BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

MANUAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA I

AUTORES: M.C. REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZN M.C. GLORIA LEN TELLO M.C. ALMA LPEZ GARCA M.C. MARA SUSANA PERZ FERNNDEZ M.C. PATRICIA GUADALUPE SUREZ ALBORES D.C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA

NDICE
NMERO DE PRCTICA Prctica 1 TTULO PGINA

Aplicacin de los criterios de Cowan y Steel para la identificacin de bacterias

Prctica 2 Prctica 3 Prctica 4 Prctica 5 Prctica 6

Caracterizacin de bacterias no fermentadoras Caracterizacin del gnero Pseudomonas Caracterizacin del gnero Haemophilus Caracterizacin del gnero Brucella Caracterizacin de bacterias de los gneros Neisseria y Moraxella Caracterizacin de enterobacterias: lactosa positivas Caracterizacin de enterobacterias: lactosa negativas Caracterizacin del gnero Vibrio Caracterizacin de bacterias de los gneros Streptococcus y Enterococcus Caracterizacin de bacterias del gnero Staphylococcus Caracterizacin de bacilos Grampositivos: Bacillus

8 13 15 17 19

Prctica 7

21

Prctica 8

25

Prctica 9 Prctica 10

28 30

Prctica 11 Prctica 12 Bibliografa

33 36 38

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PRACTICA No.1 APLICACIN DE LOS CRITERIOS DE COWAN Y STEEL PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
Introduccin La identificacin de una bacteria es la asignacin a un taxn segn una clasificacin dada y consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin.

Cowan y Steel establecen un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso, familia a la que pertenece un aislamiento. Dichas pruebas son:

1.- Tincin de Gram. 2.- Tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener bacilos Grampositivos (BGP)). 3.- Tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener bacilos BGP). 4.- Metabolismo (Oxidativo/Fermentativo/Inerte). 5.- Produccin de catalasa. 6.- Produccin de oxidasa. 7.- Movilidad. 8.- Crecimiento de aerobios. 9.- Crecimiento de anaerobiosis.

10.- Produccin de cido a partir de glucosa.

Tambin se pueden incluir pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ejem. produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptfano, produccin de coagulasa, de fenilalanina desaminasa, etc.)

Objetivo Realizar tomando como base los criterios establecidos por Cowan y Steel, las pruebas bioqumicas fundamentales, que permiten la identificacin presuntiva de las bacterias de inters mdico.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Benzal Algodn Cepas de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores Tubos con O/F con glucosa Placas con agar nutritivo o soya tripticasa

Metodologa Tomar una cepa problema a la cual se le realizar lo siguiente: 1. Inocular por estra cruzada una placa de agar nutritivo, incubar a 37C durante 24 h. 2. De una colonia aislada realizar la tincin de Gram (ver figura 1) Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un min. Escurrir y lavar.

Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 seg. Escurrir y lavar. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 seg. Escurrir y lavar. Dejar secar al aire. Observar el frote con objetivo de inmersin. Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada cepa empleada.

Figura 1.Esquema y fundamento de tincin de gram

3. De una colonia aislada hacer la tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener BGP) (ver Figura 2). Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. Cubrir el frote con verde de malaquita a emisin de vapores y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente. Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por 1 min. Escurrir y lavar. Observar el frote con objetivo de inmersin y dibjala

Figura 2.Esquema y fundamento de tincin de Shaeffer y Fulton

4. De una colonia aislada realizar la tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener BGP) (ver Figura 3). Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. Cubrir el frote con fucsina fenicada a emisin de vapores durante 5 min. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente, no permitir que se seque el colorante Decolorar con alcohol-cido durante 7 min. Enjuagar con agua el portaobjetos y quitar el exceso. Aplicar azul de metileno durante 1 min, volver a enjuagar con un leve chorro de agua e inclinar el portaobjetos hasta drenar el exceso de agua y secar al aire. Colocar una pequea gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con 100x

Figura 3.Esquema y fundamento de tincin de Gram

5. Inocular por picadura el medio O/F e incubar a 37C por 24 h (ver figura 4)

Figura 4. Metabolismo bacteriano en medio O/F

6. Inocular por picadura el medio MIO e incubar a 37C por 24 h, si se observa turbidez en el tubo ser movilidad positiva y movilidad negativa cuando crece nicamente en la estra 7. Inocular por picadura una base de CTA con un carbohidrato e incubar a 37C por 24 h, si se observa vire a color amarillo ser positivo a formacin de cido a partir de glucosa. 8. Del crecimiento en placa realizar las pruebas de oxidasa y catalasa. 9. Comparar los resultados en la tabla 1 e identificar familia o gnero.

Tabla 1. Identificacin de bacterias hetertrofas segn Cowan y Steel

Tincin de Gram (cultivo fresco) Forma Agrupacin Crecimiento aerobio Crecimiento anaerobio Esporas Movilidad Catalasa Oxidase Fermentacin de glucosa a acido o a acido+gas O/F Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomonas Enterobacterias Aeromonas Chromobacterium Neisseria X X X X X X X X X X X X X X X X X X X + + + + + (o ) + + coco + Coco + coco + coco + + + +

bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco pares + + + + +o + + + +o + + + +o + + +o + + + +o + + O + + +o+ + F + + + + + + F + + + O

racimos Racimos cadenas tetradas + + + + + + + + +

Fuente: 3

Cuestionario: 1. Cul es la importancia de los criterios de Cowan y Steel? 2. Para qu sirve la tincin de Ziehl-Neelsen y cul es su fundamento? 3. Cul es el fundamento de la prueba de oxidasa y de catalasa y cmo se realiza en el laboratorio?

4. En qu medios se puede realizar la prueba de movilidad y cmo se interpreta? 5. D cada uno de los criterios de Cowan y Steel efectuados a la cepa de estudio durante la prctica, realiza dibujos y menciona tus resultados.

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PRACTICA No. 2 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS NO FERMENTADORAS

Introduccin Este grupo abarca microorganismos aerobios, no esporulados, que no utilizan a los carbohidratos como fuente de energa o los utilizan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin.

La importancia de estas bacterias radica fundamentalmente en su capacidad para infectar hospederos inmunocomprometidos, por lo que cobran especial inters a nivel intrahospitalario, donde adems es comn la presencia de cepas con marcadas caractersticas de resistencia a los antimicrobianos de uso convencional. Dentro de este grupo se encuentran los siguientes gneros: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Flavobacterium, Agrobacterium, entre otros.

Algunos de los indicios tempranos para detectar a un microorganismo no fermentador seran los siguientes:

1. Falta de evidencias de fermentacin de la glucosa. 2. Positiva la prueba de oxidasa. 3. Carencia de crecimiento en el agar de Mac Conkey.

En la rutina bacteriolgica es necesario rapidez y bajo costo en la identificacin de este grupo de bacterias, por lo que se sugiere se siga el esquema de King-Weaver para su identificacin, el cual se basa en 4 pruebas (ver tabla 2):

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1. Utilizacin de glucosa (fermentador (F), oxidador (O) o no sacaroltico (NS)). 2. Capacidad de crecer en Mac Conkey. 3. Produccin de citocromo oxidasa. 4. Movilidad.

Tabla 2. Caractersticas de algunos gneros gramnegativos no fermentadores

GNERO METABOLISMO MOVILIDAD + flagelos polares OXIDASA CREC MAC CONKEY + OTRAS CARACTERSTICAS Desnitrifican nitratos a N2 Parecen diplococos

Pseudomonas

Acinetobacter

O NS

V algunos presentan flagelos pertricos V + un solo flagelo + flagelos pertricos

Flavobacterium

Escaso o negativo Escaso o negativo Escaso o negativo +

Requieren complejo B

Bordetella Moraxella

O O NS

+ +

Requiere factores de crecimiento Cocobacilar, difcil de crecer. Prueba de DNasa + Produccin de cido a partir de O/F con maltosa Aerobio estricto

Stenotrophomonas

Alcaligenes Fuente: 3

O NS

Objetivo Comprobar por medio de anlisis de laboratorio, el comportamiento caracterstico de cepas bacterianas no fermentadoras de carbohidratos.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Tubos con O/F con glucosa Placas con agar sangre de carnero Placas con agar Mac Conkey Tubos con Medio MIO

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Benzal Algodn Caldos con BGNnF

Metodologa 1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte del estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero. 2.- Sembrar por picadura los medios O/F y MIO. 3.- Incubar 24 h a 37 C. 4.- Leer morfologa colonial. 5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram. 6.- Leer pruebas bioqumicas.

Cuestionario: 1. Por qu es importante identificar a los BGNnF y qu gneros conforman dicho grupo? 2. Cules son las pruebas claves para sospechar de un BGNnF? 3. Mencione un esquema diferente al de King-Weaver para identificar a los BGNnF 4. De los BGNnF que gneros dan la prueba de oxidasa negativa, quines movilidad negativa y quines son capaces de crecer en Mac Conkey? 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial b) Tincin de Gram c) Pruebas de catalasa y oxidasa d) Pruebas bioqumicas e) Establecer si la cepa pertenece al grupo de BGNnF

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PRCTICA No.3 CARACTERIZACIN DEL GNERO Pseudomonas

Introduccin Este gnero se encuentra ubicado dentro del grupo de BGNnF y ocupa dentro de stos, el primer lugar como agente causal de infecciones intrahospitalarias, resaltando la capacidad de resistencia presente en algunas cepas a desinfectantes elaborados a partir de sales cuaternarias de amonio. De las especies que integran este gnero destacan: Pseudomonas aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. alcaligenes, Burkholderia cepacia (anteriormente llamada Pseudomonas cepacia). Siendo en el ambiente clnico P. aeruginosa la especie aislada con mayor frecuencia (ver tabla 3). Tabla 3. Caractersticas importantes del grupo fluorescente
Prueba Piocianina Pioverdina Reduccin de nitratos Desarrollo a 42 C Pseudomonas aeruginosa + + V (74 %) + Pseudomonas fluorescens + V (19 %) Pseudomonas putida + -

Objetivo Demostrar las particularidades bioqumicas y de cultivo del gnero Pseudomonas.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Tubos con O/F con glucosa Placas con agar sangre de carnero

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Reactivo para catalasa Portaobjetos Benzal Algodn

Placas con agar Mac Conkey Tubos con agar MIO Tubos con agar Sellers

Cepas con diferentes especies de Pseudomonas

Metodologa 1. Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte del estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero. 2. Sembrar por picadura los medios O/F y MIO. 3. Sembrar por picadura y estra el medio Sellers. 4. Incubar 24 h a 37 C. 5. Leer morfologa colonial. 6. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram. 7. Leer pruebas bioqumicas e identificar especie utilizando la tabla 3.

Cuestionario 1. Cul es la importancia del gnero Pseudomonas? 2. Qu pruebas de laboratorio permiten diferenciar una enterobacteria del gnero Pseudomonas? 3. Para qu es til el medio O/F y cul es su fundamento? 4. Por qu es importante utilizar el medio Sellers, en la identificacin de Pseudomonas? 5. Qu pruebas de laboratorio son tiles para diferenciar especies de Pseudomonas?

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PRCTICA No. 4 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Haemophilus

Introduccin Los miembros del gnero Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeos, inmviles, que requieren de factores de crecimiento presentes en la sangre como el factor X, que es un grupo de compuestos tetrapirrlicos termoestables, como la hemina. Mientras que el factor V, es el dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). Estos dos factores estn contenidos en los eritrocitos, por lo tanto el agar chocolate es un buen medio de cultivo para la recuperacin de Haemophilus. Las especies de Haemophilus humanos, estn vinculadas en su mayora con infecciones del tracto respiratorio superior a excepcin de H. ducreyi que es un patgeno de tracto genital.

Objetivo Identificar el gnero Haemophilus Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Placas con agar sangre de carnero Tubos con medio urea Placas de agar chocolate Placas con agar soya tripticasa Sensidiscos con factores V y X Benzal Cepas de Haemophilus spp

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Metodologa 1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar chocolate. 2. Incubar 48-72 h a 37 C. 3. Leer morfologa colonial. 4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram. 5. Realizar pruebas de identificacin de especie en agar soya tripticasa con sensidiscos impregnados de los factores V y X.

Cuestionario: 1. Cul es la importancia clnica de Haemophilus? 2. Existe algn agar comercial para el aislamiento de Haemophilus? 3. Menciona la(s) especies de Haemophilus que requieran el factor V, la(s) que requiera el factor X y la(s) que requiera ambos factores. 4. Cmo definen Cowan y Steel a ste gnero? 5. Existe otras pruebas en la actualidad ms rpidas que el cultivo convencional para el diagnstico de Haemophilus?

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PRCTICA No. 5 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Brucella

Introduccin El gnero Brucella abarca un grupo de microorganismos que son cocobacilos diminutos de tincin dbil, considerados como parsitos intracelulares facultativos y desarrollo lento en agar sangre. Son responsables de la brucelosis, considerada enfermedad zoontica, que se adquiere por estar en contacto con animales infectados o por la ingesta de productos lcteos no pasteurizados, la cual es difcil de diagnosticar, debido al amplio espectro de manifestaciones clnicas asociadas. Se conocen pocas especies de Brucella, con ligera especificidad del husped: B.

melitensis infecta cabras y ovejas, B. abortus infecta vacas, B. suis infecta cerdos, B. ovis infecta ovejas y B. neotomae infecta cerdos. Objetivo Identificar al gnero Brucella.

Material Equipos de tincin de Gram. Sensidiscos de oxidasa . Reactivo para catalasa. Cepas de Brucella spp. Botellas para hemocultivo Placas de agar sangre

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Tubos para prueba de urea Colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.

Metodologa 1. Sembrar en botellas para hemocultivo. 2. Incubar a 35 C durante 4-6 semanas. 3. Hacer subcultivos en agar sangre y chocolate. 4. Identificar especies, mediante pruebas bioqumicas como necesidad de CO2, produccin de ureasa y sensibilidad a los colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.

Cuestionario: 1 Cul es la importancia clnica del gnero Brucella? 2 Qu especies de Brucella requieren CO2 para crecer, cuales producen H2S y cuales ureasa? 3 Cul es la dosis infectiva de Brucella?

4 Qu dao les puede causar Brucella a las vacas?

5 En qu consiste la prueba de Rosa de Bengala?

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PRCTICA No.6 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Neisseria y Moraxella

Introduccin Los miembros del gnero Neisseria son microorganismos gramnegativos cocoides o baciliares que pueden encontrarse en pares o en cadenas cortas. Son inmviles, no forman esporas y producen cido a partir de carbohidratos lo que permite identificar especies. Neisseria gonorrhoeae es la especie de importancia en salud publica ya que se adquiere por transmisin sexual. Neisseria catarrhalis ahora conocida como Moraxella catarrhalis, puede ser responsable de infecciones respiratorias principalmente en nios y ancianos, crece en agar chocolate y agar nutritivo, no produce cido a partir de glucosa, maltosa, fructosa, sacarosa no lactosa.

Objetivo Identificar los gneros Neisseria y Moraxella.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Cepas de Neisseria spp Placas de agar Thayer-Martin Placas con agar chocolate Placas con agar nutritivo Benzal Placas con agar DNAsa

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Cepas de Moraxella spp. Tubos con CTA con diferentes carbohidratos

Metodologa Para Neisseria 1. Sembrar una placa de Thayer-Martin en forma de Z y luego estriar. 2. Incubar 24-48 horas a 37 C. 3. Leer morfologa colonial. 4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram. 5. Realizar pruebas de identificacin de especie en bases de CTA con diferentes carbohidratos.

Para Moraxella 1. Sembrar en agar chocolate y agar nutritivo. 2. Incubar 24-48 horas a 37 C. 3. Leer morfologa colonial. 4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa, tincin de Gram y DNAsa.

Cuestionario: 1. Cul es la importancia clnica de Neisseria gonorrhoeae? 2. Qu tipo de medio es el Thayer-Martin? 3. Menciona las especies de Neisseria y su comportamiento frente a los diferentes carbohidratos. 4. Cul es la importancia clnica de Moraxella catarrhalis? 5. Qu tipo de muestra debe utilizarse para la bsqueda de Neisseria gonorrhoeae y cual para Moraxella catarrhalis?

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PRCTICA No.7 CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA POSITIVAS

Introduccin La familia Enterobacteriaceae est conformada por un nmero importante de especies, que incluyen bacilos gramnegativos, con metabolismo fermentador, anaerobios facultativos, catalasa positivos, oxidasa negativos, la mayora son mviles, reducen los nitratos a nitritos, y no presentan condiciones nutritivas exigentes, crecen muy bien en agar Mac Conkey.

La familia Enterobacteriaceae tiene como nicho ecolgico el tracto intestinal de gran variedad de seres vivos, incluyendo al hombre, lo cual facilita su presencia prcticamente en todo lugar. La mayora de las enterobacterias son parte importante de la microbiota intestinal, comportndose como patgenos solo en el caso de pacientes inmunocomprometidos (patgenos oportunistas).

Con el objeto de facilitar la caracterizacin de esta familia se ha dividido con base a la capacidad de fermentar lactosa en dos grupos: lactosa positivos, los que la fermentan y los lactosa negativos los que no poseen el sistema enzimtico que les permite llevar a cabo el proceso. Tambin es necesario el empleo de pruebas bioqumicas y fisiolgicas para establecer el grupo bacteriano.

La fermentacin bacteriana de la lactosa es ms compleja que la de la glucosa. La lactosa es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa, unidas entre si por un enlace glucosdico. Para que una bacteria pueda metabolizar a la lactosa debe tener a la enzima beta-galactsido 21

permeasa, que transporta a la lactosa al interior de la bacteria y la beta-galactosidasa, necesaria para hidrolizar el enlace glucosdico y liberar a la glucosa y galactosa, finalmente la glucosa entra a la ruta de Embden-Meyerhof para la formacin de cidos mixtos los cuales pueden ser detectados en un medio de cultivo con un indicador de pH (ver tabla 4).

Objetivo Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa positivas.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter. Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas. Placas de agar Mac Conkey Placas con agar EMB Benzal

Metodologa 1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y EMB. 2. Inocular pruebas bioqumicas. 3. Inocular galeras. 4. Incubar. 5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa, oxidasa. 6. Comparar resultados en la tabla 4 y establecer gnero y especie.

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Tabla 4. Diferenciacin de enterobacterias mediante pruebas bioqumicas

Fuente: Seccin Entrica y Rama de Entrenamiento Bacteriolgico. CDC

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Cuestionario: 1. Cul es la importancia mdica de esta familia? 2. Las enterobacterias se han clasificado en dos grupos: lactosas (+) y lactosas (-), qu gneros de importancia mdica se encuentran en cada uno de estos grupos? 3. De las bacterias lactosa positivas menciona a las inmviles y a las que son capaces de producir H2S? 4. Cules son las pruebas bioqumicas que permiten identificar a las enterobacterias y menciona el fundamento bioqumico de cada una de ellas? 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial. b) Tincin de Gram. c) Pruebas de catalasa y oxidasa. d) Pruebas bioqumicas. e) Establecer gnero y especie de la cepa problema.

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PRCTICA No. 8 CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA NEGATIVAS

Introduccin Dentro de las bacterias lactosa negativas se encuentran los patgenos primarios como es el caso de Salmonella spp, Shigella spp y Yersinia spp.

La tribu Salmonelleae contiene un nico gnero Salmonella y reciben el nombre del bilogo estadounidense Salmon. Esta tribu est relacionada con la salmonelosis que es una causa importante de enfermedad entrica bacteriana en seres humanos y animales. Se estima que ocurren 1.4 millones de casos anuales de salmonelosis en seres humanos en los Estados Unidos. Estas infecciones son causadas por ingesta de alimentos, agua o leche contaminados con excremento de animales o humanos. Las salmonelas son patgenos primarios de los animales inferiores como vacas, cerdos, mascotas, etc. que constituyen la fuente principal de salmonelosis no tifoidea en los humanos. Mientras que Salmonella typhi es especfico del humano y causa fiebre tifoidea.

La shigelosis es la ms contagiosa de las diarreas causada por Shigella, la enfermedad es transmitida por va fecal-oral y se requieren tan solo 200 bacterias viables para producir la enfermedad.

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Se conocen 3 especies del gnero Yersinia: Y. pestis, Y, pseudotuberculosis y Y. enterocolitica. La peste bubnica es causada por Y. pestis, es una enfermedad de la antigedad que persiste en los tiempos modernos, es una enfermedad zoontica, transmitida por un roedor a otro o del roedor al hombre a travs de las pulgas (ver tabla 4).

Objetivo Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa negativas.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas Placas de agar Mac Conkey Placas con agar Salmonella-Shigellla (SS) Benzal Cepas de Salmonella sp, Shigella sp, Proteus sp

Metodologa 1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y SS. 2. Inocular pruebas bioqumicas. 3. Inocular galeras. 4. Incubar 24 h a 37 C. 5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa, oxidasa. 6. Comparar resultados con ayuda de la tabla 4 y establecer gnero y especie.

Cuestionario: 1. Qu gneros son lactosa negativa? 2. Cul es la importancia de las enterobacterias lactosa negativas? 3. De las lactosas negativas, menciona a las enterobacterias inmviles y a las que son capaces de producir H2S?

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4. Cul es una caracterstica importante de la tribu Proteae y porqu? 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial b) Tincin de Gram c) Pruebas de catalasa y oxidasa d) Pruebas bioqumicas e) Establecer gnero y especie de la cepa problema

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PRCTICA No. 9 CARACTERIZACIN DEL GNERO Vibrio

Introduccin Este gnero se define como bacilos gramnegativos, fermentadores, mviles, catalasa y oxidasa positivas. Algunas especies se caracterizan por ser haloflicas. Todos los gneros se consideran patgenos, resaltando en particular Vibrio cholerae por ser el agente causal del clera,

enfermedad que se presenta comnmente en forma epidmica, sobre todo en pases en vas de desarrollo (ver tabla 5). Tabla 5. Diferenciacin entre biotipos de Vibrio cholerae Prueba Clsica El Tor Prueba del filamento + + + -hemlisis en agar sangre de carnero Prueba de CAMP + Prueba de Voges-Poskauer + Aglutinacin de eritrocitos de pollo + Sensibilidad a 50 U de polimixina B S R Susceptibilidad al fago IV S R Objetivo Determinar con base a las pruebas de laboratorio correspondientes, las caractersticas bioqumicas ms relevantes de este gnero.

Material Equipos de tincin de Gram Placas de agar Mac Conkey

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Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn

Placas de agar TCBS Benzal Cepas de Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus.

Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas

Metodologa 1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa. 2.- Sembrar las pruebas bioqumicas convencionales. 3.- Incubar 24 horas a 37 C. 4.- Leer morfologa colonial. 5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram. 6.- Leer pruebas bioqumicas.

Cuestionario: 1. Qu gneros conforman a la familia Vibrionaceae? 2. Cul es la importancia clnica del gnero Vibrio? 3. Indique el mecanismo de patogenicidad de Vibrio cholerae. 4. Qu pruebas permiten diferenciar entre las especies de Vibrio? 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial b) Tincin de Gram c) Pruebas de catalasa y oxidasa d) Pruebas bioqumicas e) Establecer gnero y especie de la cepa problema

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PRCTICA No.10 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Streptococcus y Enterococcus

Introduccin Estos gneros se caracterizan por ser cocos Grampositivos agrupados en pares o cadenas, generalmente inmviles, catalasa negativos en general, no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos con metabolismo fermentativo en el que producen cido lctico, frmico, etanol y CO2, crecen ptimamente a 37 C. Enterococcus se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los humanos, como parte de su flora intestinal. Son microorganismos muy resistentes, capaces de tolerar concentraciones relativamente altas de sales y cidos. El gnero de mayor inters mdico son los Streptococcus. Algunas especies forman parte de la flora normal del hombre y otras estn relacionadas con cuadros clnicos de amigdalitis, celulitis, erisipela, faringitis, rinitis, fiebre escarlatina, sepsis puerperal, neumona, endocarditis bacteriana, caries, meningitis, infecciones en vas urinarias y heridas, fiebre reumtica, glomrulo nefritis y conjuntivitis purulenta.

Objetivo Caracterizar bioqumicamente a las especies ms importantes de ambos gneros.

Material Equipos de tincin de Gram Placas con agar sangre de carnero

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Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Benzal Placas con agar bilis-esculina Sensidiscos con optoquina

Caldos BHI con Streptococcus pyogenes Caldos BHI con Streptococcus agalactiae Caldos con Staphylococcus aureus Caldos BHI con Enterococcus sp Caldos con BHI con 6.5 % de NaCl Sensidiscos con bacitracina (0.04 UI)

Metodologa

HEMLISIS

ALFA

BETA

NO HEMLISIS (GAMA) Crece en 6.5% NaCl

Soluble en bilis Sensible a optoquina

Sensible a bacitracina: S. pyogenes

Ennegrece la bilis esculina

CAMP + Hidrlisis del hipurato +: S. agalactiae S. pneumoniae Enterococcus

1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre carnero. 2. Realizar pruebas de CAMP. 3. Realizar pruebas de sensibilidad a bacitracina. 4. Realizar pruebas de sensibilidad a optoquina. 5. Realizar tincin de Gram y observar al microscopio. 6. Incubar 24 horas a 37 C.

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7. Leer morfologa colonial. 8. Interpretar resultados.

Cuestionario 1. Cul es la definicin del gnero Streptococcus? 2. Cul es el fundamento de la prueba de CAMP? 3. Para qu se utiliza la prueba de sensibilidad a bacitracina y optoquina? 4. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial b) Tincin de Gram c) Pruebas de catalasa y oxidasa d) Otras pruebas e) Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Streptococcus, de ser positiva la respuesta, menciona la especie. 5. Menciona las especies ms importantes de Streptococcus y qu enfermedad producen.

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BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

PRCTICA No.11 CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Staphylococcus

Introduccin Este gnero est constituido por cocos grampositivos, agrupados en racimos, catalasa positiva con metabolismo fermentativo. Son responsables principalmente de infecciones supurativas de la piel y tejidos blandos. As como de infecciones oportunistas. Se reconocen 3 especies de importancia mdica: Sta. aureus, Sta. epidermidis, Sta. saprophyticus (ver tabla 6).

Tabla 6. Diferenciacin de las especies de Staphylococcus PRUEBAS DE LABORATORIO Color de las colonias Amarilloblanco Hemlisis en agar sangre Crecimiento anaerobio Coagulasa y DNasa Fermentacin de la glucosa Fermentacin del manitol Novobiocina Objetivo + + + + + Sensible +/+ + Sensible +/+ -/+ Resistente Blanco Blanco S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

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Observar las caractersticas ms relevantes del gnero, resaltando aquellas que permiten su diferenciacin con otros cocos grampositivos de cercana filiacin.

Material Equipos de tincin de Gram Sensidiscos de oxidasa Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Benzal Sensidiscos con novobiocina Placas con agar sal y manitol Placas con agar sangre de carnero Cepas de Staphylococcus aureus Cepas de Staphylococcus epidermidis Cepas de Staphylococcus saprophyticus Placas con agar DNasa Plasma de conejo

Metodologa 1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre y una de agar sal y manitol. 2. Incubar 24 h a 37 C. 3. Leer morfologa colonial y microscpica. 4. Realizar pruebas de identificacin de especie. 5. Interpretar resultados.

Cuestionario: 1. Cul es la definicin e importancia del gnero Staphylococcus? 2. Qu prueba permite diferenciar entre el gnero Streptococcus y Staphylococcus? 3. Cul es el fundamento de la prueba de coagulasa y cmo se realiza en el laboratorio? 4. Cules son los ingredientes del agar de sal y manitol y por qu es importante utilizarlo para la identificacin de este gnero y no de otros? 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: 6. Morfologa colonial 7. Tincin de Gram 8. Pruebas de catalasa y oxidasa. 9. Otras pruebas

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10. Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Staphylococcus, de ser positiva la respuesta, menciona la especie.

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BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

PRCTICA 12 CARACTERIZACIN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS: Bacillus

Introduccin Los microorganismos del gnero Bacillus son bacilos Grampositivos, formadores de endosporas, catalasa positivos, son mviles excepto B. anthracis y -hemolticos excepto B. anthracis. Este gnero es ubicuo en la naturaleza ya que posee endosporas y stas pueden permanecer en campos contaminados por periodos de 10 hasta 30 aos. B. anthracis es el agente causal de ntrax en animales, principalmente vacas y ovejas, as como en el humano (ver tabla 7).

Tabla 7. Caracteres mnimos para diferenciar Bacillus anthracis de Bacillus cereus Bacillus anthracis Lecitinasa Colonias rugosas Morfologa Movilidad Cpsula Hemlisis Colonias lisas (capsulacin en agar bicarbonato de sodio 0.7%) Sensibilidad a penicilina + + Bacilar; extremos rectangulares + + + Bacillus cereus + + bacilar; extremos redondeados + + -

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Objetivo Identificar por pruebas de laboratorio al gnero Bacillus.

Material Equipos de tincin de Gram Placas con agar nutritivo Reactivo para catalasa Portaobjetos Algodn Benzal Placas con agar sangre de carnero Equipo para tincin de Shaeffer-Fulton Cepas de Bacillus sp Sensidiscos de oxidasa Caldo nutritivo Tubos con gelatina

Metodologa 1. Inocular una placa de agar sangre carnero. 2. Inocular un tubo de caldo nutritivo e incubarlo a 42 C. 3. Inocular un tubo con gelatina e incubarlo a 4 C por 7 das. 4. Leer morfologa colonial, buscar hemlisis, hacer tincin de Gram y Shaeffer-Fulton 5. Interpretar resultados.

Cuestionario 1. Cul es el fundamento de la tincin de Shaeffer-Fulton y cmo se realiza en el laboratorio? 2. Menciona otras pruebas para diferenciar especies de Bacillus. 3. Menciona medios de cultivo para el aislamiento de Bacillus. 4. Menciona las medidas de seguridad que debe tener el laboratorio para poder trabajar con Bacillus anthracis. 5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos: a) Morfologa colonial. b) Tincin de Gram. c) Pruebas de catalasa y oxidasa. d) Otras pruebas.

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Bibliografa 1. Bailey and Scott. 2009. Diagnstico Microbiolgico. 12. edicin. Ed Mdica Panamericana. 2. Bergeys 1994. Manual. Determinative bacteriology. 9a. edicin. Williams & Wilkins. 3. Cowan y Steel.1988. Manual para la identificacin de bacterias de inters mdico. Ed. Panamericana. 4. HernndezMndez, J.T y cols. 2003. Bacteriologa Mdica Diagnstica. Instituto Politcnico Nacional. 2. edicin. Ed. Cullar. 5. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2001. Microbiologa Mdica. 25. edicin. Ed. Mc Graw Hill 6. Koneman. 2003. Diagnstico Microbiolgico. 5. Edicin. Ed. Mdica Panamericana. 7. Mc Faddin 1998. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Inters Mdico. Ed. Panamericana. 8. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

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