BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Paracetamol Rumus Bangun

Pemerian Kelarutan

: serbuk hablur, putih tidak berbau rasa sedikit pahit : Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1 N, mudah larut dalam etanol.

2.2.Penetapan Kadar Paracetamol Berdasarkan Farmakope Indonesia Edisi 4, kadar paracetamol dapat di tetapkan dengan menggunakan teknik Kromaografi Cair Kinerja Tinggi, dengan menggunakan campuran air-metanol (3:1) sebagai fase gerak. Dan menggunakan kolom dengan pengisi L1 dan dengan detektor 243 nm. Laju aliran yang digunakan 1,5 ml. 2.3.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satunya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat - zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing- masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik. Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlaut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat penjerap, seperti halnya penjerap alumina yang

diaktifkan, silika gel, dan penukar ion, atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. (FI ed. IV. 1995 : 1009). HPLC adalah singkatan yang umum dipakai di dunia internasional yang mengandung dua pengertian yaitu High Performance Liquid Chromatography atau High Pressure Liquid Chromatography. Namun beberapa ilmuwan di Indonesia mempopulerkan istilah KCKT yang merupakan singkatan dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. (Gritter.1991 : 5). Kemajuan dalam teknologi kolom sistem, pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabhan perubahan kromatografi cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi tinggi. Metode ini dikenal sebagai Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. (FI ed. IV. 1995 : 1009). Kromatografi cair tekanan tinggi modern merupakan jenis yang khusus dari kromatografi kolom. Berbeda dengan kromatografi gas, metode ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase mobil sebagai pengganti gas. Metode ini dapat dibedakan dari kromatografi kolom klasik oleh empat sifat yang khas yaitu: 1. menggunakan kolom pendek untuk mempersingkat waktu 2. menggunakan kolom sempit dengan diameter 1 sampai 3 mm, untuk memungkinkan pemisahan dalam jumlah mikro. 3. Ukuran partikel bahan absorbsi terletak di bawah 50 , hingga akan tercapai suatu bilangan teoritik yang tinggi. 4. Pelarut elusi dialirkan ke dalam kolom dengan tekanan untuk mengompensasikan tekanan arus di dalam kolom. ( Roth Hermann J. dan Gottfried: 431).

2.3.1. Sistem dan Radas Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi terdiri dari wadah penampung yang berisi fase gerak. Pompa untuk menekan fase gerak ke dalam sistem pada tekanan tinggi, suatu injektor untuk memasukkan zat ke dalam fase gerak, kolom, kromatografi, detektor dan peralatan pengolah data seperti komputer, integrator atau recorder. (Synder. 1997 : 63).

2.3.2.1. Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu: a. Sub sistem pemisahan, sistem pemasok pelarut dengan bagian utama pompa yang mengalirkan fase gerak dan sampel dari injektor ke dalam kolom

b. Sub sistem pendeteksian, detektor pada ujung akhir kolom dan direkam dengan rekorder integrator atau data prosesor.

2.3.2.

Radas KCKT
Injektor Pompa Kolom

Wadah cairan pembawa

Data sistem

Detektor

Gambar 2.3. Bagan Instrumen KCKT

Instrumen KCKT terdiri dari: a. Wadah cairan pembawa Wadah cairan pembawa harus mempunyai beberapa ciri. Bahan harus lembam terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja nir (anti) karat dan gelas menjadi bahan yang terpilih. Tetapi baja nir karat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika wadah harus bertekanan, hindari penggunaan gelas. Daya tampung wadah harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama empat jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1 - 2 ml/menit. Volume wadah menjadi tak terbatas, pada sistem dengan pompa torak balik. Bila terokan yang encer dianalisis, maka pelarut dapat didaur ulang tanpa gangguan yang berarti. (Munson James W. 1991 : 26)

b.

Pompa Pompa merupakan alat untuk menggerakkan zat cair (fase gerak) melalui kolom. Ada dua jenis pompa yaitu pompa tekanan tetap dan pompa pendesakan tetap (aliran tetap). Pompa aliran tetap sangat berguna jika terjadi perubahan dalam tekanan atau viskositas fase gerak yang dikompensasi dengan perubahan dalam tekanan kerja. Perkembangan pompa KCKT pada

saat ini telah dapat melakukan sistem elusi baik isokratik maupun gradien (Johnson. 1991 : 4) Selain itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan yaitu syarat pompa pada kromatografi cair kinerja tinggi: - Dapat memompa fase gerak secara konstan - Dapat memberikan tekanan yang cukup tinggi - Fluktuasi tekanan yang seminimal mungkin - Memberikan noise yang rendah - Cara kerjanya sederhana

c.

Injektor Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Katup injektor terdiri atas katup pengatur yang dihubungkan dengan loop sampel (pipa dari baja tahan karat). Suatu pipa pendek yang menghubungkan injektor dengan bagian atas kolom. Dimana bagian ujungnya identik dengan bagian ujung bawah. Sampel dimasukkan ke dalam loop pada saat katup posisi load. Sementara aliran fase gerak dari pipa ke kolom mengalir melalui bagian lain dari katup. Ketika katup diputar ke posisi suntik, loop sampel dihubungkan dengan aliran fase gerak antara pompa dan kolom. Hasil penyuntikan yang kuantitatif diperoleh dengan mengisi penuh volume loop larutan sampel. (Snydner.1997 : 76).

Injektor dikatakan baik apabila: - Dapat memasukkan larutan contoh ke dalam kolom sesempit mungkin - Memiliki keberulangan tinggi - Dapat digunakan pada situasi damana tekanan balik pada kolom relatif tinggi - Mudah dipergunakan

d. Kolom Dipergunakan untuk memisahkan komponen - komponen yang tercampur. Kolom merupakan jantung kromatografi dan hampir selalu terbuat dari baja tahan karat, berlubang kecil dengan diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm. isi kolom berupa partikel kecil dengan ukuran 3 m hingga 50 m.

Fase gerak yang melewati kolom dapat menyumbat kolom karena: - Pertumbuhan bakteri - Presipitasi - Kontaminan - Gelembung udara Oleh karena itu fase gerak harus disaring atau diawaudarakan, pH fase gerak harus diantara 2 8, dan jika menggunakan fase gerak larutan dapar maka harus dibuat segar. (Snydner. 1997 : 205-230) e. Detektor Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen - komponen yang telah dipisahkan di dalam kolom baik secara kualitatif pada konsentrasi contoh. Perbandingan antara sinyal dan konsentrasi disebut sensitifitas. Suatu detektor dikatakan amat sensitif apabila terjadi perubahan sinyal yang besar oleh perubahan konsentrasi yang kecil. (Snydner. 1997 : 292-314). Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis senyawa. (Johnson Edward L. dan Robert Stevenson. 1991 : 6)

f.

Rekorder Pada umumnya sinyal yang berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu sebelum disampaikan pada alat perekam otomatis yang sesuai. Biasanya berupa suatu perekam potensiometrik, dalam hal ini sinyal merupakan fungsi dari waktu. (Snydner. 1997 : 685 - 713).

g.

Profil Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatogram KCKT merupakan hubungan antara respon puncak detektor dengan waktu, dimana pada saat sampel diinjeksikan dinyatakan sebagai titik 0, seperti pada gambar berikut: t2

t1 t0 t0

Gambar 2.4. Profil Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Keterangan gambar: t0 = Waktu retensi komponen yang tidak ditahan t1 = Waktu retensi komponen 1 t2 = Waktu retensi komponen 2 2.3.2. Uji Kesesuaian Sistem 2.3.2.1. Definisi dan Tujuan Uji Kesesuaian Sistem Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995 : 1016), yang dimaksud dengan uji kesesuaian sistem adalah suatu uji yang digunakan untuk membuktikan bahwa resolusi dan keberulangan suatu sistem kromatografi memenuhi syarat dalam melakukan suatu pengujian. Konsep dari uji kesesuaian sistem adalah berdasarkan pada prinsip bahwa instrument, reagen, kolom, kondisi percobaan, rincian prosedur, contoh, sistem elektronik dan bahkan analis adalah suatu sistem yang harus diuji fungsinya. Dalam validasi, suatu metode dapat diyakini akan kendalanya untuk suatu waktu tertentu, tetapi untuk mempertegas bahwa suatu metode masih tetap secara konsisten memberikan hasil yang baik pada sistem yang berbeda, maka suatu uji yang disebut uji kesesuaian sistem harus dilakukan setiap kali metode tersebut digunakan. Tujuan dari uji kesesuaian sistem adlah untuk mengetahui apakah suatu sistem kromatografi cair kinerja tinggi ataupun sistem kromatografi gas yang digunakan memenuhi syarat yang telah ditetapkan dan berada dalam kondisi yang prima dan dapat dipercaya, sehingga data analisis yang dihasilkan cukup handal untuk dipakai dalam menyimpulkan suatu hasil pengujian. Uji kesesuaian sistem berbeda dengan validassi metode analisis, karena validasi metode analisis hanya dilakukan pada saat suatu metode analisis dikembangkan dengan tujuan memperlihatkan bahwa metode yang bersangkutan dapat dipercaya dan dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah, sedangkan uji kesesuaian sistem bertujuan untuk memeriksa kinerja dari sistem kromatografi yang digunkan memenuhi standar yang diperoleh oleh metode tersebut. (FI edisi IV. 1995 : 1016).

2.3.2.2. Parameter Uji Kesesuaian Sistem a. Presisi Presisi merupakan salah satu parameter uji yang berguna untuk menguji keberulangan dari penyuntikan ulang larutan yang mengandung analit. Keakuratan penyuntikkan menunjukkan kinerja dari KCKT yang digunakan, yang meliputi kondisi percobaan, kolom, kerja instrumentasi dan sebagainya pada saat analisis dilakukan. Keberulangan (reprodusibility) dari penyuntikan ulang umumnya dinyatakan dalam simpangan baku relatif [Relatif Standard Deviation (RSD) atau Coefficient of Variation (CV)], dengan persamaan sebagai berikut :

Keterangan: SR X Xi = RSD = CV = Simpangan baku relatif = Nilai rata rata dari N kali pengukuran = Hasil pengukuran individual

Bila digunakan baku internal, maka yang dimaksud dengan Xi adalah

rs = Respon puncak dari baku pembanding yang digunakan ri = Respon puncak dari baku internal

sedangkan bila tidak menggunakan baku internal (cara baku eksternal), maka yang dimaksudkan dengan xi adalah respon puncak dari baku pembanding (rs). Penyuntikan ulang dari larutan baku umumnya dinyatakan dalam masing masing monografi. Hasil yang diperoleh yang dinyatakan dalam RSD selanjutnya dibandingkan dengan syarat yang dicantumkan dalam Farmakope untuk mengetahui apakah presisi dari hasil penyuntikan ulang memenuhi syarat yang ditetapkam. Kecuali dinyatakan lain dalam masing masing monografi, jika batas RSD yang ditetapkan 2,0%, maka yang harus digunakan untuk menghitung RSD

adalah data dari 5 kali penyuntikan ulang, sedangkan jika batas RSD yang ditetapkan > 2,0%, maka digunakan data dari enam kali penyuntikan ulang. (Farmakope Indonesia edisi IV. 1995:1016). Secara umum, besarnya nilai RSD yang dapat diterima adalah sebagai berikut: Untuk bahan baku obat : RSD < 1,0% Untuk sediaan obat : RSD < 2,0% Untuk analisa residu : RSD 3,0%

b. Resolusi Parameter lain untuk melengkapi presisi dari sistem kromatografi adalah kemampuan resolusi dan sistem. Cara pengukuranya adalah melalui perhitungan resolusi antara dua puncak yang dielusi berdekatan, dan puncak puncak yang dipilih haruslah merupakan dua komponen yang benar-benar terdapat dalam larutan uji. Resolusi adalah fungsi dari efisiensi kolom (N), yang berguna untuk memberikan keyakinan bahwa senyawa-senyawa yang terelusi berdekatan terpisah satu sama lain, dengan tujuan untuk menetapkan kemampuan pemisahan dari suatu sistem kromatografi serta memperlihatkan bahwa baku internal terpisah baik dari analit yang akan diuji. Jadi resolusi adalah suatu ukuran seberapa baik dua puncak terpisahkan sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif secara akurat. Untuk mendapatkan pemisahan yang baik, nilai Rs harus > 1,5. Resolusi antar dua puncak dapat dihitung menurut persamaan berikut ini:

t1 dan t2 w1 dan w2

= waktu retensi dari dua puncak kromatografi = lebar puncak puncak yang diukur dengan cara ekstraporasi sisi puncak yang relatif lurus terhadap garis dasar.

c. Efisiensi kolom

Efisiensi kolom adalah ukuran ketajaman suatu puncak yang bermanfaaat sekali dalam mendeteksi suatu zat yang berada dalam bentuk residu. Efisiensi kolom didefinisikan sebagai jumlah lempeng teoritis (theoretical plate) N. pada analisis secara beerulang, lebar suatu puncak tertentu harus konstan, variasi dalam lebar puncak yang terjadi menunjukkan bahwa kinerja kolom sudah berubah. Bila teknik penyuntikkan tidak baik, atau kolom mulai rusak, maka hal ini dapat terlihat pada variasi puncak yang pada akhirnya memberikan variasi pada efisiensi kolom. Efisiensi kolom yang didefinisikan sebagai jumlah lempeng teoritis per meter (N) dapat dijabarkan dengan persamaan berikut:

Keterangan: t = waktu retensi suatu puncak yang diukur mulai dari saat hingga keluarnya puncak maksimum. w = lebar dasar puncak Cara lain untuk menyatakan efisiensi kolom adalah dengan HETP (Height Equivalent of a Theoritical Plate), yang menunjukkan efisiensi kolom per unit panjang dari kolom. penyuntikan

Keterangan : L = panjang kolom N = jumlah plat teori Parameter yang dapat mempengaruhi N atau HETP termasuk letak puncak, ukuran partikel kolom, laju aliran fase gerak, suhu kolom, viskositas fase gerak dan berat molekul zat uji.

d. Faktor ikutan (tailing factor) Faktor ikutan (T) sering juga disebut sebagai faktor simetris, adalah ukuran kesimetrisan suatu puncak. Keakuratan akan berkurang jika faktor ikutan bertambah, hal ini disebabkan karena sulitnya bagi integrator untuk menentukan dimana dan kapan suatu puncak berakhir, yang pada akhirnya mempengaruhi

perhitungan luas puncak, sehingga bila suatu zat mempunyai puncak yang asimetris, maka beberapa alternatif perbaikan harus dipertimbangkan, antara lain mencakup pergantian kolom dan pengurangan volume penyuntikan. Faktor ikutan dapat dinyatakan dengan rumus:

Keterangan: W0,05 2f = lebar puncak 5% tinggi = jarak dari maksimum puncak sampai tepi muka puncak, diukur pada tititk dengan ketinggian 5% dari tinggi puncak terhadap garis dasar.

e. Faktor kapasitas Faktor kapasitas (k) adalah suatu parameter yang menyatakan kemampuan suatu zat tertentu untuk berinteraksi dengan sistem kromatografi, dapat dihitung dengan rumus berikut:

atau

Keterangan: t = waktu retensi komponen atau zat k > 2

t0 = waktu retensi komponen atau zat yang tidak ditahan. Pada umumnya nilai

f. Retensi relatif Retensi relatif () merupakan ukuran dari letak relatif dua puncak dan dinyatakan dengan rumus sebagai berikut:

Keterangan: t2 = waktu retensi yang ditetapkan mulai dari penyuntikan zta uji t1 = waktu retensi yang ditetapkan mulai dari penyuntikan baku pembanding t0 = waktu retensi komponen yang tidak ditahan Sedangkan waktu retensi relatif (tr) dinyatakan dengan :

BAB III PROSEDUR dan METODE PENGUJIAN 3.1. Preparasi Larutan Uji dan Larutan Baku 3.1.1. Larutan Baku Timbang seksama sejumlah paracetamol BPFI, larutkan dalam fase gerak hingga kadar lebih kurang 0,01 mg/ml 3.1.2. Larutan Uji Timbang dan serbukkan tidak kurang dari 20 tablet. Timbang seksama sejumlah serbuk tablet setara dengan lebih kurang 100 mg paracetamol, masukkan kedalam labu tentuukur 200 ml, tambahkan lebih kurang 100 ml fasa gerak, kocok selama lebih kurang 10 menit, encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Pipet 5 ml lerutan kedalam labu tentuukur 250 ml encerkan dengan fase gerak sampai tanda. Saring larutan melalui penyaring dengan porositas 0,5 m atau lebih halus, buang 10 ml filtrat pertama. Gunakan filtrat sebagai larutan uji. 3.1.3. Fase Gerak Buat campuran air metanol (3:1), saring dan awaudarakan. Jika perlu lakukan penyesuaian menurut kesesuaian sistem kromatografi.

3.2. Pengujian Suntikkan secara terpisah sejumlah volume yang sama (lebih kurang 10 l) larutan baku dan larutan uji kedalam kromatograf. Ukur respons puncak utama. Hitung jumlah dalam mg, C8H9NO2. Dalam serbuk tablet yang digunakan rumus.

C adalah kadar paracetamol BPFI dalam mg/ml larutan baku, ru dan rs berturut turut adalah respons puncak dari larutan uji dan baku.

3.3. Skema Kerja Praktikum

LARUTAN BAKU Timbang seksama paracetamol BPFI hingga kadar 0,01 mg/ml LARUTAN UJI Timbang 20 tablet paracetamol, catat bobot dan hitung bobot rata- ratanya. Gerus ad halus Timbang sejumlah serbuk setara dengan 100 mg paracetamol. Masukkan ke dalam labu tentuukur 200 ml Larutkan dengan gerak Gerusfase ad halus ad 200 ml . Pipet 5,0 ml larutan Masukkan ke dalam labu tentu ukur 250 ml, ad dengan fase gerak

Saring menggunakan penyaring dengan porositas 0,5 l, masukkan ke dalam tabung reaksi.

Suntikkan ke dalam alat KCKT menggunakan syringe.

Catat respons puncak dan hitung kadar dari paracetamol

DAFTAR PUSTAKA

Departemen Kesehatan RI. 1997. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Badan POM RI Gritter, Roy J.,et all. 1991. Pengantar Kromatografi edisi II. Bandung: ITB. Johnson, L. Edward dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB Munson, James W. 1991. Analisis Farmasi Parwa B. Surabaya: Airlangga University Press Snydner, L.R., et all. 1997. Practical HPLC Method Development 2nd edition. New York: John Wiley & Son Inc