Rezumat Teza

Rezumat
UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
TEZ DE DOCTORAT
Caracterizarea molecular a proteinelor
implicate n distrofii musculare
Rezumat
Conductor tiinific
Prof. Dr. Ion BRAD
Doctorand
Gisela Florina GAINA
BUCURETI
2008
Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008
Pagina 1
Rezumat
Teza de doctorat
Departamentului
a fost
de
elaborat
Biochimie
n cadrul
Biologie
Molecular - Baza de Cercetare cu Utilizatori

Multipli
Biologie
Molecular
(BCUM
BM),
Universitatea din Bucureti
Studiile au fost finanate integral din proiectul de

cercetare:
CEEX nr. 40/ 2005 - 2008, titlul Integrarea tehnicilor de
analiz molecular n diagnosticarea distrofinopatiilor n
perspectiva unor strategii terapeutice i profilactice
Responsabil proiect Conf. Dr Elena IONIC;
Pagina 2
Rezumat
CUPRINS
PARTEA I-A:
NOIUNI INTRODUCTIVE. .5
CAPITOLUL I: Distrofiile musculare...................................................................6

1.1. Noiuni introductive despre distrofiile musculare.......................................................7
1.2. Aspecte ale morfologiei muchiului scheletic...........................................................10
1.3. Clasificarea distrofiilor musculare............................................................................14
1.3.1. Tipuri de distrofii musculare..............................................................................14
CAPITOLUL II: Proteinele musculare................................................................17
2.1. Proteinele sarcolemale............................................................................................. 18
2.1.1. Distrofina.......................................................................................................... 19
2.1.1.1. Structura i rolul distrofinei........................................................................19
2.1.1.2. Gena distrofinei.......................................................................................... 24
2.1.1.3. Principalele tipuri de mutaii care apar la nivelul genei distrofinei.............26
2.1.1.3.1. Distrofinopatiile..........................................................................30
Distrofia muscular Duchenne....................................................31
Modalitatea de transmitere a DMD.....................................32
Caracteristicile clinice ale DMD..........................................33
Distrofia muscular Becker..........................................................34
Modalitatea de transmitere a BMD.....................................34
Caracteristici clinice ale BMD..............................................35
2.1.1.3. 2. Distrofia muscular Duchenne cu implicare cardiac.................35
2.3. Complexul proteinelor asociate distrofinei...............................................................36
2.3.1. Complexul distroglicanilor.................................................................................38
2.3.2. Complexul sarcoglicanilor.................................................................................40
2.3.2.1. -Sarcoglicanul........................................................................................... 43
2.3.2.2. -Sarcoglicanul........................................................................................... 44
2.3.2.3. -Sarcoglicanul........................................................................................... 44
2.3.2.4. -Sarcoglicanul........................................................................................... 45
2.3.2.5. -Sarcoglicanul........................................................................................... 45
2.3.2.6. -Sarcoglicanul...........................................................................................46
2.3.2.7. Distrofiile musculare de tip forma centurilor..............................................46
Sarcoglicanopatiile..............................................................................................47
2.3.2.9. Sarcospanul................................................................................................49
2.3.3. Complexul sintrofinelor.....................................................................................49
2.3.4. Complexul distrobrevinele.................................................................................50
2.3.5. Caveolina-3....................................................................................................... 51
2.3.5.1. Structura i funciile caveolinei-3...............................................................51
2.3.5.2. Distrofia muscular forma centurilor de tip 1C (LGMD 1C).........................53
2.3.6. Disferlina........................................................................................................... 54
2.3.6.1. Structura i rolul disferlinei.........................................................................54
2.3.6.2. Disferlinopatiile..........................................................................................55
2.3.7. Nitric oxid sintaza de tip neuronal (nNOS).........................................................56
2.4. Proteinele matrixului extracelular............................................................................57
2.4.1. Laminina 2...................................................................................................... 57
2.4.1.1. Structura i funciile laminina 2................................................................57
2.4.1.2. Distrofiile musculare congenitale...............................................................60
Pagina 3
Rezumat
2.5. Proteine citosolice.................................................................................................... 62

2.5.1. Calpaina-3......................................................................................................... 62
2.5.1.1. Structura i funciile calpainei-3.................................................................62
2.5.1.2. Calpainopatia............................................................................................. 65
2.5.2. TRIM 32............................................................................................................. 67
2.5.3. LARGE............................................................................................................... 67
2.6. Proteinele nucleare.................................................................................................. 68
2.6.1. Laminele A/ C.................................................................................................... 68
2.6.2. Emerina............................................................................................................. 70
PARTEA A IIA: . CONTRIBUII PERSONALE

72
INTRODUCERE................................................................................................73
Diagnosticul diferenial al distrofiilor musculare prin studiul proteinelor musculare.......73
CAPITOLUL 3: Determinarea calitativ a expresiei proteinelor musculare
implicate n distrofiile musculare....................................................................77
3.1. INTRODUCERE.......................................................................................................... 78
3.2. Materiale i metode.................................................................................................82
3.2.1. Stabilirea lotului de pacieni i prelevarea probelor de esut muscular normal i
patologic..................................................................................................................... 82
3.2.2. Realizarea seciunilor........................................................................................83
3.2.3. Detecia prin marcare imunofluorescent.........................................................84
3.2.3.1. Principiul metodei.......................................................................................84
3.2.3.2. Soluii, reactivi i anticorpi.........................................................................84
3.2.3.3. Protocol de lucru......................................................................................... 85
3.2.3.1. Evidenierea expresiei proteinelor musculare prin imunofluorescen....85
3.3. Rezultate i discuii..................................................................................................87
3.3.1. Analiza histologic a esutului muscular normal...............................................87
3.3.2. Evidenierea expresia distrofinei i utrofinei la pacienii diagnosticai cu distrofie
muscular................................................................................................................... 93
3.3.3. Evidenierea expresiei nitric oxid reductazei la pacienii cu DMD/ BMD..........102
3.3.4. Evideniera expresiei sarcoglicanilor la pacieni cu distrofii musculare...........109
3.3.5. Evidenierea expresiei caveolinei-3 la pacieni cu distrofii musculare progresive
.................................................................................................................................. 115
3.3.6. Evidenierea expresiei lamininei 2 la pacieni cu distrofii musculare.............120
3.4. Corelaii ale expresiei proteinelor musculare analizate prin imunofluorescenta.....122
3.5. Concluzii:............................................................................................................... 123
CAPITOLUL 4: Determinarea cantitativ a expresiei proteinelor musculare
implicate n distrofiile musculare..................................................................125
4.1. Introducere............................................................................................................ 126
4.2. Materiale i metode...............................................................................................128
4.2.1. Probele de tesut normal si patologic...............................................................128
4.2.2. Realizarea extractului proteic..........................................................................128
4.2.2.1.Reactivi necesari pentru obtinerea extractului proteic..............................128
4.2.2.2. Protocol de lucru.......................................................................................129
4.2.2.3. Determinarea concentraiei proteice:.......................................................129
Principiul metodei:.............................................................................................129
Reactivi si solutii:............................................................................................... 129
Modul de lucru:.................................................................................................. 129
Pagina 4
Rezumat
4.2.3. Detecia proteinelor musculare prin western blott..........................................130

4.2.3.1. Principiul metodei.....................................................................................130
4.2.3.2. Electroforeza............................................................................................ 131
Prepararea gelului.............................................................................................132
Reactivi si aparatura pentru prepararea gelului.................................................133
Protocol de lucru................................................................................................ 133
Prepararea probelor........................................................................................... 134
Migarea proteinelor............................................................................................135
4.2.3.3. Transferul proteinelor...............................................................................135
Reactivi si aparatura:......................................................................................... 136
Protocolul de lucru............................................................................................. 136
4.2.3.4. Marcarea cu anticorpi...............................................................................137
4.2.3.5. Revelarea................................................................................................. 137
Reactivi i soluii:............................................................................................... 137
Modul de lucru:.................................................................................................. 139
4.3. Rezultate i discuii................................................................................................141
4.3.1. Analiza expresiei distrofinei prin western blot.................................................141
4.3.2. Analiza expresiei calpaine-3 pe western blot...................................................149
4.4. Concluzii................................................................................................................ 154
CAPITOLUL 5: Analiza duplicaiilor si deleiilor de la nivelul genei distrofinei prin
tehnica MLPA...............................................................................................156
5.1. Introducere............................................................................................................ 157
Corelarea rezultatetelor cu cele obinute prin wetern blot i imunofluorescena. 5.2.
Materiale i metode...................................................................................................... 157
5.2. Materiale i metode...............................................................................................158
5.2.1. Tehnica MLPA................................................................................................... 158
5.2.2. Probele biologice.............................................................................................164
5.2.3. Extracia ADN.................................................................................................. 165
5.2.3.2. Reactivi i aparatur.................................................................................165
5.2.4. Determinarea spectrofotometric a puritii i concentraiei ADN genomic....167
5.2.5. Tehnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)...................167
Denaturarea probelor de ADN si hibridizarea sondelor......................................170
Reacia de ligare................................................................................................ 170
Reacia de amplificare PCR................................................................................171
Separarea i cuantificarea produilor PCR prin electoforez capilar n gel.......172
5.3. Rezultate i discuii................................................................................................173
5.4. Concluzii:............................................................................................................... 194
CAPITOLUL 6: GENA DISTROFINEI DETERMINAREA MUTAIILOR PUNCTIFORME
................................................................................................................... 195
6.1. INTRODUCERE........................................................................................................ 196
6.2. MATERIALE I METODE........................................................................................... 199
6.2.1. Analiza mutaiilor puntiforme din gena distrofinei prin Tehnica High ResolutionMelting Curve............................................................................................................ 199
6.2.1.1. Probele biologice......................................................................................199
6.2.1.2. Extracia ADN...........................................................................................199
Principiul metodei.............................................................................................. 199
Pagina 5
Rezumat
Reactivi i aparatur..........................................................................................200
6.2.1.3. Determinarea spectrofotometric a puritii i concentraiei ADN genomic.
.............................................................................................................................. 202
6.2.1.4. Tehnica HR- MCA (High Resolution-Melting Curve Analysis).................202
6.2.1.5. Amplificarea PCR a fragmentelor de interes.............................................206
Reactivi i aparatur..........................................................................................207
Prepararea mixului PCR.....................................................................................212
6.2.1.6. Analiza temperaturii de hibridizare a ampliconilor cu ajutorul LightScanner
.............................................................................................................................. 213
Protocol de lucru LightScanner..........................................................................214
Analiza datelor obtinute cu ajutorul softului LightScanner Software..................214
6.2.2. Tehnica de secveniere....................................................................................215
6.2.2.1. Probele biologice......................................................................................215
6.2.2.3. Mod de lucru............................................................................................. 216
6.3. REZULTATE SI DISCUTII...........................................................................................219
6.4. CONCLUZII............................................................................................................. 236
CAPITOLUL 7: CONCLUZII GENERALE.............................................................237
7.1. Evidenierea prin imunofluorescenta a proteinelor musculare implicate in diferite
tipuri de distrofii musculare.......................................................................................... 237
7.2. Evidenierea prin western blot a proteinelor musculare implicate in diferite tipuri de
distrofii musculare........................................................................................................ 239
7.3. Analiza duplicaiilor si deleiilor de la nivelul genei distrofinei prin tehnica MLPA. .240
7.4. Gena Distrofinei Determinarea Mutaiilor Punctiforme........................................241
BIBLIOGRAFIE.............................................................................................. 242
LISTA TABELELOR PREZENTATE N TEZ.........................................................258
LISTA FIGURILOR PREZENTATE N TEZ..........................................................261
LISTA LUCRRILOR PUBLICATE I COMUNICATE..............................................266
Pagina 6
Rezumat
INTRODUCERE
Bolile musculare includ un numr mare de afeciuni care recunosc diferite

cauze i care n marea lor majoritate sunt condiionate genetic. Cele mai frecvente
boli musculare ntlnite n copilrie sunt: distrofiile musculare progresive, distrofiile
musculare congenitale, distrofiile miotonice, miopatiile congenitale, miopatiile
inflamatorii i metabolice precum i paraliziile periodice familiale.
Distrofiile musculare sunt un grup heterogen de boli motenite genetic,
caracterizate din punct de vedere clinic prin slbiciune muscular cronic i care
prezint caracteristici anatomopatologice ca necroze ale fibrelor musculare, semne
de regenerare muscular, fibre hipertrofice i proliferarea esutului conjunctiv.
Aceast descriere difereniaz distrofiile musculare de alte afeciuni primare ale
muchiului cum ar fi miopatiile congenitale i inflamatorii cu care ar putea fi uor
confundate.
Distrofiile musculare progresive sunt cunoscute de mult timp. Prima descriere
a unei astfel de boli musculare a fost fcut de ctre Edward Meyron i William Little
care n 1852 au descris cazul unui biat de 14 ani ce prezenta la fel ca i fratele lui,
o slbiciune muscular a musculaturii proximale a minlor i picioarelor. n notiele
sale Meyron scria biatul nu putea sta n picioare de la vrsta de 2 ani i jumtate
ntotdeauna era n mod vdit obosit, la fel ca i fratele lui i ambii nu alergau, nu
sreau i nu se jucau cu ali copii. Cei doi frai aveau mari dificulti la urcatul
scrilor se agau de balustrade cu ambele mini ii nclinau capul n fa i fixnduse n aceast atitudine ncordat ii trau picioarele dup ei.
Guillaurme Duchenne, al crui nume a fost mai trziu asociat cu distrofia
muscular Duchenne, a contribuit la descrierea detaliat a acestor maladii prin
prelevarea biopsiilor musculare de la pacieni n diferite stadii ale bolii cu ajutorul
unui ac acul histologic. Obinerea unei biopsii de la un pacient cu distrofie
muscular a fost un pas hotrtor n descrierea detaliat a modificrilor care au loc
n muchiul pacientului bolnav. Prelevarea biopsiei musculare la aceti pacieni
Pagina
Rezumat
devine o cerin obligatorie pentru diagnosticul de laborator ( Becker E i van Ommen G:J,
1998).
Cu ajutorul tehnicilor de imunohistochimie i investigaiilor genetice, s-a

demonstrat c o mare parte din distrofiile musculare progresive apar ca urmare a
deficitului uneia dintre proteinele citoscheletice constitutive sau doar legate de
membrana celular a fibrei musculare (sarcolema sau plasmalema).
n anul 1986, mai muli cercettori americani ( Monaco A.P. i Kunkel L.M.)
descoper defectul genetic n distrofia muscular Duchenne (DMD), un an mai trziu
Hoffman, identificnd nsi proteina deficient n DMD - distrofina.
Descoperirea distrofinei n anul 1986 ( Hoffman et al., 1987) ca protein implicat
n distrofia muscular Duchenne, nu a clarificat numai cauza molecular a producerii
celui mai comun tip de distrofie muscular, dar a i renoit interesul privind structura
plasmalemei fibrei musculare precum i asocierea ei cu membrana extracelular a
fibrei musculare.
Cercetrile ulterioare au dus i la descoperirea altor proteine al cror deficit
modific funcia i integritatea fibrei musculare i care ulterior au fost asociate sub
numele de complexul proteinelor asociate distrofinei (Dystrophin Glycoprotein
Complex - DGC).
Complexul proteinelor asociate distrofinei a fost descoperit curnd dup
distrofin de ctre Campbell i Kahl ( 1989) care au artat c distrofina este asociat
cu un grup de proteine membranare. ncepnd din acel momet s-au fcut o serie de
descoperiri care au artat complexitatea acestui grup de proteine. Astfel au fost
identificate o serie de proteine din sarcolema fibrei musculare (distrofina,
sarcoglicanii, disferlina, caveolina-3), din
matrixul
extracelular (2-laminina,
colagenVI), din sarcomere (telotonina, miotilica, titina, nebulina), din citosol

(calpaina-3, TRIM32, LARGE), precum i proteine din nucleu (emerina, laminaA/C).
(M. Vainzof,M.Zatz, 2003). Mutaiile care apar n genele care codific aceste proteine
sunt responsabile de apariia diferitelor tipuri de boli neuromusculare.
Pn n prezent se cunosc peste 40 de proteine care conlucreaz pentru
stabilizarea structurii membranare, inser aparatul contractil al fibrei musculare pe
sarcolem i fac legtura ntre aparatul contractil al fibrei musculare i esutul
Pagina
Rezumat
conjunctiv din jurul fibrei. Mutaiile care apar n una din componetele acestui complex
determin deficiena primar a proteinei pe care o codific gena respectiv,
deficien care este adesea acompaniat i de modificri secundare a altor proteine
ce aparin complexului glicoptroteinelor asociate distrofinei.
Unele din proteinele complexului DGC au o localizare extracelular (distroglican), apte sunt proteine membranare (-distroglican, sarcospan i -, -,
-,-,si -sarcoglican), patru sunt proteine citoplasmatice (-actinin-2 i sintrophin 1,
1, i 2) i dou sunt izoforme ale proteinelor subsarcolemale (-dystrobrevin-1,
-2).
Aceste proteine mpreun cu distrofina formeaz membrana citoscheletic a
membranei fibrei musculare, au rol structural dar i posibil rol n transmiterea
semnalului celular ntre elementele contractile ale fibrei i matrixul extracelular
(Ervasti and Campbell, 1993).
Studiul proteinelor musculare este important att pentru sporirea nelegerii
corelaiilor genotip- fenotip ct i n stabilirea exact a unui diagnostic pentru aceste
maladii n care este implicat un numr mare de gene. Analiza expresiei proteinelor
deficiente reprezint un instrument valoros n stabilirea situaiilor n care este
necesar analiza genetic a genelor care codific aceste proteine i n final
diagnosticarea corect a bolii neuromusculare ( Vainzof si col.,2003b; Zatz si col.,2003).
Prin
aceste
studii
se
propune
realizarea
unui
model
pentru
diagnosticarea i caracterizarea distrofiilor musculare prin analize structurale,

moleculare i genetice care s permit identificarea i evaluarea expresiei
proteinei deficiente primar, tipul mutaiilor i n consecin stabilirea tipului de
distrofie muscular cu importan pentru prognosticul bolii, mbuntirea
calitii vieii i consilierea genetic a pacientului cu distrofie muscular i
familiei acestuia.
Rezultatele obinute vor permite pe lng stabilirea unui diagnostic de
nalt acuratee al acestor maladii i o completare a datelor existente cu privire
la incidena diferitelor forme de distrofii musculare n Romnia.
Pagina
Rezumat
Contribuiile personale au fost structurate n 7 fiecrae dintre ele avnd

obiective bine definite care au fost urmrite pe tot parcursul derulrii activitilor de
cercetare.
n CAPITOLUL 3, DETERMINAREA CALITATIV A EXPRESIEI

PROTEINELOR
MUSCULARE
IMPLICATE
DISTROFIILE
MUSCULARE s-a urmrit:
Analiza expresiei fenotipice a proteinelor musculare implicate n diferite

tipuri
de
distrofii
musculare
prin
imunohistochimie
cu
imuonofluorescen n biopsiile musculare;
Evidenierea corelaiilor dintre expresiile proteinelor sarcolemale i a

celor asociate acestora prin imuonofluorescen n biopsiile musculare
ale pacienilor diagnosticai cu o deficien primar;
Concluzii
preliminare
privind
importana
utilizrii
tehnicii
de
imunomarcare prin imunofluorescen n diagnosticarea diferitelor tipuri

de distrofinopatii.
Imunohistochimia prin imunofluorescen este o tehnica imunohistochimic,
de marcare cu fluorocromi, n care anticorpul primar nemarcat, care recunoate
antigenul tisular corespunztor, este identificat prin incubarea ulterioar a seciunilor
cu un anticorp secundar marcat, obinut prin imunizarea altei specii cu
imunoglobulina G a speciei care a furnizat anticorpul primar. Aceast metod este
specific deoarece cel puin dou molecule de anticorpi secundari pot lega fiecare
molecul de anticorp primar (Van Noorden, 1986, Ervasti J. i col., 1991).
n comparaie cu tehnica imunohistochimic clasic de marcare cu peroxidaz
n studiile realizate de noi agentul de developare este FITC (izotiocianat de
fluorescein) cuplat cu Streptavidin.
Prin aceast tehnic au fost analizate modificrile de expresie fenotipic
pentru urmtoarelor proteine sarcolemale: distrofina, utrofina, - sarcoglican sarcoglican, - sarcoglican, merozina, disferlina, nNOS i caveolina-3 deoarece la
Pagina 10
Rezumat
nivelul genelor care le codific apar mutaii care determin aparaia diferitelor tipuri
de distrofii musculare..
Absena distrofinei sau a unei proteine din complexul proteinelor asociate
distrofinei determin reducerea secundar i a altor proteine. Pentru evitarea unor
rezultate incorecte, la fiecare pacient luat n studiu au fost analizate toate proteinele
mai sus menionate pentru a se identifica n mod corect deficiena proteic primar
precum i reducerile secundare care apar n alte proteine.
Deoarece distrofina este o protein foarte mare, evaluarea expresiei
fenotipice trebuie realizat utiliznd mai muli anticorpi cu specificitate pentru mai
multe domenii ale proteinei. Utilizarea simultan a celor trei anticorpi duce la
ndeprtarea rezultatelor fals negative care apar n cazurile particulare cu mutaii inframe. Cei 3 anticorpi utilizai sunt direcionai mpotriva a trei din cele patru domenii
structurale ale acestei proteine: Dys1-pentru domeniul central al distrofinei, Dys 2 pentru captul C - terminal al distrofinei, i Dys 3 - pentru captul N - terminal al
distrofinei
Interpretarea seciunilor marcate imunohistochimic s-a facut n comparaie cu
seciunile martor provenite de la pacieni cu afectare neurologic i la care muchiul
nu este afectat.
Studiul de fa s-a realizat pe un lot de 40 de pacieni cu diagnostic clinic de
distrofie muscular progresiv de diferite tipuri sau la care diagnosticul nu a putut fi
precizat prin metoda imunohistochimic i s-a dorit o precizare de diagnostic.
Pacienii luai n studiu au provenit de la Laboratorul de Neurotiine din cadul
Spitalului Clinic Colentina care au fost selectai n perioada septembrie 2005-iulie
2008. Alturi de cei 40 de pacieni, au fost introdui n studiu i alte 10 cazuri care au
reprezentat lotul martor.
Biopsia muscular s-a realizat la Clinica de Chirurgie a Spitalului Colentina,
de fiecare dat folosindu-se tehnica biopsiei musculare deschise, sub anestezie
local cu xilin 2%.
Pentru studiul proteinelor sarcolemale s-au folosit crioseciuni deoarece pn
n prezent exist puini anticorpi care reacioneaz pe seciuni mparafinate. Ca
Pagina 11
Rezumat
probe martor s-au folosit seciuni de muchi provenite de la subieci cu neuropatii la

care proteinele sarcolemale au o expresie normal.
Evidenierea expresia distrofinei i utrofinei la pacienii diagnosticai cu distrofie
muscular
Folosind anticorpii primari anti Dys1, Dys2 i Dys3 se observ c la pacienii
fr afectare muscular, exist o reacie imunohistochimic pozitiv pentru
distrofin, pe faa intern a membranei fibrelor musculare, fiecare fibr pezentnd un
marcaj uniform pe ntreaga suprafa a sarcolemei.
n cazul marcrii cu anticorp anti-utrofin (DRP) protein cu similariti
structurale i funcionale cu distrofina n proporie de 80%, s-a observat c reacia
imun apare n muchiul adult normal exclusiv la nivelul jonciunii neuromusculare.
Prin marcarea celorlalte proteine sarcolemale nitric oxid sintaza de tip
neuronal (nNOS), sarcoglinanii -, - i -, caveolina-3 i disferlina, prin
imunohistochimie cu fluorescen se observ reacii imune pozitiv, la nivelul
membranei fibrelor musculare.
Pentru o mai bun interpretare a rezultatelor obinute, n mod convenional
intensitatea semnalului fluorescent a fost notat astfel: semnal fluorescent puternic
(+),semnal redus (+/-) i lipsa semnalului fluorescent (-).
La pacienii fr afectare muscular distrofina este localizat, pe faa intern
a membranei fibrelor musculare, fiecare fibr pezentnd un marcaj uniform (Hoffman
i colab.1988) pe ntreaga suprafa a sarcolemei. Celelalte proteine musculare
luate n studiu, fiind proteine sarcolemale sunt localizate tot la nivelul sarcolemei.
n cele mai multe cazuri biopsiile pacienilor cu distrofie muscular
Duchenne, relev o absen total a marcajului pentru distrofin pentru cei trei
anticorpi, directionai mpotriva a trei domenii structurale ale distrofinei: domeniul Cterminal (Dys 2), domeniul central (Dys 1) i domeniul N-terminal (Dys 3).
Imunomarcajul pentru utrofina la pacienii cu DMD relev extinderea
compensatorie a acestei proteine omoloag distrofinei de la nivelul jonciunii
neuromusculare unde este prezent n mod normal, pe ntreaga suprafa intern a
sarcolemei fibrelor musculare n ncercarea de a se atenua fenotipul distrofic.
Pagina 12
Rezumat
La pacienii cu distrofie muscular Becker analizele de imunofluorescen

realizate pe crioseciuni de esut muscular relev o variaie a marcajului pentru
distrofin. Astfel, imunomarcarea pentru unul sau pentru toi cei trei anticorpi
direcionai mpotriva celor trei domenii ale distrofinei poate fi redus. Au fost ntlnite
i cazuri n care imunomarcarea pentru un anticorp anti-distrofina este absent n
timp ce pentru ceilali doi este prezent. Acest lucru se datoreaz deleilor care au
loc n gena distrofinei i care, cu toate c ndeprteaz poriuni largi din protein,
menin cadrul de citire. Aceste deleii sunt asociate cu distrofia muscular Becker
(proteina trunchiata). (Brown and Lucy,1997). Aproximativ 95% din cazuri se supun
acestei reguli dar exist i excepii.
Totodat imunomarcajul la aceti pacieni poate prezenta ntreruperi sau
poate avea o intensitate mai redus dect la martor.
Evideniera expresiei sarcoglicanilor la pacieni cu distrofii musculare.
n studiul nostru a fost evaluat expresia sarcoglicanilor , , la pacienii cu
distrofinopatii ct i la pacienii la care distrofina a avut o expresie normal pentru
identificarea proteinei deficiente i precizarea corect a diagnosticului.
Studiile de imunofluorescen au artat c deficiena sarcoglicanilor nu
determin pierderea distrofinei i a distroglicanilor de la nivelul membranei, n timp
ce mutaiile care determin modificri la nivelul distrofinei sunt nsoite de o reducere
a expresiei complexului sarcoglicanilor.
Evidenierea expresiei nitric oxid sintazei (nNOS) la pacienii cu DMD/ BMD.
Pe acelai lot de pacieni la care s-a studiat expresia distrofinei, a fost
studiat i expresia nNOS, cunoscndu-se faptul c acesta este un component
important al complexului proteinelor asociate distrofinei i determin sinteza oxidului
nitric n muchi.
Prin imunofluorescen s-a observat c intensitatea semnalului pentru
nNOS este direct proporional cu intensitatea semnalului pentru distrofin.
La pacienii diagnosticai clinic cu distrofie muscular Duchenne analiza
expresiei nNOS, prin tratatea seciunilor de muchi cu anticorpi primar mpotriva
nNOS, s-a observat c la nivelul membranei fibrelor musculare reacia imun este
Pagina 13
Rezumat
complet absent (-) comparativ cu esutul normal la care expresia este observat dea lungul ntregii membrane musculare.
Totodat s-a observat c la toi pacienii cu distrofie muscular Becker care
prezint o deleie a exonului 48 din gena distrofinei sunt caracterizai n mod
surprinzator de un nivel redus al expresie nNOS n ciuda faptului c la aceti pacieni
distrofina este prezent, semnalul avnd o intensitate asemntoare sau uor
redus comparativ cu seciunile martor.
S-a observat o deficien a nNOS i n distrofiile musculare de tip forma
centurilor n special cnd este implicat complexul sarcoglicanilor sugerndu-se faptul
c deficienele fluxului sangvin pot contribui n patogenia altor forme de distrofii
musculare.
Aceste studii sugereaz importana introducerii studiului nNOS att la pacienii
cu distrofinopatii n special la pacienii cu distrofie muscular Becker care prezint
deleii n poriunea mijlocie a domeniului central al distrofinei.
Evidenierea
expresiei
caveolinei-3
la
pacieni
cu
distrofii
musculare
progresive
Caveolina-3 este exprimat n muchiul scheletic i cardiac i este localizat
la nivelul sarcolemei fibrelor musculare, unde formeaz un complex cu distrofina i
proteinele asociate acesteia prin legarea la domeniul intracelular al -distroglicanilor
(Song i col., 1996). Totui caveolina-3 n cele mai multe cazuri pare s nu fie direct
asociat cu complexul proteinelor asociate distrofinei ( Crosbie i col., 1998).
Dintre pacienii lotului de studiu pentru determinarea expresiei caveoline-3 au
fost selectai 10 pacieni la care celelalte proteine musculare aveau o expresie
normal i pentru care clinicienii au stabilit ca diagnostic distrofie muscular
progresiv. Acest diagnostic este dat atunci cnd pacientul prezint un tablou tipic
pentru distrofie muscular, are CK serice n concentraie mare (mai mare de 500U/
I), EMG indic un tablou electric modificat i nu se cunoate cu exactitate cauza
apariiei bolii.
n urma analizei expresiei caveolinei-3 s-a constatat c unul dintre cele 10
cazuri luate n studiu a prezentat o expresie modificat.
Pagina 14
Rezumat
S-a observat c distrofina este normal exprimat la pacientul cu caveolina-3

redus i general la toi pacienii cu caveolina-3 absent, expresia distrofinei este
normal.
Evidenierea expresiei merozinei la pacieni cu distrofii musculare
Evidenierea expresiei merozinei este solicitat de clinicieni atunci cnd copilul
nu are mai mult de 1-2 ani i prezint simptomele tipice unei distrofii musculare:
hipotonie, contracturi ale articulaiilor, slbiciune muscular generalizat i reflexe
tendinoase diminuate sau chiar absente. Distrofia muscular dat de deficiena n
aceast protein este de tip congenital, DMC cu deficit primar de laminin 2 este o
boal cu transmitere autosomal recesiv care apare datorit mutaiilor care au loc la
nivelul genei care codific laminin 2.
n studiul realizat, din totalul celor 28 de pacieni cu suspiciune de DMC am
gsit expresie redus a merozinei doar la pacientul 5056, un copil n vrst de 2 ani.
La acest pacient s-a observat expresia redus a distrofinei, ndeosebi n ce privete
domeniul cental i cel C-terminal, expresia utrofinei este extins de la nivelul
jonciunilor musculare la nivelul sarcolemei, o expresie normal a sarcoglicanilor iar
expresia nitric oxid sintazei este absent.
CONCLUZII
Rezultatele obtinue n urma aplicarii tehnicii de imunofluorescen pe seciuni

ngheate demonstreaz c proteinele luate n studiu pot avea o expresie diferit
n diferitele tipuri de distrofii musculare, acest lucru datorndu-se multiplelor
interacii care au loc ntre acestea.
Analizele imunohistochimice - imunofluorescena - este necesar n stabilirea

diagnosticului ntruct permite identificarea specific a proteinei deficiente i n
consecin permit stabilirea unui diagnostic de certitudine pentru distrofiile
musculare.
Deficiena primar a unei proteine poate induce deficiena secundar a altor

proteine cu care se afl n interaciune. De aceea este necesar evaluarea
Pagina 15
Rezumat
expresiei utrofinei, a sarcoglicanilor, a merozinei, caveolinei, disferlinei precum i

a altor proteine cunoscute a fi responsabile de producerea altor tipuri de distrofii
musculare. Se evit, astfel, stabilirea unui diagnostic greit avnd n vedere
faptul c aceste proteine interacioneaz unele cu altele.
Prin imunofluorescen proteinele sunt vizualizate la nivelul sarcolemei

fibrelor musculare.
Distrofinei este esenial pentru stabilirea diagnosticului de distrofie

muscular Duchenne i Becker.
Analiza imunohistochimic prin imunofluorescen relev n cazul pacientilor

cu distrofie muscular Duchenne o absena total a imunomarcajului pentru
distrofina pentru cei trei anticorpi directionai mpotriva a trei domenii structurale
ale proteinei. Totui evaluarea expresiei distrofinei prin imunofluorescen a
permis detectarea unor fibre cu imunomarcaj pentru distrofin intr-un numar mic
de fibre. Aceste fibre cu semnal se numesc fibre revertante. Expresia distrofinei
n aceste fibre revertante reiese din incercarea restabilirii cadrului de citire dar
mecanismul prin care se intampl acest lucru nu este cunoscut inc.
Imunomarcarea pentru utrofin demostreaz extinderea compensatorie a

acestei proteine de la nivelul jonciunii neuromusculare pe intreaga suprafa a
sarcolemei n incercarea de a diminua procesul distrofic.
n cazurile cu distrofie muscular Duchenne s-a observat reducerea expresiei

sarcoglicanilor. Datele din literatura de specialitate susin acest lucru.
Expresia nNOS la pacienii cu distrofinopatii este n corelaie direct cu gradul

de exprimare a distrofinei. Aceste studii sugereaz importana introducerii
studiului nNOS att la pacienii cu distrofinopatii n special la pacienii cu distrofie
muscular Becker care prezint deleii n poriunea mijlocie a domeniului central
al distrofinei.
Pagina 16
Rezumat
Biopsiile pacienilor diagnosticai BMD au prezentat o intensitate variabil a

imunomarcajului pentru distrofina. S-a observat astfel, c unele cazuri BMD
relev o reducere a intensitii marcajului pentru distrofin pentru cei trei
anticorpi utilizai. S-au gasit cazuri care posed fibre cu marcaj discontinuu, ceea
ce, de asemenea, constituie o caracteristic a expresiei distrofinei n BMD. De
asemenea n BMD poate s lipseasc imunomarcajul pentru un anticorp al
distrofinei cu meninerea semnalului pentru ceilali doi.
Expresia utrofinei la cazurile BMD prezint de asemenea o expresie variabil.

poate fi prezent pe suprafaa majoritii fibrelor sau poate fi prezent la un
numr variabil de fibre. n literatura de specialitate se susine c exist o
variabilitate a expresiei utrofinei n BMD, variabilitate aflat n corelaie direct cu
gradul de exprimare a distrofinei la nivelul sarcolemei.
Prin imunofluorescen a fost identificat un caz cu caveolina-3 redus.

Diagnosticul de LGMD 1C poate fi pus ns numai prin analiza mutaiilor din
gena caveolinei-3.
n CAPITOLUL 4. DETERMINAREA CANTITATIV A EXPRESIEI

PROTEINELOR
MUSCULARE
IMPLICATE
DISTROFIILE
MUSCULARE s-au avut n vedere urmtoarele obiective:

Analiza expresiei fenotipice a proteinelor musculare prin Western
blotting, pe lotul de studiu.
Corelarea datelor obinute prin imunofluorescen cu cele obinute
prin Western blot.
Stabilirea unui tip particular de distrofie muscular este posibil numai prin
identificarea deficienei biochimice specifice, iar identificarea acestei deficiene se
poate realiza prin evaluarea expresiei proteinelor incriminate n patogeneza
Pagina 17
Rezumat
distrofiilor musculare utiliznd tehnici imunohistochimice i cofirmate apoi prin

western blotting.
Examenul Western blot este extrem de important, mai ales n diagnosticarea
corect a pacienilor cu BMD i n stabilirea modificarilor calitative i cantitative ale
moleculei de distrofin. De asemnea, analiza Western blot este necesar pentru
direcionarea studiilor genetice ulterioare, oferind informaii despre localizarea
relativ a mutaiei i facilitnd astfel analiza genetic.
Western blot-ul (sau electrotransferul) este o metod de imunoanaliz utilizat
pentru detectarea unor cantitai foarte mici dintr-o anumit protein dintr-un lizat
celular. Proba este supus electroforezei n gel de poliacrilamid-SDS pentru a se
separa constituienii proteici i apoi transferat pe un suport solid (membrana
nitroceluloz) unde este pus n eviden cu anticorpi specifici.
Metoda presupune mai multe etape:
Electroforeza
Transferul pe membrana de nitroceluloz
Blocarea situsurilor nespecifice
Detecia
Analiza rezultatelor
S-au analizat prin aceast metod un numar de 40 pacieni care anterior au
fost diagnosticai prin imunofluorescen cu DMD i DMB precum i pacieni la care
toate proteinele musculare investigate au fost prezente, diagnosticul neputnd fiind
precizat prin imunofluorescen.
La pacientii normali utilizarea anticorpului directionat mpotriva domeniului
central al distrofinei detecteaz un dublet de benzi la 427 kDa i 400 kDa,
corespunzatoare masei moleculare a distrofinei plus mai muli metabolii cu mas
molecular mai mic, n timp ce anticorpului direcionat mpotriva domeniul C
terminal al proteinei detecteaz o singur band la 427 kDa.
La pacienii cu Distrofie muscular Duchenne n general se observ absena
complet a marcrii distrofinei pe blot att pentru anticorpul direcionat mpotriva
Pagina 18
Rezumat
domeniului central al proteinei ct i pentru anticorpul direcionat mpotriva

domeniului C terminal.
La aceti pacieni se observ meninerea semnalului pentru calpain la 94
kDa i 30 kDa precum i a celui pentru disferlin la 230 kDa. S-a observat ns o
reducere secundar a sarcoglicanilor si
La pacienii diagnosticai cu Distrofie muscular Becker expreisa distrofinei pe
blot este variabil. Se pot observa fie benzi cu o intensitate mai redus, pentru unul
sau pentru cei 2 anticorpi direcionai mpotriva celor dou domenii ale distrofinei
(Dys 1, Dys 2), fie semnalul pentru unul din cei doi anticorpi poate s lipseasc.
La pacienii diagnosticai cu Distrofie musculara de tip forma centurilor 2A se
observ absena benzilor corespunzatoare calpainei-3 (la 94, 30 i 60 kDa) cu
meninerea expresiei pentru distrofina, att pentu Dys 1 ct i pentru Dys 2.
n urma analizei western blot pe lotul de studiu la 13 cazuri diagnosticate cu
DMD s-a observat absena total a semnalului pentru distrofina pentru cei doi
anticorpi utilizai fenotipul fiind corelat cu distrofie muscular Duchenne. La 6
pacieni din lotul de studiu a fost observat reducrea semnalului pentru distrofina
pentru cei doi anticorpi utilizai i intr-un singur caz s-a observat reducerea
semnalului pentru anticorpul direcionat mpotriva domeniului central al distrofinei
(Dys 1) i absena semnalului pentru anticorpul direcionat mpotriva domeniului Cterminal (Dys 2). Ambele fenotipuri sunt corelate cu distrofia muscular Becker.
Din lotul de studiu au fost identificate un numr de 5 cazuri cu distrofie
muscular forma centurilor de tip 2A produs de absena calpainei-3. i un caz cu
calpain-3 redus la pacientul identificat cu distrofie muscular Duchenne.
CONCLUZII
Identificarea defectului proteic n biopsia muscular este important n
selectarea dintre pacieni a posibililor candidai pentru detecia mutaiilor genice.
Metoda Multiplex Western blot permite analiza simultan a mai multor

proteine implicate n distrofii musculare, prin utilizarea de cocktail-uri de anticorpi
Pagina 19
Rezumat
primari (amstec de anticorpi), fiind foarte util n stabilirea cu precizie a unui

diagnostic de distrofie muscular.
Aceast metoda este util n mod particular n diagnosticul pacientilor DMB,

ntruct prin aceast tehnic poate fi identificat mult mai uor distrofina cu mas
molecular mai mic sau mai mare.
Evaluarea expresiei distrofinei prin metoda western blotting, are valoare de

diagnostic pentru distrofinopatii, permind stabilirea cu precizie a tipului de
distrofie muscular.
Analiza Western blotting este n mod particular util n diagnosticul DMFC

2A, n identificarea i evaluarea expresiei calpainei-3. Analiza imunohistochimic
este recent introdus n studiul calpainei-3 .
Analizele
Western
blotting
se
coreleaz
bine
cu
analizele
de
imunohistochimie la pacienii cu diferite forme de distrofii musculare.
n CAPITOLUL 5 ANALIZA DUPLICAIILOR I DELEIILOR DE LA

NIVELUL GENEI DISTROFINEI PRIN TEHNICA MLPA obiectivele
carea u fost urmrite sunt urmtoarele:
Investigare molecular a genei distrofinei pe lotul de
subieci diagnosticai clinic DMD/BMD

Identificarea mutaiilor din gena distrofinei pe lotul de
studiu;
Corelarea rezultatetelor cu cele obinute prin wetern blot i

imunofluorescena
Cele mai comune mutaii care au loc n gena distrofinei sunt deleiile care
reprezint aproximativ 65 % din totalul mutaiilor i duplicaiile cu o frecven
cuprins ntre 5% i 15%. ( Abbs i col., 1992). Deleiile i mai rar duplicaiile pot avea
loc de-a lungul ntregi gene dar s-a demonstrat c exist doua zone fierbini n gena
Pagina 20
Rezumat
distrofinei numite zone hotspot n care frecvena mutaiilor este foarte ridicat. Una
dintre acestea este zone este situat n regiunea central a genei iar cealalt spre
capatul 5 al genei.
Procentele rmase sunt reprezentate de mutaii punctiforme ce apar datorit
mutaiilor frame-shift sau mutaiilor de tip nonsense.
Tehnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) introdus
de ctre Schouten i col. n anul 2002, permite detectarea sistematic a
modificrilor cantitative i calitative de la nivelul exonilor genei distrofinei - mutaii de
tipul deleiilor i duplicaiilor. Cu ajutorul acestei tehnici se pot identitifica cu un bun
randament deleiile i duplicaiile genice responsabile de apariia DMD/BMD.
Au fost analizate prin aceast tehnic un numar de 40 de pacieni la care s-a
stabilit prin metodele prezentate anterior: imunofluorescen i western blotting c
proteina implicat n procesul distrofic este distrofina. Dintre aceti 40 de pacieni, 9
sunt de sex feminin ntre care dou gemene n vrst de 9 ani iar restul 11 sunt
baiei cu vrste cuprinse ntre 3-15 ani
Probele biologice au constat n 3 ml sange recoltat pe EDTA din care n
continuare s-a efectuat extracia de ADN.
Datele obinute n urma aplicrii protocolului de MLPA la probele luate n
studiu au fost corelate cu cele obinute prin imunofluorescen i western blotting
pentru stabilirea unor corelaii ntre rezultatele obinute prin imunofluorescen i
western blotting.
Tehnica MLPA a permis realizarea screeningului celor 79 exoni ai genei
distrofinei n dou recaii PCR. Este o metod simpl i rapid i care ofer rezultate
foarte exacte fiind identificai prin aceast metod un numr de 13 pacieni care au
prezentat mutaii la nivelul genei distrofinei. Majoritatea mutaiilor au fost de tipul
deleiilor la 12 pacieni i un singur pacient a prezentat duplicaii. n cazul probelor
analizate deleiile au implicat n general exonii 45-50.
Metoda permite identificare a deleiilor care au loc la nivelul unui singur exon.
n cadrul studiului nostru a fost identificat dou cazuri care au prezentat o deleie la
nivelul unui singur exon exonul 45 n cazul probei 22 si exonul 38 n cazul probei 9.
Pagina 21
Rezumat
n cazul probei 22 la care a fost identificat deleia exonului 45, prin analiza
de imunofluorescen s-a observat absena semnalului pentru distrofin. Analiza
western blot a confirmat absena semnalului. Cercetrile de specialitate au artat c
deleia exonului 45 determin sinteza unor cantiti mici de distrofina deleia acestui
exon fiind implicat n distrofia muscular Duchenne. Diagnosticul n cazul acestui
pacient a fost de distrofie muscular Duchenne.
Corelarea datelor obinute prin imunofluorescena i westen blotting cu cele
rezultate n urma reaciei de MLPA la aceti pacieni, a condus la stabilirea
diagnosticului de distrofie muscular Duchenne.
Corelaiile genotip-fenotip sunt dificil de realizat deoarece foarte muli pacieni
cu distrofie muscular Duchenne ct i distrofie muscular Becker prezint excepii
de la teoria cadrului de citire a lui Montoni.
Probele la care nu au fost identificate mutaii dup aplicarea protocolului
MLPA vor fi supuse unei noi testri moleculare pentru identificarea eventualelor
mutaii punctiforme.
CONCLUZII:
MLPA este o tehnic uoar, rapid i care ofer rezultate

foarte bune n analiz.
Permite screeningul celor 79 de exoni din gena distrofinei prin

doar dou reacii PCR
Permite corect identificare a mrimii deleiilor i duplicaiilor

care au loc n gena distrofinei.
Permite identificarea naturii mutaiilor facilitnd corelaiile

genotip fenotip. Teoria cadrului de citire a fost postulat de Monaco i
col.,1988 conform creia mutaiile care schimb cadrul de citire duc la
distrofie muscular Duchenne n schimb cele care nu schimb cadrul de
citire conduc la distrofie muscular Becker. Totui aceast teorie nu poate
explica cele dou fenotipuri DMD i BMD ca produs al mutaiilor care au loc
n aceeai gen.
Pagina 22
Rezumat
Cu toate c tehnica MLPA poate detecta o mutaii care au loc la
nivelul unui singur exon este recomandat ca pentru determinarea mutaiilor

punctiforme s fie utilizat o tehnic specific (de ex. High ResolutionMelting Curve Analysis).
Au fost identificate doua probe la care un singur exon este
deletat. Exonul 45 la proba 22. i exonul 38 la proba 9.

Sunt dificil de identificat cu aceast tehnic i mutaiile situate
n vecintatea situsurilor de ligare ale sondelor.

Prin aceast tehnic au fost identificate mutaii la 13 pacieni.
Majoritatea au fost deleii n 12 cazuri i o singur prob a prezentat

duplicaii.
Tehnica permite orientare ulterioara a probelor spre alte metode
moleculare.
CAPITOLUL
GENA
DISTROFINEI
DETERMINAREA
MUTAIILOR PUNCTIFORME obiective urmrite au fost:

Identificarea mutaiilor punctiforme aprute la nivelul genei distrofinei
prin tehnica High Resolution Melting Curve Analysis.
Identificarea mutaiilor punctiforme prin secveniere
Gena distrofinei este cea mai mare gen descris la om fiind format din mai
mult de 2.5 milioane perechi de baze ceea ce corespunde la mai mult de 0.1 % din
ntregul genom i aproximativ 1.5% din ntregul cromozom X ( LM Kunkel i col.,1989).
DMD i DMB sunt afeciuni ereditare recesive X- linkate cauzate de mutaii la
nivelul genei distrofinei i caracterizate prin reducerea sau absena expresiei
distrofinei din sarcolema muchiului striat. 2035% dintre pacienii cu DMD i BMD
nu prezint deleii sau duplicaii la nivelul genei distrofinei ( R.G. Roberts i col.,1994).
Pagina 23
Rezumat
Identificarea mutaiilor la aceti pacieni putea fi facut doar prin determinarea

mrimii genei distrofinei.
Metoda - High Resolution-Melting Curve Analysis este o tehnic nou folosit
pentru identificarea mutailor puctiforme care au loc n gena distrofinei, mutaii care
pot determina att un fenotip DMD ct i DMB.
Tehnica HR-MCA (high resolutionmelting curve analysis) a fost introdus n
anul 2002 ca rezultat al colaborarii dintre Universitatea din Utah i firma Idaho
Technology.din USA. Fiind o metod simpl de genotipare, identificare a mutaiilor i
alinierea secvenelor, popularitatea ei este n continu cretere.
Au fost selectai pentru studiul mutaiilor punctiforme probele la care, n urma
aplicrii tehnici MLPA, nu au fost identificate muaii de tipul deleiilor sau duplicaiilor.
Au fost analizate prin aceast tehnic un numar de 13 de pacieni (8 pacieni
de sex feminin ntre care dou gemene n varst de 9 ani iar restul 5 sunt baiei cu
vrste cuprinse ntre (3-15 ani) cu diagnostic clinic de distrofie muscular progresiv
i la care s-a stabilit prin metodele prezentate anterior: imunofluorescena i western
blotting c distrofina are o expresie modificat.
Probele biologice au constat n 3 ml sange recoltat pe EDTA din care n
continuare s-a efectuat extracia de ADN.
Pentru identificarea mutaiilor punctiforme sau a inseriilor mici aprute n
gena distrofinei, la pacienii luai n studiu, n urma aplicarii protocolului pentru
tehnica High Resolution-Melting Curve Analysis au fost identificate mutaii
punctiforme distribuite randomizat de-a lungul ntregii zone.
Analiza HR-MCA arat diferene ntre forma curbei de melting corelat cu
genotipul i prezena SNP heterozigote.
Mutaiile punctiforme sunt ntlnite de-a lungul ntregii gene fr a exista zone
cu o frecvena mai ridicat, totui n rezultatele noastre la nivelul exonului 53 A,
exonul 23 B i exonul 16 au fost indentificate cele mai multe mutaii punctiforme n
probele analizate.
n urma analizei celor 36 de exoni au fost identificate mutaii punctiforme la 12
pacieni. La 5 din pacienii luai n studiu nu a fost identificat nicio mutaie la nivelul
Pagina 24
Rezumat
exonilor luai n studiu, pentru stabilirea unui diagnostic n cazul acestor pacieni fiind
necesar investigarea i restului de exoni din gena distrofinei.
La 7 pacieni au fost identificate o mutaie punctiform la nivelul unui exon
(probele 3, 10, 14, 15, 16, 25), 4 pacieni au prezentat mutaii punctiforme la nivelul e
doi exoni (probele 9, 12, 17, 40) i un singur caz a prezentat mutaii punctiforme la
nivelul a trei exoni (proba 30).
Prin secveniere au fost analizat 14 probe selectate din acele probe la care
prin MCA nu au fost observate mutaii, dar diagnosticul clinic a fost de distrofie
muscular. A fost ales pentru secveniere si proba 14, una din gemenele analizate
prin tehnica MCA, deoarece ambele prezentau aceasi mutatie.
La dou probe (proba 12, proba 14) mutaia punctiform prezent a
determinat formarea codonului STOP formarea lor determinnd producere unei
proteine foarte afectate care este rapid degradat ( Matsuo M., 1996).
Este vorba despre probele 12 si 14 la care au avut loc modificarie: n cazul
probei 12 - c.1990C>T (CAG>TAG, Glutamine>STOP) i n cazul probei 14
c.1843C>T (CAA>TAA, Glutamine>STOP).
Totodat n cazul probei 9, mutaia determinat (c.11046+119 A>G) prezint o
patogenie necunoscut.
CONCLUZII
Au fost identificate prin aceast metod mutaii punctiforme la 12 pacieni din

lotul de studiu.
Metoda nu necesit o prelucrarea anterioar a probelor i nici dup amplificarea

PCR.
Explorarea mutaiilor i alinierea secvenelor depinde de diferenele care rezult

n heteroduplexuri i care schimb forma curbei temperaturii de melting.
Mutatiile punctiforme sunt distribuite randomizat de-a lungul ntregii gene a

distrofinei.
Pagina 25
Rezumat
Forma curbei de topire este n mod expres utilizat n alinierea secvenelor i

analiza mutaiilor ca un indicator al heterodulexurilor formate n ADN heterogen.
Monitorizarea fluorescenei a profilelor de melting ale produsilor PCR permite

identificarea mutatiilor n soluie far a fi necesar separarea prin gel de agaroz
sau pe coloan.
Este o metod uoar care ntr-un timp foarte scurt permite identifcarea
modificarilor la nivelul fiecrui exon, oriennd cutarea mutaiei ntr-o anumit
regiune a genei, nemaifiind necesar secvenierea ntregii gene DYS.
CONCLUZIILE GENERALE privind studiul realizat sunt prezentate

n CAPITOLUL 7 i reprezint o sintez a datelor obinute ca urmare
a cercetrii realizate.
Evidenierea prin imunofluorescen a proteinelor musculare implicate n
diferite tipuri de distrofii musculare.
Imunofluorescena - este necesar n stabilirea diagnosticului ntruct permite
identificarea specific a proteinei deficiente i n consecin permit stabilirea
unui diagnostic de certitudine pentru distrofiile musculare.
Rezultatele obinute n urma aplicarii tehnicii de imunofluorescen pe seciuni
nghetate demonstreaz c proteinele luate n studiu pot avea o expresie
diferit n diferitele tipuri de distrofii musculare, acest lucru datorndu-se
multiplelor interacii care au loc ntre acestea. Deficiena primar a uneia
dintre proteine poate induce deficiena secundar a altor proteine cu care se
afl n interaciune. De aceea este necesar evaluarea expresiei utrofinei, a
sarcoglicanilor, a merozinei, caveolinei-3, disferlinei precum i a altor proteine
cunoscute a fi responsabile de producerea altor tipuri de distrofii musculare.
Se evit, astfel, stabilirea unui diagnostic greit avnd n vedere faptul c
aceste proteine interacioneaz unele cu altele.
Pagina 26
Rezumat
Prin imunofluorescen proteinele sunt vizualizate la nivelul sarcolemei fibrelor

musculare.
Analiza imunohistochimic a distrofinei este esenial pentru stabilirea
diagnosticului de distrofie muscular Duchenne i Becker. Prin aceast
tehnic se relev n cazul pacienilor cu distrofie muscular Duchenne o
absen total a imunomarcajului pentru distrofin pentru cei trei anticorpi
direcionai mpotriva a trei domenii structurale ale proteinei.
Au fost identificati prin aceasta metoda un numar de 14 pacieni cu distrofie
muscular Duchenne.
Imunomarcarea pentru utrofin demostreaz extinderea compensatorie a
acestei proteine de la nivelul jonciunii neuromusculare pe ntreaga suprafa
a sarcolemei n ncercarea de a diminua procesul distrofic.
n cazurile cu distrofie muscular Duchenne s-a observat reducerea expresiei
sarcoglicanilor. Datele din literatura de specialitate susin acest lucru.
Biopsiile pacienilor diagnosticai BMD au prezentat o intensitate variabil a
imunomarcajului pentru distrofina. S-a observat astfel, c unele cazuri BMD
relev o reducere a intensitii marcajului pentru distrofin pentru cei trei
anticorpi utilizati. S-au gasit cazuri care posed fibre cu marcaj discontinuu,
ceea ce, de asemenea, constituie o caracteristic a expresiei distrofinei n
BMD. De asemenea in BMD poate sa lipseasca imunomarcajul pentru un
anticorp al distrofinei cu mentinerea semnalului pentru ceilalti doi.
Expresia utrofinei la cazurile BMD prezinta de asemenea o expresie variabil.
poate fi prezent pe suprafaa majoritii fibrelor sau poate fi prezent la un
numr variabil de fibre. n literatura de specialitate se susine c exist o
variabilitate a expresiei utrofinei n BMD, variabilitate aflat n corelaie direct
cu gradul de exprimare a distrofinei la nivelul sarcolemei.
Pagina 27
Rezumat
A fost stabilit un protocol de marcare imunofluorescent privind

expresia proteinelor: disferlin, caveolin-3, nNOS i merozin.
o Expresia nNOS la pacienii cu distrofinopatii este n corelaie direct
cu gradul de exprimare a distrofinei.
o Expresia merozinei a fost modificat n cazul unei singure probe
o A fost identificat un sigur caz cu caveolin redus. Diagnosticul de
LGMD 1C poate fi pus ns numai prin analiza mutaiilor din gena
caveolinei-3.
o Optimizarea protocolului de marcare imunofluorescent pentru
disferlin a permis identificarea unei probe cu disferlin redus.
Evidenierea prin western blot a proteinelor musculare implicate n diferite
tipuri de distrofii musculare.
Identificarea defectului proteic n biopsia muscular este important n
selectarea dintre pacieni a posibililor probe candidate pentru detecia
mutaiilor genice.
Metoda Multiplex Western blot permite analiza simultan a mai multor
proteine implicate n distrofii musculare, prin utilizarea de cocktail-uri de
anticorpi primari (amstec de anticorpi), fiind foarte util n stabilirea unui
diagnostic de distrofie musculare cu mare precizie.
Aceast metod este util n mod particular n diagnosticul pacienilor DMB,
ntruct prin aceast tehnic poate fi identificat mult mai usor distrofina cu
mas molecular mai mic sau mai mare.
Evaluarea expresiei distrofinei prin metoda western blotting, are valoare de
diagnostic pentru distrofinopatii, permind stabilirea cu precizie a tipului de
distrofie muscular.
Analiza Western blot n cazul pacienilor cu DMD relev absena total a
distrofinei pentru ambii anticorpi utilizai (Dys 1- direcionat mpotriva
Pagina 28
Rezumat
domeniului central al distrofinei si Dys 2- direcionat mpotriva captului Cterminal al distrofinei).

Aceast analiz a dus la identificarea unui numar de 10 cazuri DMD i 9
cazuri DMB
Cazurile cu distrofie muscular Becker relev pe blot benzi fie benzi cu o
intensitate mai redus fat de martor pentru cei doi anticorpi utilizai mpotriva
celor dou domenii ale distrofinei, fie benzile corespunztore unui anticorp pot
s lipseasc (Dys 1 absent, Dys 2 prezent sau invers).
Imunomarcarea distrofinei pe blot prin aceast metod este foarte util n
cazul
pacienilor
cu
distrofie
muscular
Becker,
deoarece
permite
determinarea distrofinei cu mas molecular modificat, fie mai mare de 427

kDa fie mai mic de 427 kDa.
Analiza western blot a permis identificarea unui pacient DMD la care s-a
observat absena semnalului pentru distrofin pentru cei doi anticorpi utilizai,
dar la care s-a observat i o reducere a semnalului pentru calpaina-3 la
94kDa, caz rar ntlnit i n literatura de specialitate.
A fost identificat un caz la care n urma analizelor imunohistochimice a fost
observat o reducere a semnalului pentru - sarcoglican pacienta fiind
diagnosticat cu LGMD 2C. Analiza western blot la acest pacient a confirmat
reducerea - sarcoglicanului dar a fost observat i absena semnalului
pentru calpaina-3. Cazul este cu att mai interesant cu ct ntre cele dou
proteine nu exist o corelaie direct. Se pare totui c exist o legatur ntre
cele
dou
prin
intermediul
filaminei
C.
Complexul
sarcoglicanilor
interactioneaza cu filamina C (proteina citoscheletica) prin intermediul cozii

sarcolpasmatice a - sarcoglicanului si -sarcoglicanului. Calpaina 3 cliveaz
poriunea C-terminal a filaminei modernd interaciunea ntre filamina C i
sarcolicani
A fost stabilit un protocol de evidenierea prin western blot a proteinelor
musculare calpaina-3 (exonul 8), i -sarcoglicani i disferlin.
Pagina 29
Rezumat
Analiza Western blotting este n mod particular util in diagnosticul

LGMD 2A, n identificarea i evaluarea expresiei calpainei 3.
Nicio prob nu a evideniat absena semnalului pentru disferlin prin

western blotting.
Analizele Western blotting se coreleaz bine cu analizele de

imunohistochimie
la
pacienii
cu
diferite
forme
de
distrofii
musculare.
7.3. Analiza duplicaiilor i deleiilor de la nivelul genei distrofinei prin
tehnica MLPA
A fost pus la punct pentru prima dat n Romnia un protocol de
stabilire a eventualelor deleii i duplicaii la nivelul genei distrofinei

prin tehnica MLPA i care a scos n eviden urmtoarele aspecte:
Deleiile identificate la nivelul genei distrofinei au fost situate n cele

dou zone hot spot.
Prin aceast tehnic au fost identificate mutaii la 13 pacieni.

Majoritatea au fost deleii n 12 cazuri i o singur prob a
prezentat duplicaii.
Au fost identificate doua probe la care un singur exon este deletat.

Exonul 45 la proba 22. i exonul 38 la proba 9.
7.4. Gena Distrofinei Determinarea Mutaiilor Punctiforme.
A fost pus la punct pentru prima dat n Romnia un protocol de

stabilire a eventualelor mutaii punctiforme la nivelul genei distrofinei
prin tehnica HR-MCA.
Analiza High Resolution-Melting Curve Analysis a permis identificarea

unui numr mare de mutaii punctiforme n gena distrofinei.
Au fost identificate prin aceast metod mutaii punctiforme la 12

pacieni din lotul de studiu.
Pagina 30
Rezumat
Explorarea mutaiilor i alinierea secvenelor depinde de diferenele

care rezult n heteroduplexuri i care schimb forma curbei
temperaturii de melting.
Mutatiile punctiforme sunt distribuite randomizat de-a lungul ntregii

gene a distrofinei.
Forma curbei de topire este n mod expres utilizat n alinierea

secventelor i analiza mutaiilor ca un indicator al heterodulexurilor
formate n ADN heterogen.
Este o metod uoar care ntr-un timp foarte scurt permite

identifcarea modificarilor la nivelul fiecrui exon, oriennd cutarea
mutaiei ntr-o anumit regiune a genei, nemaifiind necesar
secvenierea ntregii gene DYS.
Pagina 31
Rezumat
BIBLIOGRAFIE
o Aartsma-Rus A, Janson AA, van Ommen GJ, van Deutekom JC..
Antisense-induced exon skipping for duplications in Duchenne muscular
dystrophy. BMC Med Genet 8:43. (2007).
o Anderson L.V.B. K. Davison, Multiplex Western Bloting System For The
Analysis Of Muscular Dystrophies Proteins. Am. J. Pathol., 154 (4),
1999,1017-1022. 1179, (1998).
o Anderson Lv, Davison K, Moss Ja, Richard I, Fardeau M, Tome Fm,
Hubner C, Lasa A, Colomer J & Beckmann Js . Characterization Of
Monoclonal Antibodies To Calpain 3 And Protein Expression In Muscle From
Patients With Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2a. American Journal Of
Pathology, 153: 1169- 1174, 2000
o Anderson, L.V., Davison, K., Moss, J.A., Young, C., Cullen, M.J., Walsh,
J., Johnson, M.A., Bashir, R., Britton, S., Keers, S., Argov, Z., Mahjneh, I.,
Fougerousse, F., Beckmann, J.S., Bushby, K.M.. Dysferlin is a plasma
membrane protein and is expressed early in human development. Hum. Mol.
Genet. 8: 855861. (1999)
o Anderson, L.V., Harrison, R.M., Pogue, R., Vafiadaki, E., Pollitt, C.,
Davison, K., Moss, J.A., Keers, S., Pyle, A., Shaw, P.J., Mahjneh, I., Argov,
Z., Greenberg, C.R., Wrogemann, K., Bertorini, T., Goebel, H.H.,
Beckmann, J.S., Bashir, R., Bushby, K.M. Secondary reduction in calpain 3
expression in patients with limb girdle muscular dystrophy type2B and Miyoshi
myopathy (primary dysferlinopathies). Neuromusc. Disord. 10: 553559.
(2000).
o Bashir R, Britton S, Strachan T, et al. A gene related to Caenorhabditis
elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular
dystrophy type 2B. Nat Genet;20:3742.(1998).
o Bakker E., Van Ommen G.J.B.. Duchenne and Becker Muscular Dystrophy
(DMD and BMD). In Neuromuscular Disorders: Clinica land Molecular
Genetics, Ed by, A.E.H., Emery, John Wiley & Sons Ltd., 59 -85. (1998)
o Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM Detection of 98% of
DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet 86:45
48. (1990)
o Beggs AH. Dystrophinopathy, the expanding phenotype. Dystrophin
abnormalities in X-linked dilated cardiomyopathy [editorial; comment].
Circulation.; 95: 23447. (1997).
o Bione S, Maestrini E, Rivella S, Mancini M, Regis S, Romeo G, Toniolo D:
Identification of a novel X-linked gene responsible for Emery-Dreifuss
muscular dystrophy. Nat Genet, 8:323-327, 1994
o Blake D.J. . Function And Genetics Of Dystrophin And Dystrophin - Related
Proteins In Muscle. Physiol Rev. 82, 291 329 (2002)
Pagina 32
Rezumat
o Blake, D.J., Weir, A., Newey, S.E. and Davies, K.E. (2002). Function and
genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol.
Rev. 82:291329.
o Bonemann A., Anderson L.V.. Diagnostic protein expression in human
muscle biopsies. Brain Pathol., 10, 193 - 214. (2000)
o Bonne G, Di Barletta MR, Varnous S, Becane HM, Hammouda EH, Merlini
L, Muntoni F, Greenberg CR, Gary F, Urtizberea JA et al.: Mutations in the
gene encoding lamin A/C cause autosomal dominant Emery- Dreifuss
muscular dystrophy. Nat Genet, 21:285-288, (1999).
o Bnnemann, C.G. Limb-girdle muscular dystrophies: an overview. J.
Child. Neurol. 14: 3133. (1999).
o Bushby K.M.D.. The limb girdle muscular dystrophies multiple genes,
multiple mechanisms. Human Molecular Genetics, 8 (10): 1875 1882.
(1999)
o Campbell K.B.. Three muscular dystrophies loss of cytoskeleton extracellular
matrix linkage. Cell, 80, 675 - 679. (1995)
o Campbell, K.P. and Kahl, S.D. Association of dystrophin and an integral
membrane glycoprotein. Nature 338: 259262. (1989).
o Cao H, Hegele RA: Nuclear lamin A/C R482Q mutation in Canadian kindreds
with Dunnigan- type familial partial lipodystrophy. Hum Mol Genet 2000,
9:109-112.
o Carpenter, S, Karpati, G: Pathology of Skeletal Muscle. New York: Churchill
Livingstone; (2002).
o Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT Deletion
screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA
amplification. Nucleic Acids Res 16:1114111156. (1988)
o Cohn, R.D. And Campbell, K.P Molecular Basis Of Muscular Dystrophies.
Muscle Nerve 23, 14561471 (2000)
o Crosbie RH, Lebakken CS, Holt KH, Venzke DP, Straub V, Lee JC, Grady
RM, Chamberlain JS, Sanes JR, Campbell KP. Membrane targeting and
stabilization of sarcospan is mediated by the sarcoglycan subcomplex. J Cell
Biol;145:153165. (1999).
o Crosbie RH, Lim LE, Moore SA, Hirano M, Hays AP, Maybaum SW, Collin
H, Dovico SA, Stolle CA, Fardeau M, Tome FM, Campbell KP. Molecular
and genetic characterization of sarcospan: insights into sarcoglycansarcospan interactions. Hum Mol Genet;9:20192027. (2000).
o Culligan K.G., Mackey A.J., Finn D.M., Maguire P.B., Ohlendieck K. Role of
dystrophin isoforms and associated proteins in muscular dystrophy, Int. J.
Med., 2, 639 648. (1998).
o Dalkilic I, Schienda J, Thompson TG, Kunkel LM. Loss of Filamin C (FLNc)
results in severe defects in myogenesis and myotube structure. Mol Cell
Biol;26:65226534. (2006).
o Davies, K.E., Smith, T.J., Bundey, S. et al. Mild and severe muscular
dystrophy associated with deletions in Xp21 of the human X chromosome. J.
Med. Genet., 25: 9-13. (1988)
Pagina 33
Rezumat
o De Sandre-Giovannoli A, Chaouch M, Kozlov S, Vallat JM, Tazir M,

Kassouri N, Szepetowski P, Hammadouche T, Vandenberghe A, Stewart
CL et al.: Homozygous defects in LMNA, encoding lamin A/C nuclearenvelope proteins, cause autosomal recessive axonal neuropathy in human
(Charcot- Marie-Tooth disorder type 2) and mouse. Am J Hum Genet, 70:726736. 2002
o Deconinck, A.E., Rafael, J.A. Skinner, J.A., Brown, S.C., Potter, A.C.,
Metzinger, L., Watt, D.J., Dickson, G., Tinsley, J.M., and Davies K.E.
Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular
dystrophy. Cell 90: 717-727. (1997)
o Den Dunnen, J.T. (2001). Point Mutation detection in the dystrophin gene. In:
Bushby K.M.D. & Anderson L.V.B. (Editors), Muscular Dystrophy: Methods
and Protocols. (Number 43 in the Methods in Molecular Medicine series.)
Humana Press, Totowa, NJ, pp. 85109.
o Dubowitz V. 41st ENMC international workshop on congenital muscular
dystrophy, 810 March, Naarden, The Netherlands. Neuromuscul Disord
1996;6:295306. 1996
o Duchenne, G.B.A. (1868). Recherches sur la paralysie musculaire pseudohypertrophique ou paralysie myo-sclrotique. Archives gnrales de
Mdecine 11:525, 179209, 305321, 421443, 552588.
o Duggan DJ, Gorospe JR, Fanin Met al. Mutations in the sarcoglycan genes
in patients with myopathy. New Engl J Med; 336: 618624, 1997
o Emery, A.E.H. and Dreifuss, F.E. Unusual type of benign X-linked muscular
dystrophy. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 29, 338342, (1966).
o Ervasti, J.M. and Campbell, K.P. Dystrophin and the membrane skeleton.
Curr. Opin. Cell Biol. 5, 8287, (1993)
o Fairley EA, Kendrick-Jones J, Ellis JA: The Emery-Dreifuss muscular
dystrophy phenotype arises from aberrant targeting and binding of emerin at
the inner nuclear membrane. J Cell Sci, 112:2571-2582. 1999
o Fardeau, B. Eymard, C. Mignard, F. M. S. Tomb, I. Richard, J. Beckmann.
Chromosome 15-Linked Limb Girdle Muscular Dystrophy Clinical
Phenotype Neuromuscular Disorders, Volume 6, Issue 2, March, Page S7,
(1996)
o Ferlini A, Sewry C, Melis MA, Mateddu A, Muntoni F. X-linked dilated
cardiomyopathy and the dystrophin gene. Neuromuscul Disord.; 9: 33946.
1999
o Flanigan KM, von Niederhausern A, Dunn DM, Alder J, Mendell JR,Weiss
RB.. Rapid direct sequence analysis of the dystrophin gene. Am J Hum Genet
72:931939, 2003.
o Francesco Muntonib, Dominic J. WellsNeuromuscular Disorders 13 2131,
(2003)
o Frosk P, Weiler T, Nylen E, Sudha T, Greenberg Cr, Morgan K, Fujiwara
Tm, Wrogemann K. Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2h Associated
With Mutation In Trim32, A Putative E3 Ubiquitin-Ligase Gene. Am J Hum
Genet; 70:66372, (2002).
Pagina 34
Rezumat
o Fulizio L, Chiara Nascimbeni A, Fanin M, Piluso G, Politano L, Nigro V,

Angelini C. Molecular and muscle pathology in a series of caveolinopathy
patients. Hum Mutat.;25:829. 2005
o Grady, R. M., Teng, H., Nichol, M.C., Cunningham, J.C., Wilkinson, R.S.,
and Sanes, J.R. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin
and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90: 729-738.
(1997)
o Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, Pryor RJ, Chen J, Wittwer CT.
Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for
differentiating homozygotes and heterozygotes. Clin Chem;49:396406. 2003
o Guyon, J. R. et al. Calpain 3 cleaves filamin C and regulates its ability to
interact with - and-sarcoglycans. Muscle Nerve 28, 472483 (2003)
o Hack AA, Lam MY, Cordier L, Shoturma DI, Ly CT, Hadhazy MA, Hadhazy
MR, Sweeney HL, McNally EM. Differential requirement for individual
sarcoglycans and dystrophin in the assembly and function of the dystrophinglycoprotein complex. J Cell Sci;113:25352544. 2000
o Hanna K. Kolski, Cynthia Hawkins, Mayana Zatz, Flavia de Paula, Doug
Biggar, Ben Alman and Jiri Vajsar Diagnosis of limb-girdle muscular
dystrophy 2A by immunohistochemical techniques Neuropathology 2007
o Heydemann A, Huber JM, Demonbreun A, Hadhazy M, McNally EM.
Genetic background influences muscular dystrophy. Neuromuscul Disord
2005;15:6019. Frosk P, Greenberg CR, Poulin A, et al. The most common
mutation in FKRP causing limb-girdle muscular dystrophy 2I (LGMD2I) may
have occurred only once and is present in Hutterites and other populations.
Hum Mutat 2005;25:3844.
o Hoffman, E.P. Et Al. Dystrophin: The Protein Product Of The Duchenne
Muscular Dystrophy Locus. Cell 51, 919928, (1987)
o Holaska JM, Lee KK, Kowalski AK, Wilson KL: Transcriptional repressor
germ cell-less (GCL) and barrier-to-autointegration factor (BAF) compete for
binding to emerin in vitro. J Biol Chem, 278:6969-6975, 2002
o Ibraghimov - Berskrovnaya O., Ervasti J.M., Leveille C.J. S. (1992). Primary
structure of dystrophin associated glycoproteins linking dystrophin to the
extracellular matrix, Nature, 355, 696 - 702.
o Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J.. MLPA analysis
for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the
dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics 6:2935. 2005
o Jean-Marie Gillis. The Functional Consequences of Dystrophin Deficiency in
Skeletal Muscles, Principle of Molecular Medicine , (Eds) M.S Runge;C
Patterson ed.Hardcover. (2006).
o K. Kinbara, H. Sorimachi, S. Ishiura, K. Suzuki, Skeletal Muscle Specific
Calpain, P94, Biochem. Pharmacol. 56 415420, (1989)
o Keira Y, Noguchi S, Minami N, Hayashi YK, NishinoI. Localization of
calpain 3 in human skeletal muscleand its alteration in limb-girdle muscular
dystrophy 2A muscle. J Biochem (Tokyo); 133: 659664. 2003
Pagina 35
Rezumat
o Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, et al. Complete cloning of the

Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic
organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell;50:509
17. 1987
o Koenig M, Hoffman Ep, Bertelson Cj, Monaco Ap, Feener C, Kunkel Lm
Complete Cloning Of The Duchenne Muscular Dystrophy (Dmd) Cdna And
Preliminary Genomic Organization Of The Dmd Gene In Normal And Affected
Individuals. Cell 50: 509-517, (1987)
o Lapidos K.A., Kakkar R., McNally E.M.. The Dystrophin Glycoprotein
Complex, Signaling Strnght and Integrity for the Sarcolemma. Circulation
Res., 94, 1023 1031. (2004)
o Lazarus, R., Vercelli, D., Palmer, L. J., et al. (2002) Single nucleotide
polymorphisms in innate immunity genes: abundant variation and potential
role in complex human disease. Immunol. Rev.190, 925.
o Matsuda, C., Hayashi, Y.K., Ogawa, M., Aoki, M., Murayama, K., Nishino,
I., Nonaka, I., Arahata, K., and Brown, R.H., Jr. The sarcolemmal proteins
dysferlin and caveolin-3 interact in skeletal muscle. Hum. Mol. Genet. 10,
17611766 (2001).
o Ozawa E, Npguchi S, Mizuno Yet al. From dystrophinopathy to
sarcoglycanopathy: evolution of a concept of muscular dystrophy. Muscle
Nerve; 21: 421-438. (1998).
o Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals
G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification. Nucleic Acid Res;30(12): e57, (2002).
o Schwartz M, Duno M.. Improved molecular diagnosis of dystrophin gene
mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method.
Genet Test 8:361367, (2004).
o Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals
G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification. Nucleic Acid Res;30(12): e57, (2002).
o Schwartz M, Duno M.. Improved molecular diagnosis of dystrophin gene
mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method.
Genet Test 8:361367, (2004).
o Yvonne M. Kobayashi, Erik P. Rader, Robert W. Crawford, Nikhil K.
Iyengar, Daniel R. Thedens, John A. Faulkner, Swapnesh V. Parikh,
Robert M. Weiss, Jeffrey S. Chamberlain, Steven A. Moore & Kevin P.
Campbell Sarcolemma-Localized Nnos Is Required To Maintain Activity After
Mild Exercise. Nature, (2008).
Pagina 36

Rezumat Teza

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Rezumat Teza

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Rezumat

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

Molecular - Baza de Cercetare cu Utilizatori

Universitatea din Bucureti

Studiile au fost finanate integral din proiectul de

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

CAPITOLUL I: Distrofiile musculare...................................................................6

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

2.5. Proteine citosolice.................................................................................................... 62

PARTEA A IIA: . CONTRIBUII PERSONALE

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

4.2.3. Detecia proteinelor musculare prin western blott..........................................130

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

Bolile musculare includ un numr mare de afeciuni care recunosc diferite

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

Cu ajutorul tehnicilor de imunohistochimie i investigaiilor genetice, s-a

colagenVI), din sarcomere (telotonina, miotilica, titina, nebulina), din citosol

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

diagnosticarea i caracterizarea distrofiilor musculare prin analize structurale,

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

Contribuiile personale au fost structurate n 7 fiecrae dintre ele avnd

n CAPITOLUL 3, DETERMINAREA CALITATIV A EXPRESIEI

MUSCULARE s-a urmrit:

Analiza expresiei fenotipice a proteinelor musculare implicate n diferite

imuonofluorescen n biopsiile musculare;

Evidenierea corelaiilor dintre expresiile proteinelor sarcolemale i a

imunomarcare prin imunofluorescen n diagnosticarea diferitelor tipuri

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

probe martor s-au folosit seciuni de muchi provenite de la subieci cu neuropatii la

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

La pacienii cu distrofie muscular Becker analizele de imunofluorescen

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

S-a observat c distrofina este normal exprimat la pacientul cu caveolina-3

Rezultatele obtinue n urma aplicarii tehnicii de imunofluorescen pe seciuni

Analizele imunohistochimice - imunofluorescena - este necesar n stabilirea

Deficiena primar a unei proteine poate induce deficiena secundar a altor

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

expresiei utrofinei, a sarcoglicanilor, a merozinei, caveolinei, disferlinei precum i

Prin imunofluorescen proteinele sunt vizualizate la nivelul sarcolemei

Distrofinei este esenial pentru stabilirea diagnosticului de distrofie

Analiza imunohistochimic prin imunofluorescen relev n cazul pacientilor

Imunomarcarea pentru utrofin demostreaz extinderea compensatorie a

n cazurile cu distrofie muscular Duchenne s-a observat reducerea expresiei

Expresia nNOS la pacienii cu distrofinopatii este n corelaie direct cu gradul

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

Biopsiile pacienilor diagnosticai BMD au prezentat o intensitate variabil a

Expresia utrofinei la cazurile BMD prezint de asemenea o expresie variabil.

Prin imunofluorescen a fost identificat un caz cu caveolina-3 redus.

n CAPITOLUL 4. DETERMINAREA CANTITATIV A EXPRESIEI

MUSCULARE s-au avut n vedere urmtoarele obiective:

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

distrofiilor musculare utiliznd tehnici imunohistochimice i cofirmate apoi prin

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

domeniului central al proteinei ct i pentru anticorpul direcionat mpotriva

Identificarea defectului proteic n biopsia muscular este important n

selectarea dintre pacieni a posibililor candidai pentru detecia mutaiilor genice.

Metoda Multiplex Western blot permite analiza simultan a mai multor

Tez de doctorat Drd Gisela Gin, 2008

primari (amstec de anticorpi), fiind foarte util n stabilirea cu precizie a unui

Aceast metoda este util n mod particular n diagnosticul pacientilor DMB,

Evaluarea expresiei distrofinei prin metoda western blotting, are valoare de

Analiza Western blotting este n mod particular util n diagnosticul DMFC

imunohistochimie la pacienii cu diferite forme de distrofii musculare.