LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

Ciri-Ciri Fisiologis Bakteri

Rabu, 25 Maret 2015 Pukul 13.00 16.00 WIB
Kelompok II

Nama

NPM

Tugas

Rico Saputra

260110130099Pembahasan, Simpulan

Nur Fitriatuzzakiyyah

260110130100Prosedur, Data pengamatan

Ani Hanifah

260110130101Tujuan, Prinsip, Prosedur,

Alat bahan

Hendita Faradina

260110130102Pembahasan, Simpulan

Qisty Ahla D

260110130103Tujuan, Prinsip, Prosedur,

Alat bahan

Angelika Riati

260110130104Pembahasan, Simpulan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai

TTD

( Shintya ) (Benedictus)

I.

TUJUAN
Mengamati secara langsung atau tidak langsung produk. kegiatan enzimatik
bakteri.

II.

PRINSIP
1. Aseptis
Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang
menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk
mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan.
Kerja aseptic dilakukan dengan bekerja diantara dua nyala api Bunsen
dengan jarak +/- 20 cm. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan
kontaminasi.
2. Inkubasi
Inkubasi merupakan waktu yang diperlukan untuk berlangsungnya setiap
proses pertumbuhan tertentu. Misalnya, jangka waktu untuk bakteri untuk
tumbuh adalah masa inkubasi.
3. Sifat fisiologis bakteri
Sifat fisiologis bakteri merupakan sifat-sifat khusus yang dimiliki oleh
suatu bakteri terhadap reagen-reagen tertentu.. hal ini sangat penting
didalam proes identifikasi suatu bakteri.
4. Pertumbuhan bakteri
Pertumbuan bakteri dibagi kedalam 4 fase, yaitu fase lag phase yang
merupakan fase adaptasi bakteri, lalu Log phase yang merupakan fase
pertumbuhan dari suatu bakteri, lalu Stationer phase dimana pertumbuhan

dan kematian seimbang atau stasioner, dan yang terahir adalah Death
phase yang merupakan fase kematian dari bakteri.

III.

TEORI DASAR
Isolasi dan identifikasi merupakan metode konvensional dalam
pemeriksaan bakteri yang didasarkan pada reaksi biokimia. Oleh karena itu,
dalam isolasi dan identifikasi bakteri diperlukan media yang selektif. Setelah
dilakukan pewarnaan Gram dilanjutkan dengan uji biokimia pada berbagai
media seperti gula. Bakteri yang sudah diisolasi dan diidentifikasi selanjutnya
diuji secara serologis untuk menentukan serotipenya. Isolasi dan identifikasi
untuk berbagai jenis bakteri dapat mengikuti metode Cowan (suwito, 2010).
Selain itu,isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari
medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan
sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat
ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas
dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik
aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Bila tidak dijalankan
dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain
sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga
melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006).
Metabolisme adalah semua reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel
yang menghasilkan energi dan yang menggunakan energi untuk sintesis
komponen-komponen sel dan untuk kegiatan-kegiatan selular, seperti
pergerakan. Reaksi kimiawi yang membebaskan energi melalui perombakan
nutrient disebut reaksi disimilasi atau penguraian; jadi merupakan kegiatan
katabolik sel. Sedangkan reaksi kimiawi yang menggunakan energi untuk

sintesis dan fungsi-fungsi sel lainnya disebut reaksi asimilasi atau anabolik.
Jadi,

reaksi

disimilasi

menghasilkan

energi,

dan

reaksi

asimilasi

menggunakan energi (Singleton dan Sainsbury, 2006).

Bila

sel

merombak

ikatan-ikatan

kimiawi

tertentu

selama

metabolisme, energi yang dilepaskan menjadi tersedia untuk melangsungkan

kerja biologis. Selama masa hidup sel, kerja ini bersifat ekstensif dan
beragam.

Mikroorganisme

heterotrofik

nonfotosintesik

memperoleh

energinya dari oksidasi (pengusiran electron atau atom hydrogen) senyawasenyawa anorganik (Pelczar dan Chan, 1986).
Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan
tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan
eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem
endoenzim selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan
eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam
media. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa
eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekulmolekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini
kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel (Waluyo,
2004).
Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan
dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan
berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan
reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah
secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang
berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan
untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis.
Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis
yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri.
Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu

pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain.
Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugusgugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut.
Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat
berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995).
Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri
berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh
pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang
dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang menghasilkan
warna reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan
pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan
kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim
gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan,
1986).
Dalam mengidentifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri
yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan
sifat morfologi koloni serta pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya.
Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri
tersebut.Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui
sifat-sifat suatu koloni bakteri. Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia
biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan
reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan
senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004).
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting
di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara
morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa,
tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang
diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik
dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi
enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media

memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi

mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna
reagen (Murray, 2005).
Uji biokimia dapat digunakan untuk menentukan sifat metabolisme
bakteri dilihat melalui interaksi reagen - reagen kimia dengan metabolit metabolit yang dihasilkan. Selain itu juga dapat dilihat dari kemampuan
bakteri dalam pemakaian suatu senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan
sumber energi. Metode Uji Biokimia dapat digunakan sebagai upaya untuk
proses identifikasi bakteri (Backmann,2006).
Menurut Cappucino (1978) besar kecilnya daerah hambatan
dipengaruhi oleh laju pertumbuhan mikroorganisme,kemampuan dan laju
difusi bahan aktif pada medium, kepekaan mikroorganisme terhadap zat aktif
serta ketebalan dan viskositas medium (zaraswati dan eva (2005).
Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain
uji dalam melakukan fermentasi, reduksi terhadap nitrat, uji oksidase,
produksi katalase, hidrolisis protein, uji sitart simmons, hidrolisis urea,
hidrolisis H2S dan uji motilitas (Funke, 2004).

Uji kebutuhan oksigen dengan medium NB

Uji kebutuhan oksigen dilakukan untuk mengetahui sifat pertumbuhan
bakteri dengan menggunakan medium NB. Sifat pertumbuhan yang
diamati adalah aerob, anaerob, fakultatif atau mikroaerofil (Volk &
Wheeler, 1993).

Uji Katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk
mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob
fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi
bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya
antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang

dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan

reaksi sebagai berikut :
2 H2O2

2 H2O

O2

(Volk & Wheeler, 1993).

Uji fermentasi karbohidrat

Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat
bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis
gula, yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa (Lay, 1994).

Uji hidrolisis pati

Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis
pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan
polisakarida yang memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya
yang besar, polisakarida tidak mampu diserap oleh membran sel
(Cappuccino dan Sherman, 1992).

Uji indol
Uji

indol

digunakan

untuk

mengetahui

apakah

dalam

proses

pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari asam amino esential

triptofan (Lay, 1994).

Uji fermentasi gula, H2S, dan gas dengan TSIA

Uji ini menggunakan medium TSIA yang mengandung glukosa, laktosa
dan ferosulfat (Volk & Wheeler, 1993).

Uji MR-VR
Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk
mengoksidasi glukosa dan menstabilkan konsentrasi asam yang tinngi
sebagai produk akhir. Sedangkan uji VR untuk membedakan kemampuan
mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral

seperti asetilmetilkarbonil dari asam organik yang dihasilkan dari

metabolisme glukosa (Lay, 1994).

Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi
(Capuccino dan Sherman, 1992).

Uji hidrolisis urea

Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghidrolisis urea dengan menggunakan enzim urease dan mengubah pH
media dari pH netral menjadi basa (Lay, 1994). Uji ini sangat penting
dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus, begitu pula uji
yang lain sebenarnya digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan
karakter tertentu, yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan
dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup disekitarnya
(Dwidjoseputro, 1994).
Komposisi media yang digunakan dalam uji uji tersebut antara lain

(Strohl, 2001):

1. Medium Skim Milk:

- Susu skim
- Agar
2. Medium Pati:
- Agar
- Pati 1 %
3. Fermentasi Karbohidrat:
- Laktose
- Maltose
- Glukose
- Sukrose
- Mannitol
4. Uji MR- VP:
- MR (Metil-Red) / VP (Voges-Proskauer)
5. Reduksi Nitrat :
- Nitrat cair
6. Produksi Katalase:
Larutan hidrogen peroksida

7. Hidrolisis asam amino triptofan:

- TSB atau tripton cair 1%
8. Hidrolisis Urea:
- Urea cair
9. Uji Sitrat Simons:
- Sitrat
- Garam amonium
- indikator biru bromtimol
10. Uji Motilitas
- Indikator garam tetrazolium
Bakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah E. Coli.Dimana E. Coli
ini termasuk bakteri berbahaya karena dapat menyebabkan diare. Salah satu syarat
E. coli dalam SNI 01-6366-2000 harus negatif. Pemeriksaan E. coli dapat
menggunakan metode AOAC (1996), sedangkan untuk strain E. coli O157:H7
mengikuti Robert et al. (Suwito, 2010).
IV.

ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat

Autoclave
Bunsen
Inkubator
Ose berujung lurus dan bundar
Rak tabung reaksi
Tabung durham
Tabung reaksi
Gambar alat:

4.2 Bahan
Agar miring sitrat Simmons
Agar miring TSIA/H2S
biakan dalam agar miring trypticase soy agar (TSA); Staphylococcus

aureus.
biakan dalam trypticase soy broth (TSB) berumur 24 jam: Escherichia
coli, Enterobacter aerogenes, pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris,
Bacillus subtilis, bacillus cereus, streptococcus mitis, streptococcus

pyogenes, streptococcus faecalis

Indikator merah metil
Kaldu glukosa
Kaldu laktosa
Kaldu maltosa
Kaldu manosa

Kaldu sakarosa
Kaldu tripton
Media Sulfite SIM
Medium MR
Medium VP
Nutrient Agar
Reagen Barritt
Reagen Kovac
Reagen uji nitrit
Suspensi bakteri

V. PROSEDUR
1. Uji fermentasi karbohidrat
Biakan diamati di dalam tabung durham berisi kaldu glukosa
dengan indicator merah fenol. Bila Warna medium berubah menjadi
kuning, artinya bakteri tersebut membentuk asam dari fermentasi glukose.
Bila pada tabung kecil yang diletakkan terbalik di dalam tabung media itu
terdapat gelembung, artinya dari fermentasi tersebut terbentuk pula gas.
Kemudian hasil pengamatan ditulis dalam tabel pengamatan.
2.

Uji MR (methyl red, merah metil)

Sebanyak 2 tabung bersih berukuran 13 x 100 mm dan biakan MRVP disiapkan, kemudian kedua biakan tersebut dituangkan masing-masing
setengahnya ke dalam tabung-tabung bersih dan tabung diberi tanda agar
tidak tertukar. Sisanya disimpan untuk uji berikutnya (uji VP). 3-4 tetes
indikator merah metil ditambahkan pada salah satu tabung MR-VP dari
setiap organisme. Bila warna medium berubah menjadi merah, artinya
terbentuk asam. hasil pengamatan dicatat dalam tabel hasil pengamatan.

3. Uji VP (Voges-Proskauer)
Reagen Barritt yaitu 10 tetes larutan A dan 10 tetes larutan B
ditambahkan pada sisa biakan dalam medium MR-VP masing-masing
organisme. Tabung-tabung tersebut dikocok keras-keras selama 20-30

detik, Bila terlihat merah muda artinya terjadi pembentukan 2,3-butandiol

atau reaksi Voges-Proskauer positif. Kadang-kadang diperlukan waktu 2
jam untuk memperoleh dari hasik uji ini. hasil pengamatan dicatat dalam
tabel Hasil Pengamatan.
4. Uji motilitas
Ose kawat lurus disterilisasi kemudian suspensi bakteri ditusukkan
secara tegak lurus ke dalam tabung reaksi yang berisi media agar (padat).
Tabung diinkubasikan selama 24 jam dan diamati. bakteri yang dinyatakan
positif motil atau bergerak akan ditunjukan dengan adanya kekeruhan pada
media uji yang menunjukan pertumbuhan koloni..
5. Uji indol
biakan-biakan TSB diambil lalu ditambahkan masing-masing 1020 tetes reagen Kovac kedalamnya. Bila dalam biakan tersebut terdapat
indol, maka dibagian atas biakan akan segera terbentuk lapisan berwarna
merah. Hasil pengamatan dicatat dalam tabel hasil pengamatan.
6. Uji hidrogen sulfide / TSIA
Tabung reaksi diinokulasikan dengan ose yang disterilisasi dengan
cara digoreskan secara zigzag ke agar miring suspensi bakteri. Tabung
diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian, perubahan diamati. Hasil positif
ditunjukkan dengan adanya endapan hitam dengan gas.
7. Uji penggunaan sitrat
Biakan agar miring sitrat Simmons diamati, apakah ada perubahan
warna dan apakah ada petumbuhan. Hasil pengamatan dicatat pada tabel
hasil pengamatan. Bila organisme yang diuji dapat tumbuh dengan
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya maka akan
terlihat adanya pertumbuhan pada permukaan agar miring yang Anda
gores disamping berubahnya warna medium menjadi biru.

VI.

DATA PENGAMATAN
N

Jenis uji

Sebelum

Sesudah

keterangan

o
1

Uji

Media

fermentasi

berubah

karbohidra

dari merah

menjadi

(glukosa)

kuning, dan
terdapat gas

Gelembung udara

Uji

Media

fermentasi

berubah

karbohidra

dari merah

t (laktosa)

menjadi
kuning, dan
terdapat gas

Gelembung udara

Uji

Media

fermentasi

berubah

karbohidra

dari merah

menjadi

(sakarosa)

kuning,
tanpa

ada

gas

Uji

Warna

fermentasi

media

karbohidra

berubah

t (manosa)

dari merah
menjadi
kuning,
terbentuk
gas

Gelembung udara

Uji

Warna

fermentasi

media

karbohidra

berubah

t (maltose)

dari merah
menjadi
kuning,
terbentuk
gas

Gelembung udara
6

Uji MR

warna
media
berubah
menjadi
merah
setelah
ditambah
methyl red

Uji VP

Tidak
terjadi
perubahan
setelah
diberi
pereaksi naftol

dan

KOH

Tidak
terbentuk
8

Uji indol

cincin
merah
setelah
diberi
reagen
Kovac

Uji TSIA

Media tidak
berubah

10

Uji sitrat

Media tidak
berubah

11

Uji

Tidak

motilitas

tampak
adanya
motilitas
dari bakteri
di

sekitar

tusukan

VII.

PEMBAHASAN

1. Uji Fermentasi Karbohidrat

Pada pengujian fermentasi karbohidrat, tabung durham berisi kaldu
glukosa, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa dengan diberikan indikator
merah fenol. Menurut Volk dan Wheeler (1993) organisme-organisme
yang berbeda akan menggunakan karbohidrat atau gula-gula yang berbeda
tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula
digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya
perubahan warna indikator merah fenol yang terdapat dalam perbenihan
menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indikator merah
fenol).
Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang
dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses penggunaan senyawa
makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh
aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan
berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat
menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet,
ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).

Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat

berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asamasam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau
tidak disertai pembentukan gas. Pembentukan gas dapat dilihat adanya
udara di dalam tabung peragian atau fermentasi (Volk dan Wheeler, 1993).
Pertumbuhan mikroba diambil dengan ose steril dan dinokulasikan
ke dalam medium glukosa, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa
kemudian diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 37C dengan uji positif
ditandai dengan terjadinya perubahan warna dan menghasilkan gas atau
gelembung udara (Naid dkk, 2013). Namun pada praktikum dilakukan
inokulasi dengan jarum ose bulat steril dan di masukkan ke dalam tabung
reaksi yang sudah diberi tabung durham dan selanjutnya diinkubasikan
selama 24 jam pada suhu kamar. Perlakuan ini dilakukan untuk semua
tabung yang mengandung glukosa, laktosa, maltose, sakarosa dan manosa.
Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap
pertama. Sedangkan, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa akan di
hidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa
dihidrolisis menjadi galaktosa dan glukosa. Monosakarida jenis manosa
dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi
epimerisasi. Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi
fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa
6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan
manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk
menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO2 dan kemudian pada
tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat di reduksi kembali
oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk
asam laktat dan etanol (Volk dan Wheeler, 1993).
Berdasarkan hasil pengamatan didapat tabung yang berisi glukosa,
laktosa, maltose, sakarosa dan manosa mengalami perubahan warna dari
merah menjadi kuning. Uji fermentasi karbohidrat dikatakan positif jika
terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning dengan menggunakan
indikator merah fenol. Hal ini mengacu pada bakteri Escherichia coli yang

berdasarkan literatur bahwa Escherichia coli dapat memfermentasikan

karbohidrat. Perubahan warna tersebut terjadi dikarenakan hasil fermentasi
oleh Escherichia coli adalah asam. Merah fenol dalam keadaan basa
memiliki warna merah sedangkan dalam keadaan asam memiliki warna
kuning. Hal ini menunjukkan bahwa sebelum Escherichia coli dapat
melakukan fermentasi, medium masih memiliki pH basa, sedangkan
setelah Escherichia coli melakukan fermentasi menghasilkan medium
yang bersifat asam.
Hasil fermentasi karbohidrat selain asam yang ditandai perubahan
warna adalah adanya gas. Gas tersebut dapat dilihat dengan adanya
gelembung pada tabung durham. Gas yang dihasilkan dari proses
fermentasi merupakan gas karbondioksida. Berdasarkan hasil pengamatan,
tabung yang menghasilkan gas adalah tabung dengan adanya kandungan
glukosa, laktosa, maltosa dan manosa. Sedangkan pada tabung sakarosa
tidak ditemukan adanya gelembung. Maka berdasarkan literatur, hasil
pengamatan ini dengan pengujian fermentasi karbohidrat semakin
mengacu pada bakteri Escherichia coli walaupun pada tabung sakarosa
tidak menghasilkan gelembung atau gas. Sebab berdasarkan literatur pada
fermentasi sakarosa dapat terjadi adanya gas atau tidak. Namun yang
paling menentukan adanya uji fermentasi karbohidrat yang positif adalah
perubahan warna pada medium.
2. Uji MR (methyl red, merah metil)
Pada uji ini, pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan
suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi
terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke
dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi. Proses ini
dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik
aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung
reaksi diinkubasi selama 18-21 jam. Setelah diinkubasi, biakan suspensi
bakteri tersebut kemudian ditetesi indikator metil merah sebanyak 3-4
tetes, kemudian dilihat apakah terjadi perubahan warna menjadi merah

atau tidak. Hasil positif ditunjukkan oleh perubahan warna suspensi

bakteri menjadi merah. Hasil dari uji MR ini adalah positif. Hal ini sesuai
dengan literatur pada bakteri Escherichia coli yang menunjukkan uji MR
adalah positif. Bakteri Escherichia coli memfermentasi glukosa di dalam
medium MR-VP dan menghasilkan banyak sekali- asam laktat, asetat,
suksinat, dan format disamping C02, H2 dan etanol. Akumulasi asamasam ini menurunkan pH sampai 0,5 atau kurang.
3. Uji VP (Voges-Proskauer)
Pada uji ini, pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan
suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi
terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke
dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi. Proses ini
dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik
aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung
reaksi diinkubasi selama 18-21 jam. Setelah diinkubasi, suspensi bakteri
kemudian ditambahkan reagen Barritt yang dapat dengan mudah
mendeteksi adanya asetoin (asetil-metil dan karbinol), yaitu prekusor 2,3butandiol. Reagen ini terdiri dari -naftol dan KOH. Kemudian
ditambahkan pereaksi -naftol dan KOH masing-masing sebanyak 3-10
tetes ke dalam tabung reaksi, kemudian dikocok selama 30 detik, lalu
dilihat adanya perubahan warna menjadi merah atau tidak. Hasil positif
ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah yang artimnya
terjadi pembentukan 2,3-butandiol dan etanol. Hasil uji bakteri kami
adalah negatif, yang artinya bakteri kami tidak menghasilkan alkohol. Hal
ini sesuai dengan literatur yang menunjukkan uji VP pada bakteri
Escherichia coli adalah negatif.
4. Uji Motilitas
Selanjutnya dilakukan uji motilitas. Media uji motilitas digunakan
untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas
sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae. Uji

motilitas dilakukan dengan cara Uji motilitas berperan dalam mengetahui

pergerakan bakteri (Shields dkk, 2013).
Untuk uji motilitas dilakukan dengan cara ose kawat lurus yang
sudah disterilisasi, suspensi bakteri ditusukkan secara tegak lurus ke dalam
tabung reaksi yang berisi media agar (padat). Tabung diinkubasikan
selama 24 jam dan diamati. Hasilnya tidak didapatkan adanya pergerakan
bakteri (negatif) dimana pada media pertumbuhan bakteri tidak terdapat
kekeruhan pada media yang telah ditusukkan. Menurut Shields (2013),
bakteri yang dinyatakan positif motil atau bergerak akan ditunjukan
dengan adanya kekeruhan pada media uji yang menunjukan pertumbuhan
koloni.
Motilitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian
bakteri. Sifat ini diakibatkan oleh adanya alat motor cambuk yang disebut
flagela sehingga sel bakteri dapat berenang di dalam lingkungan air.
Motilitas sebagian besar jenis bakteri motil pada suhu relatif rendah 15-25
C dan mungkin tidak motil pada suhu 37 C. Namun suatu resiko tersendiri
bagi organisme berukuran kecil untuk menerima kenyataan bahwa dengan
ukurannya tersebut sel bakteri dapat dipengaruhi oleh aktivitas molekul
air/pelarut disekitarnya yang dinamakan Brownian movement. Gerak
brown adalah gerak partikel koloid yang bergerak dengan arah tak
beraturan, gerakan ini disebabkan oleh molekul-molekul pelarut dengan
molekul koloid yang saling berbenturan. Gerakan acak molekul air ini
dapat membuat sel bakteri bergoyang-goyang cepat atau lebih tepatnya
bergetar tak beraturan sehingga bagi mata yang awas akan terlihat motil.
Sel yang terpengaruh gerak brown dapat diamati pada perbesaran 1000X
dengan mikroskop cahaya, tentunya dengan preparat ulas sederhana dari
media kaldu atau koloni yang dicampur air, dapat juga dengan
metode hanging drop preparation (Barrow, 1993).
5. Uji Indol
Selanjutnya dilakukan uji Indol. Menurut Leboffe (2011), Uji indol
bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol
dengan menggunakan enzim tryptophanase. Uji indol dilakukan pada ose

yang sudah distrelisasi, suspensi bakteri dipindahkan ke dalam tabung,

yang didalamnya berisi media cair yang mengandung 10-20 tetes reagen
kovac. Tabung diinkubasikan 24 jam kemudian hasil diamati. Bila dalam
biakan tersebut terdapat indol, maka dibagian atas biakan akan segera
terbentuk lapisan berwarna merah. Hasil yang didapat adalah negative,
dapat ditunjukkan dengan tidak terbentuknya lapisan warna merah. Hasil
uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin)
berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini
tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat
diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Produksi indol di dalam
media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki
enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat
dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC,
sebuah tes yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga
Enterobacteriaceae (Hemraj, 2013).
Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh
beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat
dan amonia. Uji indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam
tryptophan broth, yang mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan
dideteksi dengan menambahkan reagen Kovacs ini yang menghasilkan
cincin berwarna merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi warna merah
berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol positif dinyatakan
dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol bereaksi
dengan aldehida (Sridhar, 2006).
6. Uji TSIA/ H2S
Kemudian

dilakukan

uji

Hidrogen

Sulfide

(H2S)/

TSIA.

.Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna

hitam. TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam
menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, ujia
TSIA ini juga dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme
karbohidrat. TSIA membedakan bakteri berdasarkan fermentasi mereka

laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi hidrogen sulfida. TSIA yang
paling sering digunakan dalam identifikasi Enterobacteriaceae, meskipun
berguna untuk bakteri gram negatif lainnya (Lehman, 2005). Proses uji
H2S/ TSIA dilakukan dengan tabung reaksi diinokulasikan dengan ose
yang disterilisasi dengan cara digoreskan secara zigzag ke agar miring
suspensi bakteri. Tabung diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian, amati
perubahan. Hasil uji H2S/TSIA menunjukkan hasil positif. Hasil positif
ditunjukkan dengan adanya endapan hitam dengan gas. Gas positif
dikarenakan gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul
sebagai celah di media atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah
tabung (Leboffe, 2011).
7. Uji Sitrat
Uji Sitrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk
memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan
indikator pH bromothymol biru. Pemanfaatan sitrat melibatkan enzim
citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat.
Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO 2. Produksi
Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium
masing-masing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan
warna medium dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013). Bromothymol blue
digunakan sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan
karbondioksida

yang

menggabungkan

natrium

dengan

air

untuk

membentuk natrium karbonat yang merupakan produk alkaline yang

menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini
menunjukkan tes tersebut positif (Sridhar, 2006).
Dalam uji Sitrat dilakukan dengan tabung reaksi diinokulasikan
dengan ose yang disterilisasi dengan cara digoreskan secara zigzag ke agar
miring suspensi bakteri. Tabung diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian,
amati perubahan. Hasilnya berupa negatif dimana tidak terjadi perubahan
warna pada media suspensi bakteri.

Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri No. 3A yang

diujikan, dapat diketahui bahwa bakteri yang diujikan merupakan bakteri
Escherichia coli. Hal ini diperkuat dengan hasil uji biokimia yang telah
dilakukan. Tetapi berdasarkan literature yang ada, uji Indol seharusnya
memberikan hasil yang positif. Hal ini dapat terjadi dikarenakan beberapa
factor seperti kesalahan dalam prosedur kerja dimana besar kemungkinan
kerja yang dilakukan kurang aseptis yang menyebabkan bakteri mati atau
terkontaminasi dengan lingkungan yang menyebabkan tidak terjadi reaksi
apa-apa pada saat uji indol.
VIII.

SIMPULAN

Kegiatan enzimatik dari sampel bakteri dapat diamati dimana hasil

identifikasi yang telah dibandingkan dengan karakteristik bakteri melalui
uji biokimia menyimpulkan bahwa sampel bakteri No. 3A adalah bakteri
Escherichia coli.

DAFTAR PUSTAKA
Backmann, A. 2006. Carbohydrate metabolism in bacteriause of differences in
carbohydrate metabolism for identifying bacteria. Caister Academic Press.
USA.
Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham. 1993. Cowan and Steels, Manual for the
Biology 3rd Edition. John Wiley and Sons. Sussex, England.
Cappuccino , J.G & Sherman. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. Addison
dari berbagai spesimen klinis. Vol. 23 No. 4
Dr.Zaraswati Dwyana,M.Si dan Dra.Eva Johannes M.Si.2005. Uji Efektivitas
Ekstrak Kasar Alga Merah Eucheuma cottonii Sebagai Antibakteria
Terhadap Bakteri Patogen.
Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambaran. Jakarta.
Funke BR, Tortora GJ, Case CL . 2004. Microbiology: an introduction (8th ed,
ed.). Benjamin Cummings. San Francisco.
Hemraj V, Diksha S, Avneet G. A Review On Commonly Used Biochemical Test
Biochemical Test for Bacteria. Innovare Journal of Life Science. 2013.1-7.
Hera Noviana.2004.Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi
diisolasi dari berbagai spesimen klinis. Vol. 23 No. 4

Irianto, K.2006. Mikrobiologi.Yrama Widya : Bandung

Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Leboffe MJ and Pierre BE. 2011. A Photographic Atlas for the Microbiology for
Laboratory. Morton Publishing Company.
Lehninger. 1995. Dasar dasar Biokimia. Jilid I. Erlangga. Jakarta.Malang
Murray. 1995. Biokimia Harper. EGC. Jakarta.
Naid, T., Kasim, S.,Marzuki, A.,Sumarheni. (2013). Produksi Antibiotika Secara
Fermentasi dari Biakan Mikroorganisme Simbion Rumput Laut Eucheuma
cottoni. Majalah Farmasi dan Farmakologi, Vol. 17, No.3, hlm. 61 68.
Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press.
Jakarta.
Pelczar. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Singleton dan Sainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular
Identification of Medical Bacteria. New York: Cambridge University
Press.
Sridhar, RPN. 2006. IMViC Reaction. JJMMC.
Strohl, William A., Rouse,H and

Fisher, BD. 2001. Lippincotts Illustrated

Reviews: Microbiology. Lippincott William & Wilkins. USA.

Volk and Wheleer. 1993. Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk
Perguruan Tinggi. Yogyakarta: UGM Press.
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang.
Weshley Publishing Company. New York
Widodo Suwito.2010.Bakteri Yang Sering Mencemari Susu:Deteksi, Patogenesis,
Episemiologi, Dan Cara Pengendaliannya. Jurnal Litbang Pertanian.