La replicacién de los RNA-virus de cadena negativa’ D. F, SUMMERS, V. HILL, S. HARMON, L. MARNELL, P. CORTES, R. SHEPPARD and M, A. ROSEVEAR?,, En afios recientes, los investigadores han esta- blecido muchos hechos relacionados con la estrus tura, biologfa molecular y epidemiologia del gran nimero de RNA-virus animales encapsulados y de hélice negativa, muchos de los cuales son agentes patégenos humanos importantes de distribucién mundial. Sin embargo, un problema central en relacin con esta amplia clase de agentes infec- ciosos, que no ha sido solucionado todavia, es el del mecanismo (s) por el cual las grandes RNA- polimerasas virales pueden cambiar de una moda- lidad transcriptiva a otra replicativa. Este proceso incluye un cambio singular en la forma como la enzima reconoce y copia la informacién genémica y en los productos de la respectiva modalidad fun- cional. La transcripcién origina segmentos “‘in- completos” y hélices que son metiladas, poliade- niladas y cubiertas, mientras que la replicacion ge- nera productos completos (+) y hélices (—) ensam- bladas en los complejos ribonucleoprotéicos (RNP) (ver fig. 1} (1-3) 1. Presentado en el It Congreso Interamericano de tnfectolog Universidad’ del Norte, Barranduilla, 27-29 de septiembce de 1984. Teaduecién Wolfgang Munar 2. Todos fos autores: Department of Celular, Viral and Molecular Biology. University of Utan Medical School. Salt Lake City, Utah. USA, © Universidad det Norte, Salud Uninorte, Barranquilla (Col), 2 (2): 111 = 120, 1985, Nuestro laboratorio ha seleccionado, como sis temas modelo de estudio, los rabdovirus, el virus de la estomatitis vesicular (VSV) que es un miem- bro de la familia de los Rabdovirus y el virus in- fluenza tipo A; el primero contiene un genoma conformado por RNA de cadena simple ¢ intacta que ordena la sintesis de cinco proteinas virales especificas y el dltimo contiene un genoma de ‘ocho segmentos que dirigen la sintesis de diez proteinas virales. La secuencia completa de cada uno de estos genomas ya ha sido determinada (2,3). Los RNA-virus encapsulados y de hélice negati- va se dividen en dos grupos: existen dos familias con genomas ininterrumpidos (los rabdovirus y los paramixovirus) y tres, con genomas segmentados (los arenavirus con dos segmentos, los bunyavirus con tres y los ortomixovirus con acho). Los virus que son miembros de la familia comparten varias caracterfsticas comunes; por ejemplo, todos po- seen nucleocdpsides helicoidales compuestas de una sola proteina estructural rodeada por una cu- bierta lipidica de doble estrato. En asocio con el complejo RNP interno se encuentra la transcrip- tasa/replicasa que, en la mayorfa de los casos, es un polipéptido Unico y grande (PM 200.000 aprox.) 0 como en el caso de los rabdovirus, es un heterod/mero que contiene una subunidad mayor (L) [PM 241.000] y otra fosforilada y pequefia (NS) [PM 28.000]. La excepcién, en términos de composicién polipeptfdica, es la enzima encontra- mProporcién 80/20 =~ /+ Reunién de proteinas RNP (L, NS, IV) acompanada por sintesis de RNA Necesita sintesis de Conductor N producto cistron VSV N ppp m/GpppA™p Www A (A)n, ect +? factor huésped TRANSCRIPCION: ee REPLICACION (90% de sv eproporcion? (10% de VSV total total - sintesis el factor sintesis de RNA especifico) de RNA especifico) huésped NS. (-) Conductor Ns ™ ¢ L Ho 06a" aera, wedceey ‘sacEEaY NapeEG) cna” ee SN Fae GAAA Genoma *v 2.000 copias ~ 11,000 bases de proteina N 50 copias de polimerasa RNA heterodinémica (NS) Ly) asociada con virién RNP patrén, esto es complejo transcriptivo, nimero desconocide con complejo replicador 3} - UTA ~ Serial accidn de Poli A +2.base separadora intercistrénica no transcrita INFLUENZA: Modelado desde la segunda base en todos los segmentos genémicos mlcppp x”... yea) asaccace = —~“* __aaaain) Cap + 10-13 bases desde el hutsped 15-22 mdedticos no em RNA en el nicl wanseritos dese la enzima puede ser principal con APG. ImRNAs dese os seamentos 78,8 estén unides TRANSCRIPCION \Xiniisdorcon —_a_—_—_—E—eeeewrr > a > REPLICACION * 0 < P/20 nucledticos sgenoma cerca de 11.500 bases Exige sintesis de protefna 1 molécula de prote(na’ 2 enzima comprometida 4 union de NPS: (+) durante la sintesis (a replicadora Jasiento en la célula Pep 3 Fig. 1. Esquema que representa la transcripclin y la repliacion del virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) y of de fa Influenza, m2 Salud Uninorte, Saranguilla (Co), 2 (2): 111 -120, 198da en los influenzavirus donde se trata de un he- terotrimero de dos subunidades bésicas y una dci- da, cada una de ellas con un peso molecular de unos 80,000 (1-3). La mas profundamente estudiada de las RNA- polimerasas de virus de hélice negativa es la de los virus de la estomatitis vesicular (VSV) y de los de virus influenza, en los que se trata de enzimas multifuncionales que comparten caracter‘sticas durante los ciclos replicativos virales. vsv: a) Transcripcién: Ha sido claramente demostrado que la enzima dimérica LINS1 del VSV requiere de ambas subunidades para cumplirla funcion de transcriptasa; los productos de esta reaccién in vivo e in vitro son una corta secuencia gu/a tri- fosforilada y los cinco mRNA monocistrénicos, cubiertos, metilados y poliadenilados. Existe un acuerdo general en el sentido de que la enzi- ma tiene sitios activos cuya funcién es adicio- nar la cubierta y los grupos metil- y poli-adeni- lar los mRNA. Se ha visto que la activacién de la metilacin es una de las funciones que resi- de en la subunidad L; en dos mutaciones de VSV -que se pudo detectar habian ocurrido a nivel del cistrén L- no fue posible lograr in vitro la metilaci6n de los mRNA del VSV (4). El que fa enzima del VSV inicie la transcripcién en un sitio 3° de entrada tinico o el que lo haga tam- bign en sitios internos (5-7); el que la enzima sintetice una transcripcién grande con procesa- miento nucleot(dico 0 se detenga en las cortas secuencias intergénicas y la reinicie al comienzo del siguiente gen, son problemas que todavia no han sido resueltos (6). (ver fig. 1). b) Replicacién: La RNA-polimerasa del VSV sufre ciertas modificaciones por mecanismos que to- davia no han sido identificados; posiblemente sea un factor del huésped (8-14), la fosforila- cién de una unidad pequefia y/o un cambio en el ntimero de subunidades de la enzima (15) y una desviacién hacia la modalidad replicativa de tal manera que los productos de esta reac cién sean copias completas (+) y (—) del geno- ma que al ser sintetizadas van siendo ensambla- das, en part culas RNP que contienen proteinas N, NS y L (16). La modalidad replicativa re- quiere de la sintesis simulténea de proteinas (17-19) y se necesita como minimo a la protel na N para poder realizar la reaccion in vitro (17, Salud Uninorte. Barranquilla (Col), 2(2}: 111 120, 1985 18), Todavia quedan ciertas dudas por aclarar con relacién a la naturaleza de los controtes de transcripcidn/replicacién, el papel de los niveles de NS en la fosforilacién y la composicién de transcriptasa versus replicasa. Influenza a) Transcripcién. Durante la modalidad de trans- cripcién la enzima tripartita del virus influenza (PB1-PB2-PA) también recubre, metila y poli- adenila los hnRNA del virus, pero esto Io hace mediante la ruptura endonucleolitica del mRNA. de la célula huésped (dentro del nucleo) para producir una estructura cobertora de 10a 13, nucleétidos que son usados para la transcripcién primaria (3,20). La transcripcién se inicia a ni: vel de la segunda base de cada segmento gené mico (3) y estas reacciones, aparte de las de elongacién y finalizacién/poliadenilacién, son levadas a cabo por la enzima. E| proceso de fi- nalizacién llega a detenerse 15 a 22 nucledtidos antes del extremo 5’ del genoma. Ya que la transcripcién del virus influenza depende del hnRNA recién sintetizado por la célula hués- ped, es posible que el proceso pueda ser blo- queado por la actinomicina D. Es interesante anotar aqué que el Bunyavirus La Crose tiene una proteina grande (L) que es la RNA polimerasa putativa, Esta enzima utiliza para la transcricpién un mecanismo casi similar al descrito para el virus influenza (21). b) Replicacién: La replicacién del virus influenza depende de la sintesis simulténea de proteinas es inhibida, como ocurre con todos los virus de hélice negativa, por la cicloheximida, No se sabe cuales subunidades enzimaticas estén com- prometidas en la replicacién, cual puede ser el sitio de la célula donde ocurre la misma o si la desviacién hacia la modalidad replicativa tal vez ‘comprometa una o més de las tres protefnas no estructurales (NS1, NS2 6 M2). En caso de que exista una protefna que modifique la enzima del virus influenza, un posible candidato serfa NS1 debido a las siguientes razones: (1) una mutacién ts en el segmento genético 8, que co- difica la sintesis de NS1, produce una disminu- cin de més del 90% en la sintesis del virién RNA (-); (2) NS1 es producida en etapas ini- ciales del ciclo replicativo y es transportada al niicleo y nucléolo (23) y (3) parece tratarse de tuna protefna enlazadora de RNA (24). 13Con la intencién de definir el mecanismo (s) que regula (n) la RNA polimerasa del VSV y del virus influenza, nuestro laboratorio ha se- leccionado diversas técnicas. Describiré estos enfoques brevemente y discutiré también nues- tras futuras Ifneas de investigacién al respecto. Replicacién in vivo ein vitro del RNA del VSV: Cuando iniciamos nuestra investigacién sobre los complejos de RNA del VSV Io hicimos con el ‘objeto de estudiar la replicacién del genoma viral in vivo e in vitro, Era sabido que esta reaccién sin tética dependia de una sintesis proteica simulté nea, mientras que la transcripcién para formar mRNA no lo era (19). Nuestros estudios iniciales fueron enfocados hacia el proceso de replicacién in vivo y al seguir esta reaccién nos apoyamos en el hecho de que, si se analizaban extractos celulares infectados mediante gradientes de CsCl, todos los productos de la transcripcin se encontrarfan en la fraccién de la cdpsula, mientras que los RNA del ge- noma replicado aparecerfan en una banda cuya den- sidad es de 1,31gm/ml, Estos estudiosestablecieron que la tasa de replicacién mostraba un pico nico a las 4,5 horas postinfeccién y representaba el 10% de la sintesis de RNA especifico para VSV en células Hela infectadas viralmente, Estos experi- mentos mostraron también que la sintesis del ge- noma completo y de la hélice representaba un 40% de la sintesis del RNA gendmico dos horas postinfeccién (Pl) mientras que, a las 4-6 horas, PI representaba el 15-20%, Estos estudios también demostraron que este virus encapsulado era libera- do de la célula infectada en forma de un “estalli- do” a las 4-7 horas Pl (25, 26) En un esfuerzo para separar las diversas formas de compleios RNP intracelulares (en replicacién, en transcripcién y los que estaban préximos a ser empacados en viriones) examinamos diversos mé- todos que empleaban la separacién basada en ta- mao, en la densidad, etc. Finalmente, comproba- mos que los gradientes lineales de renografina separarfan, al menos “bioqu(micamente”, los com- plejos RNP transcriptivos y replicativos. Es decir, en las células infectadas los complejos replicativos marcados con 3H-Uridina quedaban intactos y aparecian en la banda como un pico claramente agudo, mientras que las moléculas nacientes de mRNA se disociaban del elemento transcriptivo y se localizaban en la porcién superior de los gra- dientes. Demostramos que las hélices repticativas m4 nuevas eran resistentes a la RNA-asa, es decir, eran incluidas dentro de tos complejos RNP du rante la sintesis siendo su polaridad negativa en un 85% tal y como hab/an predicho nuestros anterio- res estudios, Otras investigaciones con el empleo de los gra- dientes de renografina demostraron que estos com plejos RNP en formacién podtan ser “cazados” 0 inclufdos dentro de complejos genémicos comple- tos. Adin més, su sintesis podia ser bloqueada in- hibiendo la sintesis proteica mediante el uso de la cicloheximida, tal y como uno podria predecir que cocurriria con los complejos en replicacién (27), Posteriormente, examinamos cudles eran las proteinas VSV-especificas que eran ensambladas en los complejos RNP nacientes durante su stnte- sis; pudimos sefialar que las tres prote/nas RNP (L, NS y N) eran co-ensambladas. Contrariando previas presunciones, estos estudios también de mostraron que existia una agrupacién intracelular de estas proteinas capaces de apoyar 20-30 minu- tos de replicacién después de adicionar ciclohexi- mida (16). Logramos establecer, entonces, un método que permitia diseminar particulas RNP de VSV para microscopra electronica (ME) usando EDTA y asumimos que, si habramos podido aislar comple- jos replicativos “‘intactos” usando gradientes de Fenografina, podriamos identificar tales complejos bajo el ME usando el tratamiento con EDTA. De hecho lo logramos y pudimos identificarlos como complejos de 10 x 4000 nm que permanecian in- tactos después de ser desenrrollados por accién del EDTA. Muchos complejos replicativos con RNP nacientes lucian como estructuras idénticas a una horquilla con dimensiones de 20 x 2000 nm. No fue posible encontrar elementos RNP lineales desenrrollados con hélices sencillas nacientes, To- dos parecian existir en la forma de horquilla ya descrita (28,29). Después de completar los estudios in vivo de la replicacién del VSV, empezamos a establecer un sistema para_analizar la replicacién in vitro del RNA del VSV. Pensébamos que debfamos aco- plar la transcripcién del VSV a un sistema tra- ductor capaz de producir las proteinas del virus dirigiendo as/ la replicacién mediante complejos replicativos intracelulares. El primer sistema que utilizamos (un S10 obtenido a partir de células HeLa infectadas por VSV) fue exitoso y produjo un bajo nivel de replicacién in vitro, EI RNA com- Salud Uninorte, Barranquilla (Col), 2 (2): 111-120, 1985pleto de hélices (+) y (—) fue ensamblado in vitro en particulas RNP, las cuales eran resistentes a la RNA-asa, aparecfan en las bandas de CsCl de 1,31 g/cc de densidad y contenian primordial- mente RNA de hélice (—) y un poco de protefna N. El sistema $10 infectado no era inhibido por accién de la cicloheximida debido al hecho de que los extractos de células infectadas contenfan gru- pos de las protefnas necesarias para mantener una replicacién suficiente hasta para 60 minutos de sintesis in vitro (30). Posteriormente, llevamos a cabo la misma reac cién de replicacién in vitro con células HeLa S10 no infectadas, empleando complejos de replica- cién de origen intracelular como fuentes de mate- rial, En este sistema, en el que no existfan las pro- tefnas preformadas, pudimos demostrar de nuevo la sintesis de moléculas completas de RNA (+) y (—) que eran ensambladas dentro de las particulas RNP. Este sistema era completamente inhibido por accién de la Pactamicina u otros inhibidores de la sintesis proteica (31). Odtuvimos un antisuero monoespec fico -me- diante la inoculacién en ganglios popliteos de co- nejo- de cada uno de los productos derivados de los genes de! VSV incluyendo las protefnas L y NS de la transcriptasa viral. Usando nuestro siste- ma acoplado in vitro, que ahora dependia de sin- tesis proteica, pudimos establecer directamente si L y/o NS también estaban comprometidas en la replicacion, Primero comprobamos la monoespe- cificidad del suero (32) y luego comparamos los efectos de estos sueros sobre la capacidad de las RNP intracelulares para transcribir mRNA con los efectos sobre la replicacién que genera RNA com- pletos (32,33) Los resultados que obtuvimos fueron los siguien- tes: 1. EI anti-NS inhib(a totalmente tanto la replica- cién como la transcripcién; 2. El anticL estimulaba, por un lado, de 1,5 a2 ve- ces la replicacién (por mecanismos que aun no son claros) mientras por el otro inhibfa la trans- cripcién por completo; 3. EI suero anti-N no tenia ningin efecto sobre la transcripcién pero inhibfa totalmente la repli- cacién presumiblemente debido a la deplecién de la prote(na N necesaria para mantener el ensamblaje ribonucleoproteico. Salud Uninorte. Barranquilla (Col.), 2 (2): 111 -120, 1985 La proteincinasa asociada al virién y la fosfori- lacién de las proteinas NS: Iniciamos también ciertos estudios tendientes a analizar si la fosforilacién de la pequefia subuni dad enzimética NS representaba algdn papel en la regulacién enzimética, Habia sido previamente de- mostrado que el dATP podia servir como un subs- trato apropiado para la proteincinasa asociada al VSV, pero no asi para la transcriptasa (34). Los autores de este Ultimo articulo sugerfan que la fosforilacién de proteinas RNP era un evento ne- cesario para activar la transcriptasa viral. Para es- tudiar la relacién entre la fosforilacién de L_y NS y la funcién de la transcriptasa, seguimos estos pa- rmetros en reacciones in vivo que contenian RNP purificadas. Pudimos encontrar que existia una li beracién permanente de NS fosforilada provenien- te de las RNP durante la reaccidn de la cinasahasta Por un periodo de 2 horas. Tratando de inhibir es Pecificamente la proterncinasa, utilizamos TLCK, Un inhibidor de proteasas, det cual se habia infor- mado.que inhibia una cinasa muscular del conejo (35) y demostramos que este compuesto inhibia completamente la cinasa y la transcriptasa del VSV. Estos estudios sugerian fuertemente -aun- que no establecian el requerimiento- que la fosfo- rilacin de L y/o NS era un requisito para activar Ja transcripcién (36). Por cuanto estos experimentos con las reaccio nes in vivo con cinasas no eran concluyentes, nos Parecié que un andlisis directo de! niimero de si- tios de fosforilacion y de su localizacién en la pro- tefna NS seria algo més definitivo, especialmente si tenfamos en cuenta que ya habia sido publicada la secuencia total de NS (37). Iniciamos, pues, un esfuerzo mayor para obtener una enzima (L, NS") y un complejo RNP-P completamente puros con los cuales pudiéramos realizar estudios de recons titucién in vitro de la actividad de ta transcriptasa y de la protefna NS. Un resultado de nuestra puri- ficacién enzimatica fue que mientras obten famos una mayor cantidad de los elementos purificados, la actividad de la proterncinasa disminura hasta de- saparecer. Posteriormente, pudimos demostrar que la actividad de cinasa asociada al virién no era aislada o co-purificada en ninguna prote{na espe: cifica del VSV, ni era precipitada por ningin anti- suero contra las proteinas del VSV y que la tra- ducci6n in vitro de los mRNA del VSV no produ- cia un incremento en la actividad de cinasa. Liega- mos a la conclusién de que la cinasa del virién era una protefna de la célula huésped (38) 15Anilisis De la secuencia de aminodcidos derivada de la secuencia del gene que en cDNA codifica la sinte- sis de NS (37), dedujimos que esta subunidad po- limerasa era una proteina altamente dcida, de aproximadamente 28.000 daltons. Rose y sus co- legas sugirieron que probablemente esta propiedad dcida hacia que NS se uniése muy pobremente a SDS y migrase hacia SDS-PAGE como si tuvieran tun peso molecular de 48.000. Por ello analizamos a NS en pH bajo en geles de SDS-dcido y geles de CTAB -un detergente de carga positiva- y en am- bos casos NS migré a un punto cercano a su peso molecular de 28.000 (39] confirmando la hipéte- sis de Gallione et al. (37). La secuencia de amino- dcidos también indicaba que la ruptura con bro- muro de cianégeno (CNBr) produciria un péptido aminoterminal dcido (PM = 18.000) y de gran ta- mafo. Este péptido fue ulteriormente demostra- do después de usar CNBr, pudiendo demostrarse que migraba hacia SDS-PAGE con un peso mole- cular de 18,000. Este péptido aminoterminal con- tenfa la mayorfa si no la totalidad- de los resi- duos de fosfato de la protefna NS (39). estructural de la proteina NS. Demostramos también que los péptidos tripti- cos derivados de NS radiomarcada con ?$S-metio- nina o cisterna y *H-lisina, arginina, dcido asparti: Co 0 Acido glutdmico, al ser posteriormente anali- zados con HPLC no coincidian con la secuencia de aminodcidos que habfan sido publicadas como derivados del cDNA. Por ejemplo, nuestros datos mostraban que ninguno de los péptidos con Met tampoco contenian Cis, mientras que la secuencia predicha aseguraba la existencia de un péptido que contenia Met-Cis, Esto, aparte de otras d ctepancias inexplicables, nos llevaron a concluir que la secuencia de aminoacidos publicada era i correcta; esto es, existfan algunos errores en la s cuencia del cDNA que posiblemente se encontra- ban en la porcién terminal 3” del gene. Desde el momento en que este trabajo sobre la proteina NS indicé que era muy factible la exis- tencia de un error en la secuencia del cDNA que habia sido publicada 0 que posiblemente algin segmento del cDNA usado en la clona no prove- nfa de NS, hemos comenzado a obtener la clona de NS y secuenciar el gen completo, Obtuvimos un oligonucleétido generador sintético de 12 nu- cledtidos (5".. T-G-G-A-T-A-A-T-C-T-CA.. 3") pro- porcionado por el doctor Clay Naeve del Centro de Investigaciones Pedidtricas San Judas, de Mem- 16 phis, Tennessee. El primer nucleétido del genera- dor corresponde al residuo U del codén AUG de iniciacién en el gene de NS. La primera statesis de una cadena de cDNA fue realizada en el genoma RNA del VSV obtenido de virus purificado e hi- bridizado con el generador y la reverso-transcripta- sa viral (RT). Posteriormente, sintetizamos CDNA para todos [os mRNA del VSV usando generado- res del tipo oligo-dT. Después de seleccionar to- dos los cDNA con mas de 600 nuclestidos, hibri- dizamos las dos poblaciones antes mencionadas y sintetizamos la segunda hélice usando un fragmen to Klenow. Estos dscDNA de més de 600 nucle6: tidos fueron clonados mediante la insercién de cDNA del gen NS usando un vector de expresion -pUCTS - (40-43), el cual fue posteriormente am- plificado en E. coli JM105. Tenemos entonces cinco transformadores, todos los cuales pueden expresar altos niveles de NS después de la induc- cidn. Ahora trataremos de expresar el gen NS en una base eucaridtica usando el plésmido seleccio- nable construfdo por Genetech (44) que contiene un gen de DHFR. Microscop{a inmunoelectrénica del RNP de VSV Recientemente hemos sido capaces de cuantifi car el niimero y localizaci6n de las subunidades de RNA polimerasa (L, NS) inclufdas en el complejo RNP del VSV. Para ello hemos utilizado nuestro antisuero monoespecifico acoplado a esferas du- reas (190 A) (28) que contienen bien sea una IgG obtenida en cabras y con actividad anticone- jo 0 bien proteina A de Staphilococcus. Como se observa en la figura 2, los complejos RNP del VSV pueden ser visualizados facilmente después del tra tamiento con EDTA. Cuando se usan esferas du- reas 0 protefna A de Staphilococcus después de una reaccién con antisueros anti-L, uno puede cilmente observar y contar las esferas unidas a las subunidades de la enzima L (fig. 3). Por este me- dio pudimos determinar que existian un minimo de 60 subunidades de NS y 30 de L por cada com- plejo RNP. Estos estudios han sido extendidos ahora a complejos activamente replicantes y trans- criptores Influenza A, Simulténeamente con nuestros estudios en rela- cidn a la replicacién in vitro del VSV, estamos co- menzado a examinar los mecanismos comprome- tidos en la replicacin del virus influenza tipo A, con la intencién de establecer si la enzima viral Salué Uninorte, Barranquilla (Col), 2 (2}: 111 - 120, 1985Fig, 3 Esferasaureas unidas a las subunidades de la ensima L después de aplicarantsuores anti. (PB, PB, P1) que transcribe el mRNA, es tam- bién la enzima que replica el genoma del virus. Es- tamos enfocando este problema inicialmente me- diante el establecimiento de un sistema de replica- cién in vitro similar al que usamos para el VSV, excepto que el sistema del virus influenza deberd tener algunas ventajas adicionales por cuanto la transcripcién y replicacion de este agente pueden ser inhibidas diferencialmente. Ha sido demostra- do que la transcripcién del virus influenza puede ser inhibida por la Actinomicina-D debido a que esta reaccién depende de la transcripcién activa de la células huésped (hnRNA) como fuente de las cubiertas que necesita el mRNA viral y como generador. La replicacién de este agente es inhibi- da por la cicloheximida, Recientemente, Krug y sus colegas (46) demos- traron muy claramente que la transcripcién del vi- ‘us influenza se realiza en el niicleo de la célula in- fectada; sin embargo, el sitio de la replicacién del Salud Uninort. Barranquilta (Col), 2 (2}: 111-120, 1985 RNA viral no ha sido definido todavia. Puesto que la replicacién depende de la sintesis paralela de proteinas, nosotros hemos asumido que esta dependencia tiene unas bases similares a las que hallamos para el VSV, es decir, que durante la modalidad replicante de la sintesis de RNA, las hélices (+) y (—) eran ensambladas dentro de las particulas RNP que conten/an la ribonucleoprotei- na estructural que, en el caso del virus influenza, es la NP. Sin embargo, ésto no ha sido demostra- do todavia. No obstante, ha sido bien establecido que el ge- noma del virus influenza esté envuelto 0 agrupado dentro de estructuras ribonucleoproteicas de la cé- lula infectada durante la replicacién en algin mo- mento posterior a éta, y si esto ocurre en el nd- cleo, entonces estas estructuras son transportadas al citoplasma en forma de 8 discretas estructuras de, diferentes tamafios que contienen los 8 RNA del genoma viral. Se ha demostrado también que, wa diferencia del VSV, el RNA de estos complejos RNP es sensible a las RNAasa (47-49) y los men- cionados complejos no son estables en CsCl. Usan- do técnicas de hibridizacin RNA/RNA, mediante mRNA y/o muestras de RNA del viridn, se ha de- mostrado que los productos replicativos intracelu- lares existen en una relacién de 90 (—)/10(+) y que muy poca hélice (+) es inclu‘da finalmente en los viriones (50). El porcentaje de sintesis total de RNA en la célula infectada que representa la repli- cacién viral no ha sido establecido (3), aunque Hay et al. (51) estimaron que se acercaba a un 10% del total Hemos establecido un sistema in vitro de sinte sis de RNA que se deriva de extractos nucleares de células HeLa infectadas con virus influenza, e! cual sintetiza RNA virales espectficos de ambos ti- pos de hélice (+ y —);es decir, estos extractos nu- cleares muy posiblemente -como ocurrié con el VSV. son transcriptores y replicadores. Para de- terminar con mayor precisién la cantidad de RNA tetizado in vitro que fue producto de la replica- cién y cuanto lo fue de la transcripcién, hemos sintetizado copias completas de cDNA de doble hélice procedente de los 8 segmentos del genoma Viral, los cuales han sido insertados en ambas orientaciones en la forma replicativa del bacteric. fago M13 (40-43). Esta estrategia proporcionard grandes cantidades de secuencias (+) y (—} prove- nientes de cada uno de los segmentos del genoma viral que han sido introducidos como DNA de hélice Gnica en las particulas del fago en mencién. Con estas muestras de cDNA de una sola helice, podemos cuantificar facilmente los productos ob: tenidos en nuestro sistema in vitro de replicacién por hibridizacién, Con estos recursos podemos facilmente pregun- tarnos el sitio preciso de replicacién viral, trans- Porte de las RNP del nticleo al citoplasma, etc. Mediante dos métodos diferentes estamos obte- niendo antisueros del conejo, especificos para las tres subunidades enzimaticas y contra NSIT, para poder determinar cual de las tres subunidades de la transcriptasa viral (PB1, PB2, PA) estd compro- ‘metida en la replicacién y’ para definir si NS1, un Fig. 4. Esquema del grifico computarizado de la subunidad enzt 18 producto genético viral temprano, desempefia un papel regulador 0 modulador en la sintesis del RNA viral. El primer enfoque es similar al que empleamos para producir IgG anti-enzimas del VSV, es decir, estamos purificando las subunidades enzimaticas del influenzavirus y el NS1 mediante técnicas de quimica proteica normalizadas para luego inyec- tarlas (5-10 ug) en nédulos linfaticos popliteos de conejo. El segundo enfoque que estamos empleando utiliza un sintetizador de péptidos Beckman, me- diante el cual sintetizamos oligopéptidos cortos derivados de secuencias conocidas de aminodcidos provenientes de proteinas virales, Basados en su naturaleza hidrofilica, hemos seleccionado 4 pép- tidos para la sintesis; ésto lo podemos hacer me- diante un programa de computador que analiza la secuencia de aminodcidos de cada proteina en busca de regiones de relativa hidrofobia o hidroft lia, Estos graficos computarizados fueron suminis- trados por el Dr. J.V, Maize, Jr., del Instituto Na- ional de Salud y un ejemplo de ellos para la sub- unidad enzimatica PB2 se muestra en la figura 4, Aproximadamente la mitad de la densidad foto- grafica en el eje de las ordenadas, es un valor cero arbitrario. Por encima y por debajo de un punto medio se grafica la hidrofilia 0 hidrofobia relativas [(+) y (—)]. Los valores hidrofilicos para cada ami- nodcido se encuentran en la parte superior Los péptidos sintetizados serén unidos a una proteina transportadora (KLH 0 BSA), mezclados con adyuvante de Freund completo e inyectados en conejos. Hasta ahora hemos sintetizado dos péptidos de NS1, uno de la regidn carboxiterminal Y otro aminoterminal. El primero de ellos provenia de los residuos 209 a 220 y su secuencia es: NH3~ Asn-Gly-Arg-Pro-Leu-Thre-Pro-Lys-Arg-COOH. Dos conejos fueron inyectados con el péptido y después de tres aplicaciones ambos antisueros fue- ron dilu'dos 1:1000 y pudimos detectar mediante técnicas de ELISA, RIFA o Western blotting has- ta 200 nanogramos de los péptidos o de NST, Ac tualmente estamos examinando los efectos inhibi il dala lca PB del virus Influenza A, Salud Uninorte. Barranquilla (Col), 2(2): 111 - 120, 1985torios de estos anti-NS1 en nuestro sistema de re- plicacién in vitro. En resumen, mediante el uso de inmunoelectro- microscopfa, péptidos sintéticos, sistemas enzimé- ticos in vitro y técnicas de bioingenieria espera- mos obtener informacién relevante sobre los me- canismos por medio de los cuales esta clase tinica de enzimas sintéticas de RNA regula y dirige las funciones transcriptiva y replicativa de los RNA- virus de hélice negativa. Referencias 1. RHABDOVIRUSES, Vols. 1980, HL DAML. Bishop. CRE Press, 2, CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND INMUNO- LOGY. Vol. 105, eds, Cooper et al. Springer-Verlag, 1983, ‘Chapter 1 St2uss, ES. and Straus, 114 3, ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY. Vol. $2:467:506, 1983. Lamb, R.A. nd Chappin, PW 4. PELUSO, RAW, and MOYER S.A, Proc, Nath Acad. Se, 80 3198-3202, 1983. 5. CHANDRA, P.K. and BANERIEE, A.K. Virol, 39:93-103, 1981 6, EMERSON, $.U, Cell, 31:635-642, 1982, 7, NAEVE, GE. and SUMMERS, D.F, Replication of negative ‘irand viruses, Dat. Bishop and Compans eds, 169-779, Elsevier North Holland, 8, NOWAKOWSKI,M, eta, J. 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