EFECTOS DEL FR-91 SOBRE LAS CELULAS INMUNES DE INDIVIDUOS SANOS Y DE PACIENTES CON LINFOMA NO- HODGKIN Martinez* E, Chacon* R, Cacabelos** R, Etcheverria** I, Lombardi** VRM. *Georgian Alternative Medicine, Madrid, Espafia **EBIOTEC, Division de Biotecnologia, La Corufia, Espafia Introduecién: Debido a la importancia de identificar immunofenotipos celulares, se ha realizado un considerable esfuerzo en desarrollar métodos répidos para la identificacion de antigenos de la superficie celular implicados en la modulaci6n del sistema inmune. El objetivo principal del presente estudio era evaluar la actividad del FR91, un lisado estandardizado de células microbianas del género Bacillus, en linfocitos de sangre periférica de individuos sanos (HI) y de pacientes con linfoma no-Hodgkin (NHL) siguiendo los cambios secuenciales en el immunofenotipo de las poblaciones de mezclas de células, asi como en la produccién del citoquinas. Material y métodos: Los linfocitos de sangre periféricos fueron obtenidos a partir de 15 HI y 10 pacientes de NHL. 500 pL de sangre completa fueron diluidos 1:1 con RPMI 1640 conteniendo un 10% de suero bovino fetal, y el FR91 fue afiadido en los tubos correspondientes en la concentracién de 10 wL/mL, 25 uL/mL, y 50 uL/mL, respectivamente, ¢ incubados 24 horas a 37°C en atmosfera humidificada con 5% de CO2 . Después de la incubacién 100 pL de sangre fueron afiadidos a los tubos individuales y teitidos con anti-human CD3-FITC, anti-human CD25-FITC, anti-human CD69-FITC, anti-tuman HLADR-PE, anti-human CD4-PE, y anti-human CD8-PE. Tras la ineubacién y el lavado, los tubos fueron pasados a un citémetro del flujo y se calcularon los porcentajes de células positivas. Para la cuantificacién de citoquinas, se ha utilizado el andlisis Multiplex bead array, que permite la cuantificacién citométrica simultanea de: IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 p70, IL-12, IFN-y, TNF-a en la solucion, por tener diferentes indices espectrales. Resultados: Los resultados de la actividad FR91 en las tres concentraciones diferentes muestran un aumento significative con respecto a los controles no tratados de la expresién del antigeno CD3 ( p=0.02) y CD8 (p-0.02) en el grupo HI, mientras que un mayor incremento en CD3 (p=0.002) y CD4 (0.002) fire observado en el grupo de ‘NHL. Un significativo incremento en la expresién de fas citoquinas, IL-2 (p=0.014), IL- 6 (p=0.001), I-12 (p=0.003), IFN-y (p<0.0001) y de TNF-a (p=0.002) fue observado en el grupo HI. Resultados similares fueron observados en el grupo NHL: IL-1 (p=0.03), IL-6 (p=0.008), II-12 (p< 0.0001), IFN-y (p< 0.017) y TNF-a (p=0.012). Conclusiones: El significativo incremento de los linfocitos CD3* en ambos grupos estudiados, sugiere un posible uso del FR91 en pacientes con alteracién de la funcién del sistema inmune. Ademas, el aumento en la produccién de las citoquinas, IL-2, IL-6, IL-12 y de TNF-a, puede ser uno de los mecanismos subyacentes por los cuales el FR91 controla la proliferacién celular.Las figuras 1-3 indican los cambios observados en los sujetos normales (N=15), mientras las graficas 4-6 indican los cambios que se observan en los pacientes con linforma (N=10). Figura 1. Nivel de expresion de CD3, HLA-DR y doble positivos en sujetos normales estimulados in vitro con 10 y 25 pl de FR91 Activacién linfocitaria en sujetos normales estimulados yao2 poor CONFRS1 0 wwe we gn 3 60 g ‘aControt go ‘a FROX t0micro S40 |G FROI 25micro, er | Bs pros pao 210 we vie o Ce 5 eps HLADR ‘coseLA-OR Marcador linfocitario Figura 2, Nivel de expresion de CD4, CD25 y doble positives en sujetos normales estimulados in vitro con 10 y 25 ul de FR91. Activaci6n linfocitaria en sujetos normales estimulados | con FR91 | as] | Sa 8 as | pest 5 0 (@ FR91 10micro. | gs F701 25miere an | £1 Bo [#3 | cpt cms cosrcos | Marcador linfocitario adFigura 3. Nivel de expresion de CD8, CD69 y doble positivos en sujetos normales estimulados in vitro con 10 y 25 il de FR9I | Activacion linfocitaria en sujetos normales estimulados: con FR91 6 gx 0.00 3 ve —_ bes ‘acentrot | | Bao 1a FROI tOmicro) S45 oon SFR ZEmere | ' wo ve Hy | ol coe cos c0sicps9 | Marcador linfocitario Figura 4. Nivel de expresion de CD3, HLA-DR y doble positives en pacientes con linfoma estimulados in vitro con 10 y 25 yl de FROT | Activacién linfocitaria en pacientes con linfoma estimulados con FR91 | 80 — (a Control 5 FRO tomicro 1m FROI 25micro cps HLA-DR (CDO+IHLA-DRY Marcador linfocitario | Porcentaje de expresionFigura 5, Nivel de expresién de CD4, CD25 y doble positives en pacientes con linfoma estimulados in vitro con 10 y 25 yl de FROL | Activacion linfocitaria en pacientes con linfoma estimulados con FR91 60 | (a Control FRI 10micro FRI 25micro ce «66S cot cos ‘cowcDes | Marcador linfocitario Porcentaje de expresion Figura 6. Nivel de expresién de CD8, CD69 y doble positivos en pacientes con linfoma estimulados in vitro con 10 y 25 yl de FR9L Activacién linfocitaria en pacientes con linfoma estimulados con FR91 oGontrat | ‘oF tamicro FE 25micro 8 P-0.01¢p-0.022 we we | | = | | | coe cose ccosicose | | Marcador linfocitario | Porcentaje de expresion