Analisis & Aplikasi Protein

Benedict Ryan Lita Lianti M. Teguh Gumelar Monica Winata Taufik H. Abdullah Yulianto

Analisis Kuantitatif

Metode Spektroskopi
Mengukur absorbansi protein pada 220 nm (UV) yang disebabkan oleh ikatan peptida.
Banyak senyawa lain yang juga menyerap sinar pada 220 nm : derajat interferensi cukup besar

Asam amino aromatik : 280 nm

Metode Kjeldahl
Kuantifikasi nitrogen dalam senyawa

Dapat digunakan jika proporsi nitrogen dalam protein diketahui (biasanya 16%).
Zat pengotor yang mengandung nitrogen harus dihilangkan : Mempresipitasi protein terlebih dahulu Presisi dan akurasi tinggi
Source of protein
Meat Blood plasma Milk Flour Egg

Proportion of nitrogen % total weight

16 15,3 15,6 17,5 14,9

Conversio n factor
6,25 6,54 6,38 5,7 6,68

Metode Kjeldahl
1. DIGESTION : Sampel dioksidasi menjadi garam amonia dengan memanaskannya bersama H2SO4 pekat. (CuSO4 sebagai katalis) 2. NEUTRALIZATION : Garam amonia dikonversi menjadi gas amonia dengan pemanasan dan penambahan NaOH, kemudian didestilasi. 3. TITRATION

Metode Biuret
Reagen : CuSO4, Na-K-tartrate dan KI dalam larutan NaOH -CONH- pada protein membentuk kompleks berwarna ungu.

Intensitas warna sebanding dengan jumlah ikatan peptida

Kuantifikasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pada 545 nm

Metode Lowry
10X lebih sensitif dari metode biuret. Analytical range : 1g 1mg protein

Menggunakan reagen Folin & Ciocalteu (Mengandung phosphotungstic & phosphomolybdic acid, suatu reagen untuk mendeteksi fenol)
Metode :
1.Sampel diberi reagen seperti pada metode biuret 2.Sampel diberi reagen Folin & Ciocalteu 3.Ukur absorbansi pada 600 nm

Kompleks Cu-Protein mereduksi Folin & Ciocalteu menjadi warna biru.

Bradford Assay
Metode yang paling sering digunakan, karena kemudahannya, sensitivitasnya dan ketahanannya terhadap interferensi. Metode : 1. Sampel diberi reagen (Coomasie Blue G250 + larutan asam) 2. Ukur absorbansi pada 595 nm. Coomasie Blue dalam kondisi asam berwarna merah-coklat dan menjadi warna biru ketika berikatan dengan protein Kekurangan : reagen cenderung menempel pada wadah

Sodium Dideocyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electropohoresis (SDS PAGE)

Dapat digunakan untuk mengukur berat molekul (Mr) protein Metode
1. Mencampurkan sampel dengan larutan berisi buffer (tris) , SDS dan -mercaptoethanol. 2. Elektroforesis gel 3. Memberi pewarna (Coomasie Blue)

SDS mendenaturasi protein, memutus ikatan disulfida, dan menambah muatan negatif pada protein. -mercaptoethanol membantu mendenaturasi protein (memecah ikatan disulfida) Protein dengan Mr kecil bergerak lebih cepat (Molecular sieving)

Analisis Kualitatif

Analisis Struktur Protein

Teknik Menganalisa Struktur Protein

Kristalografi X-Ray

NMR

CDSpektroskopi

Protein Sekuensing

Kristalisasi X-Ray

Komputasi Struktur Protein Menembakkan sinar X-Ray - Menembakan sinar x ke protein sehingga akan terjadi difraksi sinar x

Kristalisasi Protein - Mengubah protein menjadi kristal

Menerjemahkan difraksi yang diakibatkan oleh protein menjadi struktur 3D dari suatu protein

Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Sampel sebelumnya harus dimurnikan dan diekstraksi terlebih dahulu Memanfaatkan sifat magnetik dari ikatan inti protein yang mengandung hidrogen dan carbon

Circular Dichroism (CD) Spectrocopy

Untuk menentukkan struktur sekunder dari protein Menggunakan instrumen dextrorotory dan levorotory untuk membelokkan struktur protein Sampel bisa berupa larutan dalam jumlah yang cukup besar Tidak bisa memberikan letak belokan dari struktur sekunder protein Biasa diaplikasikan dengan sinar-UV dan cahaya tampak

Protein Sequencing

Mengambil Sampel yang Ingin di Uji

Menentukan Susunan Asam Amino Struktur Primer Protein

Membuat Permodelan Fungsi dan Struktur 3D protein

Metode Permodelan Struktur 3D Protein

Permodelan Komparativ Protein

Permodelan Homologi Protein threading

Pendekatan de novo

Analisis Kualitatif Lainnya

Uji Ninhidrin
Digunakan untuk mendeteksi keberadaan amonia atau amina primer & sekunder Dapat digunakan pada seluruh jenis asam amino Menghasilkan warna ungu yang disebut dengan Rheumanns Purple

Mekanisme Reaksi yang Terjadi:

Uji Xantoproteic

Digunakan untuk menguji keberadaan senyawa aromatik yang terdapat dalam suatu asam amino Asam amino yang biasa digunakan: tirosin, triptofan, fenilalanin, dan asam glutamat Akan menghasilkan warna kuning-orange

Hasil yang diperoleh dari Uji Xantoproteic:

Uji Kelarutan
Tujuan: Untuk menentukan tingkat kelarutan asam amino Asam amino yang dapat digunakan pada percobaan: glisin, tirosin, sistein, dan asam glutamat Karena kelarutan suatu zat akan bergantung terhadap kelarutan pH, maka uji kelarutan dapat dilakukan dengan menentukan sifat asam/basa yang dikandung larutan tersebut.

Prosedur:
Masukkan sedikit sampel asam amino, kemudian dipanaskan Masukkan kertas lakmus ke dalam larutan tersebut untuk menentukan sifat asam/basa asam amino Lakukan hal serupa dengan larutan HCl dan NaOH sebagai pembanding

Uji Endapan
1. Karena adanya Garam Netral Dikenal juga dengan nama salting-out method
Larutan yg dapat digunakan: Amonium sulfat Dapat diterapkan pada seluruh jenis protein/asam amino Proses: Garam yang dimasukkan ke dalam sampel akan mengikat air sehingga protein menjadi bersifat hidrofobik. Oleh sebab itu, akan timbul endapan dari larutan ini.

Uji Endapan
2. Karena adanya Logam
Tujuan: Menguji keberadaan logam di dalam sampel Ion logam yang dapat teruji: Hg2+, Pb2+, Ag+, Tl+, Cd2+ Cara kerja: Masukkan larutan yang mengandung logam ke dalam sampel protein. Nantinya, akan timbul endapan berwarna putih yang menunjukkan bahwa sampel mengandung logam yang dimasukkan tersebut. Proses: Ion negatif pada protein akan berikatan dengan ion logam (positif) sehingga akan timbul endapan putih Dapat diterapkan pada seluruh jenis protein.

Western Blotting
Digunakan untuk mendeteksi adanya protein tertentu. Elektroforesis gel memisahkan protein berdasarkan struktur 3D Menggunakan gel elektroforesis yang ditransfer pada nitroselulosa Protein akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik terhadap protein target Protein akan memisahkan diri berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi

Western Blotting

VP-ITC
Isothermal Titration Calorimetry
Mengukur

sifat termodinamik interaksi antar makromolekul dalam larutan Menentukan konstanta kesetimbangan, perbandingan mol reaksi dan entalphi ikatan

DLS Dynamic Light Scattering

Mendeteksi

sifat hidrodinamik makromolekul Oligomerasi Agregasi

BIAcore 2000

Surface Plasmon Resonance

Memperlihatkan

proses interaksi sebagai fungsi waktu antara ligand diam pada permukaan sensor chip dan analit dalam larutan Memberikan informasi specificity ikatan, kinetik dan afinitas

Aplikasi Protein

Industri Obat-Obatan
Cairan Albumin

Protein Therapeutics

Green Fluorescent Protein

Cairan Albumin
Albumin bermanfaat dalam pembentukan jaringan sel baru. Dalam kedokteran, albumin dimanfaatkan untuk mempercepat pemulihan jaringan sel tubuh yang terbelah

Sedangkan dalam produk farmasi, antara lain, dimanfaatkan untuk pengocokan (whipping), ketegangan, atau penenang dan sebagai emulsifier. Kadar albuminpun bisa menurun karena faktor medis, dan ini dapat dijumpai pada penderita penyakit hati kronik, ginjal, saluran cerna kronik dan infeksi tertentu.

Protein Therapeutic
Protein terapeutik dapat digunakan sebagai perawatan medis sangat efektif (terapi protein) untuk berbagai macam penyakit di mana protein yang baik kurang atau kekurangan (hormon pertumbuhan dan insulin), atau protein terapi digunakan untuk menghambat proses biologis (antibodi yang memblokir pasokan darah ke tumor)

Green Fluorescent Protein

Komponen Biosensor GFP telah banyak digunakan dalam pelabelan spermatozoa dari berbagai organisme untuk tujuan identifikasi seperti pada Drosophila melanogaster, di mana ekspresi GFP dapat digunakan sebagai penanda untuk karakteristik tertentu. GFP juga dapat dinyatakan dalam struktur yang berbeda memungkinkan perbedaan morfologi.

{ Aplikasi Protein
di Industri}
Pemanfaatan Protein sebagai bahan baku atau tambahan dalam kegiatan di bidang Industri

Protein Function :
Structure Movement Defense Storage Signal Catalyst

Protein and its Function

Protein in Industry
Protein Application in Industry

Detergent

Biocatalyst (enzyme) Emulsifier Sensoring Absorbing water Etc.

Meat based Pulp & Paper

Added value Auxiliary Agent

Raw Material

Bio-Detergent Industry
Protein as raw material

Enzymatic product
Proteases (e.g. blood stain)

Lipases (e.g. Butter)

Powder Liquid

Amylases (e.g. chocolate) Cellulases (modifiy cellulose fibrils) Clolor brightening Softening Particulate soil removal

Meat based products : Protein as added value

High added value :

Sausage Meatball Burger pattiies Meat loaf

Low added value :

Minced beef Beef cube Minced chicken Boneless chicken

Raw Meat

Why Soy Protein?

Proportional with animal protein Contain all amino acid for growth 25% of fat contents is unsaturated

Soy Protein Isolate

Soy Protein Concentrate

Textured Soy Protein

hidrophyllic

hidrophobic

Glycinin (11S Globulin, 34% SPI) -conglycinin (7S, 27% SPI) -conglycinin (Trimer of 170 kD) 7S Globulin

Aglutinin (7S) Lipoxygenase (7S) -amylase (7S) Soy tripsin inhibitors (2S)

Inside Soy Protein Isolate

Pulp & Paper Industry Xylanase

Cellulase Lipase

Cellulase

Esterase

Daftar Pustaka
Wilde, Pete. __.Emulsifiers, Thiickeners and Stabilisers. Institute for Food Research. http://www.food-research.info/talks/Pete_Wilde.pdf (diakses 11/3/2013). Pitrucelli, Silvanna dan Anon, Maria Cristina. 1995. Soy Protein Isolate and Their Component Interactions. J.Agric.Food Chem. 1995, 43, 1762-1767. Redaksi Biotech. ___. The Detergent Industry. http://www.imbiotech.com/enzymes/detergents/ (diakses 11/3/13). Nielsen, Per H., et al. 2007. Environmental Assessment of Enzyme Assisted Processing in Pulp and Paper Industry. LCA Case Studies.

Anonim. ___. Properties of Glycinin. http://www.food-allergens.de/symposiumvol1%282%29/data/soy/glycinin.htm (diakses 11/3/13)

Suryanto, Edi. 2011. Penggunaan Protein Kedelai Pada Industri Olahan Daging. Fakultas Peternakan UGM : Foodreview Ed.Maret. Kuchel, Philip dan Ralston, Gregory B. 2006. Biokimia : Schaums easy outlines. Jakarta : Erlangga.

Terima Kasih