1.

OBJETO

1.1. Describir la formar de preparar el estndar de solucin Mc Farland.

2. DESRIPCIN

2.1. EQUIPOS Y MATERIALES:

Frascos volumtricos de 100 ml.
Pipetas automticas de 0.50 ml
Tubos de ensayo tapa rosca
Gradilla

2.2. REACTIVOS.
Acido sulfrico 95 -98 % (H2SO4)
Cloruro de bario dihidratado, p.a. (BaCl2.2H2O).
Agua destilada.


2.3. LA ESCALA Mc FARLAND
La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn,
generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra
bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina al 0.9% o solucin de peptona al 0.1%
en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual).

La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin
bacteriana. Creamos 10 estndares (en la tabla aparece la composicin de estos) y por
espectrofotometra, creamos una recta patrn, de forma que vamos a poder detectar la
concentracin de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de
factores como el tamao de la bacteria, la formacin de agregados). La escala se basa en la
capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico.

La escala de MacFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato de bario con el
nmero presente en la muestra


Mc Farland BaCl
2
1% (p/v) H
2
SO
4
1% (v/v) u.f.c/ml
0.5 0,5 99,5 1,5x10
8

1 0,1 9,9 3,0x10
8

2 0,2 9,8 6,0x10
8

3 0,3 9,7 9,0x10
8

4 0,4 9,6 1,2x10
9

5 0,5 9,5 1,5x10
9

6 0,6 9,4 1,8x10
9

7 0,7 9,3 2,1x10
9

8 0,8 9,2 2,4x10
9

9 0,9 9,1 2.7x10
9

10 1,0 9,0 3,0x10
9




2.4. PRERACION DE LA SOLUCION Mc FARLAN 0.5
Los estndares de turbidez de Mc Farland se utilizan para estandarizar el nmero de
bacterias aproximado en una suspensin comparando la turbidez de la misma con la
turbidez del estndar. Los estndares de Mc Farland se preparan agregndole cloruro
de bario a una solucin de cido sulfrico para obtener un precipitado de sulfato de
bario. Se pueden preparar estndares con varios grados de turbidez, ajustando los
volmenes de ambos reactivos, lo que representa distintas concentraciones de
bacterias. El estndar usado ms comnmente en el laboratorio de microbiologa para
los mtodos de sensibilidad de rutina es de 0.5, el cual representa 1.5x10
8
bacterias
por ml.


Reactivos
Acido sulfrico 1% v/v (H
2
SO
4
)
Agregar aproximadamente 90 ml de agua destilada en un frasco graduado de 100
ml.
Con una pipeta de 1 ml agregar 1 ml de H
2
SO
4

Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar.
Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por ms de un ao.

Cloruro de Bario.2H
2
0 (1.75% p/v) (BaCl
2
)
Pesar 1.175 g BaCl2. 2H2O y pasarlo a u frasco graduado de 100 ml.
Agregar aproximadamente 50 ml de agua destilada y mezclar bien hasta disolver.
Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar.
Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por ms de un ao.


Procedimiento.
Agregar aproximadamente 85 ml de H
2
SO
4
(1%, v/v) a un frasco graduado de 100
ml.
Con una pipeta de 0.5 ml agregar 0.5 ml de BaCl
2
.2H
2
O (1.175% p/p) gota a gota al
H
2
SO
4
(1%, v/v) manteniendo agitacin constante.
Llevar a 100 ml de volumen con H
2
SO
4
(1%, v/v)
Examinar la solucin visualmente para asegurarse de que sea homognea sin
precipitados visibles.
Fraccionar en tubos similares a los que se van a utilizar para preparar los inculos
bacterianos (3-5 ml).
Cerrar los tubos y sellarlos con Parafilm o parafina.
Conservar en oscuridad a temperatura ambiente por 3 meses o ms.
Para tener una referencia de la turbidez, la solucin se le puede medir en un
turbidmetro. Cuando se realice la preparacin de suspensin de microorganismos
con equivalencia de 0.5 en la escala de Mc Farland se debe medir ambas
soluciones, debindose obtener valores cercanos de turbidez.

Control de Calidad.
Cada vez que se a utilizar el estndar controlar si hay precipitados visibles y
comprobarlo con un estndar que no este uso. Si se observan precipitados,
descartar el estndar.
Controlar cualquier evidencia de evaporacin. Esto puede hacerse dibujando una
lnea en el tubo sealando el menisco en el momento de llenar los tubos. Si al
usarlo el nivel de lquido est por debajo de esa marca, descartar el estndar.
Luego de tres meses de uso leer la densidad ptica de un estndar
o