influncia da maior ramificao e simetria em molculas como as descritas a seguir e a presena de outros grupos bioisostricos, tais como amidina e outros. Cabe ressaltar, que a execuo deste projeto ainda mais justificvel pelo fato de que recentemente, uma molcula do tipo precursor dendrimrico (DENDRI) desenvolvida por nosso grupo foi submetida a testes antitumorais pelo grupo da Profa. Mriam Lopes do ICB-UFMG (colaboradora deste projeto) e a atividade foi constatada no excelente nvel de 10-8 mol.L-1, o que nos leva ao patenteamento desta nova molcula.
X Y ( )n DENDRI X = N; Y = d e riv a d o c a rb o x lic o ( )n X ( )n Y
Figura 40: Estrutura geral do composto com atividade antitumoral. Assim, pode-se racionalizar as modificaes moleculares propostas, baseados no composto-prottipo os compostos bis-catinicos tipo PD estudados em dissertaes anteriores (Tabela 5). Os compostos propostos para esta dissertao seguem o esquema retrossinttico descrito na Figura 41.
65
(I)
NHCH3
S S S
Cl
Cl
NCH3
(II)
R'HN S N R'HN S NR S NHR' NR Cl NR IGF Cl N Cl HO IGF OH N OH
R= H, Me; R=H, Me
(III)
NR R'HN S N IGF N R'HN NR S S NHR' NR Cl S NR NHR' Cl N N Cl HO Cl IGF
HO N N
OH
OH
R= H, Me; R=H, Me
66
III. OBJETIVOS O objetivo geral dos estudos realizados nesta dissertao o desenvolvimento de novos compostos-prottipo que sejam potencialmente agentes quimioteraputicos para cncer e para o tratamento de doenas infecciosas emergentes (DIEs) ou infeces fngicas invasivas (IFIs). Com estas metas gerais, os objetivos especficos so resumidos como a seguir: a) Sntese, isolamento e caracterizao espectromtrica de novos derivados precursores
dendrimricos do tipo bis-, tris- e tetra-tiouredo de P1 (nico j conhecido na literatura) a P6, propostos por planejamento racional por mtodos de QSAR e Modelagem Molecular feitos anteriormente;
X X N X X N X X= SC(NH)NH2 (P1); SC(NH)NHCH3 (P2); SC(NCH3)NHCH3 (P3). N X X X= SC(NH)NH2 (P4); SC(NH)NHCH3 (P5); SC(NCH3)NHCH3 (P6).
S S NHCH3 NCH3
(P7)
CH3HN
NCH3
Figura 42: Estrutura geral dos compostos preparados. b) Avaliao da lipofilia pela medida do coeficiente de partio (Log P) utilizando
cromatografia lquida em fase reversa: RP-HPLC; c) Estudo da atividade anti-fngica in vitro (determinao de MIC) de todos os derivados
sintetizados (Profa. Ma. Aparecida Resende ICB, colaborao) contra Candida spp. (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis), Cryptococcus neoformans e Saccharomyces cerevisiae; d) Estudo da atividade anti-tumoral dos compostos P1 e P2 contra algumas linhagens
tumorais: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF-7) e glioma de rato (C6) (Profa. Dra. Miriam Tereza Paz Lopes ICB; colaborao).
67
IV-RESULTADOS E DISCUSSO IV.1- Consideraes Gerais Neste captulo primeiramente sero discutidos os resultados obtidos na preparao e identificao estrutural dos produtos (IV, RMN 1H, RMN
13
so bis-, tris- e tetra-funcionalizados do tipo tioureido e so bioissteros planejados racionalmente. Todos os tioureidos foram preparados a partir de seus respectivos precursores clorados na forma protonada e que por sua vez foram obtidos a partir dos hidrxi-derivados correspondentes pela reao com cloreto de tionila em excesso (Figura 42). Com exceo do derivado amino tri-funcionalizado composto P1, todos so inditos na literatura cientfica. Na Tabela 6 so mostradas as estruturas detalhadas de cada um dos derivados estudados e so dados os nomes oficiais (IUPAC) de todos eles. No item IV.3 apresentaremos resultados da avaliao da lipofilia pela medida do coeficiente de partio destes compostos, no seguinte descreveremos os resultados obtidos da investigao da atividade antifngica e tambm da atividade antitumoral. Finalmente, cabe esclarecer que trazemos a correlao entre lipofilia e atividade farmacolgica conjuntamente com a descrio dos resultados de atividade obtidos. Tabela 6: Nomenclatura oficial dos compostos preparados nesta dissertao.
Estrutura N(CH2CH2Cl)3 [CH2N(CH2CH2Cl)2] S(CH2CH2CH2Cl)2 N(CH2CH2SC(NH)NH2)3 N(CH2CH2SC(NH)NHCH3)3 N(CH2CH2SC(NCH3)NHCH3)3 [CH2N(CH2CH2SC(NH)NH2)2] [CH2N(CH2CH2SC(NH)NHCH3)2] [CH2N(CH2CH2SC(NCH3)NHCH3)2].4HCl S(CH2CH2CH2SC(NCH3)NHCH3)2 Sigla PA PB PC P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 Nomenclatura Oficial Tris-(2-cloroetil)amina N,N,N,N- Tetrakis (2-cloroetil)etilenodiamina 1,7-dicloro-3-tia-heptano Tris(2-tioureidoetil)amina Tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina Tris(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina N,N,N,N- tetrakis (2-tioureidoetil)etilenodiamina N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureidoetil)etilenodiamina N,N,N,N-tetrakis(2-1,3-dimetil-tioureidoetil)etilenodiamina 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano
68
IV.2- Obteno e Caracterizao dos Compostos tioureido-substitudos Para a preparao dos compostos finais desejados (P1-P7) do tipo amino-tioureido foram utilizados como precursores os seus respectivos derivados halogenados recm-preparados: tris(2cloroetil)amina (PA) e N,N,N,N-tetrakis-2-cloroetil-etilenodiamina (PB), os respectivos mtodos de obteno se encontram no item IV.2.a. Estes haletos de alquila foram submetidos reao clssica de sulfurao (Figura 43) e de mecanismo bem caracterizado (Esquema 1) com os derivados tioureia, 1-metil-2-tioureia ou 1,3-dimetil-2-tioureia em proporo molar correspondente (bis-equimolar, tris-equimolar ou tetra-equimolar) em etanol ou isopropanol a refluxo, gerando por cristalizao ou evaporao os derivados mencionados (rendimentos de 49 a 92%). A rota retrossinttica planejada para a sntese desta classe de estruturas se encontra na Figura 42. Os derivados
1
preparados
13
foram
caracterizados
por
tcnicas
espectromtricas:
ou
Cl
= R
Cl
S R Cl + RHN NHR'
EtOH ou i-PrOH Refluxo
NHR+ R S ClNHR'
R=H ou Me R' = H ou Me
ou
Cl
= R
: Cl
: Cl
H2N
: S:
NH2 R S+
NH2
NH2 R S
NH H ::Cl
::Cl NH2+
Esquema 1: Mecanismo geral de preparao de derivados tioureidos com tioureia. Nos itens a seguir sero discutidos detalhadamente tanto os mtodos adotados para as respectivas preparaes como a caracterizao dos respectivos compostos.
69
IV.2.a-Obteno de 2,2,2-triclorotrietilamina e N,N,N,N-Tetrakis(2-cloroetil)etilenodiamina138 Os precursores tricloro- e tetra-cloro-substitudos - hidrocloreto de tris(2-cloroetil)amina (PA) e N,N,N,N-tetrakis-2-cloroetil-etilenodiamina (PB) - foram preparados a partir da halogenao dos hidrxi-derivados correspondentes com cloreto de tionila em um procedimento j relatado na literatura e com mecanismo de reao bem conhecido (Esquema 1). Por exemplo, para obteno de PA (Figura 44), executando-se a reao de tris-etanolamina com cloreto de tionila, respectivamente na proporo molar de 1:4 mol/mol, a reao inicia-se imediatamente, no entanto, completar-se necessrio agitao por 2 h, com rendimento de 59%.
Cl
1
N
2
Cl
.HCl
Cl
1 2
Cl
1 2
N
2 1
N
3
Cl
Cl
Cl
PA
PB
ou
OH
2 2
= R
OH
: : Cl
R
OH
Cl
Cl
+ S
: : Cl
Cl R
O H Cl R Cl
+
:O:
:O:H
O
H
+ S
Cl
Cl
SO2
HCl
Esquema 2: Mecanismo geral de preparao dos haletos de alquila desta dissertao. Quanto caracterizao destes produtos, os espectros na regio do infravermelho (PA, Figura 52; PB, Figura 45) apresentam as seguintes bandas referentes : PA: 2974, 2940, 2887, 2832 cm-1: Def.axial de C-H2; 2470, 2423 cm-1: Def. axial (sim. e no-sim) NH de amina terciria protonada; 1447, 1410 cm-1: Def. angular de CH2, 760 cm-1: Def.axial C-Cl. PB: 3289 cm-1: Def. axial (no-sim. e sim.) N-H protonado; 2957, 2885 cm-1 : Def. axial de C-H2; 1448 cm-1: Def. angular de C-H2, 751 cm-1: Def. axial C-Cl.
138
70
99,0 95
1635
90
85
80
2957 2885 1214
75
%T 70
1448
910
65
3289
60
751
55
50
1059
44,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0
Figura 45: Espectro na regio do infravermelho de PB. Pela anlise dos espectros de RMN de 1H foi possvel identificar sinais referentes aos diferentes tipos de hidrognios presentes nas respectivas molculas de PA (Figura 46) e PB (Figura 47): PA: tripleto em 3,71ppm (J1,2= 6) sinais relativos aos hidrognios vizinhos ao tomo de cloro (H1), um tripleto 3,92 ppm (J2,1 = 6) relativos aos hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio (H2). PB: tripleto em 3,42 ppm (J1,2= 5), sinais relativos aos hidrognios vizinhos ao tomo de cloro (H1), singleto em 3,73 ppm, relativo aos hidrognios centrais (H3); tripleto 3,95 ppm (J2,1 = 5) relativos aos hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio (H2).
4.689 3.948 3.919 3.890 3.744 3.714 3.685
1000
500
0 5.85 6.00
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
71
4.838
3.982
3.932
3.734
3.446
3.423
3.402
3.953
3000
2500
2000
1500
1000
500
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
carbonos magneticamente no-equivalentes presentes (Figura 48 e Figura 49): PA: 36,71 ppm: sinal relativo ao carbono -cloro-(C1), 54,55 ppm: sinal relativo ao carbono amino- (C2). PB: 48,34 ppm: sinal relativo ao carbono -cloro-(C1); 55,65 ppm: sinal relativo ao carbono amino- (C2) e 55,35 ppm: sinal relativo ao carbono da parte etilenodiamina (C3). O sub-espectro DEPT (Figura 49) feito para PA e PB confirmou esta atribuio.
54.552 36.706 600
500
400
300
200
100
-100
150
100
50
72
55.652 55.353
48.335
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
-1000
55.0
50.0
10000
5000
60.0
55.0
50.0
45.0
40.0
73
IV-2.b-Obteno de tris(2-tioureidoetil)-(P1) e tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)aminas (P2)139 Na reao para a formao de P1 foi utilizado PA e tioureia, em etanol a refluxo por 70 h, obtendo-se rendimento de 55%; com uso de isopropanol, o tempo de refluxo foi de 53 h e com 92% de rendimento. Quando se reagiu PA com 1-metil-2-tioureia, obteve-se P2 com 55% de produto formado pela reao por 48 h em etanol e com 49% de rendimento, em isopropanol por 53 h. Cabe ressaltar que as reaes foram repetidas usando-se como solvente isopropanol (i-PrOH) e observou-se a obteno de produtos idnticos tanto para P1 como para P2 (com igual PF e dados espectroscpicos) com a reduo do tempo reacional, no entanto, nem sempre com rendimentos superiores.
NH S NH H2N S N
1 2
NH S NHMe
6
NH2 NH S 3 NH2
MeHN NH S
NH N
1 2
S 3 NHMe
4 5
P1
P2
Figura 51: Tris(2-tioureidoetil)amina (P1) e tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2). A caracterizao espectromtrica dos compostos P1 e P2 (Figura 51) foi feita atravs dos espectro no IV, onde se observaram todas as bandas de absoro caractersticas do composto sintetizado, confirmando a obteno dos compostos.Os espectros de IV de P1 (Figura 52) e P2 (Figura 53) confirmaram a sua obteno pela presena das respectivas bandas de grupos funcionais caractersticos: P1: 3254 cm-1: Def. axial N-H de NH2; 3118 cm-1: Def. axial (no-simtrica) N-H protonado; 2986 cm-1: Def. axial (simtrica) N-H protonado; 2741, 2454, 2341 cm-1: Def. axial de C-H2; 1647 cm-1: Def. axial C=N; 1632 cm-1: Def. angular simtrica no plano (N-H). P2: 3431 cm-1: Def. axial N-H (no-simtrica) de NH2; 3078 cm-1: Def. axial N-H (no-simtrica) de NH2; 2971 cm-1: Def. axial (no-simtrica) N-H protonado; 2928 cm-1: Def. axial (simtrica) N-H protonado; 2796, 2649, 2565 cm-1: Def. axial de C-H; 1610 cm-1: Def. angular simtrica no plano (N-H); 1646 cm-1: Def. axial C=N; 1441 cm-1: Def. angular CH3.
139
Furukawa, N.; Ogawa, S.; Kawai, T.; Oae, S. J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1984, 1839.
74
1080 1591 2887 1209 2974 2940 2832 1310 1283 1197 1175 1037 1024 973 2423 1414 1447 1379 945 774 1105 1069 1395 859 912 809 790
%T
760
1536 2454 2341 2741 1252 1281 3254 3118 1647 1421 1396 1076 2986 1184 977 759 1021 814
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000 cm-1
1800
1600
1400
1200
1000
750,0
1080
2470 2423
1463
774
%T
1006
760
1736 3431 2796 1471 1503 1677 3078 2971 2928 1646 2565 2649
1217
805
754
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800 cm-1
1600
1400
1200
1000
800
600
450,0
Figura 53: Espectros na regio do IV de PA (acima) e de P2 (abaixo). A anlise do espectro de RMN de 1H tambm confirmou a obteno dos produtos esperados, pois possibilitou a identificao dos diferentes tipos de hidrognios presentes nas molculas de P1 (Figura 54) e de P2 (Figura 55):
75
P1: Tripleto, relativo aos hidrognios vizinhos aos tomos vizinhos ao grupo tioureido (H2) em 3,35 ppm (J1,2= 6); tripleto, hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio central (H1) em 3,48 ppm (J2,1= 6) P2: Tripleto, relativo aos hidrognios vizinhos aos tomos vizinhos ao grupo tioureido (H-2) em 3,17 ppm ( J1,2= 7); tripleto, hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio central (H-1) 3,33 ppm (J2,1 = 6,0); Um quarteto em 3,55 ppm (J4,5= 7): hidrognios do grupo N-H tioureido (H-4); Um singleto em 2,92 ppm relativo aos hidrognios de CH3 do grupo NHCH3 (H-5).
500 3.447 3.380 3.509 3.478 3.349 3.317
400
300
200
100
0 6.00 5.64
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
76
350 3.496 3.363 3.359 3.600 3.566 3.530 3.333 3.302 3.199 3.166 3.132 2.922 1.111 1.081 1.050
300
250
200
150
100
50
3.0
2.0
1.0
0.0
esperados nas molculas de P1 (Figura 56) e de P2 (Figura 57), respectivamente: P1: 26,39 ppm: relativo ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C-2); 51,76 ppm: relativo ao carbono vizinho ao nitrognio central (C-1); 169,70 ppm: relativo ao carbono sp2 tipo amidnicos (C-3). P2: 26,34 ppm: relativo ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C-2); 30,36 ppm: referente ao grupo metil-tioureido (C-5); 52,19 ppm: relativo ao carbono vizinho ao nitrognio central (C1); 165,80 ppm: relativo ao carbono sp2 tipo amidnico (C-3).
169.705 51.765 26.391 300
200
100
-100
150
100
50
77
Figura 57: Espectro de RMN de 13C P2. Os sub-espectros DEPT de P1 (Figura 58) e de P2 (Figura 59) indicaram as fases dos tomos de carbono sp3 das estruturas planejadas: P1: 26,90 ppm: sinal relativo ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C2); 52,26 ppm: carbono vizinho ao nitrognio central (C1). P2: 27,03 ppm: sinal relativo ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C2); 52,47 ppm: carbono vizinho ao nitrognio central (C1), 30,68 ppm: o sinal referente ao grupo metila-tioureido (C4).
52.259 26.900
200
150
100
50
-50
150
100
50
78
52.468
30.680
27.034
200
100
-100
-200
70 ppm (f1)
60
50
40
30
20
10
Figura 59: Espectros de DEPT de P2. IV-2.c-Obteno de tris(2-(1,3-dimetil)-tioureidoetil)amina (P3) e N,N,N,N-tetrakis(2-1,3dimetil-tioureido-etil)etileno-diamina (P6). Os procedimentos para a obteno dos compostos P3 e P6 (Figura 60) foram anlogos aos relatados para a preparao de P1 e P2, no entanto, utilizou-se como solvente apenas isopropanol, com adio de iodeto de potssio para catalisar a reao de substituio nucleoflica, o tempo de reao para P3 foi de 43h, com rendimento de 83%. No caso de P7, o rendimento foi de 80% aps 46h de reao.
NHCH3 NCH3
6
6 7 3 5
NCH3 S
.4HCl
P3
79
Pela anlise dos espectros de IV de P3 (Figura 61) e P6 (Figura 62), constatou-se as bandas caractersitcas esperadas, respectivamente: P3: 3159 cm-1: Def. axial (no-simtrica) N-H protonado; 2969 cm-1: Def. axial (simtrica) N-H protonado; 1617 cm-1: Def. angular (simtrica)no plano de N-H; 1705 cm-1: Def. axial C=N; 1525,1455 cm-1: Def. angular CH3; 712 cm-1: Def. axial C-S. P6: 3252 cm-1: Def. axial N-H protonado; 2941 cm-1: Def. axial (simtrica) CH2; 1555 cm-1: Def. angular sim. no plano de NH; 1501 cm-1: Def. axial C=N; 1440 cm-1: Def. angular CH3; 663 cm-1: Def. axial C-S.
1591 859 2887 2940 2974 2832 1310 1197 1283 1175 1269 2470 2423 1463 1395 1069 790 1209 1080 1105 912 809
774
%T
760
2538
1705
972 960 3331 1383 3159 2969 1455 1525 1299 1269 1182 1083 1144 879
799
712
1039
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800 cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
80
99,0 95 90 85 80
875
75 70 65 %T 60 55 50 45
3252
2941 1417
1144 751
1501
1257
40 35
1555 1034
29,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0
Figura 62: Espectro na regio do IV de P6. As estruturas propostas para os produtos obtidos P3 e P6 foram confirmadas tambm a partir da anlise do RMN de 1H, para ambos os experimentos o solvente utilizado foi D2O. Assim para o derivado trissubstituido P3 h: um singleto em 2,89 ppm: grupos metilatioureido ligados a nitrognio sp3 (H-5); um singleto em 2,98 ppm: grupos metila-tioureido ligados a nitrognio sp2(H-6) ; um tripleto em 3,27 ppm (J2,1= 6 Hz): relativo aos hidrognios vizinhos ao tomo enxofre (H-2); um tripleto em 3,39 ppm (J1,2= 6 Hz): relativo aos hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio central; 3,52 ppm (J4,5= 7 Hz): relativo aos hidrognios vizinhos ao grupo metila (H-4). O espectro de RMN de 1H do derivado tetra-funcionalizado P6 por sua vez mostra sinais anlogos: um sinal alargado em 2,82 ppm referente simultaneamente aos dois tipos de metilas ligados aos nitrognios sp3 e sp2 (H-5 e H-7); um tripleto em 3,09 ppm (J1,2= 5 Hz) referente a C2; um tripleto em 3,25 ppm (J2,1= 5 Hz) referente a C-1 e um sinal singleto 3,77 ppm referente aos hidrognios do grupo etilenodiamina (C-4).
81
4.695
2.976
2.886
1000
500
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
500
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
esperado nas estruturas propostas para P3 e P6 com sinais em: P3: 27,28 ppm para os carbonos vizinhos ao tomo de enxofre (C-2); 30,02 ppm dos carbonos de grupo metlicos em nitrognio sp3(C-5); 30,75 ppm, metilas de nitrognio em sp2(C-6);
82
51,37 ppm referentes ao carbono vizinho ao nitrognio central (C-1); 166,93 ppm referentes aos carbonos imidnicos (C-3). P6: 166,04 ppm dos carbonos imnicos (C-3); 56,38 ppm sinal referente ao carbono vizinho ao nitrognio da cadeia lateral (C-1); 51,24 ppm sinal referente ao carbono etilenodiamnico (C-4); 31,38 ppm sinal correspondente ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C-2); 18,93 ppm sinal referente ao carbono de grupo metlico em nitrognio sp3 (C-6).
166.931
51.369
30.749 30.016
27.276
500
100
50
83
166.038
56.376 51.240 41.136 40.721 40.304 39.887 39.470 39.053 38.635 31.385 18.929
5000
150
100
50
Figura 66: Espectro de RMN 13C de P6 (DMSO). Os sub-espectros DEPT (Figuras 67 e 68) colaboraram na caracterizao dos sinais atravs da diferenciao entre os carbonos metilnicos e metlicos, alm de revelar o sinal referente ao grupo metila de C-5 para P6. P3: 27,74 ppm para os carbonos vizinhos ao tomo de enxofre (C-2); 30,47 ppm dos carbonos de grupo metlicos em nitrognio sp3(C-5); 31,22 ppm, metilas de nitrognio em sp2(C-6); 51,85 ppm referentes ao carbono vizinho ao nitrognio central (C-1). P6: 56,86 ppm sinal referente ao carbono vizinho ao nitrognio da cadeia lateral (C-1); 51,73 ppm sinal referente ao carbono etilenodiamnico (C-4); 31,87 ppm sinal referente ao carbono de grupo metlico em nitrognio sp2 (C-5); 27,77 ppm sinal correspondente ao carbono vizinho ao tomo de enxofre (C-2); 19,41 ppm sinal referente ao carbono de grupo metlicos em nitrognio sp3(C-6).
84
51.830
31.195
30.434 27.727
500
-500
50
1000
500
85
IV-2.d- Obteno de N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil)etilenodiamina (P4). O mtodo de preparao para P4 (Figura 69) anlogo ao dos compostos tioureidosubsitudos mencionados anteriormente. A partir do haleto de alquila correspondente PB que foi submetido a refluxo juntamente com tioureia e isopropanol na presena de iodeto de potssio ou carbonato de sdio, os rendimentos foram, respectivamente, em torno de 50% a 60%.
H2N S
5
NH
1 2
NH S
3
NH2
N
5
N
4 2 1
S NH2
H2N NH
HN
P4 Figura 69: N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil)etilenodiamina (P4). A obteno do derivado tioureido desejado P4 foi verificada e comprovada por anlise espectromtrica, pois a anlise por espectrometria na regio do infravermelho (Figura 70), mostrou as bandas de absoro caractersticas do composto sintetizado, tais como: 3273 cm-1: Def. axial (no-simtrica) N-H; 3165 cm-1: Def. axial (simtrica) N-H; 2959, 2887, 2826 cm-1: Def. axial de C-H de CH2; 1602 cm-1: Def. axial C=N ; 1398 cm-1: Def. axial NC-H; 1071 cm-1: Def. axial C-N e 727 cm-1: Def. axial C-S.
99,0 95 90
2050
85 80 75 70 %T 65 60
1112 875 916 1458 2887 2959 2826
55 50
3273
1309
45 40
34,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0
86
Alm disso, a estrutura molecular de P4 foi confirmada devido presena dos hidrognios caractersticos da estrutura proposta (Figura 71): um tripleto em 3,50 ppm (J2,1= 5 Hz) que indica os hidrognios vizinhos a enxofre da cadeia lateral (H-2); singleto em 3,86 ppm hidrognios dos grupos CH2 centrais da molcula (H-4); um tripleto em 3,98 ppm (J1,2= 5 Hz) relativo aos hidrognios vizinhos ao tomo de nitrognio da cadeia lateral (H-1).
molculas de P4: 50,82 ppm: referentes aos tomos vizinhos ao enxofre de tioureido (C-2); 55,22 ppm: relativos aos tomos de carbono centrais (C-4); 58,40 ppm referente aos carbonos vizinhos a nitrognio da cadeia lateral (C-1) e 181,70 ppm: referentes aos carbonos sp2 de grupo amidino (C-3).
87
181.699
58.399 55.221
50.816
1500
1000
500
150
100
50
Figura 72: RMN 13C de P4 em D2O. A anlise do sub-espectro DEPT (Figura 73) contribuiu para a caracterizao do composto P4: 48,40 ppm: referentes aos tomos vizinhos ao enxofre de tioureido (C-2); 55,55 ppm: relativos aos tomos de carbono centrais (C-4); 56,03 ppm referentes a carbonos vizinhos a nitrognio da cadeia lateral (C-1) .
56.034 48.398 55.826 400
300
200
100
-1 00
-2 00
-3 00
-4 00
5 5 .0 p p m ( t1 )
5 0 .0
Figura 73: A presena do terceiro tomo de carbono da estrutura molecular de P4 foi confirmada pelo DEPT.
88
IV.2.e-Obteno de N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina (P5) De maneira similar aos demais tioureidos, P5 (Figura 74) foi preparado a partir de tioureia e sua estrutura molecular foi confirmada pela anlise das tcnicas espectrocpicas.
CH3NH S N CH3NH NH S
HN
NH
2 1
NH S 3 NHCH3
4
N
5
S NHCH3
Figura 74: Estrutura de N,N,N,N-tetrakis(2-metil-tioureido-etil)etilenodiamina (P5). No infravermelho foram identificadas as seguintes bandas: 3252 cm-1: Def. axial (no-sim. sim.) de N-H; 2941 cm-1: Def. axial de C-H; 1555 cm-1: Def.axial C=N (ligada a N); 1555 cm-1: (que uma banda nitidamente larga), 1501 cm-1: Def. angular CH3; 1257, 1086 cm-1: Def. axial C-N; 663 cm-1: Def. axial C-S.
99,0 95 90 85 80
875
75 70 65 %T 60 55 50 45
3252
2941 1417
1144 751
1501
1257
40 35
1555 1034
29,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0
Figura 75: Espectro na regio do IV de P5. No RMN foi possvel atribuir os respectivos carbonos presentes na estrutura: 29,45 ppm, 31,20 ppm, 50,05 ppm, 54,74 ppm, 56,93 ppm e 178,16 ppm. A presena de diferentes grupos metilas neste tipo de composto pode ser explicada pelo seguinte equilbrio ilustrado na figura 76.
89
NHCH3 NH
NHCH3 NH2
CH3NH NH S N N S HN NHCH3 X = R
Onde
CH3NH NH
3.789
3.763
3.736
3.186
3.079
3.052
1000
500
5.00
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
90
178.160
56.926
54.742
50.047
31.203
29.447
1500
1000
500
150
100
50
200
100
-100
-200
91
IV.2.f- Obteno de 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano (P7) Para preparao de P7 utilizou-se 1,3-dimetil-2-tioureia e 1,7-bis(2-cloroetil)-4-tiaheptano (PE) na proporo 2:1 (mol/mol) em refluxo por 7,5 h com 57% de rendimento.
5 3 7 6
CH3HN
S
1
S 4 NHCH3
NCH3
P7
NCH3
Figura 80: 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tia-heptano (P7). Para elucidao deste composto foi fundamental a utilizao de mtodos
espectromtricos, entre eles, o espectro no IV (Figura 59) indicou a presena das bandas caractersticas nesta molcula: 3173, 2939 cm-1: Def. axial (no-sim. sim.) N-H protonado; 2939 cm-1: Def. axial de C-H; 1614 cm-1: Def.axial C=N (ligada a N); 1556, 1520 cm-1: Def. angular CH3; 1257, 1038 cm-1: Def. axial C-N e 666 cm-1 : Def. Axial C-S.
100,0 95 90 85 80 75 70 %T 65 60
1295 2939 1144 797 3173 1350
1094
55 50 45 40 38,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600
1556 1520
1400
1200
1000
800
650,0
Figura 81: Espectro na regio do infravermelho de 1,7-bis-(2-1,3-dimetil-tioureido-etil)-4-tiaheptano (P7). A partir da anlise de RMN de 1H foi possvel identificar os diferentes hidrognios esperados: um quinteto em 1,89 ppm (J2,1= J2,3=7 Hz) relativo aos hidrognios de H-2 da
92
molcula, um tripleto em 2,59 ppm (J1,2= J1,3= 7 Hz) relativo aos hidrognios vizinhos ao tomo de enxofre central (H-1), dupleto em 2,90 ppm (J5,6= 9 Hz) relativos a hidrognios do grupo metila (H-6); um singleto em 2,78 ppm que indica os hidrognios do grupo metila (H-7), um tripleto em 3,12 ppm (J3,2= J2,3= 7 Hz) relativo aos hidrognios vizinhos ao tomo de enxofre do tioureido (H-3).
4.684 3.615 3.584 3.553 3.153 3.119 3.084 2.919 2.872 2.778 2.678 2.621 2.586 2.551 2.092 1.953 1.922 1.888 1.853
500
400
300
200
100
4.0
3.0
2.0
1.0
(C-1), 29,88 ppm (C-3), 30,29 ppm (C-6), 30,85 ppm (C-7) e 167,76 ppm (C-4).
93
167.764
27.235
2000
1500
1000
500
-500
150
100
50
Figura 83: RMN 13C de P7. A anlise de DEPT indicou as fases dos respectivos carbonos em sp3: 27,75 ppm (C-2), 29,63 ppm (C-1), 29,88 ppm (C-3), 30,29 ppm (C-6) e 30,85 ppm (C-7).
30.853 30.294 29.885 29.630 27.748
500
-500
30.0
25.0
94
IV.3- Determinao do log kw para os compostos P1 a P7. Primeiramente foi feita uma srie de medidas experimentais com os tempos de reteno medidos em seis diferentes concentraes ou propores de metanol/tampo MOPS, variando de 75 : 25 (vol/vol) at 25: 75 (vol/vol), com a finalidade de determinar o fator de capacidade (K) de cada composto em um determinado comprimento de onda mximo. Com os diversos valores de log K obtidos em diversas concentraes do agente modificador tem-se a correlao entre log K e a composio da fase mvel () que fornece informaes a respeito destes efeitos seletivos e consequentemente sobre a lipofilia dos padres. Este , portanto, o processo responsvel pela reteno do soluto na fase estacionria apolar, que pode ser vista como um processo de associao reversvel entre as cadeias de hidrocarbonetos da fase estacionria e as partes apolares do soluto140. O agente modificador (solvente orgnico que compe a fase mvel juntamente com a gua), exerce um efeito seletivo, principalmente na reteno de solutos polares154. Neste intervalo de concentraes h um comportamento linear que pode ser vista como uma boa aproximao na Equao 6. Como j foi mencionado, em nosso grupo j foi feito um estudo da correlao entre os valores de log Kw e log P, obtendo-se a Equao 5. Com estes dados da padronizao da coluna medimos ento os valores de reteno para os nossos compostos estudados, dos quais se tem os valores descritos de log K na Tabela 7 e os dados de log kw na Tabela 8. Com estes dados de log Kw pode-se por correlao com os dados do grfico da Figura 64 interpolar e avaliar os dados de log P para os nossos compostos, tendo-se os resultados obtidos na Tabela 8. Contudo, pode-se observar que a variao dos dados no leva s concluses de variao de lipofilia interpretveis. Cabe ressaltar, contudo que j discutido na literatura que a correlao entre log Kw e log Poct apresenta alguns inconvenientes uma vez que solutos altamente lipoflicos e com estruturas mais complexas podem possuir log Poct no confiveis. De fato, as nossas estruturas so mais ramificadas e complexas do que as dos padres utilizados e alm do mais a presena de grupos muito polares com possibilidade de formao de fortes interaes de ligaes de hidrognio intramoleculares podem levar a espcies agregadas que dificultam a medida da lipofilia. Assim, tentar-se- a determinao de lipofilia atravs de outras tcnicas, tais como cromatografia delgada e shake-flask para obteno de relaes lineares entre os parmetros lipoflicos medidos e a diferena de atividade biolgica obtida conforme as diferenas estruturais entre os derivados estudados.
140 Wells, M. J. M; Randall C. C.; Patterson, R. M.; J. Chromatogr. 1982 , 235, 43. Tanaka, N.; Goodel, H.; Karger, B. L.; J. Chromatogr. 1978, 158, 233. Tanaka, N.; Sakagami K.; Araki, M.; J. Chromatogr. 1980, 199, 327. Miyake K.; Misuno, M.; Terada, H.; J. Chromatogr. 1988, 439, 227.
95
Tabela 7: Valores de log k para as diferentes propores de metanol para compostos de P1 a P7.
[MeOH] P1 P2 P3 P4 P5 25 -1,2852 -1,16036 -1,11934 -0,711 -0,95079 35 -1,3846 -1,46055 -0,94867 -0,99331 -1,17936 45 -1,31309 -1,06304 -1,26867 -0,82606 -1,07917 55 -1,70368 -0,96255 -1,14095 -1,10757 -0,99632 65 -1,85812 -0,54598 -0,871 -1,00748 -1,05996 75 -0,49762 -0,4674 -0,54421 -0,9706 -1,20436 * Os valores em fundo cinza foram desprezados para obteno da equao de P6 -0,77047 -1,25023 -1,00379 -1,53383 -1,02875 -0,95657 reta. P7 -0,37275 -0,67246 -0,84338 -1,23971 -1,89742 -0,95694
Tabela 8: Valores de log kw e log P calculados para P1 a P7. P1 logkw log P -0,85 9,68 P2 -1,84 15,9 P3 -2,42 19,6 P4 -0,84 9,61 P5 -0,32 6,34 P6 0,62 0,43 P7 0,11 3,64
IV.4- Avaliao da Atividade Antifngica dos Compostos P1 a P7 As leveduras usadas para os testes antifngicos so da American Type Culture Collection (ATCC): Candida albicans (ATCC 18804), C. glabrata (ATCC 20001) e C. krusei (ATCC 32608), C. parapsilosis (ATCC 22019), C. tropicalis (ATCC 22019), Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), Cryptococcus neoformans (ATCC 32608), Candida dubliniensis (CD22 - isolada clinicamente) estas foram repicadas em Agar Sabouraud Dextrose. Neste estudo a Anfotericina B foi o composto utilizado como padro e os valores de concentrao inibitria mnima (MIC) se encontram na Tabela 9. Os compostos estudados foram desprotonados em bicarnonato de sdio de maneira estequiomtrica. IV.4.a- Resultados de Atividade Antifngica A atividade biolgica dos compostos foi avaliada a partir da menor concentrao em que no so detectadas colnias de fungos em 24h e 48h. No caso de C. neoformans, em 72h tambm. A determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) para os compostos P1, P2, P3, P4, P5, P6 e P7 se encontra na Tabela 9. Entre todos os compostos testados, nesta classe de compostos tipo tioureido, o derivado tri-funcionalizado no-metilado P1 de fato o mais ativo, apresentando inibio contra Candida albicans e C .glabrata em concentraes (0,49 g/mL) comparveis s de inibio por anfotericina B e fluconazol (quando comparados na grandeza mencionada) entretanto, P1 no apresentou tal atividade contra C.krusei e C.parapsilosis. Candida albicans, C. glabrata Cryptococus neoformans e Saccharomyces cerevisae foram espcies mais sensveis aos compostos P1 e P3, este ltimo tambm apresentou atividade contra C. krusei (250 g/mL). P5 foi ativo apenas contra C. glabrata (250 g/mL), enquanto P6 foi ativo contra C. glabrata (125 g/mL) Cryptococus neoformans (125 g/mL), Saccharomyces cerevisae (125 g/mL) e C. parapsilosis (125 g/mL). P2 e P4 mostraram-se inativos contra todas as todas as leveduras dentro das concentraes testadas que foram entre 1000-0,30 g/mL.
96
possvel notar que P1 um agente antifgico promissor to efetivo quanto os compostos comercialmente conhecidos (anfotericina B e fluconazol) quando se compara a concentrao em g/mL. A relao estrutura-atividade parece depender tambm do nmero de ramificaes presentes na estrutura. Assim, dos compostos tri-substitudos, P1 o derivado menos alquilado com maior atividade antifngica, P2 o tioureido tri-metilado e no apresentou atividade antifgica e P3 o tioureido hexa-metilado apresentou atividade razovel. Para os anlogos tipo tetra-tioureido o aumento do grau de metilao aumenta a atividade antifngica: o derivado octametilado, P6, mais ativo do que o derivado tetra-metilado (P5) e o no-metilado (P4) no mostra nenhuma atividade. Uma explicao razovel para tal fato vem da possibilidade de ocorrer interaes de hidrognio intramoleculares entre os tomos de nitrognio e hidrognio dos dois grupos tioureido da molcula que claramente observado no espectro na regio do IV de P4. A ocorrncia deste tipo de interao intermolecular (ou intramolecular) muito favorvel em compostos com alta polaridade e alta simetria, como P4. Este derivado por apresentar dois pares de grupos nitrognio-hidrognio (NH) apresenta tal tipo de interao intramolecular, desta maneira no h nenhum grupo tioureido (responsvel pela atividade antifgica) livre para interagir no meio biolgico. Tabela 9: Concentrao inibitria mnima dos compostos que apresentaram atividade biolgica.
Produto MM (g/mol)
MIC (g/mL) MIC(nmol/mL) C.dubliniensis MIC (g/mL) MIC(nmol/mL) C.krusei MIC (g/mL) MIC(nmol/mL) C.parapsilosis MIC (g/mL) MIC(nmol/mL) C. neoformans MIC (g/mL) MIC(nmol/mL) S. cerevisae
P1 0,49 (323) (1,5) P2 > 1000 (365) (>2740) P3 250 (407) (614) P4 > 1000 (468) (2137) P5 > 1000 (524) (1908) P6 > 1000 (580) (1724) P7 250 (322) (776) Anfotericina 0,25 B (924) (0,27) Fluconazol 1,95 (306) (6,37)
-1
0,49 (1,5) > 1000 (>2740) 250 (614) > 1000 (2137) 250 (477) 125 (216) 125 (388) 0,5 (0,49) 32 (104)
> 1000 (>3095) > 1000 (>2740) > 1000 (2457) > 1000 (2137) > 1000 (1908) > 1000 (1724) >250 (776) 4,0 (4,3) 4,0 (13,1)
> 1000 (>3095) > 1000 (>2740) 250 (614) > 1000 (2137) > 1000 (1908) > 1000 (1724) 62 (192) 1,0 (1,1) 1,0 (3,27)
> 1000 (>3095) > 1000 (>2740) > 1000 (2457) > 1000 (2137) > 1000 (1908) 125 (216) 250 (776) 0,5 (0,54) 0,9 (2,94)
250 (>3095) > 1000 (>2740) 250 (614) > 1000 (2137) > 1000 (1908) 125 (216) 100 (310) 31,3 (34) > 1000 (3268)
250 (>3095) > 1000 (>2740) 250 (614) > 1000 (2137) > 1000 (1908) 125 (216) 125 (388) 1,0 (1,1) 16 (52,3)
1000 g.ml , nesta concentrao o composto considerado inativo at a concenrao mxima testada.
97
Quanto ao composto tioureido tetrametilado, ele no apenas apresentou um grande espectro atividade como tambm tem um baixo MIC, desta maneira possvel afirmar que quanto menor o nmero de ramificaes no grupo tioureido, maior o espectro de atividade do composto. Diante dos resultados obtidos, atravs da comprovao da atividade inibitria foram realizados testes de atividade fungicida. IV.4.b- Teste de Atividade Fungicida Os compostos que apresentaram atividade fungicida foram P6 e P7, o primeiro apresentou esta atividade na CFM de 125 g/mL contra C.nerformans, o segundo apresentou atividade fungicida iniciando contra S.cerevisiae a CFM de 62 g/mL onde cerca de 90% das leveduras foram mortas e C.neoformans com CFM a 125 g/mL (Tabela 10). Na figura 65 possvel visualizar os dados da atividade fungicida de P7 contra S.cerevisiae.
Figura 85: Resultado do teste de ao fungicida, a atividade comea a 62 g/mL, de baixo para cima: nitidamente notvel que h o desenvolvimento da cultura para controle de crescimento; a 250 g/mL e a 125 g/mL (com 90% do desparecimento da cultura). Tabela 10: Concentrao fungicida mnima dos compostos P6 e P7. Composto P6 P7 CFM (g/mL) (nmol/mL) (g/mL) (nmol/mL) Sacharomice.Cerevisae Cryptococus.neoformans >250 (431) 62 (192) 125 (216) 125 (388)
Os compostos P6 e P7 so aminas com grupo 1,3-dimetil-tioureia e no apenas apresentaram atividade antifngica como tambm atividade fungicida. Tais compostos no apenas inibem o desenvolvimento do fungo, como tambm faz com que a levedura no mais exista nas
98
concentraes mencionadas. Assim, estes derivados com altos nveis de alquilao, e com nmero par de ramificaes, so os agentes fungicidas mais potentes. Em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa foram realizados testes de atividade inibitria de compostos bis-tioureido cuja frmula geral se encontra na Figura 83, a partir dos resultados apresentados foi montada a Tabela 11 contendo a relao entre atividade antifngica e grupo funcional central de todos os compostos bis-tioureido sintetizados at agora. Estes compostos foram testados contra C. albicans, C. glabrata e C. krusei.
X2
( )n
( )n
X2
n = 3, X2 = tioureido, Y= S, SO, SO2,NCH3 Figura 86: Estrutura geral dos compostos estudados em trabalhos anteriores.19 Tabela 11: Dados gerais da Atividade antifngica dos compostos estudados nesta dissertao (P1 a P7) e em trabalhos anteriores (A-L).
Grupo Central Grupo terminal Produto A B P7 C D E F I J K L P1 P2 P3 P4 P5 P6 MIC* C.albicans MIC* C.glabrata MIC* C.krusei 3,1 31,3 62
S S S SO SO SO2 SO2 NCH3 NCH3 O O CH2CH2SC(NH)NH2 CH2CH2SC(NH)NHCH3 CH2CH2SC(NCH3)NHCH3 NCH2CH2N NCH2CH2N NCH2CH2N
* MIC (g/mL)
Tioureia 1-metil-iouria 1,3-dimetil-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia 1,3-dimetil-2-tioureia Tioureia 1-metil-tioureia 1,3-dimetil-2-tioureia
>1000
31,3 >1000
>1000
31,3 125
>1000
>1000 125
>1000
125
>1000
125
>1000
250
>1000
1,95 0,97 0,49
>1000
31,3
>1000
31,3
>1000
250
>1000
250
>1000
250 125
Desta tabela possvel atestar que alm da influncia da lipofilia, ou do grau de alquilao dos compostos, o tipo de tomo presente do grupo central das molculas (O, S, N) importante para caracterizar a atividade antifngica dos mesmos, sendo assim, os compostos simtricos tendo como grupo central o oxignio foram os mais ativos apresentando uma concentrao inibitria mnima muito baixa para espcies do tipo C. albicans, principalmente o composto oxigenado mais metilado foi o mais ativo. Os compostos sulfurados tambm apresentaram atividade biolgica considervel tanto para C. glabrata quanto para C. krusei, neste caso, o aumento da lipofilia do composto influenciou na atividade biolgica.
99
Desta forma o nvel de lipofilia, de ramificao e mesmo grau de alquilao podem tanto aumentar a capacidade inibitria do composto como tambm diminu-lo, isto depende da espcie estudada e da presena do grupo central. Adicionalmente, vemos que as substncias estudadas neste trabalho parecem apresentar estruturas mais complexas e que devero ser analisadas posteriormente por mtodos computacionais. IV-5- Avaliao da Atividade Antitumoral dos Compostos P1 e P2 Os compostos P1 e P2 foram submetidos a ensaios farmacolgicos para avaliao da atividade citotxica (ou antitumoral) contra algumas linhagens: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF-7) e glioma de rato (C6). Os resultados obtidos esto na Tabela 12. Tabela 12: Concentraes de atividade anticancergena dos compostos P1 e P2. Linhagem AGS CT26WT MCF-7 C6 P1 3,2 x10-5mol/L 5,0 x10-5mol/L 5,0 x10-5mol/L 4,0 x10-5mol/L P2 3,0 x10-5mol/L 5,0 x10-5mol/L 5,0 x10-5mol/L 4,0 x10-5mol/L
Os dados obtidos revelam uma atividade antitumoral ou citotxica mdia para todos os compostos estudados na faixa de 10-5 mol/L para todas as linhagens investigadas, contudo esta faixa de concentrao no considerada promissora para o desenvolvimento de novos agentes anti-neoplsicos. Cabe ressaltar que a avaliao dos dados mostra que no se observa discriminao entre os compostos estudados para que se possa efetuar um estudo de correlao estrutura-atividade aprecivel.
100
V. PARTE EXPERIMENTAL V.1. Preparaes efetuadas Os reagentes utilizados cuja preparao no est descrita foram adquiridos
literatura141.
Os compostos foram purificados conforme descrito nos procedimentos de obteno (item V. 2) e analisados, geralmente, por tcnicas espectromtricas usuais (RMN de 1H, RMN de
1 13 13
C,
DEPT e IV). Os espectros de ressonncia magntica nuclear (RMN de H, RMN de C e DEPT) foram feitos pelos espectrmetros Brucker 200MHz do Departamento de Qumica da UFMG e pelos espectrmetros Varian modelo INOVA. Os deslocamentos qumicos () so relatados em partes por milho em relao a tetrametilsilano (TMS), usado como padro interno. Os solventes utilizados para esta anlise foram gua deuterada (D2O) e deuterodimetilsulfxido (DMSO). Os espectros na regio do infravermelho (IV) foram obtidos em um espectrofotmetro da Perkin-Elkmer modelo Spectrum One do Laboratrio de Qumica Farmacutica da Faculdade de Farmcia da UFMG. Os pontos de fuso foram determinados pelos aparelhos Fisher-Johns, analgico e Microqumica Equipamentos Ltda. MQAPF-301 digital sem correo. Para a cromatografia em camada delgada foi utilizada slica-gel 60G MERCK em lminas de vidro. Como revelador foi utilizado o vapor de iodo ressublimado. Para RP-HPLC foi utilizada uma coluna Rainin C8, 5 m de 4,6 mm x 250 mm (com fase estacionria SIGMA ALDRICH). O aparelho utilizado para medidas foi um cromatgrafo lquido da marca SHIMADZU equipado com duas bombas LC-10AD, um detector ultravioleta SPD-6AV e LC-R6A do Grupo Nequim do Departamento de Qumica da UFMG, o programa de deteco utilizado foi CLASS-LC10 LC Workstation. A fase mvel foi constituda de metanol/soluo de MOPS (cido 3-[Nmorfolino]-propanossulfnico) a pH 7,2 e o fluxo da fase mvel foi 0,3 mL/min. O sal utilizado na determinao do tempo morto da coluna foi o nitrato de sdio. V.1.2-PROCEDIMENTO GERAL PARA OBTENO DE HALETOS DE ALQUILA: Preparao de tris(2-cloroetil)amina (PA)
OH
3
SOCl2
CHCl3
HCl. N
Cl
3
141
Riddick, J. A. E Bunger, W. B.; Organic Solvent _ Physical Properties and Methods of Purification. Techniques of Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 3 ed, 1970; Assumpo, R. M. V E Morita, T.; Manual de Solues, Reagentes & Solventes , Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1968.
101
Em um balo tritubulado de 250 mL, acoplado a condensador para refluxo, funil de adio, agitao magntica e banho de gelo, colocaram-se 9,20 g (61,7 mmol) de trietanolamina e 8,0 mL de clorofrmio anidro. Adicionaram-se, com o auxlio de um funil de adio de 50,0 mL, 18,0 mL (248 mmol) de cloreto de tionila solubilizados em 12,0 mL de clorofrmio. Deixou-se sob agitao magntica durante 2 h. Ao final da reao adicionaram-se 40,0 mL de benzeno anidro e esta soluo foi submetida a evaporao em evaporador rotatrio para retirada total do cloreto de tionila, obtendo 8,743 g (59 %) de um slido branco. PF.: 116-118 oC FM. C6H12Cl3N.HCl MM= 241 g/mol
Cl
1
N
2
Cl
.HCl
Cl
Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C e IV de PA RMN de 1H (D2O) Atribuio H-1 H-2 Atribuio C-1 (ppm) 3,71(t) 3,92(t) RMN de (ppm) 36,71
13
IV Integrao 6H 6H Atribuio Def. axial (sim. e no-sim) N-H de amina terciria protonada Def. Axial de C-H2 Def. Angular de C-H2 (ppm) 54,55 Def. Axial C-Cl (cm-1) 2470, 2423 2974, 2940, 2887, 2832 1447, 1410 760
OH HO N N OH
SOCl2
Cl Cl N Cl N Cl
OH
CHCl3
Seguindo o procedimento geral V.1.2 fez-se reagir 9,33 g (39,5 mmol) de N,N,N,N- Tetrakis (2hidroxietil)etilenodiamina em 20,0 mL de clorofrmio anidro com 18,0 mL (248 mmol) de cloreto
de tionila em 20,0 mL de clorofrmio. Adicionaram-se 20,0 mL de clorofrmio e deixou-se sob agitao magntica durante 2h. Ao final da reao adicionaram-se 40,0 mL de benzeno anidro e esta soluo foi submetida a evaporao em evaporador rotatrio para retirada total do cloreto de tionila e o produto bruto (leo transparente e viscoso) foi utilizado para a prxima reao. FM C10H20N2Cl4.2HCl MM 383 g/mol
1 2
Cl Cl .2HCl
Cl
N
3
Cl
Tabela 17: Dados de RMN de 1H, RMN de H (D2O) Atribuio H-1 H-3 H-2 (ppm) 3,42(t) 3,73(s) 3,95(t) J(Hz) J =5 J =5
1,2 1,2 1
13
C e Dept de PB Dept (D2O) Atribuio C-1 C-3 C-2 (ppm) 48,82 55,84 56,14 (ppm) 48,33 55,35 55,65
Tabela 18: Dados de IV de PB Atribuio Def. axial (sim. e no-sim) N-H de amina protonada Def. Axial de C-H Def. Angular de C-H Def. Axial C-Cl (cm-1) 3289 2957, 2885 1448 751
V.1.3 PROCEDIMENTO GERAL PARA OBTENO DE TRIS-TIOUREIDO-DERIVADOS: Preparao de tris(2-tioureidoetil)amina (P1) em EtOH
S
HCl. N
Cl
3
H2N
NH2
4HCl. N
NH
3
NH2
Em um balo tritubulado de 100 mL, dotado de agitao magntica e condensador para refluxo, contendo 1,00 g (4,15 mmol) de PA e 40,0 mL de lcool etlico, adicionou-se 1,056 g (13,9 mmol) de tiouria. Manteve-se sob refluxo por 70 h com a reao sendo acompanhada por CCD (eluente: acetato de etila; rf do produto: 0, rf da tiouria: 0,6, rf do reagente: 1). Terminado o tempo de reao a mistura foi esfriada at temperatura ambiente, e levada geladeira, filtrou-se o slido formado e aps secagem com presso reduzida em dessecador dotado de pentxido de fsforo, foram obtidos 1,064g (55%) de um slido branco. PF= 174-175 C FM = C9H20N7S3.4HCl MM= 469g/mol
NH S NH H2N S N
1 2
Tabela 19: Dados de RMN de 1H, Atribuio H-2 H-1 RMN de H (D2O) J(Hz) (ppm) 3,35(t) J1,2= 6 3,48(t) J2,1= 6
1
13
Integrao 6H 6H
RMN de 13C (D2O) Atribuio (ppm) C-2 C-1 C-3 26,39 51,76 169,70
Tabela 20: Dados de IV de P1 Atribuio Def. Axial N-H de NH2 Def. Axial (no-simtrica) N-H Def. Axial (simtrica) N-H Def. Axial de C-H (cm-1) 3254 3118 2986 2741,2454,2341 Atribuio Def. Axial C=N
Def. Angular simtrica no plano (N-H)
V.1.3.1-Preparao de tris(2-tioureido)etilamina (P1) em i-PrOH Repetindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3, fizeram-se reagir 0,948 g (12,4 mmol) de tiouria com 1,00 g (4,15 mmol) de PA em 30 mL de isopropanol a refluxo por cerca de 53 h (acompanhamento CCD com etanol e acetato de etila (4:1 vol/vol; rf do produto: 1,4, rf da tiouria: 1, rf do reagente: 0,1). Obtiveram-se 1,802 g (92 %) de um slido branco filtrado. PF: 174-175 C V.1.3.2-Preparao de tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2) em EtOH
S HCl. N Cl
3
H2N
NHMe
4HCl. N
NH2 NH-Me
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3 reagiu-se 0,502 g (2,07 mmol) de PA com 0,619 g (6,86 mmol) 1-metil-2-tiouria em 40mL de lcool etlico. Aps refluxo por 48 h (acompanhamento por CCD; acetato de etila ; rf do produto: 0, rf do reagente:1). Aps o fim da reao e adio de 30 mL de acetato de etila, filtrao e secagem presso reduzida, obtiveramse (55%) de um slido branco. PF= 198-200 C FM = C12H27N7S3.4HCl MM= 511g/mol
NH S NH MeHN S N
1 2
NHMe
6
NH S 3 NHMe
4 5
.4HCl
Tabela 21: Dados de RMN de 1H, RMN de H (D2O) Atribuio H-5 H-2 H-1 N-H (ppm) 2,92(s) 3,17(t) 3,33(t) 3,55(q)
2,1 1
13
C e Dept de P2 Dept (D2O) Atribuio (ppm) C-2 C-5 C-1 27,03 30,68 52,47
RMN de 13C (D2O) Integrao 9H 6H 6H 3H Atribuio (ppm) C-2 C-5 C-1 C-3 26,34 30,36 52,19 165,80
Tabela 22: Dados de IV de P2 Atribuio Def. Axial N-H (no-simtrica) de NH2 Def. Axial N-H (simtrica) de NH2 Def. Axial (no-simtrica) N-H Def. Axial (simtrica) N-H 2928 Def. angular CH3 1441 (cm-1) 3431 3078 2971 Atribuio Def. Axial de C-H Def. Axial C=N
Def. Angular simtrica no plano (N-H)
V.1.3.3 - Preparao de tris(2-(1-metil-2-tioureidoetil)amina (P2) em i-PrOH Seguindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3 (porm, com adio de 0,207 g de iodeto de potssio) reagiu-se 1,122 g (12,45 mmol) de 1-metil-2-tiouria com 1,000 g de trimustina em 30mL de isopropanol sob refluxo por 53h (acompanhamento por CCD; eluente etanol/acetato de etila 4:1; rf. do produto: 0,28) desligou-se o aquecimento. Aps o final da reao, diminuio do volume total por evaporao e adio 30 mL de acetato de etila h precipitao de um slido. Aps e filtrao a presso reduzida e secagem, obteve-se 1,059 g (49%) de um slido branco. PF = (201-204) C MM =511 g/mol FM = C12H31Cl4N7S3
3 MeNH
4HCl. N
NHMe
NMe
3
NH-Me
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3 (porm, com adio de 0,207g (1,25 mmol) de iodeto de potssio) reagiu-se 1,297 g (12,45 mmol) de 1,3-dimetil-2-tiouria com 1,000 g (3,15 mmol) de PA em 30 mL de isopropanol. Aps refluxo por 43 h (acompanhamento por CCD;
eluente etanol/acetato de etila 4:1; rf. do produto: 0,1) a mistura foi concentrada e adicionou-se 30 mL de acetato de etila e filtrao a presso reduzida e secagem, obtiveram-se 1,910 g (83%) de um leo extremamente viscoso de colorao branca. MM = 553 g/mol FM = C15H33N7S3. 4HCl
NHMe
6
NMe
.4HCl
S 3 NHMe
4 5
Tabela 23: Dados de RMN de 1H, Atribuio H-5 H-6 H-2 H-1 H-4 RMN de H (D2O) J(Hz) (ppm) 2,89(s) 2,98(s) 3,27(t) 3,39(t) 3,52(q) J2,1= 6 Hz J1,2= 6 Hz 1
13
C e Dept de P3 (D2O) Dept (D2O) (ppm) Atribuio (ppm) 27,18 C-2 27,67 29,94 C-5 30,43 30,70 51,32 166,88 C- 4 C-1 (CH2N) 31,19 51,80
Integrao 18H 6H 6H -
RMN de 13C Atribuio C-2 (CH2-S) C-5 (NHCH3) C- 4 (=NCH3) C-1 (CH2-N) C-3
Tabela 24: Dados de IV de P3 Atribuio Def. Axial (no-simtrica) N-H Def. Axial (simtrica) N-H Def. Axial de C-H Def. Axial CN (cm-1) 3159 2969 2538 1705 Atribuio
Def. Angular simtrica no plano (N-H)
V.1.4 PROCEDIMENTO GERAL PARA OBTENO DE TETRA-TIOUREIDO-DERIVADOS: Obteno de N,N,N, N- tetrakis (2-tioureidoetil) etilenodiamina (P4) em presena de Carbonato de sdio
H2N Cl Cl S
-PrOH NH2 iNa 2CO3
NH S N N S HN NH2 S
NH NH2
N
Cl
N Cl
+ 4 H2N
H2N NH
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3 (porm, com adio de 0,691 g de carbonato de sdio) reagiu-se 0,982 g (12,90 mmol) de tiouria com 1,000 g (3,220 mmol) de PB
em 50mL de isopropanol sob refluxo por 44 h (acompanhamento por CCD (eluentes: clorofrmino/etanol/hexano: 5:4:1- r.f. da tiouria 0,89; r.f. do PA 0,37; r.f. do produto 0,11). Aps resfriamento da mistura reacional na geladeira, obteve-se um slido que foi retirado por filtrao e a soluo gerada foi concentrada a presso reduzida. Aps evaporao obteve-se um slido alaranjado (929 mg, 61%) que se mostrou muito higroscpico, mesmo apesar de ter sido secado. FM = C14H32N10S4 MM = 468g/mol
H2N S NH
3 1 2
NH S
3
NH2
N
3
N
4 2
S NH2
H2N NH
HN
Tabela 25: Dados de RMN de 1H,13C e Dept de P4 RMN de 1H (D2O) Atribuio H-2 H-5 H-2 e H-4 (ppm) 3,50(t) 3,86(s) 3,98(t) J(Hz) J2,1= 5 J =5
1,2
13
Tabela 26: Dados de IV de P4 Atribuio Def. Axial (no-simtrica) N-H Def. Axial (simtrica) N-H Def. Axial de C-H Def.axial C=N (ligada a N) (cm-1) 3273 3165 2959, 2887, 2826 1602 Atribuio Def. Axial NC-H Def. Axial C-N Def. Axial C-S (cm-1) 1398 1071 727
V.1.4.1 - Obteno do N,N,N,N-Tetrakis(2-tioureidoetil) etilenodiamina (P4) sem carbonato de sdio Conforme o procedimento no item V.1.3 (mas com adio de 0,276g (1,66mmol) de iodeto de potssio), fez-se reagir 1,277g (16,78mmol) de tiouria em 40mL de isopropanol e 1,290 g (4,16 mmol) de N,N,N,N-tetrakis(2-cloroetil)etilenodiamina em 10mL de isopropanol, aps 48h de refluxo, deixando-se sob refluxo por mais 3h. Aps cristalizao da mistura reacional na geladeira, obteve-se um slido que foi retirado por filtrao e o filtrado foi concentrado a presso reduzida, do qual obteve-se um slido amarelado que foi secado em dessecador sob presso reduzida com P2O5 gerando 1,273 g (50 %). PF = 140-146 C FM = C14H32N10S4.4HCl MM = 614 g/mol
N
Cl
N Cl
4 H2N
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item IV.1.3 (com adio de 0,215 g (1,30 mmol) de iodeto de potssio) reagiu-se 1,160 g (12,87 mmol) de 1-metil-2-tiouria com 1,000 g (3,22 mmol) de N,N,N,N-tetrakis-2-cloroetil-etilenodiamina em 30 mL de isopropanol. Aps refluxo por 50 h (acompanhamento por CCD; eluentes: etanol/acetato de etila (4:1) rf. do produto: 0,2). Aps resfriamento da mistura reacional observo-se a formao de duas fases: uma densa e viscosa e outra com isopropanol, esta ltima foi filtrada e concetrada presso reduzida, obtendo-se 1,059 g (49%) de um slido branco que foi seco no dessecador com pentxido de fsforo. PF = 105-108 C FM = C18H40N10S4.4HCl MM = 670 g/mol
CH3NH S
NH
1 2
NH
4
S 3 NHCH3
4'
N CH3NH NH S
N
5
. 6HCl
S HN NHCH3
13
Tabela 27: Dados de RMN de 1H, RMN de H (D2O) Atribuio (ppm) H4 e H4 H-2 H-5 H-1 2,88 e 2,74(s) 3,05(t) 3,19(s) 3,76(t)
2,1 1
C e Dept de P5 DEPT Atribuio C-4 C-2 C-5 C-1 (ppm) 29,95 e 31,73 50,54 56,24 57,42
RMN de 13C Integrao Atribuio 20H 8H 4H 8H C-4 C-2 C-5 C-1 C-3 (ppm) 29,45 e 31,20 50,05 54,74 56,93 178,16
J(Hz) J =5 J1,2= 5
Tabela 28: Dados de IV de P5 Atribuio Def. Axial (assimtrica) N-H protonado Def. Axial (simtrica) N-H protonado Def. Axial de C-H Def. axial N-H banda de combinao (cm-1) 3366, 3245 3164 2970 2097 Atribuio Def.axial C=N (ligada a N) Def.axial C=S (ligada a N) Def. Axial C-N Def. Axial C-S (cm-1) 1625 1544,1294 1122 714
NCH3 S
S
NCH3 NHCH3
+ 4 CH3NH
NHCH3
i-PrOH
N CH3NH S NCH3
CH3N
N S NHCH3
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item IV.1.3 (com adio de 0,214 g (1,29 mmol) de iodeto de potssio), reagiu-se 1,341 g (12,87 mmol) de 1,3-dimetil-2-tiouria com 1,000 g (3,22 mmol) de N,N,N,N-tetrakis-2-cloroetil-etilenodiamina em 30 mL de isopropanol. Aps refluxo por 46 h (acompanhamento por CCD: eluentes: clorofrmio/etanol/hexano (5:4:1); rf. do produto: 0,2) desligou-se o aquecimento. Aps o fim da reao esfriou-se, filtrou-se e concentrou-se o filtrado obtendo-se 1,465 g (80%) de um leo amarelo escuro. FM = C18H40N10S4.4HCl MM = 726 g/mol
NHCH3 NCH3
6 7 3 5
NCH3 S
. 6 HCl
Tabela 29: Dados de RMN de 1H, RMN de H (D2O) Atribuio H-4-H-5 H-2 H-6 H-1 (ppm) 2,92(s) 3,19(t) 3,35(s) 3,69(t) J(Hz) 5,2 5,2 Integrao 24H 8H 4H 8H
1
13
C e Dept de P6 C (DMSO) (ppm) 18,93 31,38 51,24 56,38 166,04 DEPT (DMSO) Atribuio C-6 C-2 C-5 C-4 C-1 (ppm) 19,41 27,77 31,87 51,73 56,86
13
Atribuio
Tabela 30: Dados de IV de P6 Atribuio Def. Axial de N-H Def. Axial de CH2 Def.axial C=N (ligada a N) Def.angular sim. No plano N-H (cm-1) 3252 2941 1501 1555 Atribuio Def. angular CH3 Def. Axial C-N Def. Axial C-S (cm-1) 1440 1034 663
S Cl
S
Cl + CH3NH
i-PrOH
CH3NH
NHCH3
NHCH3
Seguindo-se o procedimento geral descrito no item V.1.3 reagiu-se 0,671 g (6,44 mmol) de 1,3dimetil-2-tiouria com 0,602 g (3,22 mmol) de 1,7-dicloro-3-tia-propano em 30mL de isopropanol. Aps refluxo por 7,5 h (acompanhamento por CCD: eluente: acetato de etila; rf. do produto: 0,68). Resfriou-se a mistura reacional at a temperatura ambiente, filtrou-se e concentrou-se a soluo. Aps purificao em coluna cromatogrfica de slica usando como eluente mistura de etanol/acetato de etila (6:1 v/v) e evaporao do solvente, obteve-se 0,726 g (57%) de um leo marrom claro.
CH3HN
FM = C12H26N4S3.2HCl
S S
1 2 3
S 4 NHCH3 NCH3
13
. 2 HCl
NCH3
Tabela 31: Dados de RMN de 1H, Atribuio H-2 H-1 H-6 H-7 H-3 RMN de H (D2O) J(Hz) (ppm) 2,1 1,89 (quinteto) J = J2,3=7 Hz 2,59 (t) J1,2= J1,3= 7 Hz 2,90 (d) J5,6= 9 Hz 2,78 (s) 3,12 (t) J3,2= J2,3= 7 Hz
1
C e Dept de P7 Dept (D2O) Atribuio (ppm) C-2 27,75 C-1 29,63 C-3 29,88 C-6 30,29 C-7 30,85
Integrao 4H 4H 12H 4
RMN de 13C (D2O) Atribuio (ppm) C-2 27,24 C-1 29,11 C-3 29,35 C-6 29,69 C-7 30,31 C-4 167,76
Tabela 32: Dados de IV de P7 Atribuio Def. Axial (assimtrica) N-H Def. Axial (simtrica) N-H Def.axial C=N (ligada a N) (cm-1) 3173 2939 1614 Atribuio Def.axial C=S (ligada a N) Def. Axial C-N Def. Axial C-S (cm-1) 1556, 1520 1257, 1038 666
V.2 - DETERMINAO DO LOG KW PARA OS COMPOSTOS P1 A P7. Os parmetros de lipofilia para os compostos sintetizados neste trabalho foram calculados a partir dos dados obtidos em um cromatgrafo com coluna Rainin C-8, 5 m de 4,6 mm x 250 mm (com fase estacionria SIGMA ALDRICH). Usou-se uma coluna, preparada com fase estacionria obtida comercialmente. Esta coluna constituda de cadeias alqulicas de oito carbonos quimicamente ligados ao oxignio da slica, por esta razo denominada octilsilano (C8). A fase mvel foi constituda de metanol e soluo tampo de MOPS (cido 3-(Nmorfolino)propanossulfnico) a pH 7,2 e fluxo mvel de 0,3 mL/min, o tempo morto foi determinado a partir do nitrato de sdio.
Os tempos de reteno foram medidos em seis diferentes propores de metanol/tampo MOPS, variando de 75 : 25 (vol/vol) at 25: 75 (vol/vol), com a finalidade de determinar o fator de capacidade (K) de cada composto em um determinado comprimento de onda mximo. K = (tr to)/ to Equao 4 onde: tr = tempo de reteno do composto, to = tempo morto A partir da determinao do fator de capacidade (K), calculou-se o log K para os compostos P1 a P7 que podem ser vistos na Tabela 8. Os coeficientes de partio podem ser correlacionados atravs da equao de Collander142 neste caso uma vez que log P e log K so parmetros hidrofbicos obtidos em diferentes sustemas a equao de Collander pode ser escrita como: log Poct = a log Kw + b (Equao 5) onde, a e b so constantes caractersticas do agente modificador empregado juntamente com uma soluo tampo de pH igual a 7,2 (MOPS), neste caso, o metanol. Tabela 33: Valores de log K para os padres utilizados para diferentes porcentagens de metanol.
PADRES* 1-CLA 2-HBZ 3-TBA 4-BUT 5-FTU 6-MTU 7-ACA 8-ACP 9-IPA 10-ABN 11-PTM 12-BER 13-AFA 14-DOT 15-PAF 16-CAF 17-CPN 18-EDT 19-DTP 20-NPD log k para as diferentes porcentagens de MeOH () 25 0,642 -0,424 0,082 1,566 -0,064 -0,727 -0,885 -0,753 -0,883 0,179 -0,738 -0,735 -0,869 -0,687 -0,463 -0,065 -0,229 -0,878 -1,003 -0,820 35 0,517 -0,572 -0,112 1,105 -0,285 -0,814 -1,011 -0,880 -0,969 -0,135 -0,830 -0,820 -0,944 -0,767 -0,518 -0,268 -0,340 -0,982 -1,135 -0,956 45 0,004 -0,790 -0,346 0,646 -0,504 -1,016 -1,112 -1,002 -1,071 -0,400 -0,920 -0,890 -1,018 -0,860 -0,557 -0,400 -0,470 -1,065 -1,499 -1,068 55 -0,192 -0,927 -0,689 0,350 -0,665 -1,090 -1,274 -1,094 -1,196 -0,607 -0,980 -0,950 -1,099 -0,900 -0,589 -0,508 -0,567 -1,167 -1,590 -1,032 65 -0,411 -1,080 -0,854 0,063 -0,879 -1,170 -1,383 -1,150 -1,301 -0,811 -1,017 -1,036 -1,158 -0,944 -0,632 -0,577 -0,615 -1,222 -1,775 -1,110 75 -0,663 -1,253 -0,997 -0,167 -1,118 -1,270 -1,500 -1,300 -1,405 -1,003 -1,116 -1,068 -1,259 -1,003 -0,660 -0,757 -0,723 -1,331 -1,780 -1,299
* (1)4-cloroanilina (2) 4-hidroxibenzamida (3) 4-terbutilanilina (4) 4-butilanilina (5) cido 1,4,7,10-tetraazociclododecanoNNNN-tetractico (DOTA) (6) cido 1,1,4,7,7-dietilenotriaminopentactico (DTPA) (7) p-aminofenol (8) Cafena (9) 3cloropropionitrila (10) cido etilenodiaminotetractico (EDTA-bisdico) (11) Feniltioureia (12) 1-metil-2-tioureia (13) Pentamidina (14) 4,4'-(1-triazeno-1,3-diil)-bis[benzenocarboximidamida] (Berenil) (15) cido 4-aminofenilactico (16) 4-aminobenzonitrila (17) cido cloroactico (18) cido cloropropinico (19) Isopropilamina (20) N,N-bis(3-aminopropil)1,3-propanodiamino
142
Brito, M.M.; Montanari, C.A. (coord.); Tese de Doutorado, Departamento de Qumica da UFMG, 2000.
Tabela 34: Valores do log Poct obtidos na literatura e log kw para todos os padres cromatogrficos.
PADRES 1-CLA 2-HBZ 3-TBA 4-BUT 5-FTU 6-MTU 7-ACA 8-ACP 9-IPA 10-ABN Log kw (C8) 1,341 -0,012 0,652 2,320 0,444 -0,463 -0,573 -0,510 -0,605 0,701 Log Poct 1,83 0,25 2,70 3,02 0,73 -0,71 -0,05 0,42 0,21 1,07 PADRES 11-PTM 12-BER 13-AFA 14-DOT 15-PAF 16-CAF 17-CPN 18-EDT 19-DTP 20-NPD Log kw (C8) -0,575 -0,578 -0,676 -0,552 -0,375 0,213 -0,006 -0,666 -0,621 -0,501 log Poct 2,47 1,64 0,94 -1,31 0,04 -0,13 0,18 -0,43 0,05 -1,27
log kw
log Poct
Figura 87: Correlao entre log kw e Poct para os padres cromatogrficos. Os valores de Kw foram obtidos a partir da extrapolao do dos valores de log K calculados a partir do tempo de reteno do nitrato de sdio e do tempo de reteno de cada composto, em diferentes concentraes de agente modificador (Tabela 33), atravs da equao da reta para 0% de metanol. Desta maneira, log k= B[MeOH] + A Onde, a e b so constantes do agente modificador (metanol) e [MeOH] a porcentagem de metanol do sistema. Os valores de log de kw que foram interpolados na Equao 5.
Tabela 35: Valores calculados de fatores de capacidade (K) para as diferentes concentraes de compostos de P1 a P7. P1 0,05 0,04 0,05 0,02 0,01 0,32 P2 0,07 0,03 0,09 0,11 0,28 0,34 Valor de K x % MeOH P3 P4 0,08 0,19 0,11 0,10 0,05 0,15 0,07 0,08 0,13 0,10 0,29 0,11 P5 0,11 0,07 0,08 0,10 0,09 0,06 P6 0,17 0,06 0,10 0,03 0,09 0,11 P7 0,42 0,21 0,14 0,06 0,01 0,11
25 35 45 55 65 75
Tabela 36: Correlao entre log K e concentrao de metanol P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 A -0,84972(+0,19008) -1,8446 (+0,24055) -2,4222(+0,1956) -0,84495(+0,09619) -0,32213(+0,44255) 0,62231(+0,24355) 0,10752(+0,22175) B -0,1465(+0,0405) 0,1803(+0,04553) 0,02443(+0,0032) -0,0402(+0,0173) -0,2044(+0,1066) -0,3617(+0,0516) -0,20626(+0,0534) R -0,90206 0,89259 0,98323 -0,80255 -0,80485 -0,97076 -0,93906 SD 0,12797 0,19045 0,0716 0,06641 0,23826 0,16327 0,11939 N 5 6 4 5 4 5 4 P 0,03625 0,01669 0,01677 0,10215 0,19515 0,00598 0,06094
V.3 ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTIFNGICA V.3.1-Consideraes Gerais Estes testes foram realizados no laboratrio de microbiologia no instituito de cincias biolgicas da UFMG para todos os derivados sintetizados P1 a P9. V.3.2 Tcnica da microdiluio A microdiluio (diluio em caldo, realizada em placa de microdiluio) foi realizada em placas plsticas esterilizadas de microdiluio com fundo chato contendo oito sries identificadas de A a H, cada qual com 12 poos (total de 96 poos) (Figura 88). Os ensaios foram preparados, inicialmente, com 4 diferentes concentraes finais (em g/mL) de cada amostra examinado. Nos poos de 2 a 5 e 8 a 11 foram colados 100 L de diferentes concentraes de amostra, com auxlio de pipeta multicanal . Os poos 1, 6,7 e 12 foram usados para controle do ensaio.
Na preparao de cada microorganismo, inicialmente, foi feita diluio em soluo salina esterilizada, e depois diluio em RPMI-1640. Esta preparao da soluotrabalho, foi realizada para se obter o dobro da concentrao final desejada, visto que posteriormente adicionou-se igual volume de soluo contendo a amostra examinada. A seguir, volumes de 100 L de suspenso balanceada de inculo-RPMI-1640 foram transferidos para os orifcios da placa de microdiluio, contendo 100 L de duas vezes as concentraes finais a serem examinadas, de modo que em cada poo foi adicionado um volume total de 200 L de soluo. Os inculos referentes a cada microorganismo foram adicionados em cada concentrao de amostra em duplicata. Adicionalmente, poos pertencentes coluna identificada com os nmeros 1, 6, 7 e 12 em cada placa de microdiluio so utilizados como controle de esterelidade 1 e 6 e os poos 7 e 12 para controle de crescimento da levedura. No controle de esterelidade (negativo), foram colocados apenas RPMI-1640 e, no controle de crescimento (positivo), somente a soluo balanceada do meio e o inculo. No momento da leitura, o crescimento de microorganismos no controle positivo, tem a finalidade de mostrar a viabilidade da cultura usada e seu crescimento comparado visualmente, ao crescimento verificado nos poos referentes s diferentes amostras testadas. No caso das cultura contendo C.tropicalis no se observou crescimento. No controle negativo, pela ausncia de inoculo no pode haver crescimento de microorganismos. Esse controle muito importante, pois ele indica se o meio de cultura est isento de microorganismos que possam causar contaminao (fungos, bactrias, etc.). V.3.3 Solventes utilizados na solubilizao Para solubilizao dos compostos sintetizados (P1-P7), foi utilizado o prprio RPMI 1640 (SIGMA) no teste de micro diluio. V.3.4 Meio de cultura O meio de Agar Sabouraud Dextrose (ASD) foi utilizado para a manuteno das culturas fngicas. Para os testes de microdiluio, usou-se o meio de RPMI 1640 (SIGMA) tamponado com cido-2-(N-morfolino)-propanosulfnico (MOPS). V.3.5 Origens dos microrganismos utilizados nos ensaios As leveduras usadas para os testes antifngicos so da American Type Culture Collection (ATCC): Candida albicans (ATCC 18804), C.glabrata (ATCC 20001) e C. krusei (ATCC 32608), C. parapsilosis (ATCC 22019), C. tropicalis (ATCC 22019) , Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), Cryptococcus neoformans (ATCC 32608), Candida dubliniensis (CD22isolada clinicamente). V.3.6- Avaliao da Atividade Antifngica dos Compostos P1 a P7 As espcies de Cndida spp. e S. cerevisae foram subcultivadas em meio ASD, 24 horas antes da realizao dos testes e mantidas a 35 C, j o C. neoformans foi subcultivado da mesma
maneira, porm 72 h antes da inoculao (Documento NCCLS M-27-A, 2002).143 Preparou-se uma suspenso, usando-se um tubo falcon grande estril, contendo 5 mL de soluo salina estril 0,85 %, e transferiu-se para esse tubo falcon a cultura, com auxlio de uma ala de platina. Ajustou-se a concentrao desta suspenso salina em espectrofotmetro a 530 nm, at obter uma transmitncia entre 75 a 77% . O inculo de cada levedura foi preparado transferindo-se 300 L da suspenso salina da levedura correspondente, para um falcon estril grande com 14,7 mL de RPMI 1640, obtendo-se uma suspenso de 1 x 103 a 1 x 104 ufc/mL.144
5mg de amostra
Esquema 3: Diluio seriada das amostras. Todas as amostras testadas foram devidamente desprotonadas com bicarbonato de sdio em proporo molar correspondente (bis- ou hexa-equimolar). Foram preparadas solues estoque 5 mg/mL e, a partir de cada uma delas foram preparadas quatro outras solues com as respectivas concentraes de compostos: 2000 g/mL, 1000 g/mL, 500 g/mL, 250 g/mL, 125 g/mL e 62,5 g/mL. Foram transferidos 100 L de cada soluo para uma placa de elisa de maneira que as concentraes de fato testadas, aps incubao foram: 1000 g/mL, 500 g/mL, 250 g/mL, 125 g/mL e 62,5 g/mL e 31,3 g/mL. A placa foi selada com um papel filme, incubada a 35 C pelo tempo estabelecido para cada espcie e a leitura feita visualmente. As CIMs (concentraes inibitrias mnimas), foram consideradas como a menor concentrao em que a amostra testada inibiu totalmente o crescimento do microorganismo, em relao ao controle de crescimento, aps a incubao e foram expressas em g/mL e mol/mL. medida que um determinado composto apresentava atividade inibitria na mnima concentrao, foram preparadas outras concentraes menores a partir de uma nova soluo estoque, no caso de P1 at 0,25 g/mL (1,5 mol/mL). Neste estudo foram utilizados como drogas padres: Anfotericina B e fluconazol.
143
Giannini, F. A.; Aimar, M. L.; Sortino, M.; Gomez, R.; Sturniollo, A.; Juarez, A.; Zacchino, S.; Rossi, R. H.; Enriz, R. D.; Il Farmaco, 2004, 59(4), 245. 144 Chan, M. M. Y.; Biochem. Pharmacol. 2002, 63(2), 99.
V.3.7- Teste de Atividade Fungicida V.3.7.a- Preparao das Placas de Petri Para preparao da placa de petri solubilizou-se 65 g Agar Sabouraud Dextrose para 1 L de gua deionizada, autoclavou-se tal mistura e transferiu-se (ainda quente) para as placas de Petri. V.3.7.b- Avaliao da Atividade Fungicida Em uma placa de Petri contendo cultivo de Agar Sabouraud Dextrose (Esquema 6) foi feito um subcultivo transferindo 10 L do composto inoculado em diferentes concenraes a partir da da placa de elisa que havia sido avaliada a CIM e, portanto, com atividade inibitria comprovada. Esperou-se uns 15 minutos at que o RPMI do subcultivo evaporasse e levou-se a placa estufa de 35oC com a finalidade de determinar a cultivo. Os compostos que apresentaram atividade fungicida foram P6 e P7, o primeiro apresentou esta atividade a CFM de 125 g/mL contra C. nerformans, o segundo apresentou atividade fungicida iniciando contra S. cerevisiae a CFM de 62 g/mL onde cerca de 90% das leveduras foram mortas e C. neoformans com CFM a 125 g/mL. concentrao fungicida mnima (CFM ) aps 24h de
Esquema 4: Placa de petri subcultivada em duplicata para diferentes concetraes em g/mL, A, controle de esterilidade (negativo) e B o controle de crescimento (positivo). V.4 - ESTUDOS DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DETERMINAO DA CONCENTRAO INIBITRIA DE 50% DA POPULAO CELULAR (IC50) Para a medida do crescimento e da viabilidade celular, h trs alternativas de ensaios in vitro, consideradas pelo NCI (National Cncer Institute).145 Duas consistem em ensaios de metabolismo celular, onde sais de tetrazlio (MTT e XTT) so reduzidos a produtos coloridos. Nestes ensaios colorimtricos (Figura 89), a viabilidade celular avaliada por meio de uma reao biolgica catalisada por desidrogenases. Em clulas viveis, essas enzimas esto ativas e tm a capacidade de reduzir o sal de tetrazlio formazana, um produto colorido. Os cristais de formazana, de cor roxa, que se formam com a metabolizao do MTT so insolveis em meio aquoso, e devem ser solubilizados em dimetilsulfxido (DMSO), antes da leitura145. No entanto a metabolizao do XTT produz cristais de formazana, de cor laranja, que so solveis em gua,
145
Boyd, M. R.; Principles and Practice of Oncology Updates, 1989, 3(10), 1.Bellamy, W. T.; Drugs, 1992, 44, 690.
dispensando a etapa de solubilizao, o que torna o ensaio mais simples e rpido. Por outro lado, h relatos que vrias linhagens celulares tumorais metabolizam o XTT de forma menos eficiente que o MTT e, por isso, esse ltimo ainda preferido.146147A absorbncia dos produtos formazanas, medida espectrofotometricamente, diretamente correlacionada com o nmero de clulas ativas metabolicamente. Sendo assim, valores de absorbncia altos indicam uma elevada produo de formazana (roxo ou laranja), o que significa, em outras palavras, uma alta atividade enzimtica e, portanto, presena de um grande nmero de clulas viveis. O estudo da atividade antitumoral dos compostos P1 e P2 contra as linhagens tumorais: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF-7) e glioma de rato (C6) foi feito em colaborao e sob superviso da Profa. Dra. Miriam Tereza Paz Lopes ICB.
NAD H Br N N N N
+
N S
NAD H
O N H
MeO
NO2 MeO
NO2
N N
N N
+
SO3 SO3
NO2
Na
Desidrogenase Mitocondrial
O N H
N N H N N
MeO
SO3 SO3 Na
NO2
+
MeO
Formazana (laranja)
Figura 89: Reduo do MTT e do XTT a formazana. V.4.1 - Meio de Cultura Celular Para cada 1,0 L de meio tem-se: RPMI 1640 (Sigma Chemical Company) em gua deionizada, 1,2 g de bicarbonato de sdio (Grupo Qumica Indstria Ltda.), 10 M de Hepes pH 7,4 (INLAB), 0,1 g de Ampicilina (wyeth), 0,1 g de Estreptomicina (Sigma Chemical Company), 0,05 g de Gentamicina (farmcia HC FMUSP), 0,0025 g de Anfotericina B (Bristol- Myers Squibb). Este
146
Scudiero, D. A.; Shoemaker, R. H.; Paull, K. D.; Monks, A.; Tierney, S.; Nofziger, T. H.; Currens, M. J.; Seniff, D.; Boyd, M. R.; Cancer Research, 1988, 48, 4827.
meio foi esterilizado por filtrao atravs de membranas de 0,2 de porosidade (Micro Filtration Systems). V.4.2 - O Soro Fetal Bovino (SFB) (Cultilab) O SFB foi inativado a 56 C por 30 minutos e esterilizado por filtrao atravs de membranas de 0,2 de porosidade (Micro Filtration Systems). V.4.3 - Os Reagentes Utilizados Os reagentes utilizados foram Mitomicina Sigma Chemical Company), Taxol (Sigma Chemical Company), MTT (Brometo de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazol) (Sigma Chemical Company) V.4.4 - Aparelhos Estufa de CO2 (SANYO); Fluxo laminar (VECO); Leitor de Elisa Biorad modelo 2550; Microscpio ptico (Olympus CK 2); Aparelho ultra-som THORNTON T14; Purificador de gua MilliQ Plus (Millipore); Balana analtica Micronal AB 204. V.4.5 Estudo da Atividade Antitumoral As clulas foram cultivadas, rotineiramente, em meio RPMI 1640 a 5 % v/v de soro fetal bovino (SFB) e incubadas em atmosfera mida com 2,5 % de CO2, 37 C, no escuro. Antes de atingirem confluncia as clulas foram subcultivadas da seguinte maneira: as clulas foram lavadas com PBS-EDTA, adicionou-se uma soluo de tripsina 0,2 % e, aps o descolamento das clulas da superfcie da garrafa, foi feita a inativao da tripsina pela adio de meio RPMI 1640 a 5 % v/ v de SFB. As clulas em suspenso foram distribudas para novas garrafas ou placas nas densidades desejadas ou ainda estocadas em nitrognio lquido (na presena de 10 % de DMSO e 30 % de SFB). Suspenses celulares148149foram distribudas em micro placas de 96 cavidades contendo 1,0 x 103 clulas/poo. As culturas foram incubadas em atmosfera mida a 5 % de CO2, a 37 C. Aps 48 h , foram adicionados os compostos, dissolvidos em DMSO, nas concentraes de 10-7 10-4 mol/mL. O DMSO utilizado foi 1 % e este no afetou a metabolizao celular na concentrao utilizada. O MTT foi adicionado 4 horas antes das leituras (0,05 mg/cavidade), sendo esse realizado 5 dias aps a adio dos compostos, em espectrofotmetro (Leitor de Elisa), a 600 nm. Antes da adio do MTT, o meio RPMI 1640 a 5 % de v/v de soro fetal bovino (SFB) foi trocado para se evitar qualquer interao entre os compostos analisados e o MTT. Os cristais de formazana
formados, devido metabolizao do MTT, so insolveis em meio aquoso, e por isso foram solubilizados em 150 L de dimetilsulfxido (DMSO), antes das leituras. Para controle positivo dos ensaios, no se utilizou nenhum antineoplsico. Em cada micro placa de 96 poos, o branco, utilizado para zerar o espectrofotmetro, foi apenas com meio RPMI 1640 a 5 % v/v de SFB e MTT. O crescimento celular foi acompanhado pelo controle negativo, composto apenas de clulas em meio RPMI 1640 a 5 % v/v de SFB. As mdias aritmticas das densidades pticas (absorbncia) obtidas para os controles foram consideradas como 100 % de viabilidade celular, sendo assim, as porcentagens de clulas viveis foram calculadas pela formula: B/A x 100, onde A = mdia aritmtica da densidade ptica do controle e B = densidade ptica na presena de amostra. A porcentagem de inibio da viabilidade celular foi determinada subtraindo-se de 100 % o valor.
como possvel centro farmacofrico, da ramificao (bis-, tris- ou tetra-substituio) e do grau de metilao dos grupos tioureido. Mais especificamente pode-se relatar que: 7a) Para os derivados tipo amina tri-funcionalizada com grupos tioureido (P1, P2 e P3) observa-se que o maior grau de metilao parece diminuir a potncia antifngica. 7b) Para os derivados tipo amina-tetraureido-substituda (P4, P5 e P6) o maior grau de metilao parece acentuar a potncia antifngica. 7c) Em uma anlise mais global, considerando os resultados anteriores do nosso grupo de pesquisas com derivados bis-funcionalizados (PA a PL, Tabela 9, p. 66), que podem ser comparados com o nosso derivado sulfeto bis-funcionalizado mas, tetra-metilado P7, observa-se perfil de correlao similar aos dos derivados amina-tetra-funcionalizados descritos acima (7b). 7d) Pode-se sugerir que nos derivados bis- e tetra-funcionalizados h grande possibilidade de fortes interaes tipo ligao de hidrognio intramoleculares devido maior simetria molecular e presena de nmero par de grupos aceptor/doador de ligaes de hidrognio e nos derivados noalquilados estas interaes so mais fortes tornando os grupos farmacofricos tioureido inacessveis para a ocorrncia da ao antifngica mesmo com diluio; 7e) Nos derivados tipo tri-substitudos o nmero mpar de grupos tioureido conduz a possvel ocorrncia de uma interao intramolecular entre dois dos grupos tioureido e a ocorrncia de interao intermolecular com o terceiro grupo. Estas interaes intermoleculares so quebradas pela diluio e assim a atividade antifngica pode ser alcanada em baixos nveis de concentrao; 8) A espcie Candida dubliniensis foi a mais resistente a ao dos nossos compostos, o que no incomum, pois esta espcie extrato clnico usualmente mais resistente; 9) As espcies Candida albicans and C. glabrata foram as espcies mais sensveis aos nossos compostos; 10) Cryptococus neoformans foi susceptvel a P1, P3, P6 e P7 nas seguintes respectivas concentraes: 250 g.mL-1(3095 nmol.mL-1), 250 g.mL-1(614 nmol.mL-1), 125 g.mL-1 (216 nmol.mL-1)e 100 g.mL-1(310 nmol.mL-1). 11) P1, P6 e P7 apresentaram atividade inibitria contra Saccharomice Cerevisae.
12) Apenas os compostos P6 e P7 apresentaram atividade fungicida contra Cryptococcus neoformans e contra Saccharomyces cerevisae. 13) O uso da metodologia de RP-HPLC para avaliao da lipofilia e determinao do log P no se mostrou adequada para os compostos sintetizados, provavelmente devido ao fato de que os compostos utilizados na padronizao da coluna no eram to similares estruturalmente aos nossos compostos, que so bem mais ramificados e polifuncionalizados, o que pode conduzir de agregados (por ligao-H, etc...) que podem alterar o mecanismo de difuso dentro da coluna do HPLC e no permitir a correlao dos dados entre os padres e os compostos estudados; o uso de outras tcnicas, tais como a cromatografia de camada delgada e mesmo shake-flask podem ser alternativas para a determinao de log P; 14) Os compostos P1 e P2 que foram testados contra as linhagens tumorais: adenocarcinoma gstrico humano (AGS), carcinoma de clon murino (CT26WT), carcinoma mamrio humano (MCF7) e glioma de rato (C6) mostraram-se ativos somente na concentrao da ordem de 10-4-10-5 mol.L-1 e pelas convenes atuais no se mostram como agentes antineoplsicos promissores para o tratamento destes tumores. Finalmente, como perspectivas futuras deste trabalho tm-se o estudo de novos derivados similares tipo tioureido e/ou amidnicos com outras estruturas que forneam maior lipofilia e maior rigidez, o que ser efetuado com a introduo de unidades aromticas e heteroaromticas. Alm disso, ser efetuado o estudo de atividade anti-leucmica de todos os compostos. Para termos um melhor entendimento do mecanismo de ao biolgica dos compostos estudados far-se-o colaboraes cientficas com grupos de pesquisa do ICB-UFMG e IQ-USP-So Carlos. Adicionalmente, tentar-se- tambm verificar a possibilidade do estudo da interao enzima-substrato com enzimas tipo aspartase de Candida spp. com os nossos substratos e em estudo avanado tentar-se- verificar tal interao por espectrometria de massas.