UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA, PARASITOLOGA E INMUNOLOGA

MICROBIOLOGIA I
ANTIFUNGICOS Terico 15
Dra Maria Teresa Mujica

Bibliografa
MICROBIOLOGA MDICA. Murray y col. Elsevier. 5Ed. Barcelona, 2006. MICROBIOLOGA MDICA. Murray PR y col. Ed. Elsevier, Barcelona, 2009 MICOLOGA MDICA (ILUSTRADA). Arenas, Roberto. Mc Graw Hill. 3 Ed. Mxico, 2008. MICOLOGA MDICA (ILUSTRADA). Arenas, Roberto. Mc Graw Hill. 4 Ed. Mxico, 2011. MICOLOGA MDICA BSICA. Bonifaz, Alexandro. Mc Graw Hill. 3 Ed. Mxico, 2010.

La clase contiene informacin que completa la de los textos

Objetivos
Conocer los distintos antifngicos (ATF) y sus los mecanismos de accin sobre la clula fngica. Comprender los mecanismos de la adquisicin de la resistencia a los ATF. Conocer los mtodos de determinacin de la susceptibilidad a los antifngicos.

La clula fngica
Hongos son eucariotas Unicelular o multicelular (levaduras miceliales) Distinguidos de otros reinos
Organizacin estructural Nutricin: absorcin de nutrientes previa degradacin de biopolmeros. Crecimiento Reproduccin (esporas o conidios)

Clula Fngica

Pared celular

Membrana celular

Mitocondrias Ncleo

Hongos pluricelulares

Nucleolo

Retculo endoplsmico

Hongos unicelulares

Clula fngica
Pared: estructura fibrilar y capa amorfa
Mananosproteinas b-(1,6)-glucanos b-(1,3)-glucanos Quitina Bicapa fosfolipdica

Membrana citoplasmtica Formacin de Ergosterol

Ergosterol

b-(1,3)-glucan sintetasa Quitin sintetasa DNA/RNA Sntesis

Escualeno

Citoplasma
Pared celular

Citoesqueleto:

microtbulos ( tubulina ) y microfilamentos (actina)

Circulacin de las organelas y separacin de los cromosomas en la divisin celular
MC

Microvesculas

Mitocondrias Retculo endoplsmico

Ribosomas

Nucleolo

Ncleo

Antifngico- evolucin histrica

Anfotericina B 5-Fluorocitosina Ketoconazol Griseofulvina Fluconazol Caspofungina Itraconazol Voriconazol

1950

1960

1970

1980

1990

2000

Ravuconazol

Posaconazol

Formulaciones lpidicas de la Anfotericina B

Albaconazol Micafungina

Anidulafungina

Drogas antifngicas: estuctura y clasificacin

Polienos
Anfotericina B desoxicolato y formulaciones lipidicas Nistatina Natamicina

Lipopptidos
Candinas: Caspofungina Anidulofungina, Micafungina

Azoles
Imidazoles: Ketoconazol, miconazol Triazoles : fluconazol- itraconazolvoriconazol- posaconazol y ravuconazol

Pptidos nuclesidos
Nikomicina Z

Derivados tetrahidrofuranos
Sordarinas azasordarinas

Alilaminas
Terbinafina

Otras
Griseofulvina Tiocarbamatos: tolnaftato, Morfolinas: amorolfina

Pirimidinas fluoradas
Fluocitocina

Clula Fngica
Pared celular
Candinas Nikomicina Z

Membrana celular
Polienos Azoles Alilaminas Tiocarbamatos Morfolinas

Mitocondrias

Ncleo Nucleolo Retculo Sntesis proteica endoplsmico

sordarinas Pirimidinas fluoradas: 5- FC

Membrana celular y Pared

Clula

fungica

Mananosproteinas b-(1,6)-glucanos b-(1,3)-glucanos Quitina Bicapa fosfolipdica

Ergosterol Formacin de Ergosterol Escualeno

b-(1,3)-glucan sintetasa

DNA/RNA Sntesis

Anfotericina B
(1955)
Streptomyces nodosus Standard de oro*

PORO

*Hoy en da se cuestiona su uso como tal

Mecanismo de accin: Unin al ergosterol y formacin de poros transmembrana

Anfotericina B

Ergosterol Membrana plasmtica

Unin al ergosterol

Ca++ Ca++ Mg++ Na+ + Na K+

K+

Alteracin osmtica

Farmacocintica
Baja absorcin por va oral (5%) Va de administracin: i.v. lenta. Alta unin proteica 90-95% Se fija a membranas citoplasmticas, concentra en hgado, pulmn, bazo y riones Atraviesa meninges inflamadas y placenta

Efectos adversos
Toxicidad dependiente de la dosis. Nefrotoxicidad: dosis acumulada mxima: 4-5 g.(adecuada hidratacin!!!)

Smas. de administracin: fiebre escalofros y temblores; cefalea, vmitos, hipotensin. Tromboflebitis y necrosis tisular. Efecto inmunomodulador Anemia normoctica normocrmica

Formulaciones lipdicas de anfotericina B 1- Anfotericina B en complejos Mayor lipdicos: tolerancia y L- -dimiristofosfatidilcolina; L- menor dimiristofosfatidilglicerol. (ABLC, Albecet) toxicidad
2- Anfotericina B en dispersin coloidal (ABCD, Amphocil o Amphotec ) 3- Anfotericina B liposomal (L-AmB, Ambisome )

Propiedades e indicaciones de las formulaciones de Anfotericina B asociadas a lpidos

Eficacia similar a la Anfotericina B deoxicolato (convencional) Menor nefrotoxicidad Alto costo Indicadas en pacientes con infecciones fngicas sistmicas que presentan intolerancia al tratamiento con anfotericina B deoxicolato o ante falla renal preexistente

Mecanismo de liberacin
Mecanismo desconocido

Secuestro selectivo por parte del SRE Alta fagocitosis y eliminacin lenta por parte del macrfago
Liposoma

Macrfago
Lisosoma Fusion Degradacin del liposoma

Endocitosis

Vescula endoctica Liberacin en sangre Liberacin del macrfago

5-fluorocitosina - Flucitosina (1957)

Mecanismo de Accin

Pro-droga (derivado fluorado de citosina)

En el citoplasma de la clula fngica se transforma en 5- fluoruracilo Alteracin de la sntesis de cidos nucleicos y de sntesis proteica

Fue utilizada en trat. de candidiasis y criptococosis asociada a AMB Alta resistencia si se la administra sola
Se absorbe por va gastrointestinal

5-fluorocitosina
Inhibe la timidilato sintasa Inhibe la sntesis de DNA 5-fluoro-UTP Incorporado en RNA Interrumpe la sntesis proteica

Azlicos
Imidazoles: Miconazol, Ketoconazol, Triazoles: Fluconazol, Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol

Fluconazol, triazol

Gen ERG 1

Sntesis Ergosterol
2,3 oxidoescualeno Azoles
1-Fluconazol

Alilaminas
Tiocarbamatos Escualeno

Lanosterol2-Voriconazol
Lanosterol 14 demetilasa
3- Itraconazol
4-Posaconazol

Gen ERG 11

Morfolinas Zymosterol
Morfolinas: amorolfinas (lacas)

Gen ERG 24

C-14 esterol reductasa

7-8 esterol isomerasa

Gen ERG 2

Ergosterol

Azoles: inhibicin de la sntesis del ergosterol

Azlicos Membrana Plasmtica

Ergosterol
Sntesis De ergosterol Escualeno Acumulacin de Esteroles txicos Esteroles txicos Inhibicin de la 14-alpha-demetilasa

 1. 2.

Imidazoles:

Azlicos

Ketoconazol (1978): Producto de la sntesis farmacutica. Usado en formas sistmicas de las micosis. Va oral, alta fijacin a protenas. Formas tpicas. Miconazol, Sertaconazol, Clotrimazol, Econazol. Formas tpicas: tratamiento de Micosis superficiales Triazoles: Fluconazol, Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol

Va oral e IV a excepcin de Posaconazol Via oral

Inhibicin de la sntesis del ergosterol

Alilaminas: terbinafina Tiocarbamatos: tolnaftato

Morfolinas: amorolfina

Gen ERG 1

Sntesis Ergosterol
2,3 oxidoescualeno

Alilaminas
Tiocarbamatos
Gen ERG 1

Escualeno

Lanosterol Fluconazol
Lanosterol 14 demetilasa
Voriconazol Itraconazol

Azoles

Gen ERG 11

Morfolinas Zymosterol

Gen ERG 24

C-14 esterol reductasa

Morfolinas
7-8 esterol isomerasa
Gen ERG 2

Ergosterol

Alilaminas
Va oral
Mecanismo de Accin Terbinafina
Inhibe la sntesis del ergosterol a nivel de la epoxidacin del escualeno Indicado en las micosis superficiales
Se absorbe por va digestiva

Griseofulvina: Metabolito de Penicillium griseofulvum

Mecanismo de accin Alteracin de los microtbulos.

Inhibicin de la mitosis y la replicacin del DNA
Citoesqueleto: microtbulos (- tubulina ) y microfilamentos (actina)

Alteracin de la quitinsintetasa (por inhib. la sntesis proteica)

Circulacin de organelas y separacin de los cromosomas en la divisin celular

Griseofulvina: Metabolito de Penicillium griseofulvum

Tinea capitis y tinea corporis en nios por su menor toxicidad que los azoles

Fungisttico para diversas especies de dermatofitos Se detecta en la piel 4 a 8 hs despus de su administracin

Candinas

Candinas
Caspofungina y Micafungina Anidulofungina
Anidulafungina Micafungina

Caspofungina

Caspofungina:

Derivado semisinttico del Glarea lozoyensis

Inhibicin no competitiva de la -(1-3)D-glucano sintetasa.

neumocandina

Administracin IV

Mecanismo de accin: Candinas

Mananoprotenas

Inhibidor de la glucan sintetasa

(1,6)-glucanos (1,3)-glucanos Quitina Membrana plasmtica

(1,3) glucano sintetasa

Deplecin de (1,3) glucanos de la pared Inhibidor de la glucan sintetasa

EQUINOCANDINAS: Caspofungina

Inhibicin de sntesis -(1-3) glucanos (de glucan sintasa ) Acta en los puntos de activo crecimiento y de ramificacin (sitios de activa sntesis de pared en los micelios) En levaduras los brotes fracasan en la separacin de la clula madre Se producen clulas osmticamente sensibles

Solo endovenoso y no concentra en LCR

Hifas sanas Caspofungina sobre hifas de Aspergillus fumigatus

hifas aberrantes

Antifngicos sistmicos: vas de administracin

Oral Fluconazol Itraconazol Voriconazol Posaconazol Anfotericina B Caspofungina
* No disponible en nuestro pas

IV Si Si* Si No Si Si

>80 % 60 a70% > 80% >70 % No No

Drogas contra Pneumocystis jirovecii

Trimetroprima- Sulfametoxazol
Combinacin de drogas que actan en forma secuencial inhibiendo la sntesis del acido flico (inhiben la dihidrofolato reductasa y la dihidrofolato sintetasa). Activo contra bacterias, hongos y P. jirovecii

Pentamidina
El mecanismo de accin es desconocido: interacta con los fosfolpidos de membrana, inhibicin de ARN y ADN. Inhibicin de topoisomerasas. Indicaciones: P. jirovecii (nebulizaciones), tripanosomiasis, leishmaniasis

Antifngicos Nuevos antifngicos

Combinaciones de antifngico
Con antifngicos: bloqueo de dos o ms mecanismos antifngicos. Sinergia. con citoquinas Con anticuerpos (Mycograb: anticuerpo recombinante humano contra la protena de shock trmico 90,HSP90). Tercera etapa en los ATF. Fase clnica

Combinaciones de Antifngicos Inhibicin de distintas enzimas en la misma ruta metablica (azoles y terbinafina). Aumento de la penetracin de un compuesto como consecuencia de la accin permeabilizadora de otro en la pared o la membrana celular (AmB y 5FC). Inhibicin simultnea de distintas dianas de la clula fngica (caspofungina y AmB)

Mecanismos de resistencia a los antifngicos

RESISTENCIA es..
CLINICA

MICROBIOLGICA

MOLECULAR

Resistencia clnica.

Husped

Respuesta immune: inmunidad innata- adaptativa Sitio de infeccin: lugar, formacin de abscesos, presencia de necrosis, pH y anaerobiosis

Hongo

Tamao y tipo de inculo *levadura / hifa Produccin de biofilm Estabilidad genmica Poblacin cuello de botella

Droga

Dosis Farmacocintica Interacciones drogadroga

INTRNSECA- NATURAL INSENSIBILIDAD

Ningn miembro de la especie fngica es sensible.

Candida krusei es resistente intrnseca al fluconazol

PRIMARIA Una especie normalmente sensible posee una resistencia natural a la droga y NUNCA tuvo contacto con la droga SECUNDARIA o ADQUIRIDA Cepa previamente sensible adquiere resistencia despus del tratamiento con el ANTIFNGICO

RESISTENCIA A LOS ANTIFUNGICOS

MECANISMOS GENERALES DE

RESISTENCIA

Permeabilidad disminuida

Eflujo activo

Inactivacin enzimtica

Modificacin Alteracin de una va del blanco de metablica accin

sobreproduccin de la enzima blanco

Mutaciones en el gen que codifica a la enzima

Gen ERG 1

Sntesis Ergosterol
2,3 oxidoescualeno

Alilaminas
Tiocarbamatos
Gen ERG 1

Escualeno

Lanosterol Fluconazol
Lanosterol 14 demetilasa
Voriconazol Itraconazol

Azoles

Gen ERG 11

Morfolinas Zymosterol

Gen ERG 24

C-14 esterol reductasa

Morfolinas
7-8 esterol isomerasa
Gen ERG 2

Ergosterol

Mecanismo molecular de la resistencia Cepa sensible

ABC: ATP Binding Cassette MF: Major facilitators

Mecanismo molecular de la resistencia

Cepa resistente
ABC: ATP Binding Cassette MF: Major facilitators

Candidiasis

C. albicans

Incremento de MDR m RNA

Mutacin puntual en ERG11 Aumento en mRNA ERG 11

Incremento de CDR m RNA

CIM g/ml

oCIM Dosis diaria de Fluconazol

Combinatoria de Mecanismos: R Episodio de candidiasis orofarngea

Aspectos Moleculares de la Resistencia a los Azoles

Mutaciones puntuales del gen ERG11 Altera 14 lanosterol demetilasa

Sobre-expresin del gen ERG11 Incrementa la produccin de 14 lanosterol demetilasa

Incremento en nivel de mRNA de los genes (CDR1 or MDR1 genes) que codifican para las bombas de eflujos Disminucin de la acumulacin del azol en la clula fngica

Resistencia a Azoles

Bien conocida particularmente en fluconazol Es un problema clnico

RESISTENCIA AL FLUCONAZOL INTRINSECA C. krusei, C. norvegensis. P. jirovecii INSENSIBILIDAD Aspergillus, Fusarium,Mucorales

PRIMARIA
SECUNDARIA

C. glabrata
C. albicans

C. albicans C. dubliniensis + Sida

Resistencia cruzada con fluconazol y otros azoles

C. dubliniensis.

Mecanismo de accin: Unin al ergosterol y formacin de poros transmembrana: anfotericina B

Anfotericina B

Ergosterol Membrana plasmtica

Unin al ergosterol

Ca++ Na+

Ca++ K+

Na+

K+

Alteracin osmtica

Mecanismos de la resistencia a Anfotericina B

Disminucin del contenido del ergosterol en la membrana Alteraciones en el contenido de esterol (fecosterol, episterol: de reducida afinidad) Alteraciones en la proporcin esterol a fosfolpidos Reorientacin o enmascaramiento del ergosterol Previa exposicin a azoles

Resistencia a Anfotericina B
Existe dificultades tcnicas en la deteccin de la resistencia in vitro Resistencia in vivo es rara C. lusitaniae, C. krusei Hongos con C. neoformans (algunos aislamientos) susceptibilidad Trichosporon spp. reducida a AMB A. terreus S. apiosperma Fusarium spp. ...

Anfotericina B Resistencia secundaria

Es muy baja

Mecanismo de accin: Candinas

Mananoprotenas

Inhibidor de la glucan sintetasa

(1,6)-glucanos (1,3)-glucanos Quitina Membrana plasmtica

(1,3) glucano sintetasa

Deplecin de (1,3) glucanos de la pared Inhibidor de la glucan sintetasa

Resistencia a las equinocandinas

Mutacin en el gen FSK1

Intrnseca o Insensible : C. neoformans

SECUNDARIA (?) Mutantes resistentes debido a la terapia an no existen.

Mtodos de Determinacin de Susceptibilidad a los Antifngicos

Mtodos de dilucin Mtodos de difusin

COMO DIFERENCIAMOS UN AISLAMIENTO FNGICO SUSCEPTIBLE DE UNO RESISTENTE A UN ANTIFNGICO ?

Tcnicas para realizar estudios de sensibilidad (in vitro)

Mtodos de dilucin: CIM NCCLS Doc. M27-A3 (CLSI) para levaduras (2008). Documento EUCAST para levaduras (2002) NCCLS Doc. M38-A para hongos filamentosos (2002). CLSI Mtodos de difusin E-test (AB biodisk) Tabletas Rosco (Rosco Diagnostica) NCCLS M44-A. CLSI Mtodos colorimtricos YeastOne (Trek Diagnostic System) Fungitest (Biorad)

METODO DE DILUCION Mtodo de referencia

Incubacin: Candida spp 24- 48 hs a 35C Cryptococcus 72 hs a 30C
11: Control Crecimiento (Inculo) 12: Control de Esterilidad ( Antifngico)

Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM)

Es la menor concentracin del ATF en g/ml capaz de: inhibir el crecimiento o inhibir el desarrollo fngico al 50% respecto del
control de crecimiento.

METODO DE DILUCION Interpretacin (S o R) se basa en valores del antifngico alcanzable en suero

Antifngico Susceptible Susceptible Dosis Dependiente (S-DD) 16-32 g/ml 0.25-0.5 g/ml Resistente

Fluconazol Itraconazol

8 g/ml 0.125 g/ml

64 g/ml 1 g/ml

METODO CUANTITATIVO

Susceptibilidad frente al fluconazol

Mtodo de difusin con disco

S-DD
Sensible >19 mm
S-DD 15-18 mm Resistente <14 mm

Sensible

Esta es la CIM

Gradiente de concentraciones en la tira g/ml

E-Test

La diferencia con el disco, es que el disco contiene una sola concentracin

Sensibilidad antifngica
NO se realiza de rutina. Es IMPORTANTE identificar las levaduras y hongos filamentosos (genero y especie) para identificar la RESISTENCIA (R) INTRNSECA o INSENSIBILIDAD.

MTODOS: Dilucin Micromtodos macromtodos (CIM).

Difusin en disco, tabletas, E-test

Mtodos comerciales

Determinan la R Adquirida

Sensibilidad de Candida spp aisladas de hemocultivo

DROGA
Anfotericina
Candida spp Caspofungina Candida spp 0.12-2 0.06-2 0.06-4 0.25-64 0.25-8 42 73 6 47 87 24 56 93 23 5 76 97 74 95 95 97
100 100 100 100

Especies (n =62)

Rango CIM (g/ml)

Porcentaje acumulativo de cepas que son inhibidas en cada CIM (g/ml)

0.031

0.06

0.12

0.25

0.5

16

32

64

100

100

100

100

Voriconazol

Candida spp
C. parapsilosis

97

100

100

100

31 58 81 96 96 96 96 10 47 68 95
100

100

C. albicans

100

100

100

C. tropicalis

2-64
0.25-64 0.25-64 13 13

56 78 89 89 89
13 13 38 63 63 63 63 18 40 68 89 92 92 92

100

Fluconazol

Otras especies Candida spp

100

100

Relacin in vitro / in vivo

RESPUESTA TERAPUTICA MICROORGANISMO HUSPED Mec. Innato Mec. Adquiridos Localizacin de la infeccin En la infeccin Gran nmero de microorganismos

ANTIFNGICO Concentracin en los distintos tejidos

Concentracin fluctuante del frmaco

Relacin in-vivo / in-vitro

CIM Condiciones estandarizadas de laboratorio: Fase constante de crecimiento del microorganismo Condiciones fijas de pH, temperatura, humedad y concentracin de 02. Exposicin constante de un nmero pequeo de microorganismos (103-106 UFC/mL). Concentraciones constantes del antimicrobiano. Condiciones en la infeccin: Gran nmero de microorganismos (109 UFC/mL). Concentraciones fluctuantes del frmaco. Concentracin del frmaco en los distintos tejidos Factores del husped.

Correlacin in vitro / in vivo

CIM: no es una medicin fsica ni qumica Los factores del husped resultan mas importante que los ensayos de susceptibilidad en predecir el curso clnico

La susceptibilidad de un microorganismo no predice el xito de la terapia La resistencia in vitro puede predecir falla teraputica

Prevencin y control de la resistencia a los antifngicos

Tratamiento con el antifngico apropiado.

Uso racional de los antifngicos.

Dosis apropiada y evitar las sub-optimas. Estudios de vigilancia epidemiolgica.

Uso de combinaciones de antifngicos.

Nuevas estrategias

Preguntas
Pneumocystis jirovecii es considerado actualmente un hongo sin embargo, no es susceptibles a los azoles y anfotericina B a que se debe esto? Porque otra clase de antifngicos y antibacterianos pueden ser usados para tratar la neumona que produce? Un paciente presenta una Candidiasis invasora por un aislamiento sensible de Candida albicans al fluconazol, sin embargo no se observa una respuesta al tratamiento con esta droga (con la dosis requerida). Porque?

Muchas Gracias