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FRANCISCO DE MIRANDA
REA CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA
U.C. MICROBIOLOGA I
MANUAL DE TRABAJOS
PRCTICOS DE MICOLOGA
MDICA
REALIZADO POR: Profa. LEYLA HUMBRA DE HEYLIGER
8. Los cultivos de hongos deben ser sellados con cinta adhesiva para evitar la
contaminacin del laboratorio y deben ser esterilizados en autoclave o bien
Microscopio ptico
consecuencia,
al
terminar
cada
prctica
se
proceder
limpiar
material biolgico
2. Antes de realizar una actividad prctica, el alumno debe haber ledo con
anterioridad el material correspondiente a la misma. No comience a trabajar
hasta que no haya entendido con claridad las instrucciones. Ante cualquier duda
consulte al profesor.
3. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y
mecanismos.
Microscopio ptico
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
Microscopio ptico
denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos
se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el
nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms
intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de
Microscopio ptico
que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas,
Figura
1:
Partes
de
un
microscopio
ptico.
http://cienciasept.blogspot.com/2008/09/caza-de-tesoros-1.html
a. Tubo: Soporta la parte ptica, tiene una longitud variable, segn el fabricante, en
su parte superior se encuentra el ocular y en la inferior el revlver con la serie de
objetivos.
Microscopio ptico
b. Columna o Brazo: Une el tubo con el pie, sta es la parte por la que se debe
tomar el microscopio para transportarlo.
c. Revlver: Es el extremo inferior del tubo donde estn colocados los objetivos
tienen movimientos de rotacin alrededor de su eje.
d. Platina: Sobre ella son colocadas las preparaciones. Es plana y presenta un
orificio central que permite el paso de los rayos luminosos, posee pinzas que aseguran
la inmovilidad de las preparaciones y un carro provisto de dos tornillos para
desplazarlas en direccin lateral y antero-posterior, con lo cual se logra visualizar toda
la preparacin.
e. Tornillo Macromtrico: Mueve la platina hacia arriba y hacia abajo.
f. Tornillo Micromtrico: Permite enfocar con precisin.
g. Pie: Sirve de base al microscopio y tiene el peso suficiente para dar estabilidad
al aparato.
Parte ptica: Constituida por:
a. Fuente de luz: Puede ser un espejo mvil con dos caras: una plana que se
utiliza para la iluminacin con luz solar y otra convexa para luz artificial. Su funcin es
dirigir los rayos luminosos hacia el eje ptico.
b. Condensador: Se encuentra colocado exactamente en el eje ptico del
microscopio, su finalidad es condensar la luz en un punto sobre la platina, donde va a
ser colocado la preparacin. Est constituido por un diafragma-iris para controlar la
cantidad y el ngulo de los rayos luminosos y por un sistema de lentes. Posee un
aparato enfocador, que consiste en un pin y una cremallera, que permiten bajar y
subir el condensador.
c. Objetivos: Son tubos que contienen en su interior un sistema de lentes de
diferentes aumentos, adems genera una imagen real e invertida del objeto. Los
Microscopio ptico
microscopios suelen tener 3 o 4 objetivos colocados en la parte inferior del tubo. Los
d. Ocular: Es una lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del
objetivo. Su misin es captar y ampliar la imagen proporcionada por los objetivos. Un
microscopio puede tener uno o varios oculares: monocular, binocular o trilocular.
Actualmente se utilizan los binoculares porque son ms cmodos y tienen mejor
calidad de imagen.
Manejo del Microscopio ptico
1. Ajustar la iluminacin del campo de tal forma que ste quede bien iluminado,
para lo cual se coloca el objetivo de menor aumento, se abre todo el diafragma-iris y se
sube totalmente el condensador.
2. Montar la preparacin sobre la platina, fijarla de tal modo que el centro de la
preparacin coincida con el orificio central de la platina por donde pasarn los rayos
luminosos.
3. Observar lateralmente y con el tornillo macromtrico, bajar el tubo hasta que el
objetivo de menor aumento quede muy cerca de la preparacin.
4. Observar por el ocular, subir lentamente el tubo con el tornillo macromtrico
hasta que aparezca la preparacin y aclarar la imagen con el tornillo micromtrico. Si
una vez obtenida la imagen, la iluminacin es muy intensa, sta puede disminuirse
cerrando el diafragma-iris del condensador hasta que su margen sea igual al tamao
del lente posterior del objetivo. Con los objetivos secos, el condensador debe estar
abajo y el diafragma no muy abierto.
5. Al encontrar una parte del campo que merezca mayor anlisis de detalles, se
cambiar para un aumento mayor de la siguiente manera:
a. Centrar en el campo la parte que desea estudiar, ya que al cambiar el
del mismo.
b. Girar el revlver hasta que el objetivo de mayor aumento seleccionado quede
en la posicin indicada.
Microscopio ptico
Microscopio ptico
OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.
Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de cultivo en
placa y en tubo.
Sealar los pasos para realizar un microcultivo.
Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire
agua y tierra.
MEDIO DE CULTIVO
a. Lquidos
b. Slidos
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Los medios lquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne picada
en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no llevan ninguna
solucin solidificante. Contienen protenas, factores esenciales de crecimiento y
oligoelementos. A estos medios se les pueden aadir otros nutrientes como peptonas y
glucosa as como cloruro de sodio y un tampn de pH.
Los medios slidos estn constituidos por un medio lquido ms una solucin
gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullicin, que los solidifica.
Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas ltimas son recipientes de
vidrio o plstico transparente con una tapa y ofrecen una gran superficie para la
siembra.
a. Bsicos
b. Complejos
Los medios bsicos contienen las sustancias mnimas para el crecimiento de
hongos metablicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo si se
quieren slidos o lquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben poseer un pH y
una osmolaridad adecuada para la multiplicacin de los hongos. Estos medios tambin
pueden ser utilizados como base en la preparacin de otros medios como los
enriquecidos, selectivos, entre otros.
Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores esenciales
especficos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos exigentes en
requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios bsicos.
Segn su finalidad:
Microscopio ptico
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asegurar el desarrollo
de
nitrgeno,
vitaminas,
Microscopio ptico
medio estndar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden
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Microscopio ptico
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Microscopio ptico
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HONGO FILAMENTOSO
HONGO LEVADURIFORME
Colonia
COLOR
Reverso
Pigmento del medio
TAMAO DE LA COLONIA
Dimetro
Aterciopelada,
ASPECTO
algodonosa,
Cremosa
pulverulenta
CARACTERSTICAS
MICROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
SEPTADO
ASEPTADO
SEPTADO
ASEPTADO
HIALINO
MICELIO
HONGO LEVADURIFORME
DEMATIACEO
GRUESO
OBSERVACIN DE
BLASTOCONIDIAS,
SEUDOHIFAS Y
CLAMIDOSPORAS
DELGADO
PRODUCCIN, TAMAOY
DISPOSICIN DE LAS
CONIDIAS
DEPENDIENDO DE LA ESPECIE
PREPARACIN EN FRESCO
Este procedimiento es el que se utiliza en la mayora de los laboratorios, ya que
las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas
Microscopio ptico
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Microscopio ptico
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Microscopio ptico
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Lmina
cubreobjeto
Cubo de agar
Varilla de vidrio en
forma de U
HONGOS CONTAMINANTES
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayora saprfitos, hallndose
libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgnica en descomposicin. Las
condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de
esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38 oC.
El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios puede
producir en sus habitantes determinadas patologas entre las que cabe destacar asma
y alveolitis alrgicas. La contaminacin ambiental por hongos en el medio ambiente y
en interior de edificios, es debida bsicamente a hongos filamentosos y levaduras.
Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes
Aire:
Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel.
mediante 2 procedimientos:
Microscopio ptico
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Microscopio ptico
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Tierra:
Materiales: 1 placa de Petri vaca y estril, 1 placa de Petri con medio de cultivo
Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estril, 1 tubo con tapa de baquelita que
contenga 1 ml de solucin salina fisiolgica (estril).
1. Recolectar la tierra con baja lengua estril y colocarla en la placa de Petri
estril, vaca.
2. Llevar al laboratorio. Agregar una porcin de tierra con la ayuda de un baja
lengua estril dentro del tubo que contiene 1 ml de solucin salina
fisiolgica (SSF), mezclar para homogeneizar.
3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri con
agar Sabouraud o Lactrimel.
4. Rotular la placa con el nmero del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la prxima actividad
prctica.
Luego de la incubacin por una semana a temperatura ambiente, realizar el
estudio macroscpico de las colonias aisladas (a simple vista), anotando: color,
presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia. Realizar tambin el estudio
microscpico a travs del reconocimiento de las especies por medio de la
Microscopio ptico
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ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Describa las caractersticas macroscpicas de un hongo filamentoso y de un
hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de Petri,
siguiendo el siguiente esquema:
CARACTERSTICAS
MACROSCPICAS
HONGO FILAMENTOSO
HONGO LEVADURIFORME
COLOR
TAMAO DE LA COLONIA
ASPECTO
CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
HONGO
FILAMENTOSO
HONGO
LEVADURIFORME
MICELIO
Microscopio ptico
tierra.
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OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Sealar la importancia de las pruebas inmunolgicas en el diagnstico de
las micosis que afectan al hombre en nuestro medio.
Interpretar las pruebas de intradermorreaccin (IDR) en el diagnstico de las
micosis.
Describir e interpretar la tcnica de Inmunodifusin Doble (IDD) en el
diagnstico de las micosis.
Correlacionar los resultados obtenidos de la impresin clnica, el diagnstico
epidemiolgico, las pruebas intradrmicas y la serologa para realizar un
diagnstico adecuado de las micosis sistmicas.
Microscopio ptico
INMUNIDAD CELULAR
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Tcnica de Sokal
La IDR se utiliza bsicamente en estudios epidemiolgicos, para investigar la
existencia de infeccin subclnica en una poblacin y rara vez como orientacin
diagnstica, ya que una reaccin positiva de 5 mm. de dimetro o ms, significa que la
Microscopio ptico
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respuesta inmunitaria del paciente est intacta y slo seala exposicin al agente. Por
el contrario, una reaccin negativa no necesariamente excluye infeccin y se puede
observar en pacientes con casos de micosis diseminadas, lo que indica un estado de
anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba auxiliar en
el diagnstico, pronstico y valoracin del estado inmunitario de los pacientes con
micosis sistmicas.
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Paracoccidioidina:
Se prepara a partir de la forma micelial y levaduriforme de Paracoccidioides
brasiliensis. Se utiliza en estudios epidemiolgicos y para evaluar la respuesta del
organismo al tratamiento sobre todo en aquellos casos en los cuales la respuesta a la
paracoccidioidina antes del tratamiento fue negativa.
Coccidioidina:
Existen dos tipos de antgenos fabricados a partir de Coccidioides posadasii o C.
immitis utilizados en el estudio de hipersensibilidad retardada. La esferulina, fabricada a
partir de las esfrulas y la coccidioidina a partir de la forma filamentosa o micelial del
hongo. Es positiva 2 a 3 semanas despus del inicio de los sntomas y puede persistir
durante aos. En pacientes sintomticos la positividad a la IDR se considera de buen
pronostico; mientras que su negatividad se traduce en una inadecuada respuesta
celular, anergia y por lo tanto, mal pronstico.
INMUNIDAD HUMORAL
doble
(IDD),
inmunoelectroforesis
contrainmunoelectroforesis;
Microscopio ptico
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como
positiva,
pero
debe
considerarse
realizar
otras
pruebas
Lneas de identidad
Lneas de identidad
parcial
Lneas de no
identidad
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Procedimiento de la IDD:
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1
6
1
2
1
2
3
4
en placas de Petri
Microscopio ptico
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8.- Lavar las lminas con agua destilada y cubrirlas con papel de filtro
humedecido con agua destilada. Colocarlas en estufa a 50-60 C hasta obtener
una deshidratacin total.
9.- Colorear las lminas con solucin colorante de protenas (Amidoschwarz)
durante 5 a 10 minutos y decolorarlas con Acido Actico Glacial al 4% hasta
obtener visualizacin de las bandas.
1/16
1/8
1/4
1/16
1/2
1/8
1/4
1/16
1/2
1/8
S
1/2
1/4
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CORRELACIN
INTERPRETACIN
DE
LA
IDR
IDD
EN
EL
INMUNODIAGNSTICO MICOLGICO.
ESTUDIO
IDR
IDD
Directo y
Positivo:
Positivo:
cultivo:
Presenta anticuerpos
POSITIVO
hongo
precipitantes frente a
RESULTADO
MICOLGICO
Presenta la enfermedad
Positivo:
Directo y
Presenta anticuerpos
cultivo:
el hongo o se encuentra
Positivo
en estado anrgico
fngicos
Presenta la enfermedad
(inmunosuprimido).
Directo y
Positivo:
Negativo:
Estuvo expuesto al
cultivo:
No presenta
hongo. Presenta la
Positivo
hogo
antgenos fngicos
hizo la observacin
microscpica del hongo
y aislamiento del mismo
en el medio de cultivo
Directo y
Positivo:
Negativo:
Estuvo expuesto al
cultivo:
No presenta
hongo ms no presenta
Negativo
hogo
la enfermedad.
antgenos fngicos
Directo y
Negativo:
Negativo:
El paciente puede:
cultivo:
No presenta
1. No presentar
Negativo
el hongo o se encuentra
en estado anrgico
antgenos fngicos
enfermedad mictica.
2. Estar
(inmunosuprimido).
inmunosuprimido y
presentar enfermedad
ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Realizacin de la tcnica de Inmunodifusin doble. (Demostrativa)
2. Discusin e interpretacin de las pruebas inmunolgicas.
Microscopio ptico
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OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Establecer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las micosis
superficiales.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis superficiales
Describir las caractersticas macro y microscpicas de las especies de
dermatofitos.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de colonias de Candida
spp.
Ante la sospecha clnica de una micosis superficial, el clnico tiene que confirmar
la infeccin recurriendo a una serie de procedimientos de laboratorio que incluyen la
deteccin del agente causal en el tejido, por examen directo, y el aislamiento del
patgeno en el cultivo. Al conocer el agente etiolgico se confirma la sospecha clnica
de la micosis, permitiendo as la eleccin del tratamiento especfico y la valoracin del
mismo.
Microscopio ptico
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Realizar asepsia con alcohol. La muestra debe incluir tanto cabellos alterados
como escamas del cuero cabelludo o de piel (Figura 10). Para la obtencin de los
cabellos (cuero cabelludo) y vellos (de la barba), deben preferirse aquellos que estn
opacos, quebradizos y fracturados dando aspecto de puntos negros; igualmente
Microscopio ptico
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aquellos que se extraigan fcilmente con una pinza de depilacin. Las escamas se
obtienen por raspado con bistur estril.
Las lesiones pueden ser examinadas con lmpara de Wood (luz ultravioleta, 365
nm), en busca de zonas fluorescentes que indicarn la presencia de cabellos y pelos
infectados por dermatofitos, lo cual permite recolectar muestras apropiadas con mayor
seguridad.
Figura 10. Lesiones de Tinea capitis. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra
Tinea facie, corporis, cruris, pedis y manuum (tia del cuerpo, crural,
MUESTRA: Escamas.
Las escamas son recolectadas con bistur romo, raspando los bordes de la
lesin, donde est el crecimiento activo del hongo (Figura 11 y 12). Se recogen
Microscopio ptico
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Previa limpieza con alcohol, la muestra debe ser tomada con bistur
haciendo raspado profundo del lecho ungueal o de la lmina afectada partiendo del
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La muestra debe tomarse por presin sobre el reborde ungueal, o por debajo de
este, tratando de recuperar el material caseoso.
A)
B)
C)
D)
Microscopio ptico
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EXAMEN DIRECTO
Una vez recolectadas las muestras de piel, pelos o uas se procede a realizar el
examen directo. Este se realiza colocando la muestra entre lmina y laminilla con una o
dos gotas de KOH, solucin aclarante de la queratina (10-40% dependiendo de la
muestra), se flamea para acelerar el aclaramiento (sin dejar hervir) y se observa al
microscopio con objetivos de 10x y 40x. Si el material es muy denso, se puede
disgregar presionando la laminilla con el borrador de un lpiz o con el dedo. Este
procedimiento tambin ayuda a separar las clulas y evitar artefactos como el mosaico
del hongo. Para favorecer la visualizacin, se puede agregar unas gotas de azul de
lactofenol o tinta Parker.
(figura 14).
Microscopio ptico
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microsprica
(Microsporum
canis),
con
esporas
Microscopio ptico
35
Dibujo
CULTIVO
Para la identificacin definitiva del agente causal es fundamental realizar cultivo
en tubos de ensayo o placa y, cultivo en lmina. El cultivo de la muestra se realiza
sobre agar Lactrimel, Sabouraud o DTM (medio para probar dermatofitos), el cual es un
medio con antibacteriano y rojo fenol como indicador; de esta manera se inhiben
bacterias y si crece un dermatofito hay viraje de color amarillo a rojo. Se incuban a
temperatura ambiente durante 7 a 15 das, despus de lo cual crecen colonias
Microscopio ptico
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Microsporum
gypseum
Trichophyton
mentagrophytes
Trichophyton
rubrum
Epidermophyton
floccosum
Microscopio ptico
Microsporum
canis
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Gnero: Microsporum
Tcnica: Microcultivo
Especie
M. canis
Anverso de la colonia:
Caractersticas Color blanco amarillento, de
macroscpicas aspecto lanoso o algodonoso.
Reverso:
Pigmento amarillo anaranjado
caracterstico.
Se observa un micelio septado,
con macro y microconidias. Las
macroconidias son en forma de
huso, con extremos afilados,
Caractersticas pared gruesa, con abundantes
microscpicas tabiques (6 o ms). Permiten la
identificacin de especie. Las
microconidias son alargadas en
forma de maza, ssiles, en
nmero variable, sin valor
diagnstico.
M. gypseum
Anverso de la colonia:
Color
canela,
con
superficie
pulverulenta, granulosa plana.
Reverso:
Pigmento de color caf.
Se observa un micelio septado, con
macro
y
microconidias.
Las
macroconidias son fusiformes con
puntas romas, paredes gruesas y
con menos de 6 tabiques. Permiten
la identificacin de especie.
Dibujo
Microscopio ptico
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Gnero: Trichophyton
Tcnica: Microcultivo
Especie
T.rubrum
Caractersticas
macroscpicas
Caractersticas
microscpicas
T.
mentagrophytes
Anverso de la
colonia:
Color blanco, de
aspecto
algodonoso,
pulverulento, con
formacin
de
pliegues en su
centro,
algunas
colonias
se
observan
agrietadas,
mientras
que
algunas cepas son
menos vellosas.
Reverso:
Pigmento rojo vino
caracterstico.
Anverso
colonia:
Presenta
un
micelio muy fino,
septado;
las
microconidias son
piriformes en forma
de lgrima, ssiles
o pedunculadas y
adoptan
una
disposicin
irregular en ambos
lados del filamento.
Las macroconidias
son muy escasas o
ausentes,
digitiformes,
en
forma de salchicha,
de pared celular
delgada y lisa.
Presenta
abundantes
microconidios
esfricos y nacen
en acmulos, as
como a lo largo de
las
hifas;
las
macroconidias son
cilndricas y de
paredes delgadas
y frecuentemente
se ven hifas en
espiral.
de
la
Color
blanco
crema, de aspecto
granular,
pulverulenta con
los
mrgenes
radiados.
T. interdigitale
T. tonsurans
Anverso de la
colonia:
Color
blanco
crema,
de
aspecto velloso
o algodonoso.
Anverso de la
colonia:
Puede presentar
4
variedades
morfolgicas:
crateriforme,
cerebriforme,
sulfrea
y
acuminada, de
aspecto
algodonoso
o
pulverulento.
Reverso:
Pigmento
amarillo azufre,
pardo-rojizo
o
negruzco
que
puede
ser
difusible.
Se observa un
micelio
ramificado
en
ngulo
recto,
septado,
y
microconidias
grandes (2-5 x 37 um), piriformes
o en forma de
maza, ssiles o
penducludas.
Las
macroconidias
son escasas o
estn ausentes.
Reverso:
Pigmento
color
rojo (no siempre) o
caf.
Presenta
abundantes
microconidios
subesfricos o
piriformes. Las
macroconidias
son
multiseptadas y
ocasionalmente
presentes. Se
observan
escasas hifas
en
espiral.
Clamidosporas
presentes
en
cultivos viejos
Microscopio ptico
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Microscopio ptico
Dibujo
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Gnero: Epidermophyton
Especie: E. floccosum
Caractersticas
Anverso de la colonia:
macroscpicas
Caractersticas
microscpicas
Microscopio ptico
Dibujo
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MUESTRA
Microscopio ptico
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ESTUDIO MICOLGICO
H
B
DIBUJO
Microscopio ptico
CULTIVO
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MUESTRA
Remisin:
Las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos lminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plstica estril,
acompaada de la identificacin del paciente y de las descripcin de la lesin y del
rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.
El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y procesado
de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados ungueales y los fragmentos de la
uas pueden enviarse en sobres o cajas de Petri plsticas estriles, acompaados de
los datos del paciente.
En el caso de la toma de muestra en mucosas, las mismas deben enviarse
en tubo con tapa de rosca que contenga 1 ml de solucin salina o agua destilada
estril. La muestra debe ser procesada en la hora siguiente a su recoleccin; por ello
debe anotarse en la orden de remisin la hora de toma de muestra. Si no es posible la
remisin inmediata al laboratorio de muestras de mucosa vaginal, genital masculina o
Microscopio ptico
44
ESTUDIO MICOLGICO
EXAMEN DIRECTO
Seudohifa
Blastoconidia
Clamidospora
Figura 18: Blastoconidia, seudohifa y clamidosporas de
DIBUJO
Candida albicans.
Microscopio ptico
CULTIVO
45
Cantidad
Escasa
1-5
1-10
Moderada
6-10
10-20
Abundante
>10
>20
Microscopio ptico
Candida albicans.
46
MUESTRA CLNICA
UREASA
UREASA
Trichosporum
Candida spp
+
Cryptococcus
Rodotorula (Anaranjada)
Microscopio ptico
Auxonograma, crecimiento: 37 C y 42 C
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OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Reconocer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las micosis
subcutneas.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis subcutneas.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de los agentes causales
de las micosis subcutneas.
DIAGNSTICO DE LA CROMOBLASTOMICOSIS
predominantemente
hombres,
trabajadores
del
campo,
en
edades
comprendidas entre los 20 y 70 aos, aunque tambin se han reportado casos en nios
y adolescentes. Es causada por varios hongos filamentosos con melanina, clasificados
en la familia Demateacea y denominados cromomicetos por Borelli Se adquiere por
inoculacin accidental del hongo saprofito en la piel a travs de traumatismos
ocasionados con espinas de plantas o restos vegetales que contienen el agente.
Microscopio ptico
Estudio epidemiolgico
48
Impresin Clnica
La cromoblastomicosis se caracteriza clnicamente por la presencia de lesiones
ppulo postulosas o ndulo abcesado que evolucionan lenta y progresivamente a placa
verrugosa de superficie irregular con diminutas hemorragias, visibles como puntos
negros, escamo-costrosas, de bordes activos y zonas con tendencias a la cicatrizacin,
dejando reas atrficas, acrmicas o hipocrmicas. Al cabo de varios aos
de
Microscopio ptico
49
Estudio Micolgico
Muestra:
Previa asepsia con alcohol, las escamocostras son recolectadas con bistur
romo, raspando la lesin, con preferencia donde se encuentran los puntos negros
drmicos, los cuales contienen las estructuras del hongo. Se recogen directamente
sobre la lmina portaobjeto.
Microscopio ptico
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Examen Directo:
Se realiza entre lmina y laminilla con KOH al 10-20%, slo o adicionado con
tinta, Negro de clorazol E y haciendo uso de coloraciones histolgicas como
Hematoxilina-Eosina (HE) o cido Perydico de Schiff (PAS).
En un paciente con cromoblastomicosis se observan las clulas esclerticas,
clulas fumagoides o esclerotes de Medlar, las cuales son clulas redondeadas, de
color caf o amarillo ocre, de 4 a 12 m de dimetro, de pared gruesa, con inclusiones
citoplasmticas y con particiones (Figura 20). Estas clulas pueden dividirse en varios
planos, con septos en diferente orientacin. No son blastoconidias ni tienen
reproduccin por gemacin. En casos muy crnicos, se pueden observar tambin la
presencia de hifas cortas, septadas, de pared gruesa y dematiaceas.
En la biopsias teidas con HE los cuerpos esclerticos conservan su color
caracterstico. La respuesta tisular es mixta con una respuesta supurativa y predominio
de granulomas, con acmulos de neutrfilos en el centro. Las clulas esclerticas se
localizan en los microabscesos drmicos, mientras que las hifas pueden verse en la
epidermis.
DIBUJO
Microscopio ptico
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macroscpicas:
Todas
las
especies
causantes
de
Microscopio ptico
52
Cadena de
conidias
Conidiforo
simple
Hifa septada
DIBUJO
Phialophora verrucosa:
Presenta fructificacin Phialophora, la cual se caracteriza por la produccin de
conidiforos terminales o dispuestos a los lados de las hifas vegetativas, en forma de
florero (filides), con una zona estrecha o cuello y una porcin distal ms ancha. Las
conidias son ovales, lisas, ligeramente pigmentadas y de 2 a 3 m de dimetro; se
forman en el interior de la filide, salen del exterior acumulndose en pequeos
conglomerados en forma de cabezuela. (Figura 22).
Conidias
Hifa septada
Figura
22:
Phialophora
verrucosa.
http://overcomingcandida.com/mycology/phialop
hora.jpg
DIBUJO
Microscopio ptico
Fialide
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Rhinocladiella aquaspersa:
Presenta la fructificacin de tipo Rhinocladiella, exhibe un conidiforo poco
diferenciado, erecto, cilndrico, ligeramente dilatado en su extremo distal, en forma de
clava o maza; en esta porcin se ven cortas prolongaciones del conidiforo en forma
de dientes, donde se implantan las conidias con disposicin acropleurogena. Las
conidias son ovales, unicelulares, de 2 a 5 m de dimetro y forman brotes que dan
origen a cortas cadenas de 2 a 3 elementos. (Figura 23)
Conidioforo
Conidias
Hifa septada
DIBUJO
Fonsecaea pedrosoi:
Presenta los tres tipos de formacin de conidias que exhiben los agentes
causales
de
esta
enfermedad:
Cladosporium,
phialophora
Rhinocladiella,
Conidias
Conidiforo
Microscopio ptico
Hifa
septada
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Figura
24.
Fonsecaea
pedrosoi.
www.doctorfungus.org/thefungi/img/fon1_l.jpg
DIBUJO
DIAGNSTICO DE LA ESPOROTRICOSIS
Estudio epidemiolgico
Entre los factores de riesgos conocidos para las formas cutneas se han descrito el
contacto traumtico con material vegetal (plantas espinosas, helechos, paja, musgo).
En las formas sistmicas, el alcoholismo y la inmunosupresin han sido sealados
como factores de riesgos importantes.
Impresin Clnica
Esporotricosis cutnea primaria: se describen dos formas.
Microscopio ptico
malignas.
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diseminacin hematgena.
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Estudio Micolgico
Muestra:
Se solicitan usualmente:
Exudados
Material purulento
Biopsias
Examen Directo:
Se realiza haciendo uso de la coloracin de Giemsa o histolgicas (HE, PAS,
plata-metenamina), inmunofluorescencia directa y tcnicas de inmunoperoxidasa.
Usualmente no se observan estructuras micticas y ocasionalmente se observa
el cuerpo asteroide. Las blastoconidias son adems, difciles de diferenciar de otros
hongos, como Histoplasma capsulatum, especialmente en fresco o con la coloracin de
plata metenamina.
En biopsias teidas con HE o PAS, se observan blastoconidias rodeadas de
espculas eosinfilas en forma de estrella (reaccin de Splendore-Hoeppli), conocida
con el nombre de cuerpo asteroide. Estas estructuras rara vez se observan al examen
en fresco.
Por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa se observan blastoconidias de S.
Microscopio ptico
schenckii.
57
Figura
26:
Cuerpo
asteroide.
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/20108
28/lecciones/cap6/cap6-3.htm
Cultivo:
Caractersticas macroscpicas: A temperatura ambiente los cultivos son de
crecimiento rpido (4 a 5 das), de aspecto micelial, de color gris claro que con el
tiempo se tornan ms oscuros, de superficie vellosa, muy plegada y de consistencia
membranosa. A 37 C se observan colonias blancas, cremosas, de aspecto
levaduriforme.
Caractersticas microscpicas: el micelio est constituido por finos filamentos
hialinos, ramificados y septados. Las conidias tienen forma elptica, de pared lisa y
delgada, se originan en forma simpodial, en el extremo distal de conidiforos simples,
erectos y finos, presentando en su conjunto el aspecto del tallo y ptalos de una flor de
margarita. El estado levaduriforme est constituido por blastoconidias esfricas, ovales
o en forma de cigarro, mono o multigemante de 1 a 3 m por 3 a 10 m. en algunos
casos se hace necesario demostrar el carcter dimrfico del hongo inoculando
Microscopio ptico
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H
H
S
Figura 27: Cultivo en lmina de Sporotrhrix schenckii. Hifa
septada (H), Conidiforo simple (C) y conidias (c)
dispuestas
en
flor
de
margarita.
www.facmed.unam.mx/.../pages/sschenckii2_jpg.htm
DIBUJO
Inmunodiagnstico:
Inmunidad celular: Se estudia mediante la aplicacin intradrmica de 0,1 c.c. de
esporotriquina, la cual es un antgeno que se prepara bien sea de la fase micelial o
levaduriforme del hongo, se realiza la lectura a las 48 horas. Una lectura mayor o igual
de 5 mm indica que la persona ha estado expuesta al hongo. A pesar de que la
intradermorreaccin carece de valor diagnstico, una prueba positiva ante un cuadro
clnico sugestivo de esporotricosis orienta hacia el diagnstico de la enfermedad, el
cual debe ser confirmado con el aislamiento e identificacin del agente causal.
Inmunidad humoral: La prueba de eleccin para el estudio de los casos de
esporotricosis cutnea linftica y la extracutnea es la ID. En los casos de
esporotricosis cutnea fija las pruebas de eleccin, usando un antgeno levaduriforme,
Microscopio ptico
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DIAGNSTICO DE MICETOMA
El Micetoma es una infeccin crnica, supurativa de los tejidos cutneo,
subcutneo y seo. Se caracteriza por la presencia de edema, fstulas y granos que
drenan a travs de las fstulas, esta triada es usada en un sentido estricto para definir
el trmino Micetoma. Puede estar causado por bacterias (actinomicetos) u hongos
(eumicetos).
Estudio epidemiolgico:
El Micetoma se produce por la implantacin traumtica o heridas en el tejido
subcutneo, de ciertos hongos o bacterias, presentes en espinas o astillas de madera,
entre otros. Es frecuente en regiones tropicales y subtropicales, presentndose
espordicamente en regiones templadas. La enfermedad es endmica en la India y en
algunos pases del frica y de Latinoamrica. En Venezuela, la enfermedad predomina
en la regin Centrooccidental del pas, en los estados Lara y Falcn. As mismo, se
han reportado casos en las regiones: Central, Zuliana y de Guayana.
La enfermedad se ha observado en nios de 3 aos de edad y en individuos de
80 aos, pero predomina entre la 2a dcada de la vida. Es ms comn en hombres que
en mujeres, en una relacin 2:1, y predomina en campesinos, por lo que esta entidad
es considerada una enfermedad ocupacional. Afecta principalmente los miembros
inferiores, pero tambin puede producirse en manos, rodillas, regin gltea, brazos,
cabeza, cuello y tronco.
Agentes etiolgicos:
El Micetoma puede ser ocasionado por bacterias aerbicas (Micetoma
actinomictico) los cuales producen granos claros a excepcin de Actinomadura
Microscopio ptico
pelletieri que es rojo, y por hongos verdaderos (Micetoma eumictico), los cuales
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Madurella grisea
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Impresin clnica:
La lesin inicial se localiza en el tejido celular subcutneo. Se caracteriza por
ser una masa firme, indolora y no adherida a los planos superficiales. Luego se
extiende hasta el tejido subcutneo donde forma reas de tumefaccin con produccin
de abscesos que alcanzan la piel y drenan a travs de mltiples fstulas. En el lquido
seropurulento que de all drena, se encuentran los granos caractersticos de la
enfermedad. El progreso de la lesin lleva a compromiso seo, el cual ocasiona
deformacin marcada del miembro comprometido.
Diagnostico micolgico:
Muestra:
Granos
Material purulento
Liquido serohemtico
biopsias
Examen directo:
Se realiza con la observacin directa de los granos entre lamina y laminilla con
KOH al 10%, tambin se puede realizar coloracin de Gram. Como los granos pueden
ser producidos por bacterias u hongos, es importante estudiar sus caractersticas
macro y microscpicas de su tamao, forma, consistencia y color, as como el dimetro
de los filamentos que lo conforman y la configuracin interna son caractersticas
importantes.
Los granos producidos por actinomicetos se observan al microscopio como
filamentos delgados, ramificados, de aproximadamente 1 m de dimetro y poseen
Microscopio ptico
algunas formas cocoides y bacilares; se tien con Gram, Kinyoun, Giemsa, HE y plata-
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Microscopio ptico
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