DETERMINAREA CARIOTIPULUI UMAN

Cariotipul reprezint numrul i morfologia (forma i dimensiunile) cromosomilor n

metafaz1 i este o caracteristic de specie (fiecare specie avnd un anumit numr de cromosomi i cu
o anumit morfologie).
Determinarea cariotipului uman se face pentru diagnosticul citogenetic al unor boli
genetice care au drept cauz anomalii cromosomiale numerice sau/i structurale. Acesta se poate
determina postnatal din limfocitele din snge, n baza prezenei la cazul respectiv a unor semne i
simptome clinice depistate de medic2 (malformaii, retard psihic, tulburri neuromotorii, tulburri
endocrinometabolice etc.), sau prenatal, doar la persoanele care aparin grupelor aflate la risc 3 (la
mamele cu sarcina la o vrst mai mare de 35 de ani, la mamele care au mai nscut copii/fei cu
anomalii cromosomiale) sau la cerere. Determinarea se face n laboratoare specializate n explorri
genetice de ctre medicul specialist n genetic medical sau de un biolog cu competen n
citogenetic.
Determinarea postnatal a cariotipului se face din limfocitele din snge ale cazului la care
s-a pus un diagnostic prezumtiv de anomalie cromosomial, dup urmtorul protocol:
1. Recoltarea sngelui: se recolteaz 5 ml de snge venos periferic pe un anticoagulant (heparina,
EDTA etc.);
2. Sedimentarea eritrocitelor: se sedimenteaz eritrocitele, fie n cmp gravitaional (timp de 60
min.), fie prin centrifugare (8 min. la 1000 rpm); la baza eprubetei se vor depune hematiile (roii),
deasupra rmne plasma bogat n leucocite (un lichid glbui), iar la limita dintre eritrocite i plasm
se poate observa un strat subire de leucocite;
3. Inocularea leucocitelor: plasma bogat n leucocite sau stratul subire de leucocite prelevate cu o
pipet se inoculeaz n flacoane cu medii de cultur pentru celule care conin nite glicoproteine
vegetale numite fitohemaglutinine care au rol n stimularea diviziunii celulare;
4. Incubarea: flacoanele se incubeaz n termostat la 37C timp de 72 h, timp n care limfocitele,
care se divid cel mai repede, vor deveni majoritare;
5. Blocarea mitozelor limfocitelor n metafaz: se scot flacoanele de la incubaie i se adaug
colchicin (extras din Colchicum autumnale brndua de toamn), care blocheaz formarea
fusului de diviziune prin inhibarea polimerizrii tubulinei; n acest fel o mare parte din limfocitele
aflate n diviziune sunt blocate n metafaz, cu cromosomii formnd placa ecuatorial i fr s mai
prezinte nveli nuclear;
6. Separarea limfocitelor din mediul de cultur: se separ celulele din mediile de cultur prin
centrifugare i apoi se supun aciunii unui mediu hipoton i cu fixatori;
7. Etalarea cromosomilor pe lam: suspensia de celule se picur cu o pipet de la o nlime de 25
30 cm pe o lam de microscopie optic scoas de la frigider (rece, la 4C); ocul mecanic, ocul
termic i cel osmotic, datorate cderii pe lama rece a celulelor deja umflate i cu membrana fragil
datorat mediului hipoton, vor determina ruperea plasmalemei multor limfocite blocate n metafaz,
iar cromosomii metafazici se vor etala pe lam; n fiecare mitoz se vor etala 46 de cromosomi
metafazici avnd cte 2 cromatide;
8. Colorarea cromosomilor: exist mai multe metode de colorare a cromosomilor pe lam:
a. metoda Giemsa poate fi de dou feluri: - simpl, fr bandare, caz n care cromosomii metafazici
avnd 2 cromatide se coloreaz uniform cu colorant Giemsa n albastru-violet; - cu bandare (metoda
de bandare G), constnd mai nti n digerarea parial a structurii proteice a cromosomilor (o parte
din proteinele nehistonice ale eafodului cromosomilor) cu o proteaz (de ex. tripsina), urmat de
colorarea cu colorant Giemsa; se obin benzi luminoase i ntunecate alternative pe braele
cromosomilor, numite benzi G, care sunt specifice fiecrei perechi de cromosomi, colorai n
albastru-violet;
b. metoda de bandare invers sau bandarea R 4 n care se folosete o alt metod de colorare,
1

stabilit prin convenie internaional pentru a se putea face o comparaie ntre cazuri ; se pot studia i cromosomi din
anafaz, cu o morfologie puin modificat fa de cromosomii metafazici;
2
medicul specialist n pediatrie, neonatologie, neurologie/psihiatrie pediatric, genetic medical, endocrinologie,
medicin intern, medicin de familie etc;
3
care prezint un risc semnificativ crescut de a avea copii cu anomalii cromosomiale fa de populaia general;
4
R de la engl. reverse = invers.
1

benzile R obinute avnd o dispoziie invers benzilor G/Q, adic unei benzi ntunecate R i-ar
corespunde o band luminoas G/Q i invers (un negativ al benzilor G/Q);
c. metoda bandrii Q5, cromosomii fiind colorai cu fluorocromul chinacrin, se obin pe braele
cromosomilor benzi fluorescente de culoare galben verzuie sau portocalie, numite benzile Q; de
notat c ntre benzile G sau R, pe de o parte, i benzile Q, pe de alta, nu exist coresponden;
9. Examinarea cromosomilor la microscop i aranjarea acestora n fia de cariotip: se
examineaz lama la microscopul optic n imersie (n cazul bandrii Q examinarea se realizeaz la
microscopul de fluorescen combinat cu tehnica n imersie, folosind un ulei de imersie sintetic
nefluorescent), se fotografiaz (preferabil n alb-negru) cele mai bine etalate mitoze, se mrete
fotografia, se identific i se decupeaz fiecare cromosom i se aranjeaz cromosomii n perechi n
fia de cariotip, n ordinea invers a mrimii; la om vor rezulta, n mod normal, 23 de perechi de
cromosomi (46 cromosomi dicromatidici), aranjai n 8 grupe (de la grupa A la grupa G);
actualmente, aranjarea se poate face i prin ordonarea computerizat a cromosomilor.
Prin aceast tehnic se poate realiza diagnosticul citogenetic al unor anomalii cromosomiale
numerice ale cromosomilor autosomi (sindromul London Down sau trisomia 21 etc.) sau sexuali
(sindromul Turner, sindromul Klinefelter etc.), precum i a unor anomalii structurale (rupturi
cromosomiale, cromosomi inelari, cromosomi cu forme bizare etc.). Mai recent s-au dezvoltat i
tehnici de bandare cu rezoluie foarte mare, n care se pot identifica (cu ajutorul calculatorului) zeci
de benzi pe un singur bra al cromosomului, fcnd posibil diagnosticul unor boli genetice cu o
acuratee mult mai bun (incluznd identificarea unor mutaii specifice anumitor boli).
Diagnosticul prenatal al anomaliilor cromosomiale se face, fie prin examinarea celulelor
amniotice n urma recoltrii prin amniocentez (puncie ecoghidat de lichid amniotic) a 15 ml de
lichid amniotic coninnd celulele descuamate de pe ectodermul ftului (amniocite) , fie prin
examinarea celulelor fetale recoltate din puncia vilozitilor coriale placentare. Celulele recoltate
ntodeauna de la ft, se vor cultiva pe medii de cultur, respectnd metodologia descris la
determinarea postnatal a cariotipului. Examinarea se indic doar la cazurile aflate la risc (n cazul
unor unor sarcini la mame cu vrste de peste 35 de ani sau la mamele nsrcinate care au mai avut
copii sau fei cu anomalii cromosomiale), dar se poate face i la cerere. Aceasta se face n
sptmnile 12 16 de sarcin, dar n cazul punciei vilozitilor coriale se poate face cu 3 4
sptmni mai devreme, lucru extrem de important pentru momentul n care se ofer sfatul genetic
de ctre medicul specialist n genetic medical sau obstetric ginecologie. Multe dintre aceste boli
evolueaz cu avorturi spontane, dar alte cazuri cum sunt anomaliile numerice ale cromosomului X
sau al sindromului London Down sunt compatibile cu viaa. Tabloul clinic al cazurilor viabile este
foarte variat incluznd malformaii, tulburri neuromotorii, tulburri endocrinometabolice i nu n
ultimul rnd retard psihic de grade diferite. Considernd faptul c din momentul recoltrii probei
pn la cel al stabilirii unui diagnostic trec, n medie, dou sptmni, iar prinii, n multe cazuri
fiind la prima sarcin, au nevoie de timp ca s decid oprirea sarcinii prin avort terapeutic sau
continuarea acesteia cu riscul asumat pentru viitorul copil, este important ca aceast examinare s fie
realizat la o vrst a sarcinii ct mai mic posibil i cu maxim acuratee.
Tehnica F.I.S.H. (Fluorescence In Situ Hybridisation) sau hibridizarea fluorescent in situ,
este o metod de citogenetic mai avansat dect tehnicile clasice de bandare a cromosomilor.
Metoda se bazeaz pe cunoaterea n prealabil a secvenei ADN din toi cromosomii umani
(identificai prin proiectul Human Genome) i sinteza unor oligonucleotide (alctuite din 20 30 de
nucleotide) complementare unor fragmente din secvena de ADN cromosomial. Dup etalarea
cromosomilor pe lam prin tehnica descris anterior, se denatureaz ADN-ul prin nclzirea
preparatului cromosomial, iar lanul dublu catenar de ADN se desface, urmat de adugarea acestor
fragmente oligonucleotidice (numite i probe) care se leag de fragmente complementare specifice de
pe moleculele de ADN, realizndu-se hibridizarea ADN-ului cromosomial. Probele sunt n prealabil
marcate fluorescent cu fluorocromi specifici fiecrui tip de prob. Se ndeprteaz excesul de probe i
se examineaz preparatul la microscopia de fluorescen n imersie. Se poate observa fiecare pereche
de cromosomi n alt culoare, uurnd mult identificarea acestora pentru identificarea anomaliilor
cromosomiale numerice sau structurale. n cazul realizarii bandrii prin metoda F.I.S.H., se pot
identifica boli genetice care au la baz leziuni la nivelul ADN-ului cu o acuratee mult mai mare. De
5

Q de la engl. quinacrine = chinacrin.

2

exemplu, se poate identifica localizarea unor mutaii pe braele cromosomilor care pot fi de tip deleie
(lipsa unui fragment de ADN), inseie (un fragment n plus), inversie (fragment cu secvena
inversat) sau translocaie (modificarea poziiei unui fragment de ADN, fie pe acelai cromosom pe
care trebuia sa fie n mod normal, fie pe altul).
Preparatul de examinat la lucrarea practic: studiul cromosomilor metafazici din
limfocitele umane (folosind tehnica determinrii postnatale a cariotipului, descris anterior), colorare
prin tehnica de bandare Giemsa, examinare la microscopul optic n imersie (Ob 100x). Se observ
etalai, alturi de limfocite nesparte, cromosomii metafazici, de diferite mrimi, cu cte 2 cromatide,
provenii n urma ruperii plasmalemelor unor limfocite blocate n metafaz, n numr de 46 pentru
fiecare mitoz, colorai n albastru-violet.