Universidade Federal de Santa Catarina

Cintica Enzimtica
Estgio de Docncia
Juliana Ribeiro Mariotto
Objetivos
Medir velocidade das transformaes;

Estudar a influncia das condies de
trabalho;

Correlacionar: velocidades fatores;

Otimizao do processo;

Critrios para o controle;

Projetar o reator mais adequado.
Influncia do Substrato
Concentrao de substrato [S]: afeta a
velocidade da reao;

Efeito de [S]: varia durante o curso de uma
reao S P;

Velocidade inicial (V
0
): [S] >> [E] tempo
muito curto [S] = constante.
Influncia do Substrato
[E] = cte

+ [S] = V
0
| linear

| [S] = V
0
|

V
0
= V
mx


Influncia do Substrato
Alguns casos a V
0
no pode ser medida
No existe tcnica experimental;
Equao qumica no representa a
transformao;

Velocidade da reao:
Velocidade mdia de consumo ou produo;
Variao de uma propriedade no sistema.
Influncia do Substrato
Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para
formar ES passo obrigatrio;

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)
E combina-se reversivelmente com S ES
k
1

E + S ES
k
-1

ES se rompe E e P
k
2

ES E + P




Influncia do Substrato
Qualquer instante da reao: E e ES;

[S] + = velocidade da reao [S];

V
mx
= todas as molculas de E estiverem na
forma ES enzima saturada;

| [S]: estado pr-estacionrio | ES;
Estado estacionrio [ES] = cte;
V
0
estado estacionrio.
Equao Michaelis-Menten
Curva: possui a
mesma forma para a
maioria das enzimas;

Expressa pela
Equao de Michaelis
e Menten;
Hiptese: limitante quebra de ES E + P.
Equao Michaelis-Menten
Equao da velocidade para uma reao
catalisada enzimaticamente e com um nico
substrato;

Relao quantitativa entre a V
0
, a V
mx
e a
[S] inicial relacionadas atravs de K
m
.
| |
| | S K
S V
V
m
mx
+

=
0
Equao Michaelis-Menten
Relao numrica:
V
0
metade de V
mx
;


k
m
= afinidade pelo
substrato;
+ K
m
| afinidade
mx
V V =
2
1
0
V
mx
proporcional [E].
Significado de K
m
e V
mx

Equao Michaelis e Menten = dependncia
hiperblica;

Mecanismos de reao diferentes
catalisam reaes com 6 ou 8 passos;

Significado e magnitude de V
mx
e K
m
varia;

K
m
: depende de aspectos especficos do
mecanismo de reao.
Significado de K
m
e V
mx


K
2
<< K
-1
afinidade da enzima;
K
2
>> K
-1
;
K
2
e K
-1
so comparveis a K
m
funo
complexa;
V
mx
: nmero de passos da reao e
identidade dos passos limitantes.
1
1 2
k
k k
K
m

=
Significado de K
m
e V
mx
Enzima na saturao: EP e V
mx
= k
3
.[Et];

K
cat
= velocidade limitante de qualquer
reao enzimas saturadas;

K
cat
e K
m
= ambiente celular, concentrao
do substrato e qumica da reao.
E + S ES EP E + P
K
1
K
2
K
3

K
-1
K
-2

Reao de 1 Ordem

[S] << K
m


k = constante de velocidade de 1 ordem
(min
-1
)

| |
m
mx
K
S V
V =
0
| | S k V =
0
[S] + V
0
+
Frao constante de S P
| |
| | dt S
S d
k
1
=
Reao de 1 Ordem
Determinar S utilizado
ou P formado durante
qualquer intervalo de
tempo Equao
integrada de 1 ordem.
| |
| |
( )
0
0
log 3 , 2 t t k
S
S
=
Reao de 1 Ordem
t
1/2
= tempo de
meia vida tempo
necessrio para
converter em P
metade do S
presente.
k
t
693 , 0
2
1
=
Reao de Ordem Zero
[S] >> K
m

| |
| | S
S V
V
mx
=
0
mx
V V =
0
Parmetros Cinticos
Lineweaver-Burk

| |
mx mx
m
V S V
K
V
1 1 1
+ =
Parmetros Cinticos
Mtodo de Hanes
| |
| | S
V V
K
V
S
mx mx
m
1
+ =
Parmetros Cinticos
Mtodo de Eadie-Scatchard
| | S
V
K V V
m mx
=
Parmetros Cinticos
Forma integrada
| |
| |
| | | | ( )
t
S S
K K
V
S
S
t
m m
mx

=
0 0
1
log
3 , 2
Parmetros Cinticos
Exemplo:

[S] (g/L) V
o
(g/L.h)
0,25 0,78
0,51 1,25
1,03 1,66
2,52 2,19
4,33 2,35
7,25 2,57
0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
V
o

(
g
/
L
.
h
)
Parmetros Cinticos
Exemplo: Lineweaver-Burk


y = 0,228x + 0,3668
R
2
= 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[S] (L/g)
1
/
V
o

(
L
.
h
/
g
)
| |
| |
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S V
V S V
K
V
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
622 , 0 228 , 0
73 , 2 3668 , 0
1
Portanto,
3668 , 0
1
228 , 0
1
1 1 1
0
0
= =

= =
+ =
+ =
Parmetros Cinticos
Exemplo: Mtodo de Hanes


y = 0,3595x + 0,2419
R
2
= 0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
[
S
]
/
V
o

(
h
)
| |
| |
| |
| |
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S
V
S
S
V V
K
V
S
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
672 , 0 2419 , 0
78 , 2 3595 , 0
1
Portanto,
3595 , 0 2419 , 0
1
0
0
= =

= =
+ =
+ =
Inibidores Competitivos
Forma estrutural = substrato competio;

Porcentual de inibio concentraes e
afinidade pela enzima.


Inibidores Competitivos
| [S] V
mx
=
K
m
|

Experimento
1 [E], [S] = cte
2 [E], [I] = cte
1/V
0
x 1/[S]
Inibidores Competitivos
Equao de
Michaelis e Menten



Lineweaver-Burk
| |
| |
| | S
K
I
K
S
V V
I
m
mx
+
|
.
|

\
|
+
=
1
| |
| | S V
K
I
K
V V
mx
I
m
mx
1
1
1 1

|
.
|

\
|
+
+ =
Inibidores Competitivos
| | ( )
| | I
S K K
K
V
V
m I
m
I

+
+ =1
0
Relao entre as velocidades com e sem
inibidor
[S] | = influncia
do [I] desprezvel.
Inibidores No-Competitivos
Ocupa outro stio
ES, EI e EIS;

[S] | = no leva
todas as E
produtiva;

V
mx
+ e K
m
normal.
Inibidores No-Competitivos
Equao da
velocidade:



Lineweaver-Burk
| |
| |
| |
| |
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
=
I I
m
mx
K
I
S
K
I
K
S
V V
1 1
| |
| |
| |
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+ =
I mx I mx
m
K
I
V S K
I
V
K
V
1
1 1
1
1
Inibidores Incompetitivos
Bloqueio de ES;

2 stios ativos I
se fixa no complexo
ES;

ESI = no forma P;

V
mx
+ e K
m
+
Inibidores Incompetitivos
Equao da velocidade:







Lineweaver-Burk:
| |
| |
| |
| | S
K
I
K
S
K
I
V
V
I
m
I
mx
+
+

+
=
1
1
| |
| |
|
|
.
|

\
|
+ + =
I mx mx
m
K
I
V S V
K
V
1
1 1 1
Inibidores Incompetitivos
Inibidores Irreversveis
Combinam-se com um grupo funcional
destruio;

Unio covalente inibidor e enzima.

V
mx
+ e K
m
=
Inibidores Irreversveis
Equao de
Michaelis e Menten:
( )
| |
| | S K
S
EI k V V
m
mx I
+
= ] [
3
Inibidores Irreversveis
Lineweaver-Burk:
| | | | | | S EI K V
K
EI K V V
mx
m
mx I
1 1 1
3 3

=
Influncia do pH
Valor de pH timo = atividade mxima;

Velocidade da reao: + pH afasta do timo;

Influncia do pH: anlise dos grupos
dissociveis;

cidos (Brnsted): compostos capazes de
dissociar-se, liberando H
+
.
( )
( ) b H NH CH CH CH CH NH CH CH CH CH
a H COO CH COOH CH


2 2 2 2 2 3 2 2 2 2
2 2
+ +
+
+
+
Influncia do pH
HA A + H
+

pH + HA | A +

Aminocidos:


pH + -COO
-
captam prtons = -COOH;
pH | -NH
3
+
so dissociados = NH
2
;

Ligao eletrosttica = -COO
-
-- NH
3
+
.

Influncia do pH
pH timo depende do nmero e tipo de
grupos ionizveis estrutura primria;

Variaes do pH afeta substrato com
grupos ionizveis;

Estabilidade da enzima: temperatura, fora
inica, concentrao de substratos ou
cofatores da enzima e concentrao da
enzima, entre outros.

Influncia do pH
pH 5 e 8 = no afeta a
atividade;

Declnio entre pH 6,8-8
e 6,8-5 = forma inica no
adequada;

5 > pH > 8 = inativao
irreversvel.
Influncia da Temperatura
| T | velocidade de reao = | energia
cintica;

T muito elevadas = desnaturao da enzima
Rompidas as pontes de hidrognio
alteraes estruturas = nova conformao;
T desnaturao pouco acima da T tima.
Influncia da Temperatura
Enzimas + PM 1 cadeia polipeptdica e
pontes dissulfeto = estveis ao calor;

Efeito da T = pH, fora inica e a presena
ou ausncia de ligantes;

Substratos protegem a enzima da
desnaturao.
Influncia da Temperatura
K funo | da T Lei de Arrhenius

RT
e k k
o
=
0
Influncia da Temperatura
Enzimas so termolbeis reao
enzimtica = inativao trmina


Efeito da T na velocidade das reaes
coeficiente de temperatura
Velocidade | quando a T | 10C.

10
log 3 , 2
10 1 2
Q T T R
E
a

=
RT
e k k
|
=
'
0
'
Regulao da Atividade
Sistema enzimtico: produto da reao da 1
enzima substrato da enzima subseqente;

Enzimas reguladoras determina a
velocidade da seqncia;
Atividade cataltica | ou + sinais;

Molculas sinalizadoras pequenos
metablitos ou cofatores.
Enzimas Alostricas
Ligao no-covalente e reversvel
modulador;

Inibio por retroalimentao
Enzima reguladora inibida pelo P final da
via reequilibra as necessidades celulares;

Moduladores: inibidores ou estimuladores.

Enzimas Alostricas
Modulador = substrato homotrpicas;
Modulador = substrato heterotrpicas;

Stio alostrico especfico para o
modulador;

Curva de saturao sigmide
subunidades mltiplas.

Enzimas Alostricas
= curvas de variao de atividade
moduladores inibidores, ativadores ou os
dois tipos.
Modificao Covalente
Ligao covalente de um grupo qumico
sua estrutura;




Metabolismo alterado aciona vias inativas
e inibem vias ativas.