FUNDACION UNIVERSIDAD DE AMRICA

Asignatura: BIOPROCESOS
GUA DE LABORATORIO
PRCTICA No. 01:
DETERMINACION DE LOS COEFICIENTES DE RENDIMIENTO DE PRODUCTOS Y
REACTIVOS EN UN CULTIVO BATCH DE Saccharomyces cerevisiae.
OBJETIVO DE LA PRCTICA:
Determinar los coeficientes de rendimiento de los compuestos que intervienen
en la fermentacin batch mediante el uso de tcnicas experimentales y
tericas.
INTRODUCCIN
La fermentacin involucra el crecimiento de los microorganismos en un
sustrato orgnico.
Los productos de fermentacin incluyen, los
microorganismos, tambin como los productos orgnicos reducidos y oxidados.
Los azcares son un buen sustrato para que los microorganismos puedan
crecer, ya que a partir de estos, se producen dichos compuestos orgnicos
oxidados y reducidos. Los productos de fermentacin varan de acuerdo al tipo
de microorganismo, tipo de sustrato, y factores ambientales, tales como el pH
y la temperatura.
La fermentacin acido lctica y alcohlica son dos rutas metablicas
comnmente usadas por las clulas, para metabolizar azcares. Las levaduras
en mayor proporcin la ruta de la fermentacin alcohlica (en condiciones
anaerbicas). Una hexosa produce dos moles de CO 2 y dos moles de etanol por
gramo de azcar (glucosa) utilizada. El rendimiento terico de etanol es 51,1%
en peso. El proceso genera dos molculas de ATP por molcula de azcar
utilizada, el cual puede ser considerado como energa para los
microorganismos.
Algunos microorganismos, usan el oxgeno molecular, en su metabolismo y
crecen aerbicamente. Este proceso es conocido como respiracin. La
respiracin es mucho ms eficiente que el proceso de fermentacin
anaerbico, ya que produce 38 moles de ATP por mol de azcar utilizado.
Saccharomyces cereviciae es capaz de crecer ya sea con presencia de oxgeno
o sin presencia de este compuesto (Facultativo).
Si hay suficiente O 2
disponible, la levadura, preferir el uso de la ruta metablica de la respiracin
(cidos tricarboxlicos), reduciendo el consumo de azcares y la produccin de
etanol. Sin embargo hay una mayor generacin de biomasa por unidad de
azcar consumido.

REQUERIMIENTOS
Equipos

pH-metro (2)
Espectrofotmetro (con sus respectivas celdas)
Balanza analtica (2)
Balanza 300 gr a 3 kg (1)
Plancha de calentamiento y agitacin (2) con 2 agitadores magnticos
Bao Termostatado (1)
Centrifuga (1)
Shaker o agitador mecnico (1)
Microscopio(1)

Reactivos

Agua destilada
NH3
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
K2HPO4
Glucosa
Levadura Fresca (estudiantes)
Solucin de DNS: Acido Dinitrosaliclico 10 g; Sulfito de sodio 0,5 g;
Hidroxido de Sodio 0,5g; llevar a un litro.
Solucin al 40% de tartrato mixto de potasio y sodio KNaC4H4O64H2O.
Solucin del glucosa (15 g/l)
Reactivos tincin de gram(lugol, cristal violeta, acetona, safranina)
Aceite de inmersin
2 litros solucin medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l,
CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 10 g/l. Ajustar pH de la
solucin a 5.
2 litros solucin medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l,
CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 15 g/l. Ajustar pH de la
solucin a 5.

Materiales

Gasa (estudiantes)

Algodn
Erlenmeyer de 100 ml (2)
Probeta de 100 ml (1)
Tijeras (estudiante)
AgitadoresMagnticos (1)
Guantes de carnaza
Esptulas (1)
Vidrios de Reloj (2)
Papel o toallas para secar
Tubos falcon (4)
Micropipetas y puntas 2
Pipetas 10 ml (2)
Tubos de ensayo de 20 ml con tapa rosca (5)
Vaso de precipitado de 500 ml (2)
Tubos de ensayo de 10 ml (6)
Porta objetos
Mecheros (1)
Pipeteador (pera) (1)
Pipetas pasteur
Microespatulas (1)
Gradilla (1)

Las cantidades sealadas frente a cada uno materiales se entienden para un

grupo. Trabajarn 4 grupos por prctica.
PROCEDIMIENTO
Preparacin del medio de cultivo.
Prepare con la ayuda de una probeta de 100 ml, dossoluciones de 75 ml de
medio de cultivo que contenga cada una los siguientes compuestos: NH 3 3 gr/l;
MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l. La glucosa se evaluar
a dos concentraciones 10 y 15 g/l (de acuerdo al diseo del experimento
consultar con el profesor el ensayo que le corresponde).Para tapar cada uno de
los frascos haga tapones con la ayuda de gasa y algodn. Mida el pH de la
solucin y ajuste para dejarlo en un valor de 5.
Una vez obtenido los medios (con su respectiva fuente de carbono), esterilizar
cada uno en auto clave a 121 C, 15 psi por 15 minutos. Si no se cuenta con
autoclave, disminuya la carga bacteriana calentando el medio hasta ebullicin
dejando los medios a esa temperatura por 5 minutos. Dejar enfriar los medios
a temperatura ambiente.
Inoculacin

Inocule de acuerdo al diseo del experimento, cada uno de los frascos

(consulte con el profesor el ensayo que le corresponde) en una proporcin de
0,5 g/l y 1 g/l de levadura. Activar en bao de mara a 38 C por 20 minutos.
Despus de esto, secar los frascos.
Muestreo y Ensayos
Para determinar la concentracin inicial de biomasa y glucosa, sacar una
muestra de cada uno de los frascos.
Para la biomasa tomar 10 ml de muestra, colocarla en un tubo falcon
(previamente pesado) y centrifugar a 9000 rpm por 6 minutos. Descartar el
sobrenadante y pesar nuevamente. El peso de la biomasa (base hmeda) es la
diferencia entre el tubo con el sedimento menos el tubo vaco. Se debe
determinar tericamente el peso seco de la biomasa tomando como base el
peso en base hmeda.
Para determinar el contenido de glucosa, tomar 3 ml de muestra y 3 ml del
reactivo DNS, mezclar. Calentar la muestra (tubos de ensayo con muestra y
DNS) en agua hirviendo por 8 minutos. Despus, agregar 1 ml de la solucin
de tartrato mixto de sodio y potasio (Sal de Rochelle). Una vez agregada la
solucin de Rochelle, dejar enfriar en un bao de agua fra y registrar la
absorbancia con el espectrofotmetro a 575 nm. Utilizar antes de la medicin,
como blanco (cero), agua destilada. Si la absorbancia de la muestra, registra
un valor mayor a 0,6; diluir la muestra 5 o 10 veces, de acuerdo a la intensidad
del color.
Tener en cuenta el factor de dilucin en el clculo de la
concentracin de la glucosa (factor de dilucin = Volumen final/volumen de
tomado de la muestra).
Se debe multiplicar el factor de dilucin a la
concentracin de glucosa determinada, para hallar el valor real. Utilizar la
curva de calibracin (correlacin concentracin de glucosa vs absorbancia)
para determinar la concentracin del azcar.
Una vez, extradas lasmuestras iniciales, registrar el peso de cada uno de los
medios de cultivo. Esto con el fin de poder calcular la produccin de CO 2,
mediante la prdida de peso del medio. Ya que este compuesto sale en forma
de gas. Antes de sacar las muestras finales, Agitar vigorosamente y registrar
el peso del medio de cultivo. La diferencia de peso al inicio y al final, ser la
cantidad de CO2 desprendido o producido por la levadura.
El medio de cultivo se deja en fermentacin durante 3 das. Una vez cumplido
este tiempo, pesar el medio para determinar la prdida de peso, y despus
sacar las muestras para determinar el contenido de glucosa y biomasa, como
se estableci anteriormente.
Curva de calibracin de glucosa
Para la curva de calibracin de la glucosa tomar de la solucin madre (15 g/l de
glucosa) las siguientes alcuotas:

1. 6 ml de la solucin concentrada y agregarle 3 ml de agua destilada (10

g/l).
2. 3 ml de la solucin concentrada y agregarle 6 ml de agua destilada (5
g/l).
3. 1 ml de la solucin concentrada y agregarle 9 ml de agua destilada (1,5
g/l).
Una vez preparadas las soluciones, aplicar el procedimiento de determinacin
de glucosa mediante DNS. Si la lectura sobrepasa el valor de 0,6 diluir y medir
nuevamente. No olvidar tener en cuenta al factor de dilucin, en el clculo de
las concentraciones.

TALLER (ANTES DE LA PRACTICA)

Explique el procedimiento que se va a realizar en la prctica mediante

un diagrama de flujo
Cul es el fin de esterilizar los medios de cultivos?
Cuando una sustancia no se puede esterilizar por medio de calor, que
otros mecanismos existen?
Defina que es un inculo.
Cul es el fin de crear un inculo?
Que es un Azcar Reductor?
Cul es el mecanismo de accin de la solucin de DNS en la
identificacin de azcares reductores?
Explique el mecanismo de identificacin de sustancias por medio de
espectrofotometra
Que otras tcnicas experimentales existen para la determinacin de
azcares? explique 3 de ellas brevemente.
Cmo se elabora una curva de calibracin y cul es su funcin?, muestre
un ejemplo.