Centro de Gestin Industrial

Informe de Laboratorio No 02
IDENTIFICACIN MACROSCPICA Y MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS
CELULOLTICOS






Aprendices
Laura Giselle Ruiz Espinel
Estefana Muoz Pramo
Ivn Daro Lozano Valerio
Nidia Marcela Guayana Suavita



Instructor
Sonia Marcela Buitrago Morales







Especialidad Qumica Aplicada a la Industria
Mayo de 2014

Tabla de contenido

1. Introduccin ........................................................................................................... 3
2. Objetivo General .................................................................................................... 3
3. Materiales .............................................................................................................. 4
4. Procedimiento ........................................................................................................ 4
5. Resultados ............................................................................................................. 6
6. Analisis de Resultados ........................................................................................... 6
7. Conclusiones ......................................................................................................... 7
8. Bilbliografia ............................................................................................................ 8
9. Imgenes ............................................................................................................... 9





























1. Introduccin

Los microorganismos se pueden encontrar en cualquier parte del medio ambiente y
pueden ser observados realizando diferentes clases de cultivos y aislamientos, en
esta prctica se realizar una identificacin macroscpica y microscpica, para
identificar si se tiene una bacteria celuloltica o no. La observacin macroscpica y
microscpica es una tcnica de gran importancia para el estudio de los
microorganismos ya que permite conocer algunas de sus caractersticas, como son:
forma disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas,
esporas, flagelos), movilidad, entre otras
[1]
. Para una identificacin microscpica se
realiza mediante tcnicas de tincin, la tincin es utilizada para aumentar el
contraste entre los microorganismos y el medio que los rodea. Existen varios tipos
de tinciones: la simple, la especfica, la diferencial y la tincin de Gram. Esta prctica
se realizar con la tincin de Gram la cual fue desarrollada por el bacterilogo dans
Christian Gram en 1884; la tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial
empleada en bacteriologa para la visualizacin de las bacterias, la tincin de Gram
es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos,
morfologas celulares y reaccin Gram (color).

Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos Gram positivas (+) y Gram
negativas (-), donde las Gram (+) tienen una gruesa capa de peptidoglucano (entre
el 80%) y gran cantidad de cidos teicoicos que no son afectados por la
decoloracin con alcohol o acetona, reteniendo el colorante inicial Cristal Violeta y
visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro
dependiendo de si la naturaleza de su pared est intacta o daada, una bacteria
Gram (-) a diferencia de una Gram (+) tiene una delgada capa de peptidoglucano
(entre el 20 y 30%) ligado a una membrana externa por molculas
lipopolisacridos.Esta membrana es daada por el alcohol o acetona de la
decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con yodo escape y
sea reemplazado por el contracolorante (fucsina).

Como se deca anteriormente esta prctica es para poder determinar si el
microorganismo celuloltico es una bacteria o no.

2. Objetivo General

Identificar microorganismos celuloliticos aislados de colonias
seleccionadas (A y B) de manera macroscpica y microscpica

Objetivos Especficos

Realizar adecuadamente el aislamiento de microorganismos
celulolticos.
Conocer el manejo adecuado del microscopio para realizar la
identificacin microscpica
Realizar un frotis para el montaje e identificacin de la textura de la
colonia seleccionada
Reconocer de manera microscpica bacterias Gram (-) y Gram (+)
por medio de la tincin de Gram
3. Materiales

MATERIALES CANTIDAD
Portaobjetos 1
Asa redonda 1
Mechero 1
Aceite de inmersion 1
Frasco Lavador 1

REACTIVOS
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol
Fucsina

EQUIPOS
Microoscopio Optico


4. Procedimiento

4.1 Elaboracion de Frotis y Sellamiento del Portaobjetos







INICIO
Tener el mechero
encendido para mantener
la zona esteril
Tomar un asa redonda y
realizar el frotis a la
colonia
La cantidad recojida de
microorganismos en el
frotis ponerla en un
portaobjetos
Flamear el portaobjetos
con el fin de sellar la
muestra
Tomar las cajas de petri
donde se encuentre las
colonias seleccionadas
FIN
4.2 Tincion de Gram












4.3 Montaje en el microscopio















INICIO
Tomar el portaobjetos
sellado con la muestra
Adicionarle Cristal violeta
por 1 minuto y retirar el
exceso con agua
destilada.
Adicionarle Lugol o
mordiente por 1 minuto y
retirar el exceso con agua
destilada.
Adicionarle alcohol por 1
minuto y retirar el exceso
con agua destilada.
Adicionarle Fucsina por 40
segundos y retirar el
exceso con agua
destilada.
FIN
INICIO
Tomar el portaobjetos
sellado y con los
colorantes.
Colocar el portaobjetos en
la platina y sujetarlo con
las pinzas del microscopio.
Agregar aceite de
inmersion
Observar con el objetivo
4x y enfoncar
Observar con el objetivo
100x y enfoncar para
observar detalladamente
el microorganismo
presente
FIN
5. Resultados

4.1 Descripcin Macroscpica y Microscpica
COLONIA MACROSCPICA MICROSCOPIA TAMAO
DE
COLONIA
COLONIA
MS HALO
HALO
A Color: Naranja
Forma:
Estrellada
Elevacin:
Ninguna
Plana



Bacilo Gram
positivo
esporulado



10 mm



70 mm



60 mm
B Color: Naranja
Forma: Ovalada
Elevacin:
Ninguna
Plana



Bacilo Gram (-)


4 mm


5 mm


1 mm

6. Analisis de Resultados

Se seleccionaron dos cajas de Petri las cuales contenan colonias aisladas
de microorganismos celulolticos, se seleccion una colonia por cada caja y
se clasificaron como colonia A en la primera caja y colonia B en la segunda
caja; (Imagen 1. Seleccin de Colonias A y B); se determin sus
caractersticas macroscpicas midiendo el tamao de la colonia, el halo, su
forma, color, textura y elevacin (Tabla 4.1 Descripcin Macroscpica y
Microscpica).

Al efectuar la identificacin microscpica se tom con un asa redonda un
frotis de cada colonia seleccionada; el portaobjetos fue marcado por la
mitad, donde se extendi cada colonia en el lado correspondiente para
realizar la adecuada tincin de Gram y posteriormente ser observada al
microscopio(Imagen 2. Portaobjetos); se observ que la colonia A contena
Bacilos Gram (+) esporulados teidos de azul, (Imagen 3. Bacilos Gram (+)
al microscopio Tincin azul Colonia A); despus de veinticuatro horas de
haber realizado la tincin se tom la colonia B, se observ en el
microscopio que los microorganismos presentes en la muestra son Bacilos
Gram negativos (-) (Imagen 4. Bacilos Gram (-) al microscopio Tincin rosa
Colonia B), ya que presentan una tincin rosada y estos no contenan
estructuras esporuladas; los bacilos Gram negativos (-), No fermentan
azucares. La gran mayora son proteolticos y lipolticos. Se encuentran en
materia orgnica
[2],
de lo cual podemos inferir que estos se encontraban en
la muestra porque esta es de constitucin orgnica, proveniente de la
Hierbabuena.

Despus de hacer la lectura de la colonia B se volvi a observar la colonia
A, y arroj un resultado de bacilos Gram (-) negativos (Imagen 5. Bacilos
Gram (-) al microscopio Tincin rosa Colonia A) este nuevo resultado en la
colonia A se debe a que los cultivos de ms de 24 horas de teidos
pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo, o
que al momento de realizar el proceso de decoloracin este debe ser corto,
y es esencial un clculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tincin
las clulas Gram (+) positivas
[3]
.

Si es correcto afirmar que se tiene un bacilo Gram (+) positivo, este es de
gran importancia para el proyecto de formacin (obtener extractos de
inters industrial a partir de Hierbabuena), puesto que en la Universidad
Nacional de Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la
degradacin de celulosa a partir de microorganismos aislados, donde ellos
afirman que se encontraron 5 microorganismos con potencial para degradar
celulosa entre ellos el actinomiceto Streptomyces siendo este
microorganismo una bacteria
[4]
por ello se puede inferir o deducir que se
tiene este tipo de bacteria en la hierbabuena, ya que los actinomicetos son
bacterias Gram positivas y en especial la bacteria Actinomiceto
Streptomyces constituye el 95% de los actinomicetales estos tienen hifas
no fragmentadas, esporas o conidias en cadena y es un micelio areo
extenso
[5]
, este tipo de actinomycete es utilizado en la industria.

7. Conclusiones

Valindonos de la tcnica por estra cruzada, se aislaron los
microorganismos que al revelarlos con rojo congo se observ que tenan
potencial celuloltico por la formacin de halos.


Se realiz la caracterizacin macroscpica de las colonias seleccionadas A
y B mediante la observacin de tamao, color, textura, forma y elevacin y
cuyas caractersticas fueron registradas en la tabla 4.1 lo que permite
describir el microorganismo que se aisl de acuerdo a lo observado.

Se aplicaron las tcnicas para el posterior anlisis microscpico, mediante
la realizacin de un frotis bacteriano el cual se realiza tomando con un asa
estril un poco de la muestra a partir de una colonia aislada; para este caso
se tom de forma paralela una muestra de las colonias A y B que se llevan
a un portaobjetos fijando cada muestra de manera uniforme para luego
proceder a realizar la tincin de Gram, que es lo que finalmente permiti
efectuar el anlisis microscpico que determino que tipo de
microorganismos se encontraba en cada cepa.

Se determin la presencia de bacterias Gram (+) lo que confirm la
existencia de microorganismos celuloliticos mediante la observacin de las
colonias A y B, estas fueron fijadas en el portaobjetos y con ayuda del
microscopio se enfoca con el objetivo 4X y posteriormente se utiliza aceite
de inmersin para el objetivo 100X con el fin de lograr una refraccin igual a
la del vidrio para que los rayos de luz no se desven; se encontr al
observar en el microscopio que se trataba de un bacilo esporulado Gram
(+), que es un microorganismo de inters para el proyecto por su potencial
para la degradacin de la celulosa lo que posteriormente puede permitir que
mediante biotecnologa sea aplicable al mejoramiento del rendimiento en la
obtencin de extractos naturales de muestras vegetales en este caso de la
Hierbabuena (Mentha Spicata).
8. Bilbliografa
1. Amortegui y Vargas. Practica de Laboratorio manejo de microscopio. 2011.
[disponible en linea]. Recuperado
de:http://www.buenastareas.com/ensayos/Informe-De-Tincion-De-
Gram/1724801.html
2. Palomino. Introducion a la Microbiologia. 1995. disponible en linea].
Recuperado de:
ambiental.http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan2/029270/029270-04.pdf
3. Universidad Tecnologica Nacional. Tincin y observacin de microorganismos.
2009. [disponible en linea]. Recuperado
de:http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnolo
gia/practico4.pdf
4. Revista Colombiana de Ciencias Hortcolas. Degradacin de celulosa y xilano
por microorganismos aislados de dos tipos de compost de residuos agrcolas
en la Sabana de Bogot. 2009. [disponible en linea]. Recuperado de:
http://www.soccolhort.com/revista/pdf/magazin/vol3/vol.3.%20no.2/pathogen
%20compost%20patogenos%20degradation%20cellulose.pdf
5. Amarin. Actinomicetos. 2010. [disponible en linea]. Recuperado de:
http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2010/06/18/los-
actinomicetos-como-fuente-de-productos-de-interes-biotecnologico/







9. Imgenes

Imagen 1. Seleccin de Colonias A y B

Tomada en el laboratorio microbiologia. Autor Ivan Lozano

Imagen 2. Portaobjetos

Tomada en el laboratorio microbiologia. Autor Ivan Lozano


Imagen 3. Bacilos Gram (+) al microscopio Tincin azul Colonia A

Tomada en el laboratorio microbiologia. Autor Ivan Lozano











Imagen 4. Bacilos Gram (-) al microscopio Tincin rosa Colonia B

Tomada en el laboratorio microbiologia. Autor Estefania Muoz


Imagen 5. Bacilos Gram (-) al microscopio Tincin rosa Colonia A

Tomada en el laboratorio microbiologia. Autor Estefania Muoz