AISLAMIENTO DE LINFOCITOS Y MONOCITOS DE SANGRE

PERIFRICA.
1.- INTRODUCCIN
El primer paso de numerosos anlisis inmunolgicos es el aislamiento de la fraccin
"mononuclear", es decir, linfocitos y monocitos, de sangre perifrica. El mtodo de aislamiento ms
utilizado se fundamenta en las diferentes densidades que presentan cada uno de los tipos celulares
de la sangre (Figura 1).

Para conseguir la separacin, la muestra de sangre se deposita sobre un lquido de densidad 1.077
g/ml, denominado Lymphoprep o Isolymph, y se centrifuga para acelerar la separacin. El
Lymphoprep est compuesto por ficoll y metrizoato sdico. El ficoll aglutina los eritrocitos, de
manera que aumenta su velocidad de sedimentacin. El metrizoato sdico es el compuesto que da la
densidad adecuada.
2.- OBJETIVOS
Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:
Aislar la fraccin linfomonocitaria de una muestra de sangre anticoagulada.
3.- EQUIPAMIENTO
-

Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.

Pipetas y puntas
Centrfuga

4.- REACTIVOS

PBS pH 7.2
Medio de separacin de linfocitos Ficoll Metrizoato sdico (ej. Lymphoprep )
Muestras de sangre anticoagulada (ej. tubos anticoagulados con EDTA descartes de
hemogramas )

PROCEDIMIENTO
1)
2)
3)

4)
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6)
7)
8)

Sangre anticoagulada (EDTA, citrato, heparina...) o sangre desfibrinada.

Diluir 1/2 con PBS o suero salino.
Pipetear cuidadosamente sobre medio volumen de Lymphoprep (p.ej. 6ml sangre diluida :

3ml de Lymphoprep). Evitar que la sangre y el medio de separacin se mezclen.

Centrifugar a 800g x 20 min a T.A (apr. 20C) en un rotor oscilante. Si la sangre ha sido
extraida hace ms de 2 horas, centrifugar 30 min.
Recoger la fraccin mononuclear y diluir con PBS o suero salino.
Centrifugar a 250g x 10 min a T.A.
Decantar o aspirar el sobrenadante (rico en plaquetas) y repetir el paso 6.
Resuspender el pellet celular en medio de cultivo o en PBS.