Cdigo: FUNDACION UNIVERSIDAD DE AMERICA FO-10-PR-EF-019 FACULTAD DE INGENIERIAS GUA DE PRCTICAS DE LABORATORIO Versin 0 Febrero 2014

PROGRAMA: Ingeniera Qumica NOMBRE ASIGNATURA: Bioprocesos PRCTICA No.

DEPARTAMENTO: Ingeniera Qumica CODIGO:

NOMBRE DE LA PRCTICA: Cintica enzimtica de la invertasa mediante la determinacin de la velocidad inicial de reaccin.

1 INTRODUCCIN Y MARCO TERICO:

La sacarosa, comnmente denominada como azcar de mesa, es un disacrido compuesto de una molcula de alfa-D-glucosa y una de beta-D-fructosa, unidas mediante un enlace glicosdico- alfa-1,4. Cuando este enlace es desintegrado en una reaccin de hidrolisis, se genera una mezcla de igual nmero de molculas de glucosa y fructosa. Esta mezcla es llamada azcar invertido, ya que la sacarosa hace rotar el plano de una luz polarizada hacia la derecha. Por el contrario la hidrolisis del producto rota el plano de la luz polarizada hacia la izquierda. La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima llamada invertasa. El nombre oficial de la invertasa es beta-fructofruransido (EC 3.2.1.26). La invertasa es usada en la industria de alimentos donde la fructosa es preferida por encima de la sacarosa, debido a que es ms dulce y no cristaliza tan fcilmente. Sin embargo, el uso de invertasa en esta industria es limitada, debido a la existencia de otra enzima (glucosa isomerasa), la cual puede ser utilizada para convertir la glucosa en fructosa disminuyendo los costos de produccin. Un amplio rango de microorganismos producen invertasa y de esta manera pueden utilizar la sacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es producida por Saccharomyces cereviciae o Saccharomyces carlsbergensis. Pueden existir, incluso en el mismo cultivo diferentes formas de la invertasa. Por ejemplo, una invertasa intracelular con peso molecular de 135.000 Daltons, por el contrario una extracelular con peso molecular de 270.000 Daltons. La invertasa puede exhibir una actividad relativamente alta sobre un rango amplio de pH (3,5 -5,5), con el ptimo en 4,5. La actividad enzimtica alcanza una velocidad mxima a 55 C. Los valores de varias enzimas pueden variar ampliamente, pero para la mayora de las enzimas Km se encuentra entre 2mM y 5mM. El valor de la constante de Michaelis-Menten para la enzima libre es aproximadamente de 30 mM. En este experimento, la cintica de la invertasa es investigada con el mtodo de las velocidades iniciales. En este, la velocidad de reaccin puede ser correlacionada con las condiciones existentes al inicio de la reaccin, ya que uno tiene control sobre las condiciones iniciales del experimento. La mezcla enzima sustrato se hacereaccionar por determinado tiempo. La velocidad de la reaccin puede ser calculada midiendo el contenido de los productos de reaccin en una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. El contenido de azucares reductores producidos, son determinados colorimtricamente con el reactivo de DNS incluido en la reaccin. El trabajo se hace sencillo, ya que el reactivo no reacciona con la enzima.

2 OBJETIVO(S):
Determinar los parmetros cinticos de la invertasa.

3 EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y/O MATERIALES:

Equipos Dos baos serolgicos uno a 50 C y otro a 92 C, con soporte para tubos de ensayo Espectrofotmetros a 540 nm y celdas para espectrofotmetro. 4 planchas de calentamiento, sin agitacin.

3.2 Reactivos (para todos los grupos) Reactivo DNS (preparar 1 L) Solucin de sacarosa grado analtico 50 g/l y 200 g/l ( 500 ml de cada una) Solucin equimolar de glucosa-fructosa a 3,34 mMn (1L ml) Buffer acetato 0,1 M pH= 5 (1 L)

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Agua destilada Hielo Solucin de enzima stock de enzima 1g/l (100ml)

Versin 0 Febrero 2014

3.3 Materiales (para cada subgrupo) 1 Probeta de 100 ml 2 vasos de precipitado de 250 ml 3 vasos de precipitado de 600 ml 10 tubos de ensayo sin tapa 7 tubos de ensayo con tapa 2 Gradillas para tubos de ensayo 4 pipetas graduada de 10 ml 2 pipeteadores Papel aluminio 1 Cronometro 1 micropipeta 100 a 1000 microlitros 1 micropipeta de 20 a 200 microlitros

4 MTODOS Y PROCEDIMIENTOS:

Prepare una solucin de 100 ml trabajo de enzima de 0,04g/l diluyendo la solucin stock de enzima con buffer de acetato a pH 5, diluyndola 25 veces. Curva de calibracin para concentracin equimolar de monosacridos. Prepare un conjunto de solucin de mezcla de monosacridos de varias concentraciones como se indica en la Tabla 1. Agite cada tubo de ensayo. Incube los tubos de ensayo a en agua 95C por 10 minutos. Coloque los tubos de ensayo en un vaso de precipitado con agua hasta enfriar. Mida la absorbancia a 540 nm. Complete la Tabla 1.

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Tabla 1: Curva de Calibracin Molaridad Final Abs. Glucosa/Fructosa (ml) (ml) mM

3.34mM

Water ReactivoDNS

Tubo de ensayo

(ml) 0 1 2 3 4 5 6 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Efecto de la concentracin de sustrato Prepare un conjunto de soluciones a varias concentraciones de las soluciones de sacarosa, como se indica en la tabla 2 y 3.

Tabla 2.
Tubo de Ensayo

1 2 3 4

Solucin de sacarosa 50 g/l ml 0 0,5 2 3

Agua ml 3 2,5 1 0

Solucin de Concentracin invertasa final de 0,04 g/l sacarosa Absorbancia ml g/l A.U 3 0 3 4,17 3 16,67 3 25

Tabla 3.
Tubo de Ensayo

5 6 7 8

Solucin de sacarosa 200 g/l ml 1 1,5 2,5 3

Agua ml 2 1,5 0,5 0

Solucin de Concentracin invertasa final de 0,04 g/l sacarosa Absorbancia ml g/l A.U 3 33,3 3 50 3 83,3 3 100

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Pre-incube los tubos de ensayo durante 5 minutos antes de agregar la enzima (solucin de sacarosa + agua) en bao termostatado a 50C. Arranque el cronmetro y agregue 1 ml de la solucin de enzima de trabajo a cada tubo de ensayo pre-incubado. Deje reaccionar por 5 minutos. Al finalizar el tiempo de reaccin agregue 1 ml de solucin de DNS. Agregue el DNS a cada tubo de ensayo en el mismo orden e intervalo de tiempo, como se agreg la solucin de enzima. Para asegurar que cada tubo de ensayo fue dejado reaccionar el mismo tiempo. Agite los tubos de ensayos. La solucin de DNS detiene la hidrolisis de la sacarosa. Incube los tubos de ensayo en agua a 95 C por 10 minutos. Coloque los tubos de ensayo en agua fra. Mida la absorbancia a 540 nm. La determinacin de la concentracin de azcar se determinar usando el mtodo colorimtrico del DNS. Completar la tabla 2 y 3.

Efecto de la temperatura Ajustar los baos termostatados a 50 y 90 C. Prepare los tubos de reaccin de acuerdo a la Tabla 4.

Tabla 4.
Tubo de Ensayo Temperatura sacarosa 50

solucin de Solucin de invertasa Absorbancia g/l 0,04 g/l ml 3 3 ml 3 3

C 1 2

50 90

Pre-incube durante la solucin de sacarosa durante 5 minutos. Como se realiz en la seccin anterior, inicie el cronometro al momento de agregar la solucin de trabajo de enzima. Repita los pasos que se detallan en la seccin anterior. Complete la tabla.

5 CLCULOS Y RESULTADOS:
Basados en los datos experimentales cual es la actividad enzimtica de la solucin? Grafique la velocidad enzimtica vs la concentracin de sustrato. La reaccin sigue el modelo de Michaelis-Menten?. Cacular Vmax y Km para la enzima. Que efecto tiene la temperatura sobre la actividad enzimtica. Realizar el informe en forma de artculo cientfico. Discutir y Concluir sobre los resultados.

6 ANEXOS:

7 REFERENCIAS:
Villadsen J., Nielsen J., Lidn, G.,. 2011. Bioreaction Engineering Principles. Sipringer tercera edicin. 561 p.

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Elabor Cargo Nombre Firma

Docente Cristian Hernndez

Revis
Director de Programa o Coordinador de rea

Autoriz
Decanatura o Direccin Ciencias