Professional Documents
Culture Documents
Replicarea bidirecional a
fost pentru prima dat pus n eviden prin intermediul audioradiografiei. Studiile de microscopie
electronic au demostrat existena
ochilor sau buclelor lucru care
dovedete implicit posibilitatea replicrii bidirecionale.
formeaza un trimer un inel asemeni subunitilor din polimeraza III a E.coli) i (rol
neelucidat n replicarea ADN-ului).
ncheierea replicrii se face prin intermediul situsurilor de terminare (Ter), poriuni de circa 23 pb, care permit trecerea furcii de replicare numai ntr-o singura direcie.
Situsurile Ter foreaza cele dou furci de replicare s se ntlneasc numai ntr-un anumit
punct. La aceste situsuri se leag o protein monomer (Tus, M 35 KDa), proteina care
se leag Dna B (helicaza), inhibnd astfel procesul de desfacere a ADN-ului duplex.
Digestia enzimatic
Endonucleazele de restricie sunt enzime bacteriene ce recunosc specific anumite
secvene de ADN dublu catenar i cliveaz ambele catene n interiorul sau n apropierea
situsului de recunoatere. Lungimea enzimelor de restricie este variabil (ntre 150 AA
la PvuII i 1250 AA la CjeI). Enzimele de restricie protejeaz bacteriile fa de infeciile
virale, avnd astfel rolul unui sistem imunitar microbian. n lipsa enzimei de restricie la
E coli, aceasta sufer o infecie viral rapid. Enzimele de restricie sunt prezente n
combinaie cu una sau dou enzime de modificare (ADN-metiltransferaze), care protejeaz celula mpotriva clivrii propriului ADN de ctre enzima de restricie cu care acesta se
asociaz. Enzimele de modificare recunosc acelasi situs catalitic asemeni enzimei de
restricie pe care o nsoesc, dar n loc de clivare, acestea metileaz una din bazele azotate
la fiecare caten. Gruparile metil ptrund n adncitura major a ADN-ului la nivelul
situsului de restricie. Enzima de restricie mpreun cu enzimele de modificare formeaz
mpreuna un sistem de restricie i modificare (R-M). n anumite sisteme cele dou
enzime acioneaz independent una fa de cealalt. n alte sisteme, cele dou
componente se prezint sub forma a dou subuniti separate, ale unei enzime mai mari,
ce combin ambele activiti catalitice (de restrictie i de modificare).
Enzimele de restricie sunt clasificate n funcie de compoziia subunitii de
clivare, a situsului de restricie, a specificitii secvenei i a cofactorilor necesari. Enzimele care fac parte din prima categorie sunt enzimele de tip I, care conin subuniti
multiple care se prezint sub forma de combinaii R-M i care taie ADN-ul aleator fa de
secvenele de recunoatere. n categoria enzimelor de tip II se gsesc enzime care taie
ADN-ul n apropierea sau n interiorul secvenei de recunoatere. Aceasta genereaz
fragmente de restricie discrete, fragmente care migreaz diferit n geluri de agaroz
(electroforez orizontal) fa de cel neclivat. Cele mai cunoscute enzime de tip II sunt
HhAI, HindIII, Not I, care taie n interiorul secvenei de recunoatere. Enzimele de acest
tip sunt cele mai des utilizate. De exemplu, enzima NotI recunoate urmtoarea secven:
5-GCGGCCGC-3
3-CGCCGGCG-5
NotI taie ADNul uman n medie la fiecare 10 Mb.
Majoritatea enzimelor de restricie de tip II recunosc secvene de ADN care sunt
simetrice deoarece ele se cupleaz la ADN sub forma de dimeri, n timp ce unele se
cupleaz sub forma de heterodimeri deoarece recunosc secvenele de ADN asimetrice
(BbvCI). Unele recunosc secvene continue (EcoRI-GAATTC), n care cele dou
jumati de recunoatere sunt adiacente, n timp ce altele recunosc secvene discontinue
(Bgl I recunoate secvena GCCNNNNNGGC) n care cele dou situsuri sunt separate.