CITOGENETICA MOLECULAR

INTEGRANTES:
Licet Liliana VASQUEZ ROMAN
Noel Alexander MAMANI QUISPE



HIBRIDACION IN SITU
INTRODUCCION

HIBRIDACION
La hibridacin en Biologia Molecular es el
enlace de dos moleculas de acido nucleico de
caxdena simple, complementarias de acuerdo
con las reglas de emparejamiento de bases.

En genetica de celulas somaticas, fusion de dos
celulas somaticas a menudo de organismos
diferentes para formar una clula hibrida que
contiene la informacion genetica de ambos
tipos de celulas.
A TRAVES DE LA HISTORIA
1969 Por Gall y Pardue, jhon et al se desarrollo
esta tecnica.
Se empleo ovocitos de Xenopus Laevis,
hibridando rRNA con rDNA extracromosomal.
HIBRIDO
Es un organismo vivo animal o vegetal
procedente del cruce de dos organismos de
razas, especies o subespecies distintas, o de
alguna o ms cualidades diferentes.
METODOS DE HIBRIDACION
Los ensayos de Hibridacin se pueden
clasificar en tres grupos:
HIBRIDACION IN SITU
La localizacion de un gen o de un segemento
de DNA en un extendido cromosomico o en un
nucleo de celulas, sobre un portaobjetos, con
huso de una secuencia marcada de DNA que
se debe localizar. Generalmente, conlleva el
uso de sondas fluorescentes en el caso se
denomina hibridacion in situ fluorescente.
Es un tipo especializado de hibridacin en
soporte solido en la que la sonda se aplica
sobre muestras en su ubicacin natural,
generalmente preparadas para microscopia.
Supone, por tanto , el empleo de hibridacin
bajo un abordaje citolgico e histolgico y
metodolgicamente es anloga a las tcnicas
inmunocitoquimicas e inmunohistoquimicas.
De forma muy global cabe distinguir entre sus
aplicaciones tisular y cromosmica.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
Se realiza sobre cortes de tejido, clulas
intactas, ncleos aislados en muchos casos,
se lleva a cabo directamente sobre tejidos
fijados con formalina, incluidos en parafina,
congelados, etc.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
Es una modalidad de hibridacin
particularmente para detectar virus patgenos
para diagnosticas clulas cancerosas como
consecuencias de cambios genticos o para
estudiar cambios en la expresin gnica,
detectando secuencias en el RNA celular.

HIBRIDACION IN SITU TISULAR
En este caso, tras una fijacin suave se aaden
sondas de DNA complementario (cDNA), de
hebra sencilla.
La deteccin se realiza por autorradiografa y
por examen de la pelcula fotogrfica bajo el
microscopio o por microscopia de
fluorescencia, si se empleo este marcaje para
la sonda.
HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICA
Se realiza sobre preparaciones en porta de
cromosomas metafasicos y prometafasico,
tratadas con fijadores para preservar las
caractersticas morfolgicas del cromosoma,
Para hacer accesible la secuencia de DNA, se
trata la muestra con enzimas proteolticas y se
desnaturaliza en DNA por calor, lcalis o
formamida para permitir su hibridacin con la
sonda.
HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICA
Inicialmente se empelaron sondas radioactivas,
pero problemas tcnicos en la deteccin de la
seal limitan su utilidad.
Se a conseguido aumentar la sensibilidad y
resolucin con el empleo de sondas marcadas
con fluorescencia.
En esta tcnicas llamando hibridacin in situ por
fluorescencia o FISH, la deteccin se hace bajo
microscopia de fluorescencia, bien de forma
directa o por mtodo indirecto.
PASOS Y CONSIDERACIONES PARA LA
HIBRIDACION IN SITU

DETECCION DE SONDA MARCADA



Sondas
Secuencia de nucletidos
complementaria
de la secuencia diana a estudio
M
Sondas
Sondas antisentido y sentido
SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucletidos
complementaria de la secuencia diana
SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de
nucletidos idntica a la secuencia diana, por lo que no puede
hibridarse con ella
Secuencia
diana
Sonda antisentido
T A A g g T C C A 3 5
A T T C C A g g T 5 3
A C g C A T g A T 5 3
A T T C C A g g T 5 3
Sonda sentido
Sondas
Tipos de Sondas
Sondas bicatenarias (ADN)
Sondas monocatenarias
Nmero de hebras
Sondas de ARN
(Ribosondas)
Sondas de ADN
Naturaleza
ARN
Oligonucletidos

Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Bicatenarias
M
M
Permiten la deteccin de ambas hebras del ADN
Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Monocatenarias
En ADN, permiten la deteccin de una de las hebras
M
En ARN, es complementaria a su secuencia
Sondas
Marcadores
Son molculas que se incorporan a un
nucletido para permitir la deteccin de la
sonda.
M
Sondas
Marcadores
Tipos de marcadores
Antignico
s
Fluorescente
s
Inmunohistoqumica
Visualizacin directa (FISH)
Sondas
Marcadores
Marcadores antignicos
Incorporan molculas antignicas acopladas a la base
nitrogenada
Los ms usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluorescena
(FITC)
CH
2
O
OH OH
P O O
OH
OH

P O
OH
OH

P O
OH
OH

M
Sondas
Marcadores
Marcadores fluorescentes
Incorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenada
Los ms usadas son: Fluorescena, Rodamina, Texas red
CH
2
O
OH OH
P O O
OH
OH

P O
OH
OH

P O
OH
OH

M
Hibridacin in situ
Procesamiento de las muestras
Fijacin
Permite preservar los cidos nucleicos y la morfologa tisular
DNasas RNasas!
Degradacin de
cidos nucleicos
diana
FIJACIN
Hibridacin in situ
Procesamiento de las muestras
Fijador
FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas
Procesado rutinario de inclusin en parafina
Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o cidos
Bouin
Zenker
B5
!
Hibridacin in situ
Procesamiento de las muestras
Secciones
Secciones de 5 m en portaobjetos tratados
Limpieza con alcohol (microtomo, bao, ...)
Esterilizacin en autoclave (pinzas, ...)
Precauciones con las RNasas exgenas (condiciones de
esterilidad):
Uso de agua destilada en el bao para recoger las secciones
Portaobjetos de caja recin abierta
!
Hibridacin in situ
Procesamiento de las muestras
Secado de las secciones durante
1 Noche a 50-55 C
Almacenamiento de las secciones desecadas a 20C
Si no se realiza la HIS
en los das siguientes
Precauciones con las RNasas
!
Hibridacin in situ
Etapas
Pretratamiento
Desparafinado e hidratacin
Deshidratacin
Desnaturalizacin
Hibridacin
Hibridacin in situ
Desparafinado e Hidratacin
Se realizar de igual manera que la IHQ
Llevar la hidratacin hasta Agua Destilada Estril
Precauciones con las RNasas
!
Hibridacin in situ
Pretratamientos
Calor
Precauciones con las RNasas
!
10 min, 95-99C
Bao Mara
Microondas
Hibridacin in situ
Pretratamientos
Medios Enzimticos
Precauciones con las RNasas
!
Enzimas
proteolticas
PEPSINA (10 min TA / 5 min 37C )
PROTEINASA K (1 min TA)
Hibridacin in situ
Deshidratacin y secado
Precauciones con las RNasas
!
Evita la dilucin de la sonda
La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduacin creciente
OH 70 OH 96 OH 100
El secado lo podemos
realizar
Al aire / campana
En placa trmica a 45-50C
Hibridacin in situ
Desnaturalizacin
Permite la separacin de las dos hebras de ADN para
que pueda ser detectada la secuencia a estudio
Slo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN
y/o cuando la sonda sea bicatenaria
Hibridacin in situ
Desnaturalizacin
95C durante 5
Hibridacin in situ
Hibridacin
La sonda se unir a la secuencia diana
bajo unas condiciones determinadas
M
Hibridacin in situ
Hibridacin
Condiciones de hibridacin
[Na
+
] Temperatur
a
M
M M
Hibridacin in situ
Hibridacin
Temperatura de hibridacin
37C / 45C noche
Temperatura a la cual la sonda se hibridar con su
diana
Hibridacin in situ
Lavados de rigor (astringency)
Permiten aumentar la especificidad de la reaccin
eliminando las uniones inespecficas de la sonda
con secuencias parcialmente homlogas
SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X
SSC: Tampn citrato salino
Se realizan los lavados a 72C, 65C, 42C, 37C
Sistemas de Deteccin
Biotina
Estreptavidina
Fluorocromos
Ac. anti-fluorocromo
Fluorescencia (FISH)
Digoxigenina
Ac. anti-digoxigenina
Sistemas de Deteccin
Sondas biotinadas
B
1. Deteccin mediante Estreptavidina unida a la
enzima (Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)
E
Z

E
Z

Diana
2. Revelado con el cromgeno de la enzima
(NBT/BCIP o DAB)
Sistemas de Deteccin
Sondas biotinadas
EA-Peroxidasa DAB EA-Fosfatasa Alcalina
NBT/BCIP
Virus JC
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
B
P

P

1. Deteccin de sonda biotinada con Estreptavidina-
Peroxidasa
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
B
P

P

T
B
T
B
2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a
residuos tirosina de protenas prximas
T
B
T
B
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

T
B
P

P

3. Deteccin de la biotina de las tiramidas con ms
Estreptavidina-peroxidasa
4. Revelado con DAB
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
Tcnica convencional Amplificacin con tiramidas
HPV
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
Caski (600 copias HPV16)
HPV
Sistemas de Deteccin
Amplificacin con tiramidas
SiHa (1-2 copias HPV16)
HPV
Sistemas de Deteccin
Sondas antignicas
A
E

1. Deteccin mediante un anticuerpo unido a una
enzima (Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)
2. Revelado con el cromgeno
(NBT/BCIP o DAB)
Antgeno
Digoxigenina
FITC
Deteccin por Inmunohistoqumica
Sistemas de Deteccin
Sondas antignicas
EBV - EBER
FITCFA NBT/BCIP
HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE
Sistemas de Deteccin
Sistemas de Deteccin
Sondas marcadas con fluorocromos
FITC
Iluminacin con luz de
alta frecuencia
(Ultravioleta)
Emisin de
fluorescencia de
frecuencia
inferior
Visualizacin directa de la fluorescencia (FISH)
Sistemas de Deteccin
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrmer
o
Gen
HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrmer
o
Gen
HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)
Variantes (M-FISH y SKY-FISH)
Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma
con un fluorocromo con espectro de emisin
nico y diferenciable de lo dems
Se pinta a cada cromosoma de un color
Los cromosomas anmalos aparecern no
uniformes
til en neos hematolgicas
Caracteriza correctamente translocaciones
complejas y crpticas