LAPORAN PERCOBAAN VI

ELEKTROFORESIS DNA DAN PROTEIN

I. TUJUAN PERCOBAAN
Membandingkan hasil elektroforesis antara sampel yang positif
mengandung virus Hepatitis B dengan sampel yang tidak mengandung virus
hepatitis B.
Menentukan banyaknya base pair dari DNA virus hepatitis B.
Membandingkan hasil elektroforesis antara crude protein dengan protein
murni.
Menentukan berat molekul protein
II. TEORI DASAR
Elektroforesis merupakan salah satu teknik untuk memisahkan DNA, RNA,
atau protein dengan menggunakan medan listrik. Dalam hal ini, molekulmolekul
tersebut dipisahkan berdasarkan perbedaan la!u migrasinya oleh gaya gerak listrik.
Molekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah
salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Arah pergerakan asam nukleat
menu!u elektrode positif karena asam nukleat memiliki gugus gulafosfat yang
bermuatan negatif "ementara itu, untuk mengelektroforesis protein, protein
tersebut harus dibuat linear dan bermuatan negatif. #a!u migrasi molekul tersebut
bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.
$el yang digunakan dalam elektroforesis biasanya merupakan polimer
bertautan silang yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. %ntuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran ke&il, gel yang digunakan
biasanya merupakan gel poliakrilamida. Elektroforesis protein biasa disebut
elektroforesis "D"'A$E ("D"polyacrylamid gel electrophoresis). %ntuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa),
gel yang digunakan adalah gel agarosa.
'ada elektroforesis DNA biasanya didahului oleh amplifikasi DNA tersebut
dengan metode '*R. Polymerase chain reaction ('*R) merupakan teknik untuk
memperbanyak DNA. '*R memungkinkan se!umlah ke&il sekuens DNA tertentu
disalin !utaan kali untuk diperbanyak sehingga dapat dianalisis atau dimodifikasi
se&ara tertentu.
"etelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pe+arnaan (staining)
agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. %ntuk menentukan berat
molekul, hasil elektroforesis dibandingkan dengan suatu marka. Marka
merupakan &ampuran molekul dengan berat molekul yang berbedabeda yang
telah diketahui. Berat molekul dihitung berdasarkan kurva logaritma berat
molekul senya+a tersebut terhadap !arak migrasinya. ,arak migrasi pita dari
sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
III. ALAT DAN BAHAN
Alat :
- Alat elektroforesis DNA dan protein
. Mesin '*R
/ 'emanas
0 #empeng ka&a dan spacer
1 Alat pen&etak gel (tray)
2 "isir pen&etak sumur
3 'ipet mikro
4 5rafo
Bahan :
1.
Agarosa
2.
#arutan 5AE -6
3.
#oading buffer
4.
DNA template
5.
Buffer -76
6.
'rimer
7.
ddH
.
8 steril
8.
Mg*l
.
9.
dN5'
10.
5a9 polimerase
11.
EtBr (Etidium Bromida)
12.
Akrilamid /7:
13.
5risH*l pH 4,4
14.
5risH*l pH 2,4
eperating gel
tac!ing gel
15.
-7: "D"
16.
A'" -7:
17.
5EMED
18.
Buffer elektroforesis (5ris$lisin)
19.
*oomasie blue
20.
#arutan destaining
IV. PROSEDUR PERCOBAAN
4.1 Elekt!"e#$# DNA
-. Agarosa ditimbang 7,0 g dan dilarutkan dalam 07 ml 5AE -6 untuk
mendapatkan gel agarosa -:.
.. #arutan agarosa dipanaskan sampai mendidih, sementara itu &etakan atau
tray disiapkan untuk elektroforesis. "isir elektroforesis ditempatkan untuk
membentuk sumur gel.
/. "etelah larutan agarosa mendidih, didiamkan sampai suhu sekitar 27 *.
0. #arutan agarosa dituang ke &etakan atau tray yang sudah disiapkan dan
dibiarkan sampai membeku.
1. "etelah membeku, penutup tray dan sisirnya dibuka, kemudian tray
ditempatkan pada &hamber elektroforesis yang sudah berisi buffer 5AE -6.
2. "emua sampel DNA (sampel DNA telah diperbanyak dengan '*R terlebih
dahulu) ditambah loading bu""er -6 dan dimasukkan ke dalam sumur
elektroforesis.
3. Marka DNA !uga dimasukkan ke salah satu sumur.
4. Elektroforesis di!alankan pada 41 ; selama - !am.
<. $el hasil elektroforesis direndam dalam larutan EtBr selama 1-7 menit
kemudian dilihat diba+ah sinar %;.
4.% Elekt"!"e#$# &"te$n
1. Elektroforesis "D"'A$E dilakukan menggunakan alat BioRad Mini
'rotean ==.
2. #empengan ka&a, spacer, dan alat pen&etak gel (gel sand#ich) dibersihkan
dan dikeringkan
3. $el sand#ich disusun dengan menyelipkan lempengan ka&a yang disisipi
spacer dan kemudian untuk memastikan tidak adanya kebo&oran
dimasukkan a9uadest ke ruang pen&etak gel
4. eparating gel -.: (b>v) dan stac!ing gel 0: (b>v) disiapkan dengan
komposisi seperti pada tabel di ba+ah ini?
Jen$# 'el
Bahan
Se&a"at$n( 'el
1%)
Sta*k$n( 'el
4)
Akrilamid> bisAkrilamid /7:
-,1 M 5ris H*l pH 4.4
7,1 M 5ris H*l pH 2.4
-7: "D"
H
.
8
A'" -7:
5EMED
0 m#
.,1 m#

-77 #
/,/1 m#
17 #
-1 #
7,/.1 m#

7,2.1 m#
.1 #
-,1.1 m#
-1 #
1 #
5. A'" -7: dan 5EMED dimasukkan paling akhir. *ampuran dihomogenkan
dengan mempipet naikturun se&ara perlahan. 'olimerasi mulai ter!adi pada
tahap ini, maka larutan harus segera dituang ke dalam gel sand+i&h
6. "e&ara perlahan, larutan separating gel dimasukkan ke dalam gel sand#ich
hingga men&apai batas dengan stac!ing gel sekitar 7,1 mm dari u!ung sisir
pen&etak sumur gel pada sta&king gel
7. "egera dimasukkan a9uades di bagian atas separating gel untuk
mendapatkan permukaan gel yang rata.
8. eparating gel didiamkan hingga men!adi padat.
9. "etelah separating gel padat, a9uades pada bagian atas dibuang.
10. 'ada stac!ing gel yang telah disiapkan, ditambahkan A'" -7: dan 5EMED
untuk memulai proses polimerasi.
11. "e&ara perlahan stac!ing gel dimasukkan ke gel sand#ich hingga penuh.
12. "isir pen&etak sumur diselipkan pada stac!ing gel se&ara berhatihati sampai
menyentuh bagian atas dari separating gel.
13. tac!ing gel didiamkan hingga men!adi padat (sekitar -1 menit)
14. "ambil menunggu gel memadat, sampel protein disiapkan. "ampel protein
diambil dalam !umlah yang setara (untuk protein murni minimal men&apai -
@g atau lebih) dan ditambahkan buffer sampel .6 (-7 @# sampel protein, -7
@# buffer sampel).
15. *ampuran sampel protein dididihkan selama 1A-7 menit. "ampel protein di
spin sebentar dan siap untuk dimasukkan ke dalam sumur gel
16. 'ada stac!ing gel yang sudah memadat, sisir pen&etak sumur ditarik dan
gelembung udara pada sumur dikeluarkan dengan menambahkan a9uades.
$el dikosongkan kembali.
17. $el sand#ich yang berisi gel siap pakai dimasukkan ke dalam chamber
elektroforesis dan chamber diisi dengan buffer elektroforesis hingga sumur
penuh.
18. "ampel protein dimasukkan menggunakan %amilton syringe sebanyak .7
# dan !uga marka protein
19. "D"'A$E dilakukan dengan tegangan -.7 ; selama - !am. $el hasil
elektroforesis selan!utnya di+arnai dengan merendam gel ke dalam staining
solution *oomasie blue selama -1 menit
20. "eterusnya gel didestaining untuk menghilangkan sisa staining.
V. DATA PEN'A+ATAN
V.1 Elekt"!"e#$# DNA
S,-," Sa-&el Pen(a-atan Ft Pen(a-atan
- Marka DNA 5erdapat enam pita
. Bontrol
negatif HB;
5idak terdapat pita
/ Bontrol positif
HB;
5erdapat satu pita
0 "ampel serum
penderita
5erdapat satu pita pada
posisi yang sama dengan
pita kontrol positif HB;
1 *airan A 5idak terdapat pita
2 *airan B 5idak terdapat pita
3 *airan * 5erdapat satu pita
berbeda dengan HB;
4 *airan D 5idak terdapat pita
Menurut data yang diberikan, DNA virus hepatitis B memiliki 277 base pair (bp).
Beterangan? *airan AD sebagai tambahan sa!a, tidak men!adi fokus per&obaan ini.
V.% Elekt"!"e#$# P"te$n
"ampel protein yang diberikan adalah interferon dengan berat molekul /.
kDa.
'ita
ke
Marka 'rotein &rude
Protein
'rotein
Murni
Coto 'engamatan
Berat
Molekul
,arak
migrasi
- --2 7,< &m 'ita yang
dihasilkan
banyak
sekali dan
rapat
sehingga
sulit diukur.
. &m
. 22,. -,. &m
/ 01 -,11 &m
0 /1 . &m
1 .1 .,11 &m
2 -4,0 /,-1 &m
3 -0,0 /,11 &m
VI. PEN'OLAHAN DATA
VI.1 Elekt"!"e#$# DNA
'ada elektroforesis DNA, pita DNA yang dihasilkan pada kontrol positif dan
sampel serum penderita hepatitis B berada pada !arak antara pita keempat dan pita
kelima dari ba+ah marka DNA. 'ita keempat dari ba+ah marka DNA
menun!ukkan DNA dengan 077 bp, sedangkan pita kelima dari ba+ah marka
DNA menun!ukkan DNA dengan 177 bp. 8leh karena itu, se&ara kualitatif,
diperkirakan DNA virus hepatitis B memiliki dengan 077177 bp.
..% Elekt"!"e#$# P"te$n
Ja"ak +$("a#$
/01
L( Be"at +lek,l
/21
7,< &m .,721
-,. &m -,4.-
-,11 &m -,21/
. &m -,100
.,11 &m -,/<4
/,-1 &m -,.21
/,11 &m -,-14
'ersamaan regresi? y D 7,/-7<6 E .,.-<1
,arak migrasi protein (interferon)D . &m
y D 7,/-7< (.) E .,.-<1
D -,1<33
Berat molekul interferon D antilog y
D antilog (-,1<33)
D /<,2 kDa
Berdasarkan persamaan di atas, berat molekul interferon adalah 345. kDa.
VII. PE+BAHASAN
'ada per&obaan ini, dilakukan elektroforesis DNA dan elektroforesis protein.
Elektroforesis merupakan metode untuk memisahkan DNA dan memisahkan
protein sesuai berat molekulnya dengan menggunakan medan listrik. Dalam
medan listrik, DNA yang bermuatan negatif dan protein yang diberi muatan
negatif akan bergerak ke arah kutub positif dengan la!u migrasi yang berbeda
sesuai berat molekul Fat tersebut. Elektroforesis ada dua ma&am yaitu?
a. Elektroforesis horiFontal
'ada elektroforesis ini, gel diletakkan se&ara horiFontal. 'ada per&obaan ini,
elektroforesis horiFontal digunakan untuk mengelektroforesis DNA.
b. Elektroforesis vertikal
'ada metoda ini, gel diletakkan se&ara vertikal. $el yang digunakan pada
elektroforesis vertikal lebih tipis dibandingkan elektroforesis horiFontal yaitu gel
poliakrilamid. 'ada per&obaan ini, elektroforesis vertikal digunakan untuk
mengelektroforesis protein.
VII.1 Elekt"!"e#$# DNA
Elektroforesis DNA merupakan elektroforesis horiFontal di mana la!u
migrasi ter!adi se&ara mendatar. "ebelum DNA dielektroforesis, DNA
diperbanyak dengan metode polymerase chain reaction ('*R). '*R ini
merupakan metode perbanyakan DNA se&ara enFimatik yang dilakukan se&ara in
'itro (di luar tubuh organisme). %ntuk melakukan '*R, diperlukan komponen
komponen yaitu?
a. DNA template yaitu DNA yang berfungsi sebagai &etakan. Dalam
per&obaan ini, DNA template yang digunakan adalah DNA virus hepatitis B.
Berikut ini adalah profil singkat virus hepatitis B.
Blasifikasi
Camili? Hepadnaviridae
$enus? 8rthohepadnavirus
"pe&ies? Hepatitis B ;irus
;irus hepatitis B memiliki kapsul lipid di
bagian luar dan nukleokapsid i&osahedral yang
tersusun atas protein. Nuklekapsid tersebut
melingkupi DNA virus dan DNA polimerase yang memiliki aktivitas
transkripsi balik. Materi genetik berupa DNA untai ganda yang ukurannya
tidak sama. %ntai yang pan!ang memiliki pan!ang /7.7//.7 nukleotida,
sedangkan untai yang pendek memiliki -377.477 nukleotida. Diameter
virus ini 0. nm. ;irus ini menginfeksi hati dan menyebabkan hepatitis.
b. La",tan 6,!!e", berfungsi untuk mempertahankan pH di sekitar 4. 'ada
pH yang asam, DNA bisa rusak. "elain itu, pH 4 !uga merupakan pH
optimum bagi enFim ta9 polimerase untuk beker!a.
&. P"$-e" P
1
dan &"$-e" P
%
yaitu primer "or#ard dan re'erse. 'rimer ini
berfungsi untuk membatasi daerah a+al dan akhir pada sekuens DNA yang
akan diamplifikasi.
d. Ta7 &l$-e"a#e yaitu enFim yang berperan dalam membuat untai DNA
baru dari &etakan DNA yang ada. 5a9 polimerase memiliki suhu optimum
37*. Akan tetapi, enFim yang berasal dari bakteri (hermus a)uaticus ini
bersifat termostabil sampai suhu <1*.
e. 8NTP (deo*ynucleoside triphosphate) merupakan bahan untuk proses
transkripsi (sebagai basa) serta berperan memberikan energi untuk proses
transkripsi.
f. La",tan +(Cl
%
, ion Mg
.E
berfungsi sebagai koenFim untuk meningkatkan
ker!a ta9 polimerase.
g. 88H
%
O (double distillated H
.
8) adalah air bebas gangguan ion sehingga
tidak mengganggu proses '*R !ika digunakan.
Bomponenkomponen tersebut ke&uali DNA template, dibuat sebagai master
mi* terlebih dahulu dengan komposisi seperti berikut ini.
N. K-&nen Vl,-e +a#te" -$9
- DNA template .,1 # 5idak dibuat master mi6
. Buffer -76 .,1 # 6 . 1 #
/ 'rimer '
-
-,.1 # 6 . .,1 #
0 primer '
.
-,.1 # 6 . .,1 #
1 ddH
.
8 -1,.1 # 6 . /7,1 #
2 #arutan Mg*l
.
-,1 # 6 . / #
3 dN5' 7,1 # 6 . - #
4 5a9 polimerase 7,.1 # 6 . 7,1 #
'ada kelompok praktikan, master mi* ini kemudian dibagi men!adi dua untuk
kontrol (kelompok kami menyiapkan kontrol negatif) dan sampel serum penderita
hepatitis B. Bomponenkomponen tersebut dibuat dalam master mi* dahulu untuk
memudahkan penger!aan. Dapat dilihat, !umlah yang dipakai untuk masing
masing komponen sedikit sehingga kurang praktis !ika memipet satu per satu
komponen tersebut sebanyak dua kali (satu untuk kontrol dan satu untuk serum).
%ntuk memipet komponenkomponen
dengan volume ke&il tersebut digunakan
mikropipet.
"etelah komponenkomponen tersebut
disiapkan dan &etakan DNA telah
dimasukkan ke dalam tube, sampel DNA
tersebut diperbanyak dengan '*R. 5ahap
tahap '*R?
1. Denat,"a#$ a:al
'roses ini dilakukan pada suhu <0* selama 1 menit. 5u!uan proses ini untuk
mengaktifkan enFim ta9 polimerase supaya segera memutuskan ikatan hidrogen
pada DNA.
.. Denat,"a#$
'roses ini dilakukan pada suhu <0* selama
- menit. 5u!uan proses ini adalah memastikan
semua DNA telah terdenaturasi (untai ganda DNA
telah lepas men!adi dua untai tunggal).
3. Pene-&elan &"$-e"
'roses ini dilakukan pada suhu 11* selama
- menit. 'ada tahap ini, dua primer akan
menempel pada bagian a+al dan akhir dari daerah
spesifik DNA yang akan direplikasi. 'rimer dapat menempel karena adanya gerak
Bro+n. 'rimer ini akan membentuk ikatan ionik yang dapat segera lepas dengan
untai tunggal DNA. Akan tetapi, pada primer yang menempel pada sekuens DNA
yang &o&ok, ikatan ini akan kuat.
4. Pe-an;an(an
'roses ini dilakukan pada suhu 3.* selama - menit. Dilakukan pada suhu
3.* karena enFim ta9 polimerase beker!a optimum pada suhu ini. 'ada tahap ini,
ta9 polimerase menyintesis untai DNA baru yang komplementer dengan &etakan
DNA dengan penambahan dN5'.
<. Pe-an;an(an akh$"
"etelah proses denturasi, penempelan primer, dan peman!angan ter!adi
sebanyak /1 siklus, proses peman!angan kahir ter!adi. 'roses ini dilakukan pada
suhu 3.* selama -7 menit. 'roses ini untuk memastikan semua DNA telah
berupa untai ganda kembali.
5eknik '*R ini dalam kehidupan seharihari digunakan untuk beberapa hal?
a. Diagnosis penyakit
Mesin PCR
'*R mempermudah dan memper&epat proses diagnosis penyakit, terutama
penyakit genetik. 'ada diagnosis penyakit, penderita dapat diambil sampel
serumnya untuk diteliti kandungan DNA virus penyebabnya sehingga dapat
diambil tindakan penanggulangan dengan &epat. %ntuk penyakit genetik, gen yang
diduga sebagai penyebab penyakit dapat direplikasi dengan primer yang sesuai,
kemudian dari hasilnya dapat dideteksi adanya gen yang termutasi.
b. Bidang forensik
5eknik forensik ini berguna untuk mengidentifikasi seseorang dengan
membandingkan DNA yang dimilikinya dengan sampel. 5eknik forensik berperan
untuk mela&ak tersangka suatu tindak kriminal dengan membandingkan sampel
dari tubuh tersangka dengan materi organik seperti rambut, darah, sidik !ari, dan
lainnya yang ditemukan di tempat ke!adian perkara. "elain itu, metode ini !uga
berguna untuk mengidentifikasi korban ben&ana alam atau kriminal yang mungkin
sudah tidak dapat dikenali se&ara fisik.
&. 5es keturunan
DNA menyimpan informasi genetik dan dapat di!adikan sarana untuk
mengidentifikasi hubungan genetik antara anak dan orang tuanya.
d. Bloning gen
Metode '*R digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA. "ekuens DNA
yang diperbanyak ini biasanya sekuens DNA yang memiliki manfaat tertentu.
'ada kloning gen, DNA dari satu organisme dapat diselipkan pada organisme lain.
Misalnya pada penyelipan gen pengkode insulin ke plasmid bakteri sehingga
bakteri tersebut dapat memproduksi insulin.
"etelah DNA diperbanyak dengan '*R, eletroforesis DNA dilakukan. 'ada
elektroforesis DNA ini, digunakan gel agarosa -:. Agarosa adalah polisakarida
linear dengan berat molekul sekitar -. 777 dan merupakan ekstrak rumput laut
yang &ukup rapuh. Agarosa ini dapat memisahkan DNA yang memiliki 17 pasang
basa sampai !utaan pasang basa dengan menggunakan alat khusus. Dalam
per&obaan ini, agarosa dibuat dengan konsentrasi -: karena !ika terlalu rendah
konsentrasinya, gel agarosa akan terlalu rapuh dan mudah han&ur. 'ada
konsentrasi yang terlalu tinggi, gel agarosa terlalu padat sehingga menghambat
migrasi DNA.
$el agarosa -: dibuat dengan melarutkan 7,0 gram serbuk agarosa dalam 07
m# 5AE (tris acetate ED5A) -6. #arutan agarosa dipanaskan untuk men&airkan
gel dan melepaskan ikatan antarmolekul agar memudahkan orientasi saat gel
membeku untuk membentuk polimer. "etelah gel agarosa membeku, gel agarosa
ditempatkan dalam chamber yang diisi buffer 5AE -6. Buffer 5AE -6 berfungsi
mempertahankan pH di daerah basa supaya DNA tidak rusak. Buffer 5AE !uga
berperan untuk menghantarkan listrik dengan baik sehingga sampel yang
dielektroforesis mendapatkan listrik yang homogen. 5AE memilki kapasitas buffer
yang rendah, tetapi menyediakan resolusi yang tinggi dalam pemisahan DNA.
"emua sampel DNA yang akan dielektroferesis ditambahkan loading bu""er.
+oading bu""er mengandung sukrosa (07: b>v) yang berfungsi sebagai pemberat
supaya saat elektroforesis DNA tetap berada d !alur dan tidak melayang. +oading
bu""er !uga mengandung bromfenol biru (7,-1: b>v) yang berfungsi untuk
memberi +arna pada DNA sehingga proses migrasinya mudah diamati.
DNA yang sudah diberi loading bu""er dimasukkan ke dalam sumur. "umur
pertama dimasukkan marka DNA. "umur kedua berisi kontrol negatif HB;.
"umur ketiga berisi kontrol positif HB;. "umur keempat berisi sampel serum
penderita hepatitis B. "umur kelima sampai kedelapan dimasukkan &airan&airan
lain. "etelah sampel dimasukkan, elektroforesis di!alankan pada tegangan 41 ;
selama - !am. DNA yang bermuatan negatif karena adanya gugus gulafosfat akan
bergerak ke kutub positif.
"etelah dielektroforesis, gel agarosa direndam dalam larutan etidium
bromida (EtBr) selama 1-7 menit. EtBr merupakan agen interkalasi yaitu
senya+a yang dapat masuk ke untai ganda DNA dan berikatan dengan basa yang
ada di DNA. EtBr akan memberi +arna pada pita DNA dan berfluorensi !ingga
kemerahan di ba+ah lampu %;. EtBr ini bersifat karsinogen sehingga
penggunaannya harus hatihati.
"etelah proses elektroforesis, dapat dilihat bah+a pada !alur pertama (marka
DNA) terbentuk enam pita. 5iga pita terba+ah halus sehingga tidak begitu tampak
pada foto pengamatan. "eharusnya, pita yang terbentuk dari marka DNA sebanyak
-. pita yaitu pita DNA yang memiliki -1-3 bp, -.77 bp, -777 bp, <77 bp, 477
bp, 377 bp, 277 bp, 177 bp, 077 bp, /77 bp, .77 bp, dan -77 bp. Akan tetapi, pada
hasil per&obaan, pita yang terbentuk tidak sampai -.. 'ita yang terbentuk
merupakan DNA dengan -77 bp, .77 bp, /77 bp, 077 bp, 177 bp, 277 bp. Hal itu
dapat disebabkan beberapa hal?
5egangan yang digunakan kurang sehingga pergerakan DNA terutama yang
bermolekul besar lambat
Gaktu elektroforesis kurang lama sehingga belum semua DNA terpisahkan
DNA bermolekul besar tertahan oleh poripori sel agarosa sehingga la!unya
lambat
'ada foto hasil pengamatan dapat dilihat pula bah+a pitapita yang terbentuk
bertumpang tindih menun!ukkan proses elektroforesis belum ber!alan sempurna.
5umpang tindih pita memnyebabkan kesulitan pengukuran.
'ada !alur kedua yang berisi kontrol negatif, tidak terdapat pita. Hal itu
menun!ukkan bah+a dalam kontrol negatif benarbenar tidak mengandung DNA
virus hepatitis B.
'ada !alur ketiga yang berisi kontrol positif, terdapat satu pita. 'ita ini berada
pada !arak di antara pita keempat dan pita kelima dari ba+ah marka DNA. Dari
hal ini, dapat ditentukan se&ara kualitatif bah+a DNA virus hepatitis B
diperkirakan memiliki 077177 bp. Menurut data yang diketahui, DNA virus
hepatitis B yang digunakan dalam per&obaan ini memiliki 277 bp. 'erbedaan
antara hasil per&obaan dengan yang seharusnya disebabkan oleh proses
elektroforesis yang belum ber!alan sempurna. Hal itu diindikasikan dengan belum
lengkapnya pita marka DNA.
'ada !alur keempat yang berisi sampel serum penderita hepatitis B, !uga
ditemukan satu pita pada posisi yang sama dengan pita kontrol positif. Hal ini
menun!ukkan bah+a dalam serum penderita hepatitis B terdapat DNA yang sama
dengan DNA pada kontrol positif yaitu DNA virus hepatitis B.
VII.% Elekt"!"e#$# P"te$n
Elektroforesis protein berguna untuk memmisahkan &ampuran protein.
Elektroforesis protein atau yang biasa disebut elektroforesis "D"'A$E ini
termasuk elektroforesis vertikal di mana la!u migrasi protein se&ara vertikal.
'rotein dengan berat molekul ke&il akan turun ke ba+ah (bermigrasi) lebih !auh.
'ada elektroforesis protein ini digunakan gel
poliakrilamid. 'orositas gel poliakrilamid ini lebih ke&il
dibandingkan sel agarosa. %kuran protein lebih ke&il
daripada ukuran DNA sehingga poripori media yang
digunakan pun harus lebih ke&il. $el poliakrilamid lebih fleksibel sehingga
menghasilkan pemisahan pitapita yang lebih !elas dan memiliki pH yang lebih
!elas dibandingkan sel agarosa.
$el poliakrilamid pada per&obaan ini terdiri dari dua bagian?
a. stac!ing gel 0:
tac!ing gel 0: merupakan tempat peletakan sampel. "e&ara umum, bahan
yang digunakan untuk membuat sta&king gel 0: dan separating gel -.: sama,
tetapi kuantitasnya berbeda. 'erbedaannya terdapat pada pH 5risH*l yang
digunakan. 'ada sta&king gel 0:, digunakan 5risH*l dengan pH 2,4. 5risH*l ini
berfungsi untuk men!aga pH sekitar sta&king gel sebesar 2,4. pH sebesar 2,4 dapat
memi&u ter!adinya reaksi ,ohlrausch yang menyebabkan protein terkonsentrasi
dalam beberapa pita tipis di a+al proses elektroforesis, hal ini tentu membantu
untuk mendapatkan hasil elektroforesis yang baik.
b. separating gel -.:
eparating gel -.: berfungsi men!adi !alur untuk proses pemisahan protein.
eparating gel -.: dibuat dengan 5risH*l pH 4,4 yang !uga berfungsi sebagai
buffer yang sesuai untuk pergerakan protein saat proses elektroforesis.
Baik stac!ing gel maupun separating gel mengandung "D" (sodium
dodeksil sulfat) yang berfungsi membantu melinearkan protein dan memberikan
muatan negatif pada protein sehingga gerakan protein dalam medan listrik &epat.
'ada akhir pembentukan gel, ditambahkan A'" -7: (ammonium persul"ate) dan
5EMED (tetrametiletilendiamin) yang berfungsi sebagai katalisator polimerisasi
akrilamid. Adanya perbedaan konsentrasi gel menghasilkan gradien yang berbeda.
Akrilamid
'ada proses pembuatan gel poliakrilamid, separating gel -.: dimasukkan
terlebih dahulu ke dalam gel sand#ich daripada stac!ing gel 0:. Berdasarkan
porositasnya, stac!ing gel 0: memiliki poripori yang lebih besar daripada
separating gel -.:. $radien konsentrasi ini menyebabkan pemisahan protein
yang bertahap sesuai ukuran pori mulai dari atas hingga bagian ba+ah gel
sehingga menghasilkan pita yang tipis.
"ampel protein yang akan dieletroforesis di&ampur dengan larutan "D". "D"
ini merupakan detergen anionik yang dapat mendenaturasi struktur sekunder dan
tersier pada protein sehingga bentuk protein men!adi linear. "D" !uga berfungsi
untuk memberikan muatan negatif yang sama ke semua protein dan membuat
gerakan protein dalam medan listrik &epat. 5anpa "D", protein dengan berat
molekul yang sama bisa memiliki !arak migrasi yang berbeda karena perbedaan
besar muatan. "ampel protein !uga diberi loading bu""er sebagai pemberat dan
me+arnai protein sehingga pergerakannya dapat diamati.
"ampel protein ini kemudian dimasukkan ke
dalam sumur elektroforesis. &hamber
elektroforesis diisi dengan buffer 5ris$lisin.
Buffer 5ris$lisin akan men!aga pH 3<.
Elektroforesis di!alankan pada tegangan -.7 ;
selama - !am.
"etelah dielektroforesis, gel poliakrilamid di+arnai dengan *oomasie blue.
*oomasie blue merupakan pe+arna anionik yang dapat terikat baik dengan
protein nonspesifik. "etelah distaining selama -1 menit, gel poliakrilamid di
destaining. 'ita protein akan tetap ber+arna biru.
Bomposisi staining solution?
- g *oomasie blue R.17
017 m# metanol
017 m# a9uadest
-77 m# asam asetat glasial
Bomposisi destaining solution ?
47: (v>v) a9uades
-7: (v>v) metanol
-7: (v>v) asam asetat glasial
Berdasarkan hasil elektroforesis protein, marka protein menghasilkan tu!uh
pita sesuai ketentuan. 'ita yang berada di paling ba+ah (paling !auh dari sumur)
Elektroforesis Protein
merupakan protein yang berat molekulnya terke&il yaitu -0,0 kDa. 'rotein dengan
berat molekul ke&il akan memiliki la!u migrasi yang &epat. Hal ini dikarenakan
dengan berat molekul yang ke&il dan ukuran yang ke&il, protein tersebut dapat
mele+ati poripori gel poliakrilamid dengan mudah dan tidak tertahan.
Hasil elektroforesis pada crude protein menun!ukkan banyak sekali pita
sehingga sulit diukur. Banyaknya pita tersebut menun!ukkan banyaknya &ampuran
protein dengan berat molekul yang berbedabeda pada sampel crude protein.
Hasil elektroforesis untuk protein murni hanya menun!ukkan satu pita.
'rotein murni adalah protein yang sudah mengalami permunian sehingga hanya
mengandung satu se!enis protein sa!a, dalam hal ini interferon. Menurut data yang
diketahui, interferon yang kami u!i ini memiliki berat molekul /. kDa. Akan
tetapi, hasil perhitungan berdasarkan data pengamatan menun!ukkan berat
molekul protein interferon tersebut /<,2 kDa. Berat molekul interferon hasil
perhitungan lebih berat daripada seharusnya mungkin dikarenakan beberapa hal?
'ada proses pemurnian protein, dilakukan penambahan histidin dan senya+a
lainnya. "enya+asenya+a ini mungkin masih melekat pada interferon
tersebut sehingga menambah berat molekulnya.
'ada proses elektroforesis, dilakukan penambahan loading bu""er yang
berfungsi sebagai pemberat. Hal ini !uga mungkin yang men!adi penyebab
interferon hasil per&obaan lebih berat molekulnya daripada /. kDa.
Berdasarkan hasil per&obaan, terlihat bah+a ada faktorfaktor yang
mempengaruhi ke&epatan migrasi DNA dan protein?
a. Berat molekul
Molekul yang memiliki berat molekul ke&il memiliki !arak migrasi lebih !auh
karena dengan mudah mele+ati pori dan tidak tertahan oleh matriks gel.
b. 'orositas media
Media dengan poripori besar akan memper&epat migrasi. 8leh karena itu,
dalam melakukan elektroforesis, poripori media harus disesuaikan dengan ukuran
molekul yang dielektroforesis. ,ika poripori terlalu besar, senya+a tersebut akan
lolos dengan mudah dan pemisahan gagal. ,ika poripori terlalu ke&il, senya+a
akan terlalu tertahan sehingga pemisahan !uga tidak ber!alan baik.
&. 5egangan listrik
'ada umumnya, !ika tegangan besar, la!u migrasi akan semakin &epat.
d. Caktor lain
Caktor lain tersebut bisa sa!a gaya gravitasi. Elektroforesis vertikal lebih
&epat daripada elektroforesis horiFontal mungkin karena dibantu gaya gravitasi.
Dalam kehidupan seharihari, elektroforesis digunakan untuk berbagai
kepentingan seperti mengidentifikasi DNA dan protein, mengisolasi dan
memurnikan senya+a organik, menentukan silsilah berdasarkan kesamaan
genetik, dan menentukan pasangan basa dalam DNA yang mengkode senya+a
tertentu, seperti insulin.
VIII. KESI+PULAN
Hasil elektroforesis DNA menun!ukkan kontrol negatif HB; tidak terdapat
pita. 'ada kontrol positif HB; dan sampel serum penderita hepatitis B,
terdapat satu pita yang sama !arak migrasinya.
Barena marka DNA tidak !elas !arak migrasinya, banyaknya pasang basa dari
DNA virus hepatitis B tidak dapat dihitung. "e&ara kualitatif, DNA virus
hepatitis B diperkirakan memiliki 077177 bp (seharusnya 277 bp).
Hasil elektroforesis crude protein menimbulkan banyak pita yang
menun!ukkan banyaknya &ampuran protein berbeda berat molekul di
dalamnya. Hasil elektroforesis protein murni menimbulkan hanya satu pita
menun!ukkan hanya terdapat satu !enis protein dengan berat molekul tertentu,
yaitu interferon.
Berat molekul interferon berdasarkan hasil per&obaan adalah /<,2 kDa
(seharusnya /. kDa).
I0. DAFTAR PUSTAKA
Bla&k, ,a&9uelyn $. .774. Mi&robiology. "eventh edition. Asia? ,ohn Giley H
"ons. Halaman .7/.70.
Madigan, Mi&hael 5. dan ,ohn M. Martinko. .772. Bro&k Mi&robiology of
Mi&roorganism. %"A? 'renti&e Hall. Halaman -44-4<, /30/33.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>'olymeraseI&hainIrea&tion. 5anggal akses -.
Desember .774 pukul .-?/4.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>5a9Ipolymerase. 5anggal akses -. Desember pukul
..?17.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>$elIele&trophoresis. 5anggal akses -. Desember
pukul ..?1<.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>AgarosaIgel. 5anggal akses -/ Desember .774 pukul
3?04.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>"D"I'A$E. 5anggal akses -. Desember .774 pukul
..?-7
http?>>+++.&hemistry.org>Jse&tDartikelHe6tD-41. 5anggal akses -/ Desember
.774 pukul -1?07.
http?>>en.+ikipedia.org>+iki>DnaItesting. 5anggal akses -/ Desember .774 pukul
-1?0..
http?>>nationaldiagnosti&s.&om>arti&leIinfo.php>arti&lesIid>-7. 5anggal akses -1
Desember .774 pukul -2?/-.
0. LA+PIRAN
1=.1 P"te$n
'rotein memiliki empat struktur yaitu?
a. 'rotein primer yaitu protein yang ter!adi karena adanya
ikatan kovalen antar asam amino membentuk sekuens asam amino yang
linear.
b. 'rotein sekunder yaitu protein yang ter!adi karena adanya
ikatan hidrogen yang menstabilkan interaksi antar protein primer,
membentuk heli* dan sheet.
c. 'rotein tersier merupakan interaksi antar protein sekunder
yang diperkuat oleh ikatan ionik, ikatan dipoldipol, ikatan van der Gaals,
dan ikatan disulfida.
d. 'rotein kuartener, hasil interaksi lebih dari satu molekul
protein atau rantai peptida yang saling berikatan.
Denaturasi dimulai dari han&urnya struktur protein kuartener membentuk
protein tersier. Denaturasi menyebabkan ikatan disulfida, ikatan van der Gaals,
dan ikatan lainnya putus. Bemudian, ikatan hidrogen pun hilang menyebabkan
pola pengulangan heli* dan sheet tidak dapat dipertahankan. "aat
terdenaturasi, bentuk protein yang ada adalah protein primer.
1=.% Te# DNA
DNA (deo*yribonucleic acid) merupakan asam nukleat yang menyimpan
semua informasi tentang genetika. DNA inilah yang menentukan !enis rambut,
+arna kulit dan sifatsifat khusus dari manusia. DNA ini akan men!adi &etak biru
(blueprint) &iri khas manusia yang dapat diturunkan kepada generasi selan!utnya.
Bomposisi DNA seorang anak akan sama dengan tipe DNA yang diturunkan dari
orang tuanya.
5es DNA adalah metode untuk mengidentifikasi fragmenfragmen dalam
DNA. DNA yang dipakai dalam tes DNA ada dua yaitu DNA inti sel dan DNA
mitokondria. DNA =nti sel memberikan hasil yang lebih akurat dibandingkan
DNA mitokondria. DNA inti sel tidak berubah, sementara DNA mitokondria ada
kemungkinan berubah karena berasal dari garis keturunan ibu yang dapat berubah
seiring perka+inan keturunannya.
%ntuk tes DNA, dapat dilakukan dengan metode elektroforesis DNA.
5ahapan pertama dari tes DNA adalah preparasi sampel meliputi pengambilan
atau isolasi sampel DNA dan pemurnian DNA. %ntuk sampel darah, dalam isolasi
DNAnya digunakan bahan kimia phenolchloro"orm dan untuk sampel rambut
dapat digunakan bahan kimia &hile*. "etelah itu, DNA dimurnikan dari kotoran
kotoran seperti protein, sel debris, dan lain lain. Metode pemurnian biasanya
digunakan teknik sentrifugasi dan metode sentrifugasi vakum. 5eknik ini mulai
ditinggalkan oleh beberapa ilmu+an dan beralih ke produkproduk pemurnian
yang telah dipasarkan seperti produk butir magnet dari 'romega *orporation yang
memanfaatkan silica-coated paramagnetic resin yang memungkinkan metode
pemisahan DNA yang lebih sederhana dan &epat.
5ahapan selan!utnya adalah amplifikasi atau perbanyakan DNA dengan
metode '*R. DNA yang telah diperbanyak diu!i dengan elektroforesis untuk
melihat pola pitanya. Barena urutan DNA setiap orang berbeda, !umlah dan lokasi
pita DNA (pola elektroforesis) setiap individu !uga berbeda. 'ola pita inilah yang
disebut DNA sidik !ari (DNA "inger print) yang akan dianalisa pola "5Rnya.
"5R (short tandem repeats) adalah lokus DNA yang tersusun atas pengulangan .
2 basa. Dalam genom manusia dapat ditemukan pengulangan basa yang bervariasi
!umlah dan !enisnya. Dengan menganalisa "5R ini, DNA tersebut dapat
diprofilkan dan dibandingkan dengan sampel DNA terduga lainnya.
5ahap terakhir adalah typing, proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipe
DNA. Mesin '*R akan memba&a datadata dari DNA dan menampilkannya
dalam bentuk angkaangka dan gambat identifikasi DNA. "elan!utnya, tipetipe
DNA di&o&okkan.
Metode tes DNA yang terbaru adalah dengan menggunakan kemampuan
partikel emas berukuran nano untuk berikatan dengan DNA. Metode ini
ditemukan oleh dua orang ilmu+an Amerika "erikat yaitu Hui6iang #i dan #e+is
Rothberg. 'rinsip metode ini adalah mempergunakan untai pendek DNA yang
disebut Probe yang telah diberi Fat pendar. Probe ini diran&ang spesifik untuk gen
sampel tertentu dan hanya akan menempel dengan DNA sampel tersebut. 'artikel
emas berukuran nano dalam metode ini berperan dalam mengikat Probe yang
tidak terhibridasi. 'endeteksian dilakukan dengan penyinaran pada pan!ang
gelombang tertentu. Beberadaan DNA yang sesuai dengan DNA Probe dapat
dilihat dari pendaran sampel tersebut. ,umlah DNA target tersebut kirakira
berbanding lurus terhadap intensitas pendaran sinar yang dihasilkan. Beunggulan
metode ini dibandingkan dengan metode konvensional adalah pada ke&epatan dan
harganya yang !auh lebih &epat dan murah dibandingkan metode elektroforesis
DNA. Metode ini masih dikembangkan.
LAPORAN PRAKTIKU+ +IKROBIOLO'I FAR+ASI
PERCOBAAN V
PENETAPAN RESPON +IKROBA TERHADAP >AT ANTI+IKROBA
/A+PISILLIN TERHIDRAT1
PERCOBAAN VI
ELEKTROFORESIS DNA DAN PROTEIN
D$#,#,n leh:
R$6kah 1=?=?=<.
S,*$ Hen8"$na 1=?=?=<4
K#a#$h L"en*$a 1=?=?=.%
An$#a A&"$l$a 1=?=?=.<
A8el$a Pa,l$na 1=?=?=.@
A#$#ten:
R$a Natal$a
LABORATORIU+ +IKROBIOLO'I FAR+ASI
PRO'RA+ STUDI SAINS DAN TEKNOLO'I FAR+ASI
SEKOLAH FAR+ASI
INSTITUT TEKNOLO'I BANDUN'
%==@