Bioquimica - Tecnicas y Metodos - Jordi Oliver y Ana Ma Rodriguez (Coautor

BI O Q U M I C A
TCNICAS Y MTODOS
Dra. Pilar Roca

Profesora Titular de Bioqumica y Biologa Molecular
Dr. Jordi Oliver
Profesor Titular de Escuela Universitaria de Bioqumica y Biologa Molecular
Dra. Ana M Rodrguez
Ayudante de Universidad
Departamento de Biologa Fundamental y Ciencias de la Salud
Facultad de Ciencias
Universidad de las Islas Baleares
Serie
Base
BIOQUMICA. TCNICAS Y MTODOS
AUTORES:
Dra. Pilar Roca
Dr. Jordi Oliver
Dra. Ana M Rodrguez
del libro:
Editorial Hlice, 2003
de los autores, 2003
del CD:
Editorial Hlice, 2003
roolpi, 2003
EDICIN Y COORDINACIN:
Alicia Irurzun y Elena Feduchi
Editorial Hlice
C/Alberto Aguilera, 13, 4
28015 Madrid
Tel y Fax: 91 548 11 90
www.editorialhelice.com
MAQUETACIN Y FOTOCOMPOSICIN: Rebeca Irazbal
DISEO LNEA GRFICA: Pedro Elipe, Off Proyect S.L.
DISEO Y DESARROLLO MULTIMEDIA: roolpi, Universitat de les Illes Balears (UIB)
IMPRESIN: Closas Orcoyen
Impreso en Espaa
ISBN: 84-921124-8-4
Depsito Legal:
Reservado todos los derechos. Ninguna parte de este libro ni del CD puede ser reproducida total ni parcialmente, ni almacenada en un sistema informtico, ni trasmitida de
cualquier forma o por cualquier medio, electrnico, mecnico, fotocopia, grabacin u
otros mtodos, sin previo aviso y expreso permiso de Editorial Hlice.
Prlogo
Sueo de un ayer
Este libro, junto con el CD-ROM que lo acompaa, es el sueo de un ayer.
Es un sueo porque, al iniciar nuestra labor docente en la Universidad explicando metodologa y anlisis bioqumico, deseamos tener en nuestras manos una
herramienta que nos permitiera superar la dificultad que tenamos para ensear
a nuestros alumnos. Con herramientas convencionales, nos resultaba difcil que
se imaginaran cmo tena lugar una separacin de molculas o cules eran los
principios que nos permitan determinar una molcula concreta en presencia de
otras. No slo eso; poco a poco nos dimos cuenta de que nuestros alumnos pertenecen a una generacin cada vez ms educada en la imagen y no en la palabra, imagen que es, normalmente, tridimensional y no bidimensional como las
que podemos encontrar en los libros de texto convencionales y en los recursos
didcticos a los que estbamos tradicionalmente acostumbrados. Por ello, hicimos una reflexin importante al respecto: los profesores debemos adaptarnos a
los tiempos y evolucionar, ampliar y mejorar nuestros sistemas y recursos a la
hora de explicar una materia. En gran medida, la respuesta a este reto podemos
encontrarla en las nuevas tecnologas de la informacin, que permiten abrir nuevas puertas para tratar la informacin, explicar con ms claridad y estimular a
nuestros alumnos y, por supuesto, a nosotros mismos como profesores.
No obstante, este libro, junto con el CD-ROM, es tambin un sueo de un
ayer, porque si hoy mismo volviramos a escribirlos o disearlos, seguramente lo
haramos de una forma diferente. Sin embargo, siempre existe un punto en el
camino en que tenemos que decir hasta aqu hemos llegado. Seguramente
maana empezaremos a trabajar en el sueo de hoy.
La manera de abordar los diferentes captulos del libro es el resultado de la
experiencia adquirida durante aos de docencia de las tcnicas y los mtodos en
Bioqumica. Ya desde el inicio, nos dimos cuenta de que explicar las tcnicas generales y los mtodos de anlisis de las biomolculas es, en muchas ocasiones,
complicado desde el punto de vista didctico; la presentacin secuencial de las
tcnicas y su aplicacin puede resultar a los alumnos algo tedioso y, por qu no
5
Prlogo
decirlo, aburrido. No obstante, se puede conseguir un enfoque distinto y ms

ameno para esta tarea, si las tcnicas generales se presentan con el objeto de determinar una biomolcula concreta. Adems, se pueden introducir bajo una
perspectiva casi cronolgica de aparicin (desde el punto de vista histrico), demostrando de esta manera que las tcnicas y los mtodos analticos en bioqumica se basan, en realidad, en los mismos principios generales: considerar la
naturaleza y las caractersticas de las molculas que se pretenden analizar. Para
conseguir este objetivo, los captulos de los mtodos de determinacin de las
distintas biomolculas se van presentando en un determinado orden: bioelementos, aminocidos, protenas, lpidos, hidratos de carbono y, por ltimo, cidos nucleicos. Los captulos de las tcnicas generales (que llevan una banda gris
en el margen para facilitar su identificacin) se van intercalando a medida que se
va haciendo necesaria su comprensin para la determinacin de una molcula
en concreto. Dar este enfoque a la organizacin del libro nos permite demostrar
que, con el paso del tiempo, los mtodos de anlisis han ido amplindose y evolucionando, introduciendo los conocimientos bioqumicos que se han adquirido,
de manera que las tcnicas y mtodos en Bioqumica y la propia Bioqumica han
ido avanzando y desarrollndose de forma sinrgica.
Una idea bsica que se repite a lo largo de todo el libro es el hecho de que
los mtodos para la determinacin de las diferentes biomolculas se basan en
sus caractersticas diferenciales qumicas, fsicas y bioqumicas, que van a permitir el anlisis de un tipo concreto de molcula o de una serie de ellas con caractersticas similares, aunque en un principio se encuentren en presencia de
otras muchas molculas diferentes, tal como sucede en las complejas muestras
biolgicas. As pues, a partir de estas diferencias, y teniendo en cuenta las caractersticas especiales de los distintos tipos de biomolculas, se han desarrollado
diferentes mtodos tanto para detectarlas como para cuantificarlas. Otro aspecto
importante es que, para detectar y cuantificar una molcula, sta debe presentar
una propiedad mensurable y, si no la presenta en un principio, es necesario
hacrsela adquirir aprovechando alguna caracterstica propia de la molcula.
De esta forma, el libro comienza con cuatro captulos introductorios en los
que se presenta qu son las tcnicas y los mtodos en la Bioqumica y su objeto
de estudio, y qu normas y criterios de seguridad se han de seguir a la hora de
trabajar en un laboratorio bioqumico, as como los diferentes tipos de muestras
que podemos encontrarnos, adems de sealar la importancia del tratamiento y
procesamiento de las mismas. En el tercer captulo de libro se presenta el leitmotiv del mismo, sealando las ideas generales a partir de las cuales se han desarrollado los diferentes mtodos de anlisis bioqumicos.
El libro contina con la introduccin, en el captulo 5, de las tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas y, en el captulo 6, de las tcnicas radioqumicas.
En el captulo 7 se trata la determinacin de los diferentes bioelementos y, en el
captulo 8, la determinacin de los aminocidos totales se utiliza como ejemplo
de la aplicacin de las tcnicas de anlisis explicadas en los dos captulos anteriores. El captulo 9 permite introducir las tcnicas de separacin y, en especial,
las cromatogrficas, las cuales se desarrollan en el captulo 10, donde se presentan diferentes mtodos cromatogrficos para la determinacin de los aminocidos individuales.
Los siguientes captulos, en los que se explican los mtodos para la determinacin de las protenas totales (captulo 11) e individuales (captulo 15), facilitan
6
Prlogo
la introduccin de tcnicas separativas como las electroforticas (captulo 12), as

como las tcnicas enzimticas (captulo 13) y las inmunolgicas (captulo 14).
Los captulos 16, 18 y 19, dedicados a los anlisis de lpidos y carbohidratos,
permiten explicar, de forma desarrollada y concreta, mtodos de determinacin
basados en tcnicas expuestas en captulos precedentes sobre la separacin y
determinacin de biomolculas, tanto por mtodos fsicos, como qumicos, enzimticos e inmunolgicos. De esta manera, se asientan toda una serie de ideas
presentadas y desarrolladas anteriormente y puede verse cmo a partir de estas
ideas bsicas y comunes es posible desarrollar mtodos concretos para el anlisis
de las distintas biomolculas en funcin de sus caractersticas diferenciales.
Adems, en el captulo 17 se introducen tcnicas separativas de biomolculas
como la dilisis, la filtracin y la centrifugacin.
Los ltimos captulos del libro, 20, 21 y 22, en los que se estudia la determinacin de los cidos nucleicos tanto de forma global como individual, no slo
nos permiten comprobar cmo, de nuevo, tcnicas y herramientas desarrolladas
en captulos anteriores son tambin tiles para el estudio de los cidos nucleicos;
adems, nos acercan a los ltimos avances en metodologa analtica, las tcnicas
de hibridacin, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y otras, que nuevamente nos permiten ilustrar cmo los propios conocimientos de la bioqumica
son capaces de proporcionar las herramientas necesarias para el anlisis de las
molculas que forman los seres vivos.
Un perfecto acompaamiento de los captulos estudiados en el libro lo constituye el CD-ROM, que incluye los mismos temas que el libro, pero proporcionando explicaciones visuales y dinmicas de los diferentes aspectos tratados, de
forma que un estudio conjunto de un captulo del libro junto con su versin en
el CD-ROM proporciona una visin clara y completa de los conceptos desarrollados. La versatilidad que proporciona el CD-ROM permite reorganizar todo el
contenido del libro, as como incluir gran cantidad de material didctico que sirve de apoyo para la comprensin de los conceptos. Se ha optado por estructurar
el CD-ROM desde un men principal que incluye: Introduccin, Tcnicas Generales, Mtodos de determinacin de biomolculas, un Anexo de mtodos
(donde se desarrollan protocolos especficos que hacen uso de las tcnicas estudiadas) y la presentacin de molculas biolgicas, en forma de scripts de Chime,
para facilitar el conocimiento de sus caractersticas estructurales. As mismo, se
ha incluido un apartado de enlaces externos a pginas web con informacin sobre los captulos del libro y del CD-ROM. La navegacin por el CD permite ir rpidamente desde una tcnica general a un mtodo en particular, aplicado a una
determinada molcula, as como la consulta de un protocolo concreto para el
anlisis de esta molcula.
Por ltimo, no podemos acabar este prlogo sin dar las gracias a todas aquellas personas que han tenido influencia, tanto de manera directa como indirecta,
en la realizacin de este sueo. Algunas nos han proporcionado acertadas ideas
y sugerencias, mientras que otras simplemente nos animaron y empujaron en
nuestra aventura. Tampoco podemos dejar de destacar la magnifica labor realizada por las editoras, Elena y Alicia, en la realizacin de este sueo. Una mencin especial merecen nuestros alumnos, que nos han ayudado a mejorar la
estructura y la manera de presentar los captulos, adems de sugerirnos qu puntos del libro mejoraran introduciendo simulaciones para una mejor comprensin de los conceptos explicados y de los procesos analticos.
A todos, muchas gracias.
7
ndice breve
01.
02.
03.
04.
05.
06.
07.
08.
09.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
LA BIOQUMICA Y SU ESTUDIO
SEGURIDAD Y RIESGOS
LA METODOLOGA ANALTICA
OBTENCIN DE MUESTRAS
TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS Y FLUORIMTRICAS
TCNICAS RADIOQUMICAS
MTODOS DE DETERMINACIN DE BIOELEMENTOS
MTODOS DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS
TCNICAS DE SEPARACIN: CROMATOGRAFA
MTODO DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDIVIDUALES
MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS
TCNICAS DE SEPARACIN: ELECTROFORESIS
TCNICAS ENZIMTICAS
TCNICAS INMUNOQUMICAS
MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS INDIVIDUALES
MTODOS GENERALES DE DETERMINACIN DE LPIDOS
TCNICAS DE SEPARACIN: DILISIS, FILTRACIN Y CENTRIFUGACIN
MTODOS DE DETERMINACIN DE LPIDOS INDIVIDUALES
MTODOS DE DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS
MTODOS DE DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS
TCNICAS DE HIBRIDACIN Y PCR
MTODOS DE DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS INDIVIDUALES
ndice
01. LA BIOQUMICA Y SU ESTUDIO ......................................................
18
INTRODUCCIN ...........................................................................................
CMO ENFOCAR UN ESTUDIO EN BIOQUMICA .......................................
NIVELES DE INVESTIGACIN EN BIOQUMICA ............................................
Estudios con un animal entero ...................................................................
Estudios de rganos aislados ......................................................................
Estudios con cultivos de tejidos y de clulas ..............................................
Estudios con orgnulos celulares ................................................................
Estudios moleculares ..................................................................................
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22
24
24
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02. SEGURIDAD Y RIESGOS ....................................................................
30
INTRODUCCIN ...........................................................................................
NORMAS DE SEGURIDAD .............................................................................
Productos qumicos ...................................................................................
Etiquetado ...........................................................................................
Almacenamiento ..................................................................................
Medidas de seguridad personales. Comportamiento del investigador .........
Fuentes de peligro en el laboratorio ...........................................................
Investigaciones con productos radiactivos ..................................................
Investigaciones con microorganismos patgenos ........................................
NORMAS GLP: The Good Laboratory Practices ................................................
31
33
33
33
33
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36
38
38
03. LA METODOLOGA ANALTICA ........................................................
42
INTRODUCCIN ...........................................................................................
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS DE ANLISIS BIOQUMICOS ................
Mtodos qumicos .....................................................................................
Mtodos fsicos ..........................................................................................
Mtodos enzimticos .................................................................................
Mtodos inmunolgicos .............................................................................
Mtodos de hibridacin ............................................................................
ERRORES DE LOS MTODOS ANALTICOS ...................................................
Variabilidad de los datos analticos ............................................................
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49
50
50
ndice
10
Errores accidentales .............................................................................

Errores sistemticos ..............................................................................
Valoracin de los mtodos analticos .........................................................
Control de calidad de los resultados ..........................................................
SELECCIN DEL MTODO DE ANLISIS .......................................................
PRESENTACIN DE LOS DATOS ....................................................................
51
51
51
53
55
56
04. OBTENCIN DE MUESTRAS .............................................................
58
INTRODUCCIN ...........................................................................................
MUESTRAS DE SANGRE .................................................................................
Recogida de muestras de sangre ................................................................
Puncin venosa ...................................................................................
Puncin arterial ...................................................................................
Puncin cutnea ..................................................................................
Anticoagulantes .........................................................................................
Alteraciones en las muestras de sangre durante la conservacin y el
procesamiento ........................................................................................
Agentes desproteinizantes ..........................................................................
MUESTRAS DE ORINA ...................................................................................
Composicin de la orina ............................................................................
Recogida de muestras de orina ..................................................................
Orina de una miccin ..........................................................................
Orina de un tiempo determinado ........................................................
Deterioro de las muestras de orina. Conservantes ......................................
58
58
59
60
62
63
63
05. TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS Y FLUORIMTRICAS ...........
70
INTRODUCCIN ...........................................................................................
ESPECTROFOTOMETRA ................................................................................
La luz .......................................................................................................
Distribucin de la energa en los tomos y en las molculas ......................
Distribucin de la energa en los tomos ..............................................
Distribucin de la energa en las molculas ..........................................
Absorcin de la radiacin ..........................................................................
Emisin y absorcin atmica .....................................................................
Absorcin molecular. Regiones ultravioleta y visible ...................................
Absorciometra molecular. Ley de Beer-Lambert ........................................
TCNICAS DE FLUORESCENCIA MOLECULAR ..............................................
71
72
72
73
73
73
74
75
79
82
85
06. TCNICAS RADIOQUMICAS ............................................................
88
INTRODUCCIN ...........................................................................................
TIPOS DE RADIACTIVIDAD ............................................................................
Partculas D ................................................................................................
Partculas E ...............................................................................................
Positrones (E+) ...........................................................................................
Captura electrnica ...................................................................................
Rayos J ......................................................................................................
DESINTEGRACIN RADIACTIVA ....................................................................
UNIDADES DE RADIACTIVIDAD ....................................................................
DETECCIN Y MEDICIN DE LA RADIACTIVIDAD ......................................
Contadores Geiger-Mller .........................................................................
Contadores de centelleo ............................................................................
Controladores de centelleo slido ........................................................
89
90
90
90
91
91
91
92
93
93
94
95
95
64
65
65
66
66
66
67
67
ndice
Contadores de centelleo lquido ..........................................................
Autorradiografa .........................................................................................
96
97
07. MTODOS DE DETERMINACIN DE BIOELEMENTOS ....................
98
INTRODUCCIN ...........................................................................................
TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE
METALES Y ELEMENTOS TRAZA ..................................................................
MTODOS DE DETERMINACIN DE BIOELEMENTOS .................................
Determinacin de calcio ...........................................................................
Determinacin de fsforo ..........................................................................
Determinacin de sodio y potasio .............................................................
Determinacin de hierro ...........................................................................
99
100
100
101
102
103
103
08. MTODOS DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS .................... 104

INTRODUCCIN ...........................................................................................
Estructura de los aminocidos ....................................................................
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS
TOTALES ......................................................................................................
Mtodo de la ninhidrina ............................................................................
Reaccin de Sanger ...................................................................................
Reaccin del fenilisotiocianato ..................................................................
Mtodo del o-ftaldehdo ............................................................................
Reaccin de la fluorescamina ....................................................................
Reaccin del cloruro de dansilo .................................................................
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS
INDIVIDUALES ............................................................................................
105
105
107
108
109
110
110
110
111
111
09. TCNICAS DE SEPARACIN: CROMATOGRAFA ............................. 112

INTRODUCCIN ...........................................................................................
PRINCIPIO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN. TCNICAS FSICAS ............
Polaridad ...................................................................................................
Volatilidad ...........................................................................................
Solubilidad ..........................................................................................
Adsorcin ............................................................................................
Carga .......................................................................................................
Tamao .....................................................................................................
DISEO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN DE MOLCULAS .....................
TCNICAS CROMATOGRFICAS ....................................................................
Tcnicas cromatogrficas basadas en la polaridad ......................................
Cromatografa lquido-slido: cromatografa de adsorcin ...................
Cromatografa gas-lquido: GLC ...........................................................
Cromatografa lquido-lquido. Cromatografa lquida de alta precisin:
HPLC ................................................................................................
Cromatografa de intercambio inico .........................................................
Cromatografa de permeabilidad. Cribado molecular .................................
113
114
114
115
115
116
116
116
117
118
118
120
124
128
131
133
10. MTODOS DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS

INDIVIDUALES ................................................................................... 134
INTRODUCCIN ........................................................................................... 135
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR TLC ........................................... 136
Separacin unidimensional ........................................................................ 137
11
ndice
Separacin bidimensional ..........................................................................
Determinacin de aminocidos por TLC con reacciones mltiples ............
Separaciones de aminocidos derivatizados ...............................................
Cromatografa de DNP-aminocidos ....................................................
Cromatografa de dansil-aminocidos ..................................................
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR HPLC ........................................
Ejemplo de determinacin de aminocidos individuales libres por HPLC:
Pico-Tag ...............................................................................................
ANALIZADORES AUTOMTICOS DE AMINOCIDOS ..................................
137
138
139
140
140
143
144
146
11. MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS ........................... 148

INTRODUCCIN ...........................................................................................
Estructura de las protenas .........................................................................
Fuerzas determinantes de la estructura proteica .........................................
Fuerzas electrostticas ..........................................................................
Puentes de hidrgeno ..........................................................................
Fuerzas hidrofbicas ............................................................................
Fuerzas de Van der Waals ....................................................................
Puentes disulfuro .................................................................................
Desnaturalizacin de las protenas .............................................................
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS ....................
Mtodo de Kjeldahl (determinacin del contenido en nitrgeno) ..............
Mtodo del biuret .....................................................................................
Mtodo de Lowry ......................................................................................
Mtodo del BCA .......................................................................................
Mtodo de Bradford ..................................................................................
Nefelometra .............................................................................................
Determinacin de albmina ......................................................................
Determinacin de hemoglobina ................................................................
149
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158
159
159
12. TCNICAS DE SEPARACIN: ELECTROFORESIS ............................... 160

INTRODUCCIN ...........................................................................................
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS ......................................................
Componentes de un sistema electrofortico ..............................................
Migracin electrofortica ...........................................................................
Naturaleza de los compuestos a separar ..............................................
Campo elctrico ..................................................................................
Tampn ...............................................................................................
Soporte ................................................................................................
TIPOS DE ELECTROFORESIS ..........................................................................
Electroforesis en papel de filtro ..................................................................
Electroforesis en membranas de acetato de celulosa ..................................
Electroforesis en geles de almidn .............................................................
Electroforesis en geles de agarosa ..............................................................
Electroforesis en geles de poliacrilamida ....................................................
VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN DE LOS RESULTADOS .......................
APLICACIONES PARTICULARES DE LA ELECTROFORESIS .............................
Isoelectroenfoque ......................................................................................
Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE .......................
Electroforesis en gradiente .........................................................................
Electroforesis bidimensional .......................................................................
Electroforesis capilar (CE) ...........................................................................
12
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164
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171
171
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174
174
175
ndice
13. TCNICAS ENZIMTICAS .................................................................. 178

INTRODUCCIN ...........................................................................................
ENZIMAS .......................................................................................................
Especificidad de accin y de sustrato .........................................................
Estructura de las enzimas ...........................................................................
Cintica enzimtica ...................................................................................
Modelo de Michaelis-Menten ..............................................................
Significado de las constantes cinticas del modelo Michaelis-Menten:
Km y Vmx ..........................................................................................
Clasificacin de las enzimas .......................................................................
DISEO DE LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA ............................
Medio de reaccin ....................................................................................
Medida de la velocidad de reaccin ..........................................................
Deteccin del sustrato o del producto de una reaccin enzimtica ...........
LAS ENZIMAS COMO REACTIVOS .................................................................
179
180
180
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185
185
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187
187
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192
14. TCNICAS INMUNOQUMICAS ........................................................ 196

INTRODUCCIN ...........................................................................................
Anticuerpos ...............................................................................................
Obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales .............................
Interacciones antgeno-anticuerpo .............................................................
TCNICAS ANALTICAS INMUNOQUMICAS ................................................
Reacciones de precipitacin ......................................................................
Inmunoprecipitacin en solucin .........................................................
Inmunoprecipitacin en gel .................................................................
Ensayos inmunoqumicos que utilizan marcadores .....................................
Radioinmunoensayo (RIA) y ensayo inmunorradiomtrico (IRMA) ........
Inmunoensayo enzimtico (EIA): marcaje con enzimas ........................
Fluoroinmunoensayos ..........................................................................
Western blot ........................................................................................
197
197
199
201
202
203
203
204
204
205
208
213
213
15. MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS INDIVIDUALES .. 214

INTRODUCCIN ...........................................................................................
TCNICAS DE SEPARACIN DE PROTENAS .................................................
Cromatografa de protenas ........................................................................
Cromatografa de intercambio inico ...................................................
Cromatografa de cribado molecular ....................................................
Cromatografa de afinidad ...................................................................
Electroforesis de protenas .........................................................................
Electroforesis en papel de filtro ............................................................
Electroforesis en acetato de celulosa ....................................................
Electroforesis en geles de agarosa .........................................................
Electroforesis en geles de polacrilamida ...............................................
TCNICAS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS ESPECFICAS ....................
Determinacin en clnica de enzimas plasmticas .....................................
Enzimas de baja concentracin ............................................................
Transaminasas ......................................................................................
Lactato deshidrogenasa ........................................................................
Determinacin de protenas por tcnicas inmunoqumicas ........................
Determinacin de insulina por ELISA en sndwich ..............................
Determinacin de la protena UCP1 por ELISA competitivo ................
Determinacin de la protena UCP1 por Western blot .........................
215
216
216
216
216
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220
220
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225
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227
228
228
13
ndice
16. MTODOS GENERALES DE DETERMINACIN DE LPIDOS ............ 230

INTRODUCCIN ...........................................................................................
Clasificacin y estructura de los lpidos ......................................................
Lpidos simples ....................................................................................
Lpidos complejos ................................................................................
Lipoprotenas plasmticas ....................................................................
DETERMINACIN DE LPIDOS ......................................................................
Obtencin y preparacin de las muestras ..................................................
Mtodos de extraccin de lpidos ..............................................................
Cuantificacin de lpidos totales ................................................................
Determinacin de glicerol .........................................................................
Determinacin de triacilgliceroles ..............................................................
Mtodos qumicos para la determinacin de triacilgliceroles ................
Mtodos enzimticos para la determinacin de triacilgliceroles ...........
Determinacin de cidos grasos libres .......................................................
Determinacin de colesterol ......................................................................
Mtodos qumicos para la determinacin de colesterol ........................
Mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol ...................
Determinacin de cuerpos cetnicos .........................................................
231
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241
241
242
243
243
244
244
245
17. TCNICAS DE SEPARACIN: DILISIS, FILTRACIN Y

CENTRIFUGACIN ............................................................................ 248
INTRODUCCIN ...........................................................................................
DILISIS .......................................................................................................
FILTRACIN ...................................................................................................
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN .................................................................
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin ..........................................
Diseo de la instrumentacin para tcnicas de centrifugacin ...................
Tipos de rotores ...................................................................................
Tipos de centrifugacin .............................................................................
Centrifugacin preparativa ...................................................................
Centrifugacin analtica .......................................................................
249
249
250
251
251
254
254
255
255
258
18. MTODOS DE DETERMINACIN DE LPIDOS INDIVIDUALES ....... 260

INTRODUCCIN ...........................................................................................
FRACCIONAMIENTO DE MEZCLAS DE LPIDOS ...........................................
Extraccin con disolventes .........................................................................
Extraccin en columna ..............................................................................
Cromatografa en capa fina ........................................................................
DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS ........................................................
Determinacin de cidos grasos por cromatografa de gases ......................
Determinacin simultnea de cidos grasos libres y esterificados en
plasma ....................................................................................................
DETERMINACIN DE LAS LIPOPROTENAS PLASMTICAS ..........................
Separacin de lipoprotenas por ultracentrifugacin ..................................
Separacin de lipoprotenas por electroforesis ...........................................
Determinacin de lipoprotenas por mtodos inmunolgicos ....................
DETERMINACIN DE FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA ................................
261
261
261
262
262
264
264
266
267
267
268
269
269
19. MTODOS DE DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS ................ 270

INTRODUCCIN ........................................................................................... 271
Estructura de los carbohidratos .................................................................. 271
14
ndice
Monosacridos .....................................................................................
Disacridos ..........................................................................................
Polisacridos ........................................................................................
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS .....................
Preparacin de las muestras ......................................................................
Mtodos qumicos para la determinacin de carbohidratos .......................
Mtodo de reduccin del cobre ..........................................................
Reacciones con cidos fuertes y fenoles ...............................................
Mtodos enzimticos para la determinacin de carbohidratos ...................
SEPARACIN DE MEZCLAS DE CARBOHIDRATOS E IDENTIFICACIN ........
Cromatografa en papel y en capa fina ......................................................
Cromatografa de gases y HPLC .................................................................
272
274
276
278
278
278
279
279
280
285
285
286
20. MTODOS DE DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS ............ 288

INTRODUCCIN ...........................................................................................
Estructura de los cidos nucleicos ..............................................................
MTODOS DE AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS ................................
Mtodos de aislamiento y purificacin de ADN .........................................
Mtodos de aislamiento y purificacin de ARN .........................................
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS .....
Determinacin por espectrofotometra ......................................................
Mtodo de tincin con bromuro de etidio ................................................
Mtodo del cido diamino benzoico (DABA) para la
determinacin de ADN ..........................................................................
289
290
292
292
294
296
296
296
297
21. TCNICAS DE HIBRIDACIN Y PCR ................................................. 298

INTRODUCCIN ...........................................................................................
PROCESO DE HIBRIDACIN .........................................................................
Formacin y separacin de la doble hebra de ADN ..................................
Medio de hibridacin ................................................................................
DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN ............................................
Preparacin de las sondas: produccin y marcaje ......................................
Produccin de sondas ..........................................................................
Tipos de marcaje .................................................................................
Inmovilizacin de la muestra .....................................................................
Hibridacin y lavados ................................................................................
Cuantificacin ...........................................................................................
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR ......................................
Fundamento de la PCR ..............................................................................
Diseo de las tcnicas de PCR ...................................................................
Medio de reaccin ..............................................................................
Etapas de la PCR ..................................................................................
Visualizacin de los productos .............................................................
RT-PCR ......................................................................................................
299
299
300
301
303
304
304
305
305
306
306
308
308
309
311
312
313
313
22. MTODOS DE DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

INDIVIDUALES ................................................................................... 316
INTRODUCCIN ...........................................................................................
SEPARACIN ELECTROFORTICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS .................
ESTUDIO DEL ADN ........................................................................................
Uso de enzimas de restriccin y Fingerprinting ..........................................
Southern blot .............................................................................................
317
317
318
318
319
15
ndice
Anlisis de RFLPs .......................................................................................
Reaccin en cadena de la ligasa (LCR, Ligase Chain Reaction) ....................
Secuenciacin del ADN .............................................................................
Mtodos de fragmentacin qumica .....................................................
Mtodo del terminador de cadena ......................................................
ESTUDIO DEL ARN ........................................................................................
Dot blot y Slot blot ....................................................................................
Northern blot ............................................................................................
RT-PCR ......................................................................................................
319
320
322
322
324
326
326
327
329
BIBLIOGRAFA .......................................................................................... 331

NDICE ANALTICO .................................................................................. 337
16
La Bioqumica y su estudio
INTRODUCCIN
CMO ENFOCAR UN ESTUDIO EN BIOQUMICA
NIVELES DE INVESTIGACIN EN BIOQUMICA
Estudios con un animal entero
Estudios de rganos aislados
Estudios con cultivos de tejidos y de clulas
Estudios con orgnulos celulares
Estudios moleculares
18
1
INTRODUCCIN
El estudio de la Bioqumica Analtica las tcnicas y los mtodos tiene una serie
de objetivos bsicos que se irn descubriendo a lo largo de este libro. Antes de
realizar un estudio ms detallado de los objetivos de esta materia, es conveniente detenerse a estudiar qu es la Bioqumica y, por extensin, conocer cules son
los objetivos de la metodologa Bioqumica.
Aunque resulta difcil definir qu es la Bioqumica, se han dado diferentes
definiciones de la misma:
Ciencia que explica la vida utilizando el lenguaje de la qumica.
La Bioqumica es la qumica de la vida.
Ciencia que se ocupa de la base qumica de la vida.
Ciencia que se encarga de estudiar a los seres vivos en el nivel molecular o,
en general, Ciencia que estudia los procesos biolgicos en el nivel molecular (Biologa Molecular) y, en general, subcelular.
Ciencia que estudia las diferentes molculas y reacciones qumicas que se
dan en las clulas y organismos vivos.
Todas estas definiciones no son lo suficientemente esclarecedoras y, a veces,
la mejor definicin no es aquella que trata de dar una explicacin de lo que es
una ciencia, sino aquella que establece cul es el objeto de tal Ciencia. As, tal
vez una de las mejores maneras de definir la Bioqumica es a travs de establecer su objeto:
El objeto de la Bioqumica es estudiar la composicin qumica de los seres vivos, las relaciones entre dichos materiales, sus transformaciones, la regulacin y el funcionamiento de estos procesos y, por lo tanto, las
repercusiones que tienen en la fisiologa de los organismos.
Resumiendo, podemos decir que la Bioqumica estudia las siguientes caractersticas de los seres vivos:
19
Captulo 1
Composicin: molculas y elementos que forman los seres vivos. As, se estudia
la composicin qumica tanto en bioelementos (C, H, N, O, S, Fe, Ca, ...), como
en las principales biomolculas que forman los seres vivos (agua, monosacridos,
polisacridos, aminocidos, protenas, cidos grasos, triacilgliceroles, etc.).
Relaciones: las diferentes molculas que forman los seres vivos interaccionan
entre ellas formando agrupaciones supramoleculares. Algunos ejemplos son los
cromosomas (cidos nucleicos + protenas), las membranas (lpidos + protenas), las lipoprotenas (lpidos + protenas), etc. Estas agrupaciones supramoleculares presentan diferentes propiedades y forman las estructuras subcelulares
(mitocondrias, ribosomas, lisosomas, aparato de Golgi, etc.), que permiten a la
clula realizar las distintas funciones para mantener el fenmeno vital. Adems,
la bioqumica estudia cmo las diferentes clulas interaccionan para formar los
tejidos multicelulares, rganos, organismos, etc.
Transformaciones: las diferentes biomolculas de los seres vivos se transforman
unas en otras a travs de la accin de las enzimas adecuadas. La Bioqumica estudia cmo las distintas biomolculas pueden convertirse unas en otras (glcidos
en cidos grasos, aminocidos en glucosa, aminocidos en bases pricas y pirimidnicas, etc.).
Regulacin: la Bioqumica estudia no slo cmo un compuesto se transforma
en otro, sino que tambin estudia la velocidad con la que tiene lugar una transformacin, y cmo diferentes elementos y compuestos regulan los flujos en estos procesos. Tambin trata de establecer cmo se da la activacin o la
inhibicin de las diferentes rutas metablicas y qu repercusiones tienen fisiolgicamente.
Figura 1.1. La instrumentacin y las

tcnicas de laboratorio permiten estudiar
los procesos moleculares que tienen lugar
en el interior de los seres vivos.
20
Poder cubrir los objetivos de la Bioqumica ha presentado una dificultad

importante; y es que el investigador es incapaz de percibir a travs de los sentidos lo que ocurre en el nivel celular y molecular dentro de un ser vivo. As, el
estudio de las clulas a un nivel molecular por parte del observador (cientfico)
se ha realizado de manera indirecta con la ayuda de instrumentos y tcnicas
que le permiten, por decirlo as, percibir lo que ocurre dentro de la clula (Figura 1.1).
Para cubrir los objetivos de la Bioqumica, los bioqumicos han tenido que
aislar las numerosas molculas que componen las clulas, determinar sus estructuras y analizar cmo funcionan. Adems, se han tenido que desarrollar mtodos
(utilizando diferentes instrumentos y tcnicas experimentales) para analizar y determinar la cantidad de biomolculas que hay en un determinado orgnulo subcelular, clula, tejido, fluido corporal, etc.
No se ha de perder de vista que la Bioqumica es una ciencia emprica (basada en la experiencia), es decir, que todo lo que se estudia deriva de hiptesis
concebidas sobre la base de observaciones y contrarrestadas por experimentos.
Este modo de proceder se conoce con el nombre de Mtodo Cientfico.
El Mtodo Cientfico es la manera de razonar y proceder para realizar inferencias en las ciencias empricas. El mtodo tiene una serie de etapas que deben
cubrirse (Figura 1.2). De esta manera, el desarrollo de una ciencia emprica es
lento y dificultoso y, al mismo tiempo, est plagado de teoras que con el tiempo
van quedando obsoletas y tienen que reformularse.
La bioqumica, como ciencia emprica, sigue el mtodo cientfico con el fin
de resolver cuestiones sobre determinados fenmenos, tal y como ocurre en to-
das las ciencias experimentales. As pues, frente a un problema que se quiera resolver o sobre el que se quiera profundizar, puede plantearse una hiptesis, a
partir de una informacin previa, sobre su resolucin. En funcin de la hiptesis,
se realizar un diseo experimental que permita descartarla o bien aceptarla. El
diseo experimental se fundamentar en toda una serie de tcnicas y mtodos,
que permitirn llevar a cabo la fase experimental, a partir de la cual se obtendr
una serie de resultados. Los datos obtenidos debern ser interpretados, extrayndose unas conclusiones que permitan rechazar o aceptar la hiptesis de partida,
aunque normalmente suelen conllevar nuevas cuestiones o nuevos problemas,
que debern ser investigados. Todo esto supone aumentar el conocimiento sobre
un tema determinado, pero es evidente que difcilmente se podr conocer toda
la verdad sin que se planteen nuevas preguntas, y que la aceptacin temporal de
una hiptesis va a depender, en gran medida, de la instrumentacin, las tcnicas
y los conocimientos cientficos del momento. De ah que la ciencia est en continua evolucin y que las viejas teoras se vayan descartando, cambiando o ampliando.
Como se puede observar, en el caso de la Bioqumica, la instrumentacin, las
tcnicas y la metodologa utilizadas para confirmar las hiptesis son cruciales,
pues se depende de la fiabilidad y la sensibilidad de stas para poder reafirmar o
rechazar las hiptesis planteadas inicialmente.
En estos momentos estamos en disposicin de decir cul es el objetivo bsico
de este libro:
Figura 1.2. Fases del mtodo cientfico.
Presentar y dar a conocer el fundamento de los diferentes mtodos y

tcnicas de laboratorio que permiten determinar la composicin de
muestras biolgicas.
El avance de la Bioqumica ha requerido el desarrollo de tcnicas y mtodos
que permitan determinar la presencia y cantidad de las diferentes molculas que
forman los seres vivos (aminocidos, protenas, glcidos, lpidos, cidos nucleicos, ...); por eso, una parte importante a desarrollar en este libro se basar en estudiar los mtodos de determinacin de estos compuestos a travs de la
utilizacin de distintas tcnicas y diferente instrumentacin.
Los bioqumicos han desarrollado la metodologa adecuada para poder cubrir
los objetivos que plantea esta Ciencia y, de esta forma, el estudio de la metodologa en Bioqumica se ha convertido tambin en objetivo de la propia Bioqumica. As, los lmites de la Bioqumica se encuentran definidos, por un lado, por el
objeto de estudio, que es el fenmeno vital y, por otro, por la metodologa experimental necesaria para cubrir el objeto de estudio de la Bioqumica. Las tcnicas
y los conceptos necesarios para conseguir una aproximacin a la ordenacin
molecular y funcional de los seres vivos hicieron que el nacimiento y desarrollo
de la Bioqumica se basara en los fundamentos de otras Ciencias, como la Qumica y la Fsica. Sin embargo, con el transcurso de los aos, las tcnicas basadas
en la qumica y la fsica no lograron dar soluciones suficientes. El avance de la
metodologa para la Bioqumica se consigui cuando los investigadores buscaron
en sus propios conocimientos bioqumicos la solucin para desarrollar nuevas
metodologas que les permitieran avanzar todava ms en tales conocimientos
bioqumicos.
En estos momentos se encuentra a disposicin de los investigadores un nmero importante de herramientas que permiten afrontar un amplio espectro de
investigaciones bioqumicas y continuar aumentado los conocimientos.
21
Captulo 1
CMO ENFOCAR UN ESTUDIO EN BIOQUMICA

Los procesos bioqumicos son complejos, y quererlos estudiar en su totalidad es
quiz un error. As, los procesos complejos son ms fciles de abordar cuando se
fraccionan en procesos ms sencillos, de manera que si se determinan los procesos sencillos, es ms fcil conocer el global.
Los enfoques de la experimentacin en bioqumica pueden dividirse en dos
grandes grupos: experimentos in vivo y experimentos in vitro.
Experimentos in vivo
En los estudios in vivo, el organismo se mantiene intacto, con la menor
perturbacin posible. En contrapartida, es ms difcil identificar las variables que pueden influir sobre el sistema.
Experimentos in vitro
En los estudios in vitro, el organismo o el sistema se mantiene aislado de su
entorno, con lo que se produce una perturbacin del mismo. En contrapartida, es ms fcil controlar las variables que pueden influir sobre el sistema.
Los dos enfoques son complementarios ya que, mientras que los estudios in
vitro son ms fciles de interpretar que los estudios in vivo, las conclusiones obtenidas de un estudio in vitro pueden alejarse de la realidad al haber eliminado
factores que influyen sobre el sistema (Figura 1.3). Entre un tipo de enfoque y
otro existe una gradacin con todos los tipos posibles. As, una experiencia in
situ, se encontrara en un nivel intermedio de la gradacin; por ejemplo, para
estudiar el rgano de un animal anestesiado, el rgano es canulado fuera del
animal y perfundido con diferentes compuestos.
Figura 1.3. Diferentes enfoques en las
investigaciones bioqumicas.
El estudio bioqumico de las actividades celulares requiere generalmente

fraccionar las clulas; se habla entonces de estudios in vitro. Los procesos de
fraccionamiento pueden tener un efecto profundo sobre las actividades que se
dan en las clulas en condiciones normales. Evidentemente, se intentan minimizar los efectos provocados por el fraccionamiento tomando todas las precauciones posibles para mantener las condiciones lo ms prximas a las que se cree
que existen dentro de las clulas. Sin embargo, resulta imposible eliminar todos
los cambios provocados por los procesos de fraccionamiento, de manera que los
resultados obtenidos en clulas desintegradas deben siempre ser interpretados
con precaucin, sobre todo cuando se realizan extrapolaciones a la clula entera, al rgano o al organismo completo. Estas extrapolaciones requieren completarse con experimentos realizados sobre el rgano y, adems, sobre el animal
entero; es decir, requieren tambin estudios in vivo.
22
As, el estudio de los procesos bioqumicos es el resultado de la integracin

de los resultados obtenidos mediante el diseo de experiencias in vitro e in vivo.
Un ejemplo puede ayudar a ilustrar cmo el avance de los conocimientos del
funcionamiento en el nivel molecular de los seres vivos requiere ambos tipos de
experimentos, pasando muchas veces por situaciones que se encuentran en una
situacin intermedia, es decir, por experiencias in situ.
Un ejemplo sera el estudio de las causas de la obesidad. En este caso, se
puede disear toda una serie de experimentos utilizando los diferentes tipos de
enfoques, que permitirn, por ejemplo, conocer los efectos de determinados nutrientes sobre el desarrollo de la misma. Se pueden estudiar los efectos de diferentes variables (dieta, cidos grasos, agonistas E adrenrgicos, etc.) en un
organismo completo, o en un tejido determinado (por ejemplo, el tejido adiposo
marrn), o en las clulas (por ejemplo, en adipocitos marrones), o en un orgnulo celular (por ejemplo, en la mitocondria), o en una molcula (por ejemplo, la
citocromo c oxidasa).
En cada uno de los experimentos se pueden estudiar los efectos de un compuesto o un determinado factor en diferentes niveles (Figura 1.4). As, en los estudios con un organismo entero, cabe analizar los efectos de una alimentacin
con un tipo de dieta especial, como por ejemplo la dieta de cafetera, o de un
compuesto determinado en los niveles fisiolgico, endocrino, inmunolgico, etc.
Adems, puede tambin estudiarse cmo un compuesto se distribuye en el organismo; en este tipo de estudios se suelen utilizar trazadores radiactivos. Aparte
de la distribucin, pueden valorarse sus repercusiones en los diferentes tejidos y
rganos y en qu compuestos se convierte. Para realizar estos estudios se requiere proceder al fraccionamiento de tejidos y clulas; una vez fraccionados, es necesario acudir a tcnicas de separacin para poder despus aplicar tcnicas de
anlisis con el objeto de estudiar los cambios en diferentes molculas. En experimentos in vitro, tambin pueden suministrarse determinados compuestos a clulas o tejidos para su estudio, utilizando bien un tejido aislado, bien clulas
aisladas, o los propios orgnulos aislados. En todos estos tipos de experimentos
se pueden estudiar los cambios de diferentes metabolitos o los efectos sobre la
expresin de determinados genes de inters. Para todo ello deben utilizarse tcnicas de separacin y anlisis.
Figura 1.4. Ejemplo de diferentes tipos de
experimentos que puede disear el
bioqumico para acometer una
investigacin acerca de los posibles
efectos de un compuesto en un tipo de
estudio determinado centrado en el tejido
adiposo marrn.
23
Captulo 1
NIVELES DE INVESTIGACIN EN BIOQUMICA

Han sido comentados los enfoques posibles en las investigaciones bioqumicas,
in vivo e in vitro, pero, como se ha visto en el apartado anterior (ver figura
1.4), se pueden realizar los estudios en niveles muy diferentes (desde el ser
vivo entero hasta el nivel subcelular o molecular). Veamos ms detalladamente
los diferentes tipos de estudios que pueden disearse en las investigaciones
bioqumicas:

Un ejemplo servir para ilustrar los distintos niveles de estudios que se pueden realizar en bioqumica: el estudio de la actividad termognica adaptativa en
roedores. La termognesis adaptativa, o produccin de calor frente a determinadas situaciones, est regulada por diferentes vas que permiten responder a diferentes factores ambientales, como la dieta y el fro.

Los experimentos con el animal entero son tiles en las investigaciones bioqumicas por muy diversas causas.
Un ejemplo es el estudio del efecto de la alimentacin con una determinada
dieta durante un perodo de tiempo ms o menos prolongado, lo que permite
estudiar los cambios fisiolgicos o clnicos. Se puede inducir un aumento de la
termognesis alimentando a los animales de experimentacin con lo que se conoce como dieta de cafetera, que consiste en ofrecer a los animales una dieta
muy sabrosa y variada en olores, sabores y texturas. Esta dieta induce una hiperfagia voluntaria en roedores, que responden a tal estmulo aumentando la actividad termognica (disipacin del exceso de energa ingerido en forma de calor)
para tratar de evitar el incremento de peso. A pesar del aumento de la termognesis, los animales de laboratorio desarrollan un sobrepeso, que puede desembocar en un estado obeso cuando se mantiene la dieta durante un perodo lo
suficientemente prolongado.
Se pueden realizar diferentes experimentos con los animales completos
durante el tratamiento para profundizar en el estudio de la termognesis (Figura 1.5):
Estudio de la evolucin del peso corporal.
Estudio de la ingesta (preferencias, consumo de diferentes nutrientes, composicin porcentual de la dieta carbohidratos, grasas y protenas).
Estudio de la actividad termognica (calorimetra indirecta; determina
el consumo y produccin de gases: O2, CO2, H2O; temperatura corporal, etc.).
Estudio de los cambios en la composicin corporal: densidad, volumen,
cantidad de grasa, etc.
24
Figura 1.5. Ejemplo de estudios con
animal entero. Estudio de los efectos de la
alimentacin con dieta de cafetera sobre
distintos factores: evolucin del peso
corporal, termognesis, ingesta calrica y
niveles sanguneos de algunos
metabolitos.
En el ejemplo antes comentado, se podra, adems, suplementar la dieta con

un determinado compuesto (como una vitamina o un oligoelemento), o estudiar
la carencia del mismo. As podr obtenerse informacin del elemento en cuestin y sobre cul puede ser su papel en la regulacin de la actividad termognica y en el control del peso corporal; por ejemplo, se puede suplementar la dieta
con cido retinoico.
Los estudios pueden realizarse utilizando modelos animales, pero tambin se
pueden llevar a cabo en personas. Mientras que en los primeros, una vez terminado el tratamiento, se puede sacrificar el animal y estudiar los efectos del tratamiento en diferentes tejidos, en el caso de estudios en humanos tan slo se
puede acudir a estudiar los niveles de metabolitos en la sangre, la orina, las heces, la bilis, el aire expirado, el sudor y la saliva; aunque tambin es posible realizar biopsias de tejidos.
Los animales pueden sacrificarse una vez finalizado el tratamiento, y pueden
recogerse diferentes tipos de muestras, como fluidos, homogeneizados de tejidos, orgnulos celulares, etc. En cada uno de estos tipos de muestras es posible
aplicar tcnicas analticas y de separacin que permitirn estudiar los efectos y
las consecuencias del tratamiento (Figura 1.6).
En los experimentos en bioqumica se pueden utilizar una gran variedad de
animales. Los ratones, las ratas y los conejos de indias o cobayas son los ms utilizados por su bajo coste y por la facilidad de su manipulacin, aunque tambin se
pueden utilizar conejos, gatos, perros o monos. Debe sealarse que la extrapolacin a humanos de los datos obtenidos en animales no es, en muchos casos, directa. Por ejemplo, mientras en roedores el tejido adiposo marrn tiene una gran
relevancia, en humanos este tejido es prcticamente inexistente. No obstante,
existen numerosos estudios comparativos del metabolismo en animales de laboratorio y en el hombre, lo que puede ayudar en la extrapolacin de resultados.
En algunos casos se pueden utilizar los compuestos que se suministran marcados radiactivamente, utilizando istopos como 14C o 3H, que facilitan el estudio del camino metablico de estos compuestos.
Un procedimiento alternativo para estudiar el destino in vivo de un compuesto es su introduccin por va vascular (a travs de una arteria) en un rgano, por
ejemplo el hgado. El hgado es algo ms complicado que el resto de rganos al
tener una doble entrada de sangre, la arteria heptica y la vena porta, y una salida, la vena heptica. Posteriormente, se recogen muestras de la sangre que sale
del rgano por la vena correspondiente (Figura 1.7).
25
Captulo 1
Figura 1.6. Esquema de la recogida y
tratamiento de las muestras una vez
sacrificado el animal.
Figura 1.7. Esquema de la circulacin

heptica.

Una estrategia alternativa a los estudios in vivo, en los que resulta difcil controlar
todas las variables que pueden influir sobre los resultados, es disear experimentos in vitro o in situ, que permitan un control ms fino de las condiciones experimentales. As, se puede, por ejemplo, extirpar de los animales los rganos que se
quieran estudiar, ya sea hgado, rin, corazn, tejido adiposo marrn, los dife26
rentes depsitos de tejido adiposo blanco, etc., y mantenerlos en un medio de

incubacin controlando sus condiciones (concentraciones de hormonas, nutrientes, temperatura, etc.), aadiendo diferentes compuestos para estudiar los efectos de stos. Tambin existe la posibilidad de realizar el estudio sin aislar el tejido
del animal, anestesindolo y canulando el tejido, en el que se aade, con un lquido de perfusin, el compuesto del que interesa estudiar sus efectos. Este tipo
de experiencia sera in situ.
Un ejemplo concreto, aplicado al estudio de la actividad termognica, podra
ser la perfusin del tejido adiposo marrn con cido retinoico que tiene efectos
sobre la actividad termognica, pudindose estudiar el consumo de oxgeno
como indicador de un aumento de dicha actividad termognica (Figura 1.8).
Tambin se podra determinar, con un microcalormetro, la produccin de calor
del tejido. Una vez terminada la incubacin, se puede homogeneizar el tejido y
extraer el ARNm mediante tcnicas de separacin y, a continuacin, proceder,
por tcnicas analticas, a estudiar los niveles del ARNm de un gen concreto,
como el de la protena desacoplante 3 o UCP3.
tejidos aislados. Estudio de los efectos del
cido retinoico sobre el ARNm del gen de
la UCP3 en el tejido adiposo marrn y el
consumo de oxgeno.

En los ltimos aos se ha desarrollado un gran nmero de sistemas para realizar
estudios directamente en las clulas aisladas y en tejidos. Los tejidos pueden disgregarse y, si se controlan las condiciones, llegar a crecer y diferenciarse. Hay diferentes tipos de cultivos: cultivo de rganos, cultivo de explantes primarios y
cultivo de clulas.
Este tipo de estudios permite un control todava ms fino de las condiciones
del medio, de manera que pueden identificarse mejor los efectos de determinados compuestos en el metabolismo de la clula, eliminando posibles interferencias. No obstante, en contrapartida, se produce un alejamiento de las
condiciones reales del organismo entero.
Los estudios con clulas pueden ser de varios tipos: se trabaja con clulas
que han sido aisladas y disgregadas, o se realizan estudios en cultivos primarios,
donde clulas procedentes de tejidos de un animal han sido diferenciadas en
placas de cultivo. Tambin es posible utilizar lneas celulares (clulas inmortales,
generalmente procedentes de un tumor).
Un ejemplo podra ser el estudio de clulas del tejido adiposo marrn tratadas con un agonista E3 adrenrgico, como el CGP-12177, y determinar cmo in27
Captulo 1
fluye en la actividad termognica (Figura 1.9). Tambin se puede estudiar el control de esta actividad analizando los efectos sobre la expresin del receptor
adrenrgico E3 (que tiene un papel clave en el control termognico del tejido), la
produccin de calor en las clulas, o el grado de diferenciacin de las mismas.
cultivos celulares. Estudio de los efectos
del frmaco CGP-12177 sobre adipocitos
marrones en cultivo; se analizan los
niveles del ARNm del receptor
adrenrgico b3 ( b3-AR ), el contenido en
lpidos y la produccin de calor en las
clulas.

En algunos casos no resulta conveniente trabajar con las clulas enteras. Si se
quiere delimitar de una manera ms precisa el mecanismo de actuacin de un
determinado compuesto, se puede trabajar con los orgnulos celulares directamente. Existen diferentes tcnicas de fraccionamiento celular para aislar un orgnulo concreto.
El fraccionamiento celular requiere la ruptura de las clulas en condiciones
en las que no se destruyan los orgnulos celulares, lo que supone una homogeneizacin del tejido y una posterior separacin del orgnulo utilizando una tcnica separativa adecuada.
En el proceso de homogeneizacin pueden utilizarse diferentes medios
mecnicos, y adems diferentes compuestos que faciliten una mejor disgregacin del tejido. En la bibliografa se puede encontrar un gran nmero de tcnicas
y medios de disgregacin, dependiendo del tejido y la finalidad del estudio que
se pretenda realizar. Adems, en todos estos procesos, si no se controla el medio, el orgnulo puede perder su forma o puede perderse la actividad de determinados procesos. Este tipo de experimentos se aleja de las condiciones in vivo
pero, en contrapartida, permite un mayor acercamiento al mecanismo de accin
de los compuestos a estudiar.
Un ejemplo, en relacin con los utilizados anteriormente, sera el estudio de
la actividad termognica en mitocondrias, que se pueden aislar para estudiar su
produccin de calor en un microcalormetro, mediante la adicin al medio de
diferentes nutrientes (cidos grasos, aminocidos, vitaminas, etc.). Una vez incubadas las mitocondrias, por ejemplo, pueden estudiarse los niveles de la protena desacoplante UCP1, o la actividad de la citocromo c oxidasa (Cox), para
determinar los efectos, de un determinado compuesto, como el cido oleico (Figura 1.10).
28
orgnulos celulares. Estudio de los efectos
del cido oleico sobre la actividad
citocromo c oxidasa (Cox) y sobre los
niveles de la protena UCP1 en
mitocondrias procedentes de adipocitos
marrones.
Otro nivel de estudio en bioqumica consiste en analizar las molculas que forman los seres vivos y la estructura que stas presentan, as como los cambios que
se pueden producir en las mismas y que pueden ayudar a entender los fenmenos que tienen lugar en la clula.
Las molculas pueden aislarse utilizando tcnicas de separacin a partir de
los homogeneizados de diferentes tejidos. As, por ejemplo, se pueden estudiar
los efectos de la incubacin de la citocromo c oxidasa (Cox) con uno de sus
efectores alostricos, el citocromo c, y determinar cmo su actividad enzimtica
queda afectada (Figura 1.11), o los cambios que pueden darse en la estructura
de esta enzima, utilizando rayos X.
Figura 1.11. Ejemplo de estudios
moleculares. Estudio de los efectos del
citocromo c sobre la actividad citocromo
c oxidasa y sobre la estructura de esta
protena.
29
Seguridad y riesgos
INTRODUCCIN
NORMAS DE SEGURIDAD
Productos qumicos
Etiquetado
Almacenamiento
Medidas de seguridad personal. Comportamiento del investigador

Fuentes de peligro en el laboratorio
Investigaciones con productos radiactivos
Investigaciones con microorganismos patgenos
NORMAS GLP: The Good Laboratory Practices
30
2
INTRODUCCIN
Este captulo va a tratar de manera muy general las medidas bsicas de seguridad
que deben tomarse y respetarse cuando se trabaja en un laboratorio. Se har especial referencia al manejo de materiales biolgicos peligrosos y de material radiactivo, y al desecho de productos txicos.
Hay un gran nmero de personas que trabaja en laboratorios y que maneja
materiales peligrosos de manera habitual y rutinaria. Las personas con riesgo son,
en primer lugar, los propios investigadores, pero tambin puede extenderse el
riesgo a otras personas, entre ellas, estudiantes (en el caso de laboratorios acadmicos o universitarios), trabajadores de mantenimiento, etc.
La palabra seguridad tiene muchas connotaciones y, a la vez, es un trmino
relativo. Se dice que un acto es seguro si est libre de cualquier posibilidad de
accidente, pero, evidentemente, la probabilidad de accidente siempre existe
aunque sea baja. El acto se denomina entonces relativamente seguro. Por
ejemplo, el uso de un determinado aparato por parte de un especialista es relativamente seguro si se compara con su uso por parte de alguien inexperto en
el tema. Por otra parte, el trmino seguridad siempre incluye asumir o aceptar
un cierto riesgo. En este sentido, el trmino es tambin relativo, ya que la cantidad de riesgo que es aceptable para una determinada persona puede no serlo para otra.
Los riesgos pueden minimizarse identificando las fuentes de peligro y conociendo el riesgo de accidente inherente a estos peligros. Muchos de los peligros
con los que uno puede enfrentarse en un laboratorio son ya conocidos y los riesgos asociados a ellos estn ya bien definidos. Adems, se han desarrollado tcnicas para evitar una exposicin innecesaria a estos peligros.
Cualquier prctica de laboratorio se lleva a cabo con un cierto grado de riesgo. Es importante determinar la cantidad de riesgo y qu efecto puede tener sobre el experimento y sobre el investigador. Por otra parte, la evaluacin de la
seguridad permite confeccionar un plan para reducir los riesgos y para encontrar mtodos alternativos que permitan alcanzar los mismos objetivos minimi31
Captulo 2
zando los riesgos. Es evidente que la exposicin a un riesgo puede ser asumida
voluntariamente o impuesta. Determinadas personas aceptan un alto grado de
riesgo porque sienten que as obtienen un beneficio en la actividad que realizan. Por ejemplo, se conoce que el tabaco es perjudicial para la salud ya que su
consumo est asociado a enfermedades neoplsicas, cardacas y pulmonares y,
a pesar de ello, sigue habiendo mucha gente que fuma. Tambin hay deportes
cuya prctica resulta muy peligrosa. Adems, hay distintos grados de riesgo; por
ejemplo, es diferente el riesgo que entraa fumar tres cigarrillos diarios que fumar tres cajetillas.
Hay distintos tipos de laboratorios (industriales, clnicos, universitarios,
etc.), y cada uno de ellos tiene sus propios problemas en cuanto a seguridad.
Por ejemplo, en un laboratorio clnico el principal problema de seguridad se
plantea en los estudios mdicos en los que se utilizan muestras biolgicas procedentes de pacientes con enfermedades infecciosas; en estos casos se requieren tcnicas especiales para evitar los riesgos de exposicin a tales agentes
infecciosos. Por otra parte, el trabajo con animales de laboratorio infectados
experimentalmente con agentes patgenos implica peligros adicionales. Por
ello son necesarios los programas de seguridad en los laboratorios de los hospitales.
El objetivo de los programas de seguridad consiste no slo en reducir la
probabilidad de accidente, sino tambin en proteger al personal laboral y a
la propiedad. Un programa de seguridad implica ciertos beneficios adicionales; entre ellos, reducir la prdida de tiempo que suponen los accidentes,
conseguir programas de produccin ms efectivos y ms predecibles, tener
seguros menos costosos y, evidentemente, motivar de forma positiva al trabajador.
Es obvio que la seguridad es responsabilidad de todos. Por lo tanto, la direccin de la institucin o de la empresa debe crear una atmsfera positiva y consciente. Los trabajadores del laboratorio son responsables de manejar y procesar
con seguridad los productos qumicos con los que trabajan habitualmente. En
este sentido, la direccin tiene la responsabilidad de comprobar y asegurarse de
que los trabajadores del laboratorio sigan y respeten las precauciones y las normas de seguridad. De la misma forma, la direccin debe ser consciente de las
posibles deficiencias en la construccin, en los equipos de seguridad o en las reglas de trabajo.
Las universidades o empresas no slo tienen una responsabilidad moral de
tener personal trabajando en condiciones ptimas de seguridad, sino que en
muchas ocasiones tienen tambin una responsabilidad legal. En este sentido, todas las instalaciones deben estar en perfectas condiciones. De hecho, se suelen
realizar inspecciones peridicas para asegurar el buen mantenimiento y funcionamiento de dichas instalaciones.
Asimismo, los trabajadores del laboratorio deben ser informados acerca de la
naturaleza de los compuestos, del equipamiento y de los procedimientos utilizados y de los peligros que entraa su manejo. Si esta informacin se desconoce o
no se tiene acceso a ella, por ejemplo, con relacin a sustancias de peligrosidad
desconocida, es recomendable que los trabajadores traten tales sustancias como
si fueran realmente muy peligrosas. Los investigadores son tambin responsables
de instruir a los tcnicos o ayudantes de laboratorio sobre los procedimientos
seguros para manejar sustancias peligrosas o llevar a cabo reacciones tambin
peligrosas.
32
Seguridad y riesgos
NORMAS DE SEGURIDAD
Productos qumicos
Etiquetado
Muchos de los productos qumicos que deben manejar habitualmente los investigadores comportan un cierto riesgo. Los distribuidores de dichos productos
qumicos tienen el deber de proteger a los usuarios de aquellos daos previsibles
que pueda acarrear la utilizacin de los mismos. Ese deber se cumple indicando
las precauciones que han de tomarse en el manejo del producto en cuestin
mediante la colocacin de etiquetas de aviso adecuadamente situadas (Figura
2.1). Los usuarios de estos productos qumicos tienen, por su parte, el deber de
leer, entender y cumplir las recomendaciones de las etiquetas con el fin de prevenir daos no solamente a ellos mismos, sino tambin a los dems. Por otra
parte, es tambin evidente que las etiquetas con indicaciones de precaucin deben ser fciles de entender y de leer, adems de proporcionar o indicar las medidas de precaucin que deben seguirse.
En las etiquetas de los productos qumicos deben aparecer las siguientes indicaciones:
Figura 2.1. Etiquetas tipo de productos

qumicos.
El nombre qumico e incluso, si es pertinente, el nombre comn. Si se trata de una mezcla de productos, debe nombrarse cada uno de los componentes, el porcentaje que representa cada componente en la mezcla, el
grado de peligro que supone cada componente y si la mezcla es peligrosa.
Las caractersticas fsicas y qumicas como, por ejemplo, el punto de fusin y de ebullicin a una determinada presin, el punto de inflamacin,
olor, calor especfico, calor de combustin, peso molecular, frmula, etc.
Debe aparecer tambin la descripcin de los peligros fsicos: perxidos
orgnicos, oxidantes, inflamables, combustibles, explosivos, etc. Tambin
debe indicarse la descripcin de los peligros para la salud, incluyendo
efectos puntuales o agudos y efectos crnicos: corrosivos, irritantes, venenos, carcingenos, hepatotoxinas, nefrotoxinas, neurotoxinas, hematotoxinas, agentes que actan sobre el sistema nervioso central y otros rganos,
agentes que pueden daar los ojos, la piel, los pulmones u otras membranas mucosas, etc. Otra indicacin importante en la descripcin de los peligros para la salud incluye los sntomas de la exposicin a los productos
qumicos peligrosos. Se debe indicar tambin la va principal de entrada
del producto qumico en el cuerpo; por ejemplo, los gases y vapores de lquidos y slidos voltiles entran por inhalacin; los lquidos y slidos corrosivos generalmente afectan a los ojos o a la piel; la ingestin raramente
es una va principal de entrada pero debera ser considerada para aquellas
sustancias que son altamente txicas; la inyeccin, a travs de un extremo
afilado de un fragmento roto de un material de vidrio contaminado, tambin es una posible va de entrada.
Almacenamiento
Hay que evitar guardar productos qumicos peligrosos, como lquidos inflamables, en recipientes que no sean adecuados o que estn incorrectamente marca33
Captulo 2
Figura 2.2. Armario para almacenamiento

de diferentes tipos de productos
qumicos.
dos e identificados. Tampoco se deben almacenar los reactivos en estanteras

que no sean seguras, ni apilar demasiadas cajas que contengan reactivos, o dejar
un determinado producto qumico muy cerca del borde de una mesa. Los reactivos altamente peligrosos no deben darse a personas no autorizadas. Los productos voltiles, inflamables o explosivos se suelen almacenar en armarios
especiales (Figura 2.2) o en campanas extractoras de gases (ver figura 2.7).
Los productos qumicos inflamables o txicos son los que habitualmente podemos encontrar en un laboratorio; de hecho, un 82% de los bilogos y bioqumicos trabajan con productos qumicos txicos. A diferencia del qumico, el
investigador biomdico no trabaja con productos qumicos para estudiar interacciones qumicas o la estructura molecular o la sntesis qumica; el investigador
biomdico utiliza los productos qumicos slo como herramienta en las tcnicas
analticas o como reactivos en los estudios metablicos. Los productos qumicos
pueden ser corrosivos (cidos, lcalis, halgenos, agentes oxidantes, etc.), txicos
(venenos, irritantes, etc.), sensibilizadores (producen un efecto citotxico directo
como irritacin de la piel o generan una respuesta alrgica), carcingenos y teratgenos, inflamables o explosivos (Figura 2.3).
Figura 2.3. Smbolos de diferentes

peligros.
Medidas de seguridad personales.

Comportamiento del investigador
Repasemos ahora algunas de las medidas de seguridad que deben observarse
siempre en el laboratorio y que hacen referencia a la proteccin personal.
Figura 2.4. Algunas prendas de

proteccin.
34
Vestuario. En el laboratorio no es adecuado cualquier vestuario. Determinadas

prendas y equipos de proteccin son ms seguros, ms prcticos y ms cmodos
que otros. Sin embargo, la comodidad no debe ser el factor que condicione la
eleccin final. Deben llevarse prendas de proteccin y guantes siempre que se
tenga contacto con materiales peligrosos o se trabaje en condiciones fsicas peligrosas, como, por ejemplo, con nitrgeno lquido, sustancias corrosivas o materiales calientes. Es recomendable llevar bata siempre que se trabaje en el
laboratorio. En algunos pases y lugares es obligatorio incluso vestir gorro y pecos para acceder al servicio de estabulario. No es recomendable trabajar en el
laboratorio con corbata o llevando determinadas joyas, como anillos o pulseras.
En determinadas circunstancias se requiere la utilizacin de gafas especiales para
la proteccin de los ojos o el uso de mscaras (Figura 2.4), incluso de cascos
para la proteccin de los odos cuando hay un ruido excesivo. En algunos casos
se recomienda el uso de mamparas de seguridad, as como utilizar campanas extractoras para el manejo de determinados productos y airear de vez en cuando
el rea de trabajo.
Seguridad y riesgos
Alimentos y bebidas. Los alimentos y bebidas de consumo humano no deben

guardarse ni consumirse en el laboratorio. Evidentemente, no debe utilizarse el
material de vidrio (placas de Petri, vasos de precipitados, etc.) como copas o
platos para consumir bebidas o alimentos. Slo los grifos localizados fuera del
laboratorio se pueden utilizar para beber agua. No se debe utilizar el hielo de
laboratorio para refrescar bebidas. De hecho, las mquinas de hielo deberan
llevar un letrero que dijera: no apto para el consumo humano. Hay dos razones
para esta recomendacin: el agua con la que se ha fabricado el hielo puede ser
la del laboratorio y quizs no sea potable, y el hielo puede estar contaminado si
alguien ha utilizado un recipiente contaminado para recogerlo, o bien la mquina simplemente puede haberse contaminado por otras vas con productos
txicos.
Tabaco. No debera estar permitido fumar, ni en el laboratorio, ni donde estn
alojados los animales, as como donde se almacenan los reactivos qumicos.
Aseo personal. Tampoco debera estar permitido que uno se afeite, se lave los
dientes o se aplique cosmticos dentro del laboratorio.
Hbitos. Es importante tambin que el investigador se acostumbre, en el laboratorio, a no tocarse la boca, la nariz, los ojos, la cara y el cabello con las manos,
que pueden estar contaminadas. Incluso se ha llegado a recomendar no llevar
barba ni el cabello muy largo (si es largo, es recomendable llevarlo recogido). Se
recomienda tambin no salir del laboratorio con los guantes puestos y tocar con
ellos objetos comunes, como los telfonos, los pomos de las puertas, las neveras
y los interruptores de los ascensores. Es necesario lavarse las manos despus de
haberse quitado los guantes. Tambin es recomendable no dejar en los laboratorios prendas de vestir como abrigos, gabardinas, paraguas, bolsos, etc, ni tener libros que en otro momento puedan pasar a reas no contaminadas. Incluso se
recomienda no llevar lentes de contacto. En el caso de trabajos con agentes
patgenos se aconseja utilizar unos determinados zapatos en el laboratorio y
cambiarlos cuando se tenga que salir. Tambin se recomienda no trabajar solo en
el laboratorio, ya que si ocurriera un accidente sera ms difcil obtener ayuda.
Debera evitarse tambin la acumulacin de materiales procedentes de experimentos pasados.
Fuentes de peligro en el laboratorio

Las pipetas de vidrio y otras herramientas bsicas de laboratorio pueden ser una
fuente de peligro, puesto que se utilizan para la medida volumtrica de fluidos
que frecuentemente suelen ser peligrosos, contener agentes infecciosos, ser txicos, corrosivos, voltiles o radiactivos. Una pipeta puede convertirse en un utensilio muy peligroso si se utiliza indebidamente. Evidentemente, el principal
peligro est en succionar con la boca, lo cual est absolutamente prohibido.
Tambin es peligroso si se aspiran directamente con la boca lquidos voltiles.
Otra fuente de peligro es tocar las puntas de las pipetas, que pueden estar impregnadas de lquidos txicos y corrosivos.
Las jeringas, las agujas (hipodrmicas) y las pipetas son instrumentos potencialmente peligrosos. Habitualmente, en los laboratorios se dispone de recipien35
Captulo 2
Figura 2.5. Recipiente para la recogida de

agujas.
Figura 2.6. Campana de proteccin

biolgica.
tes adecuados donde se pueden tirar las jeringas y agujas utilizadas (Figura 2.5).
Esta medida de seguridad evita pinchazos inoportunos.
Las tcnicas de centrifugacin tambin pueden acarrear algunos problemas de seguridad, sobre todo en cuanto a los fallos mecnicos que puedan suponer la rotura de los tubos y la contaminacin de la propia centrfuga e
incluso de los alrededores de la misma. Las centrfugas ms modernas disponen de canastillas para los tubos que pueden cerrarse hermticamente, evitando este problema.
Los baos termostatizados tambin pueden ser una fuente de contaminacin. En este sentido, deben tomarse precauciones para impedir el crecimiento
de organismos que puedan conllevar problemas de contaminacin.
La utilizacin adecuada de cabinas de seguridad (Figura 2.6) y campanas
extractoras de gases (Figura 2.7), junto con buenas tcnicas y procedimientos
de laboratorio, constituye la primera barrera contra la exposicin potencial a
materiales peligrosos. El vestuario y el equipo de seguridad son importantes,
pero deben entenderse como una medida secundaria para mejorar las condiciones de seguridad.
Las precauciones que hay que tomar en la utilizacin del material bsico de
cualquier laboratorio se hacen extremas cuando se habla de investigaciones realizadas con patgenos.
Existe tambin toda una serie de peligros, como son los mecnicos, elctricos o de incendio a los que a veces se les resta importancia precisamente por
ser ms habituales. Algn ejemplo de peligros fsicos y mecnicos son el hecho
de cortarse con un cristal o pincharse con una aguja, o bien daarse alguna parte del cuerpo al mover determinados equipos. Otra fuente de peligro es el almacenamiento de reactivos en lugares no adecuados o no habituales o la
existencia de botellas de gases. Puede constituir un peligro la utilizacin de gas
butano o propano en el laboratorio, o de productos que al mezclarse pueden
ser explosivos.
Investigaciones con productos radiactivos
Figura 2.7. Campana extractora de gases.
36
En la manipulacin de sustancias radiactivas se deben aplicar los criterios bsicos

ya expuestos para cualquier tipo de trabajo de laboratorio, pero en el caso de la
radiactividad la legislacin es mucho ms estricta. Se ha de hacer un nfasis especial en la denominada radioproteccin, que es el conjunto de medidas destinadas a paliar al mximo los efectos negativos de la exposicin a sustancias
radiactivas. La manipulacin de cualquier fuente radiactiva debe hacerse en
condiciones especiales de proteccin, a determinar en cada caso, y debe ser lo
ms breve posible. Adems, debern utilizarse detectores de radiaciones ionizantes que permitan conocer en cada momento que el nivel de radiacin se encuentra dentro de los mrgenes de seguridad.
Las fuentes radiactivas pueden encontrarse en un laboratorio en dos tipos bsicos: fuentes encapsuladas y no encapsuladas. Una fuente radiactiva encapsulada est constituida por una cierta cantidad de sustancia radiactiva
hermticamente encerrada en una envoltura sellada que impide el contacto directo con la sustancia radiactiva. Por el contrario, una fuente radiactiva no encapsulada es aquella que no est contenida en una envoltura hermtica sellada,
por lo que su sustancia radiactiva puede ser extrada, escapar y dispersarse, en-
Seguridad y riesgos
trando en contacto directo con las personas y el medio exterior. Las ms abundantes en los laboratorios son las fuentes no encapsuladas.
La manipulacin de fuentes no encapsuladas presenta el problema adicional
de que el peligro de contaminacin es muy grande, por lo que en este caso se
requieren medidas de seguridad adicionales. En primer lugar, se deben habilitar
zonas en las que realizar este tipo de operaciones, que han de ser siempre las
mismas, con el fin de evitar la dispersin de la posible contaminacin radiactiva
(Figura 2.8). El material de laboratorio y el aparataje presente en estas zonas no
debe ser utilizado fuera de ellas, a no ser que previamente hayan sido sometidos
a un proceso de descontaminacin. Debern evitarse los mtodos de trabajo
que impliquen dispersin de la sustancia radiactiva (formacin de gases, aerosoles, etc.), siendo siempre preferible trabajar por va hmeda antes que por va
seca. Todo el material utilizado que no pueda ser descontaminado con facilidad
(esencialmente material de laboratorio hecho de plsticos), as como el material
de radioproteccin (guantes, mascarillas, etc.) deber ser tratado como residuo
radiactivo, por lo que tendr que separarse del resto de residuos de laboratorio
hasta que pueda ser retirado por personal autorizado, que dispondr de l en la
forma que establece la legislacin vigente (Figura 2.9).
Figura 2.8. Medidas de proteccin para

trabajar con material radiactivo.
Figura 2.9. Contenedores de recogida de

material biolgico, radiactivo e infeccioso.
Las manipulaciones debern realizarse encima de bandejas apropiadas o

dentro de recipientes acondicionados de forma que se reduzcan al mnimo las
consecuencias de las roturas y los derrames. Conviene, adems, cubrir la superficie de trabajo con un material que absorba los lquidos derramados accidentalmente. Dicho material se debe renovar cuando sea necesario, y si est
contaminado deber tratarse como un residuo radiactivo.
Es particularmente peligrosa la contaminacin de cortes en piel, pinchazos o
heridas cualesquiera, por lo que las personas que presenten este tipo de alteraciones y no puedan protegerse adecuadamente no deberan trabajar con materiales radiactivos. Tambin est totalmente contraindicada la manipulacin de
radiactividad por gestantes.
En el empleo de radioistopos en experiencias con animales de laboratorio
deben observarse las consideraciones generales ya expuestas y, adems, se ha de
evitar que los tejidos o excreciones de los animales tratados dispersen contaminacin. Todo resto de estos animales debe ser tratado como residuo radiactivo.
La posibilidad de que la contaminacin se extienda al ser favorecida por el proceso de descomposicin debe evitarse mediante el empleo de la congelacin y
la utilizacin adecuada de desinfectantes y recipientes de material de plstico
hermticamente cerrados.
Finalmente, antes de abandonar la zona de trabajo, el personal deber lavarse con cuidado y comprobar la ausencia de contaminacin en sus ropas de
trabajo.
37
Captulo 2
Investigaciones con microorganismos patgenos

Las investigaciones con microorganismos patgenos implican peligros importantes. Por lo que respecta a la relacin entre los microorganismos patgenos y las
enfermedades humanas, los cientficos que en tiempos pasados estudiaban microorganismos patgenos aislados de pacientes enfermos, a veces se convertan
en vctimas de la misma enfermedad. De hecho, la historia del estudio de los microorganismos est repleta de mrtires que no conocan los peligros extremos de
los organismos que estudiaban y accidentalmente eran infectados y moran. Este
hecho ense a los investigadores la necesidad de poner a punto tcnicas de seguridad adecuadas para el manejo de agentes infecciosos (ver figuras 2.6 y 2.9).
Es importante destacar lo que se denomina seguridad biolgica, que hace referencia a los peligros de infeccin que supone trabajar con agentes patgenos.
Los peligros biolgicos difieren de los dems peligros en el hecho de que los
agentes biolgicos pueden crecer y multiplicarse en el organismo hospedador, y
pueden alterar sus caractersticas metablicas, genticas y estructurales produciendo, incluso, efectos permanentes sobre la salud. Estos son los llamados agentes etiolgicos.
Un segundo tipo de peligro biolgico lo constituyen las investigaciones con
virus con capacidad de inducir la formacin de tumores o cnceres en el organismo husped. Estos virus, llamados oncognicos, no se incluyen entre los agentes etiolgicos, porque son capaces de inducir cncer ya sea porque interfieren
con la funcin de las clulas del hospedador o porque modifican la dotacin
gentica de sus clulas, y porque los sntomas de la infeccin pueden permanecer latentes durante un perodo ms o menos largo de tiempo.
Un tercer tipo de peligro biolgico se encuentra asociado con las investigaciones realizadas utilizando tcnicas de ADN recombinante, las cuales hacen posible
la manipulacin de genes o de fragmentos de genes, la construccin de hbridos
artificiales y la insercin de genes extraos en clulas. Las herramientas tpicas de
este tipo de tcnicas son las enzimas de restriccin, las ADN ligasas y los vectores
(vehculos para introducir segmentos de ADN en clulas). Los vectores ms utilizados son virus (especialmente bacterifagos) y plsmidos. La problemtica de estas tcnicas en cuanto a seguridad se encuentra en los siguientes puntos:
Insertar ADN oncognico de origen viral en bacterias o en virus que sean
capaces de infectar al hombre.
Clonar genes que codifican antgenos capaces de provocar respuestas autoinmunes.
Construir plsmidos con genes que codifican protenas para la resistencia a
antibiticos e incorporarlos a organismos patgenos sensibles.
NORMAS GLP: The Good Laboratory Practices

Las normas GLP son un estndar promulgado por dos agencias americanas:
La FDA U.S. Food and Drug Administration
La EPA U.S. Environmental Protection Agency
Son una serie de normas que deben cumplir todos los laboratorios que deseen enviar datos cientficos sobre nuevas drogas o medicamentos a agencias esta38
Seguridad y riesgos
tales. La eleccin de este nombre, Good Laboratory Practices, fue desafortunada

ya que muchos cientficos no familiarizados con el asunto interpretan esta frase
de una manera muy simple, como buena ciencia, y no se dan cuenta de que se
refiere a una serie muy detallada de normas de funcionamiento de un laboratorio, que deberan ser observadas y cumplidas si se quiere obtener una aprobacin gubernamental.
A mediados de los aos 70, el Congreso de los EE.UU. aprob toda una serie
de leyes referidas a la proteccin ambiental, la seguridad y la salud pblica. Estas
leyes provocaron una gran demanda de servicios analticos. Las agencias federales no tenan personal suficiente para responder a esta demanda y se vieron forzadas a buscar ayuda en laboratorios privados. En esta poca tambin se
hicieron pblicos una serie de escndalos en el sector privado sobre la calidad
de los datos enviados a las agencias. Por todo ello, la FDA promulg la primera
versin de las normas GLP en 1978, que fue revisada en 1987. Estas normas permiten regular todos los datos enviados a las agencias sobre aplicaciones de nuevas drogas. La EPA realiz su propia versin de las normas GLP en 1983, versin
que fue revisada en 1988.
Las dos agencias han intentado mantener la mxima consistencia posible entre s, a pesar de que ambas tienen misiones diferentes. Ambas se preocupan de
la toxicologa de las sustancias qumicas, pero, mientras que la FDA se centra en
los efectos de stas sobre la salud, la EPA lo hace sobre los efectos medioambientales.
Las normas GLP se refieren a los llamados estudios no clnicos, es decir, hacen referencia a estudios que no implican la experimentacin con sujetos humanos. Gran parte del contenido de las normas GLP se refiere al cuidado de los
animales de laboratorio, a los resultados que se obtienen y al manejo de los especmenes biolgicos. Sin embargo, tambin se refieren a cuestiones qumicas,
ya que en muchos de estos estudios estn implicados anlisis qumicos en algn
punto del protocolo.
La lectura de las normas GLP en su forma original puede resultar un ejercicio
frustrante para quien no est familiarizado con la jerga utilizada por los abogados encargados de escribir este tipo de leyes. Por tanto, aqu simplemente se resumen los requerimientos ms importantes que aparecen en las normas GLP.
Comentaremos, en primer lugar, aquellas normas referidas a programas de control de calidad en los laboratorios:
01. Debe existir una unidad de control de calidad, o una comisin encargada del control de calidad. Dicha unidad puede estar integrada por una
sola persona.
02. Esta unidad debe estar separada y ser una entidad diferente del personal
que lleva a cabo el estudio.
03. El personal que lleva a cabo el estudio o la investigacin debe estar entrenado, documentado y debe tener la experiencia necesaria para realizar las funciones que se le han encargado.
04. Debe existir un manual de control de calidad, aunque las normas GLP
no especifican los contenidos de dicho manual.
05. Deben estar escritos los procedimientos estndar de operacin, incluso
los mtodos analticos.
06. Todos los procedimientos de mantenimiento y calibrado deben estar escritos.
39
Captulo 2
07. Debe existir un lugar adecuado donde almacenar las muestras antes de
ser analizadas. Debe ser un lugar separado del laboratorio que contenga
el equipamiento necesario, es decir, refrigeracin para la conservacin
de las muestras.
08. Debe haber una zona de archivo que permita el almacenamiento de todos aquellos datos y documentos que sean relevantes. El acceso al archivo debe ser restringido.
09. Se deben llevar a cabo inspecciones peridicas en distintas fases del estudio y debe quedar constancia de tales inspecciones.
10. Los mtodos de muestreo deben estar tambin disponibles si se llevan a
cabo por el personal del laboratorio; si no, este punto es responsabilidad
de la organizacin que lleva a cabo el muestreo.
11. Todos los reactivos y soluciones deben estar adecuadamente marcados
identificando sus componentes, su concentracin, la fecha de preparacin, los requerimientos de conservacin y la fecha de caducidad.
Las normas GLP fueron originalmente escritas en relacin con estudios que
evaluaban los efectos biolgicos de los materiales qumicos. Sin embargo, la EPA
est implicada con la contaminacin ambiental, los desechos peligrosos y la retirada y manejo de materiales txicos. Por ello las normas GLP, en este caso, se
han ampliado para cubrir estos aspectos.
En aquellos laboratorios en los cuales el personal trabaja con microorganismos o, en general, material biolgico peligroso, las normas GLP hacen referencia
a proteccin personal y normas de conducta y de higiene. Hay siete reglas bsicas de bioseguridad:
1. No pipetear con la boca.
2. Manipular los fluidos infecciosos con cuidado. Evitar derramarlos y producir gotas.
3. Restringir el uso de jeringas y agujas hipodrmicas a los casos en que no
haya ms alternativas. Manipular estos objetos con cuidado para evitar la
autoinoculacin y disponer el material usado en contenedores adecuados.
4. Utilizar batas y guantes de laboratorio.
5. Lavarse las manos despus de cualquier actividad en el laboratorio, siempre que se quiten los guantes e inmediatamente despus del contacto con
materiales infecciosos.
6. Descontaminar las superficies de trabajo antes y despus de usarlas e inmediatamente despus de haber derramado cualquier fluido infeccioso.
7. No comer, beber, guardar comida, ni fumar en el laboratorio.
Estas recomendaciones tan simples pueden ser implantadas en cualquier laboratorio con un mnimo coste y sin necesidad de reducir la efectividad de su
productividad. El seguimiento de estas normas puede reducir mucho el riesgo de
infeccin accidental. Se pueden utilizar, adems, cabinas de seguridad para la
manipulacin de los materiales infecciosos o se puede instalar un sistema de
ventilacin que dirija el aire, sin recircularlo, desde las zonas ms limpias a las
contaminadas.
40
La metodologa analtica
INTRODUCCIN
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS DE ANLISIS BIOQUMICOS
Mtodos qumicos
Mtodos fsicos
Mtodos enzimticos
Mtodos inmunolgicos
Mtodos de hibridacin
ERRORES DE LOS MTODOS ANALTICOS
Variabilidad de los datos analticos
Errores accidentales
Errores sistemticos
Valoracin de los mtodos analticos

Control de calidad de los resultados
SELECCIN DEL MTODO DE ANLISIS
PRESENTACIN DE LOS DATOS
42
3
INTRODUCCIN
En los laboratorios de bioqumica es fundamental la eleccin del mtodo adecuado para cada necesidad. Esta eleccin requiere que se evale una serie de
aspectos importantes, como pueden ser la finalidad del mtodo (detectar o
cuantificar), su fundamento, la disponibilidad de muestra, el tipo de muestra a
analizar (posible existencia de contaminantes e interferencias), la disponibilidad
de instrumental, la fiabilidad de la tcnica, el tiempo de procesamiento, el coste
(reactivos, instrumental, personal), etc.
As, pueden encontrarse en la bibliografa tanto mtodos que permiten identificar las biomolculas presentes en una muestra (mtodos de anlisis cualitativos), como mtodos que permiten la determinacin de la cantidad presente de
un determinado compuesto (mtodos de anlisis cuantitativos), pasando por mtodos que permiten inferir si la cantidad de muestra presente es mayor o menor
que la de un control (mtodos de anlisis semicuantitativos) (Figura 3.1).
A la hora de presentar resultados, tanto en un laboratorio de investigacin
como en un laboratorio clnico, tienen que incluirse datos para indicar la fiabilidad de los mismos, ya que las determinaciones en el laboratorio se encuentran
sometidas a errores de diferente ndole, por ejemplo debidas a la manipulacin
de la muestra, a problemas con los reactivos, a desajustes en los sistemas de deFigura 3.1. Resultados de anlisis en un
laboratorio de bioqumica. Pueden ser
cualitativos o cuantitativos.
43
Captulo 3
teccin, etc. Adems, otro aspecto importante es que los resultados de un laboratorio de anlisis clnico se utilizan para el diagnstico de enfermedades; en tales casos se establece un valor de referencia para establecer el carcter normal o
patolgico del resultado. Aparte de los errores que pueden cometerse en el laboratorio, otro problema radica en la variabilidad biolgica, que, por ejemplo,
provoca que personas sanas se encuentren en lmites establecidos como patolgicos, mientras que algunas de las personas enfermas pueden tener valores de
determinados parmetros dentro de los lmites de normalidad. As, la identificacin de las fuentes de error y la eliminacin o reduccin de stas son claves para
una correcta clasificacin de las personas dentro del grupo de las sanas o de las
enfermas.
En este captulo se introducen una serie de conceptos que ayudan a elegir el
mtodo ms adecuado a cada necesidad, as como a evaluar la calidad de los
datos de un mtodo seleccionado, al tiempo que se introducen tambin los
principios generales de los diferentes mtodos analticos que pueden utilizarse
en el laboratorio.
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS DE

ANLISIS BIOQUMICOS
Los mtodos para la determinacin de las diferentes molculas biolgicas se basan en las caractersticas diferenciales de las molculas que pueden hallarse en
los seres vivos. Las diferencias de estas molculas se encuentran en sus propiedades qumicas, fsicas y bioqumicas, por lo que los mtodos y tcnicas que se han
ido desarrollando se han fundamentado en estas propiedades. La evolucin de
los procedimientos para analizar las muestras biolgicas ha permitido el crecimiento exponencial de la bioqumica. La bioqumica y los procedimientos para
su estudio se han ido desarrollando de manera cooperativa, de manera que el
conocimiento de la bioqumica se fundamenta en la capacidad de los mtodos y
las tcnicas para conocer qu es lo que ocurre dentro de los seres vivos, y las
nuevas tcnicas que van apareciendo en los ltimos aos se fundamentan en los
conocimientos bioqumicos, de forma que ambos van avanzando de manera
sinrgica.
Los mtodos de anlisis bioqumicos deben permitir determinar la existencia
de una molcula en presencia de otras, ya que las muestras biolgicas son una
mezcla de diferentes molculas. Adems, en muchos casos, puede ser necesario
conocer la cantidad de una biomolcula determinada que se encuentre presente
en el muestra. As, los mtodos de anlisis bioqumicos se han diseado tratando
de solucionar estos problemas. La determinacin de la presencia de una determinada sustancia requiere que sta presente alguna propiedad que pueda observarse; as, en los primeros anlisis que se realizaron, estas propiedades tenan
que poder ser apreciadas por los sentidos, es decir, se determinaban propiedades como el color, el olor, etc. En el caso de que la sustancia no muestre una
propiedad que permita apreciar su presencia, se puede inducir en ella una propiedad mensurable, por ejemplo, haciendo que reaccione con alguna sustancia
especfica, que le permitir desarrollar una caracterstica como presentar color,
precipitar, pasar a estado gaseoso, etc.
La propiedad que permite detectar la presencia de una determinada molcula, en algunos casos, permite tambin cuantificarla. As, por ejemplo, la intensi44
dad de color de una sustancia coloreada es proporcional a la cantidad de sta en

la muestra. Con el tiempo se han ido desarrollando diferentes sistemas para poder determinar las diferentes biomolculas.
Las muestras biolgicas son una mezcla compleja de molculas (aminocidos,
carbohidratos, metabolitos, lpidos, protenas, cidos nucleicos, etc.), que presentan muchas veces caractersticas similares, lo que puede llevar a confundir
unas molculas con otras. Por ello, en la determinacin de la presencia de una
molcula, muchas veces es necesario realizar una primera etapa de purificacin
de la molcula o de las molculas a estudiar. Este primer fraccionamiento suele
consistir en la separacin de los grandes grupos de molculas: metabolitos, protenas, lpidos, carbohidratos, cidos nucleicos, etc. Estos aislamientos normalmente se realizan utilizando extracciones con disolventes.
Una vez aislado el grupo de molculas de inters, pueden utilizarse tcnicas
separativas para separarlas entre s antes de aplicar un procedimiento para
cuantificar la cantidad presente de una sustancia especfica.
La cuantificacin de una biomolcula se fundamenta en determinar alguna
caracterstica que permita inferir la cantidad de sustancia presente, de manera
que la intensidad de esta caracterstica debe ser proporcional a la cantidad de
molculas que haya y, al medirse, permitir conocer la cantidad de sustancia
presente. Esta caracterstica puede poseerla la molcula en s (color, radiactividad, funcin), o bien puede adquirirse por la reaccin qumica o fsica de la
molcula a determinar con otra que posea una caracterstica mensurable (que se
conoce como reactivo) y, de esta manera, podr inferirse la cantidad de sustancia presente.
Una vez determinado el valor de la propiedad mensurable con algn instrumento especfico, al medir la seal se podr, mediante clculos, conocer la cantidad de sustancia presente en la muestra estudiada.
El proceso global se puede esquematizar como aparece en la figura 3.2; a veces alguna de las etapas presentadas no es necesaria y puede suprimirse.
La mayora de procedimientos utilizados en la determinacin de las diferentes sustancias biolgicas son variaciones sobre este esquema general, lo nico
que cambia es la idea en la que se fundamenta la especificidad de la reaccin
qumica o fsica que se utilice (por la existencia de un determinado grupo funcional, por una propiedad fsica, por la presencia de una agrupacin de grupos
funcionales, por una disposicin espacial de la molcula, por una secuencia determinada de aminocidos o bases nitrogenadas, etc.). Junto con el concepto de
esta especificidad, debe aadirse un sistema que permita determinar la cantidad
de sustancia presente (cuantificacin). Esto puede conseguirse haciendo que la
sustancia adquiera una propiedad que pueda medirse (peso, color, radiactividad,
actividad enzimtica, capacidad antignica, etc.), que permitir inferir la cantidad de sustancia presente. La mayora de mtodos utilizados en el estudio de las
sustancias biolgicas son variaciones de estos conceptos generales. Las tcnicas
actuales no son ms que modificaciones del sistema de especificidad y cuantificacin de tcnicas clsicas.
Figura 3.2. Etapas de un mtodo general

de anlisis. Se usa como ejemplo la
determinacin de la concentracin del
aminocido tirosina en una muestra
biolgica.
Mtodos qumicos
Los mtodos para la determinacin de una molcula o de un elemento determinado, que normalmente se encuentra en presencia de otras molculas o ele45
Captulo 3
Figura 3.3. Longitud de onda a la que

presentan el mximo de absorcin de luz
algunos compuestos de inters en
bioqumica.
Figura 3.4. Principio de muchas tcnicas

qumicas. Una sustancia problema (A) se
hace reaccionar con un reactivo (R),
formndose un producto (A-R) que posee
una caracterstica mensurable.
46
mentos (como en el caso de las muestras biolgicas), requieren la utilizacin de

alguna caracterstica diferencial de esta molcula. Esta caracterstica puede depender de sus propiedades qumicas. Algunos compuestos presentan un color
caracterstico en disolucin y, por lo tanto, es fcil determinar su presencia en
una muestra. Por ejemplo, ya desde un principio, se poda aprovechar el color
rojo de la hemoglobina, el color verde de las clorofilas, el naranja de los carotenos, el color a la llama de determinados elementos qumicos (como el color escarlata del estroncio), etc. El color poda utilizarse para identificar su presencia
en la muestra, incluso la intensidad del color poda ser utilizada para determinar
la cantidad de sustancia presente.
Una propiedad interesante de los bioelementos es la capacidad de stos de
emitir y absorber luz de una determinada longitud de onda al ser volatilizados
en una llama no luminosa, siendo la longitud de onda de emisin caracterstica
de cada elemento, ya que depende de su nmero atmico. Por ejemplo, cuando se expone una sal sdica a la llama de un mechero Bunsen, se produce un
color naranja tpico en la llama. Los tomos utilizan la energa de la llama para
pasar sus electrones de las capas externas a un estado excitado; al retornar estos
electrones espontneamente al nivel energtico fundamental producen emisin
de energa en forma de luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo,
para el sodio la emisin se produce a 589 nm, longitud de onda que se corresponde con el color naranja). Los saltos electrnicos son caractersticos de cada
elemento, por lo que puede utilizarse esta propiedad para caracterizarlos. Pero,
adems, dentro de unos determinados lmites, la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de elemento dentro de la llama.
Algunas molculas de inters en bioqumica absorben radiacin electromagntica en la regin del ultravioleta-visible; en este caso, la propia absorcin
de luz por parte de los compuestos puede utilizarse para identificarlos y cuantificarlos (Figura 3.3).
En algunos casos se hace necesario inducir una caracterstica mensurable en
compuestos que interese determinar, ya que stos carecen de ella en un principio, o bien puede no disponerse del instrumental necesario; para ello, se provoca su reaccin con otro compuesto (reactivo). Estos mtodos se fundamentan en
las propiedades qumicas del compuesto, es decir, en los grupos funcionales que
presenta. Este es el principio de muchos mtodos qumicos. Pueden utilizarse
distintas caractersticas, como color (Figura 3.4), radiactividad, fluorescencia, un
cambio de estado, provocar una precipitacin diferencial, etc.
As pues, y como ya se ha comentado, la especificidad de los mtodos qumicos se basa muchas veces en las reacciones que pueden darse entre los grupos funcionales de los compuestos a determinar y de los reactivos adecuados.
Es decir, que se basan en las caractersticas qumicas, tanto de la sustancia a determinar como de los reactivos utilizados. El reactivo (R) debe hacer adquirir al
compuesto A una caracterstica que pueda medirse, como puede ser adquirir
un color, fluorescencia o radiactividad, que permitir inferir la cantidad de producto A-R formado. Esta cantidad de A-R ser funcin de la cantidad de sustancia a estudiar presente en la muestra, si la cantidad de reactivo utilizada est en
exceso.
En la figura 3.5 se nombran diferentes sustancias que pueden determinarse
en los seres vivos, reactivos con los que pueden reaccionar para adquirir caractersticas de absorcin de luz, y las longitudes de onda caractersticas a las que
absorben los productos formados.
Figura 3.5. Se indican diferentes
sustancias de inters que se pueden
encontrar en los seres vivos, con qu
reactivos pueden reaccionar para adquirir
caractersticas de absorcin de luz en una
zona del espectro que permita su
cuantificacin, y a qu longitud o
longitudes de onda se da el mximo de
absorcin o de excitacin y emisin
fluorescente.
Mtodos fsicos
Un problema muy comn, en el caso de los compuestos bioqumicos, es que
son muy parecidos en cuanto a sus propiedades qumicas, por lo que stas no
son lo suficientemente especficas, a veces, para poder realizar la determinacin de determinadas sustancias como, por ejemplo, de un aminocido en concreto en presencia del resto de aminocidos. Por esta circunstancia se
desarrollaron las tcnicas separativas, que se fundamentan en las propiedades
fsicas de los compuestos a determinar, como solubilidad, polaridad, punto isoelctrico, etc., para acudir posteriormente a un mtodo qumico para su cuantificacin (Figura 3.6).
En muchos casos es necesario exacerbar cualquier pequea diferencia repitiendo la manipulacin de separacin muchas veces. Un ejemplo es la cromatografa en papel, que es un procedimiento de extraccin con disolventes en el
Figura 3.6. Resultado de la determinacin

de diferentes aminocidos, tras su
separacin por tcnicas fsicas
(cromatografa) y posterior deteccin
qumica con ninhidrina.
47
Captulo 3
que se establece un gran nmero de equilibrios entre un disolvente orgnico y el

agua retenida en el papel, permitiendo de esta manera separar molculas con
solubilidades parecidas.
Mtodos enzimticos
Los mtodos qumicos y fsicos no son muchas veces suficientes para determinar
todas las sustancias presentes en una muestra. As, en el caso de las protenas, las
tcnicas separativas no permiten, la mayora de las veces, determinar una protena determinada en presencia de otras. Por ejemplo, la determinacin de una enzima en concreto es difcil por tcnicas separativas, pues las diferencias fsicas de
carga y tamao no son tan grandes que permitan, en la mayora de los casos, diferenciarlas de todo el resto de protenas. La solucin a este problema analtico
est en determinar la cantidad de funcin que tiene una protena, ya que es precisamente esta funcin lo que la diferencia del resto de protenas. Las enzimas
son especficas de reaccin y sustrato, y los elementos que intervienen en la reaccin pueden determinarse, bien porque presentan una caracterstica que puede
medirse o bien porque pueden determinarse por mtodos qumicos (Figura 3.7).
As pues, la aparicin del producto de la reaccin catalizada por la enzima, o la
desaparicin de sustrato, permiten medir la velocidad de transformacin, que es
directamente proporcional a la cantidad de enzima presente en el medio. La actividad mxima de la enzima es funcin de su poder cataltico y de la cantidad de
enzima presente. Por lo tanto, si se estudia la funcin en condiciones saturantes
de sustrato, se puede inferir la cantidad de enzima presente en la reaccin.
As, estudiar la funcin de una determinada protena puede ser un indicador
de la cantidad de protena presente. Histricamente se ha podido comprobar
que la solucin a los problemas que no podan solucionar la qumica y la fsica,
en muchas tcnicas analticas, se encontraba en los propios conocimientos de la
Bioqumica y en el funcionamiento de las protenas.
An ms, las enzimas tambin podan utilizarse como reactivos, ya que los
reactivos qumicos nicamente reconocen un grupo funcional, mientras que las
enzimas no slo reconocen el grupo funcional, sino un sustrato concreto; as
pues, la utilizacin de las mismas como alternativa a los mtodos qumicos aumenta la especificidad de muchas determinaciones bioqumicas.
Figura 3.7. Fundamento de una tcnica
enzimtica.
48
Por otra parte, las enzimas no slo pueden utilizarse como reactivos, sino
que, adems, pueden utilizarse como un sistema de marcaje alternativo a la radiactividad. Esto es debido a que determinadas molculas pueden conjugarse
con una enzima, la cual podr detectarse, por ejemplo, por su capacidad de
producir un color o luminiscencia al suministrarle un sustrato adecuado, pero
con la ventaja de que una nica molcula de enzima es capaz de transformar un
gran nmero de molculas de sustrato en un compuesto que presente una caracterstica mensurable, como la aparicin de color o de fluorescencia, actuando
no slo como sistema de marcaje, sino permitiendo tambin amplificar la seal.
Mtodos inmunolgicos
Histricamente, se observ que con la aparicin de las tcnicas enzimticas se
pudo estudiar un grupo importante de protenas, pero no todas las protenas tienen actividad enzimtica o una funcin que pueda medirse. As, un gran nmero de protenas no podan determinarse, al no poseer una funcin caracterstica
fcilmente mensurable. Sin embargo, la diferencia entre todas las protenas radica en su configuracin tridimensional (determinada por la secuencia de aminocidos que la forman), nica para cada protena, y, en consecuencia, la
cuantificacin de las protenas poda basarse tambin en esta caracterstica. La
solucin se encontr en el mecanismo de accin de las inmunoglobulinas o anticuerpos, es decir, en las reacciones inmunoqumicas (Figura 3.8). El principio de
reconocimiento anticuerpo-antgeno constituye el principio de especificidad de
los mtodos inmunolgicos, que, al igual que el resto de mtodos, necesitan un
sistema de deteccin posterior a la reaccin inmunolgica.
Mtodos de hibridacin
Figura 3.8. Antgeno unido a un

anticuerpo marcado.
Los cidos nucleicos son difciles de determinar por las tcnicas presentadas anteriormente. Las diferencias de tamao de las especies de ARN o de los fragmentos de ADN no permiten una plena identificacin de los cidos nucleicos, lo
que determin que tuvieran que desarrollarse nuevas tcnicas para poder realizar una identificacin plena y correcta de los mismos. Adems de en el tamao,
los cidos nucleicos difieren, principalmente, en la secuencia de nucletidos. La
clave estaba en desarrollar una tcnica que permitiera el reconocimiento de una
secuencia determinada. La respuesta a este problema se encontr en el conocimiento del proceso de formacin de la doble hlice del ADN, ya que las dos hebras de ADN se unen por el establecimiento de puentes de hidrgeno entre las
bases nitrogenadas. La complementariedad de bases entre dos secuencias de
ADN puede permitir que se unan formando la doble hlice. Si se poda conseguir un fragmento de ADN con una secuencia de bases complementaria a un
segmento de un cido nucleico determinado, podra utilizarse este fragmento
(conocido con el nombre de sonda) para realizar un reconocimiento especfico
del ADN a estudiar (Figura 3.9). El proceso se conoce con el nombre de hibridaFigura 3.9. Fundamento de una tcnica de
hibridacin.
49
Captulo 3
cin. Al igual que en el resto de mtodos presentados, es necesario un sistema

de marcaje que permita cuantificar la cantidad de cido nucleico presente, ya
que la hibridacin slo introduce la especificidad del mtodo.
ERRORES DE LOS MTODOS ANALTICOS

Las determinaciones realizadas en un laboratorio estn sometidas a diferentes tipos de errores. Adems debe tenerse en cuenta que una caracterstica importante de las muestras biolgicas es la variabilidad. Es, por lo tanto, necesario
controlar las fuentes de error en las determinaciones bioqumicas.
Variabilidad de los datos analticos

Al realizar determinaciones repetidas sobre una misma muestra, los datos obtenidos presentan una cierta variacin, pero se agrupan en torno a un valor central media de tal manera que, a medida que nos alejamos de este valor
central, es menos probable que se d dicho valor. En la figura 3.10 se puede observar la forma de una distribucin normal y el significado de la media y la desviacin estndar.
Cuando se realiza una determinacin en laboratorio, lo que se obtiene es tan
slo una aproximacin del valor real, ms o menos cercana a la realidad dependiendo de la variabilidad de la determinacin, que se mide por la desviacin
estndar de los resultados.
La desviacin estndar responde a la siguiente frmula:
n
Figura 3.10. Distribucin normal y

significado de la desviacin estndar.
Entre el valor de la media s (desviacin
estndar) se encuentra el 68,3% de los
resultados; entre el valor de la media 2s
se encuentra el 95,4% de los resultados; y
entre el valor de la media 3s se
encuentra el 99,7% de los resultados.
( x x i )2
donde: x : media aritmtica

xi: datos individuales
n: nmero de medidas individuales
Para el clculo de la desviacin estndar es necesario un gran nmero de repeticiones. Para menos de 30 repeticiones, el valor de s es slo aproximado y
~
debe utilizarse entonces la desviacin tipo s :
n
( x x i )2
n1
donde: x :
x:
n:
media aritmtica
datos individuales
nmero de medidas individuales
Los errores que pueden darse cuando se realiza una determinacin en el laboratorio pueden afectar tanto al valor de la media como a la variabilidad del
mtodo; entonces se habla de errores accidentales o de errores sistemticos. El
efecto de los primeros es incrementar la variabilidad en la determinacin, mientras que los segundos cambian el valor de la media. Tanto un tipo de error como
el otro provocan una mala estimacin del resultado y, en el caso de una prueba
diagnstica, una mala clasificacin de la persona. As, las medidas para evitar los
errores deben de extremarse al mximo.
50
Errores accidentales
Los errores accidentales son el resultado de una acumulacin de variaciones simples e indeterminadas que se dan durante el desarrollo del mtodo. Por ejemplo, se dan en la estimacin de valores comprendidos entre dos marcas de la
graduacin de cualquier escala, al pipetear muestras, al pesar muestras, al preparar los reactivos, durante la lectura de los resultados, etc. Un cmulo de este tipo
errores da lugar a que la variabilidad de los resultados sea mayor. Si se extreman
las precauciones se disminuye la variabilidad del mtodo.
El error experimental no puede eliminarse, pero s puede reducirse con una
manipulacin cuidadosa. La forma ms aceptable de expresar la variacin que
aparece entre medidas repetidas se consigue calculando la desviacin estndar
de los datos.
El conocimiento de la desviacin estndar permite evaluar de manera precisa
la distribucin de las medidas alrededor del valor medio. Si se ha realizado un
cierto nmero de repeticiones en lugar de una nica medida, se puede tener un
grado mayor de confianza en el valor medio resultante. Esta confianza se expresa como el error estndar de la media (S.E.M., standard error of the mean):
S.E. M.
s
n1
Otra medida para indicar la variacin alrededor de la media es el coeficiente

de variacin (V), que resulta de expresar la desviacin estndar como porcentaje
del valor medio:
s
V
u 100
x
Los errores accidentales aumentan la dispersin, es decir, el valor de la desviacin estndar (Figura 3.11).
Figura 3.11. Efecto de los errores

accidentales: aumento de la dispersin.
Errores sistemticos
Como su nombre indica, son errores que se repiten siempre en el mismo sentido, suelen ser especficos de cada mtodo y se deben generalmente a errores de
manipulacin de la muestra, a un mal calibrado de la instrumentacin utilizada,
a la presencia de contaminantes que interfieren en la determinacin, etc. El
efecto fundamental de los errores sistemticos es el cambio en el valor de la media de un grupo de valores con respecto a la media original, no afectando a la
distribucin de los valores alrededor de la nueva media, ya que la desviacin
estndar tendr un valor similar (Figura 3.12).
Valoracin de los mtodos analticos

Hay una serie de parmetros que permiten evaluar y comparar los diferentes
mtodos para poder decir cul es el mtodo ms adecuado para cada caso.
Figura 3.12. Efecto de los errores

sistemticos. Cambio en el valor estimado
de la media.
Viabilidad de un mtodo. La viabilidad de un mtodo hace referencia a la posibilidad de llevarlo a cabo, basndose en diferentes aspectos. Entre los factores
que deben considerarse se encuentran los problemas de seguridad del mtodo,
51
Captulo 3
considerando los riesgos tanto qumicos como biolgicos, el tiempo de procesamiento de las muestras y la disponibilidad de instrumentacin adecuada.
Precisin y exactitud. La precisin y la exactitud del mtodo permiten medir
dos aspectos importantes; por un lado la concordancia en la repeticin de las
medidas y, por otro, lo correcta que es la determinacin, es decir, lo prxima
que se encuentra sta al valor real. Los conceptos de precisin y exactitud se
ilustran en la figura 3.13.
Figura 3.13. Diferencias entre precisin y
exactitud. Se dice que un mtodo es
preciso cuando las diferentes medidas
realizadas con l son muy parecidas entre
s, teniendo una desviacin estndar
pequea. Un mtodo se dice que es
exacto cuando las diferentes medidas
tienen como media el valor real de la
medida. Se representa tambin una
comparacin con la exactitud y precisin
de un tirador sobre una diana.
Sensibilidad y especificidad de un mtodo analtico. Un aspecto importante a

considerar a la hora de evaluar la validez de un mtodo es su sensibilidad y su
especificidad. As, la sensibilidad del mtodo hace referencia al lmite de deteccin, que es la cantidad mnima de sustancia que puede ser cuantificada por el
mtodo. La especificidad indica la capacidad para medir nicamente la sustancia que quiere estudiarse, sin interferencia de otras sustancias que puedan encontrarse en la muestra.
La especificidad est a menudo ligada a la sensibilidad. Es posible reducir la
sensibilidad de un mtodo de tal forma que la presencia de interferencias afecte
52
en menor grado al resultado final y el mtodo pueda considerarse como especfico, aunque menos sensible para la sustancia problema.
Otro aspecto importante a sealar es que en cada tipo de muestra debe utilizarse el mtodo con la sensibilidad adecuada a la cantidad de sustancia presente
a determinar. La utilizacin de un mtodo mucho ms sensible del requerido
por la muestra tiene como resultado al final una menor precisin del mtodo,
debido a que sta debe diluirse con un factor de dilucin muy grande, por lo
que pequeos cambios en la lectura del mtodo se traducen en grandes cambios de concentracin final.
Control de calidad de los resultados

Un aspecto importante en los laboratorios es la necesidad de controlar la calidad de los datos obtenidos en los diferentes mtodos que se desarrollan en sus
instalaciones. Un laboratorio tiene que proporcionar los anlisis que le son solicitados con el mximo de fiabilidad. Para ello, debe disponerse de procedimientos que controlen la calidad de sus instalaciones y procedimientos de
anlisis. Estos sistemas de control de calidad deben incluir todas las operaciones
que han de realizarse en cada una de las determinaciones que se lleven a cabo
en cada laboratorio.
Los sistemas de control deben prestar atencin a cada una de las fuentes de
variacin de los resultados analticos:
Instalaciones: adecuacin y medidas de seguridad
Instrumentacin: calibrado y mantenimiento
Personal: cualificacin y preparacin
Muestras: identificacin, obtencin, manipulacin, conservacin y transporte
En cada uno de estos apartados deben extremarse las precauciones y realizar una correcta manipulacin de las muestras para disminuir los errores en
las determinaciones analticas de un laboratorio (ver captulo 4). Pero,
adems, se puede, y se debe, utilizar muestras control que permitan detectar
un mal funcionamiento en cualquiera de los pasos realizados en una determinacin analtica. Las muestras control en una determinacin cualitativa
son aquellas en las que estn contrastadas la presencia o ausencia de la sustancia a determinar, mientras que las muestras control de las determinaciones cuantitativas son aquellas en las que se conoce la cantidad de sustancia
presente.
Las grficas de control pueden ayudar en el control de la calidad de los datos.
Entre las ms utilizadas se encuentran las grficas de Levey-Jennings, donde se
representan cada da los resultados obtenidos para las muestras control de un
mtodo analtico determinado. En la grfica estn indicados el valor medio esperado y los lmites de validez del resultado (por ejemplo la media de las determinaciones diarias durante un ao ms la desviacin estndar de estas
determinaciones, y la media de determinaciones diarias durante el mismo ao
menos la desviacin estndar). Cuando el resultado en la muestra control, un da
concreto, est fuera de los lmites establecidos, las determinaciones realizadas
ese da no son aceptadas.
53
Captulo 3
Un ejemplo de la utilizacin de este tipo de grficas es el siguiente: en una

fbrica de productos lcteos, la muestra control del contenido de protenas de
la leche tiene un valor de 3,21 g /100 g de leche, y la desviacin estndar obtenida en la determinacin de esta muestra durante un ao de anlisis es de
0,15 g /100 g. En la figura 3.14 se han representado los datos obtenidos en las
ltimas dos semanas para una muestra control. Puede observarse que los datos
de la muestra control se encuentran dentro de los lmites aceptables durante los
primeros ocho das, pero el noveno y dcimo da los valores obtenidos estn
fuera del rango de confianza; el cambio de las disoluciones patrn el da undcimo vuelve a colocar los resultados dentro del lmite de aceptacin.
Figura 3.14. Grfica de control de calidad
de la cantidad de grasa en la leche.
Otro mtodo visual alternativo lo constituyen lo que se conoce como grficas

de sumas acumuladas. Es til cuando no se dispone de muestras control, por
ejemplo por falta de estabilidad, o cuando se realizan un gran nmero de anlisis que dan unos valores medios constantes, por ejemplo los valores de glucemia
en un laboratorio de anlisis clnicos. El valor medio de las determinaciones diarias tendr una distribucin normal en torno a la media de las medias de cada
da. La diferencia entre la media de un da y la media de las medias calculada
durante un perodo de tiempo debera ser nula. Lo mismo ocurrira con la suma
acumulada de las diferencias entre la media de un da y la media de las medias
durante un perodo de tiempo determinado. Muchas veces la representacin tiene una pequea pendiente debido a que el valor de la media de las medias es
incorrecto. Cambios en la pendiente de las sumas acumuladas estaran indicando un posible error en la determinacin.
Por ejemplo: en un laboratorio de anlisis clnicos se realizan una media de
25 determinaciones de glucemia al da, y el valor medio de la glucemia durante
el ltimo ao fue de 101 mg /dL. En los ltimos 14 das se han obtenido los resultados que se muestran en la figura 3.15, a partir de los cuales se han calculado las sumas acumuladas de la desviacin de la referencia del laboratorio
(101 mg /dL). Se puede observar que, inicialmente, se produce una disminucin
gradual de la suma acumulada, pero a partir del da 10 cambia la tendencia y se
origina un aumento gradual de la suma acumulada, lo que estar indicando que
se est produciendo algn tipo de error, aunque pueden esperarse un par de
das ms para confirmarlo. No obstante, conviene extremar las precauciones con
el fin de encontrar la fuente de error.
54
Figura 3.15. Grfica de control de calidad
de la suma acumulada.
SELECCIN DEL MTODO DE ANLISIS

La seleccin de un mtodo analtico requiere valorar un gran nmero de factores. En primer lugar, es preciso conocer algunas de las caractersticas fsicas, qumicas y bioqumicas de la sustancia a analizar. En funcin de la relacin existente
entre la propiedad que se observa y la cantidad de muestra presente, algunos
mtodos sirven slo para detectar mtodos cualitativos, mientras que otros son
vlidos cuantitativamente.
En la seleccin de un mtodo, no slo debe considerarse su validez analtica,
sino tambin el coste de cada anlisis en trminos de instrumentacin, reactivos
y tiempo. Por tanto, deben considerarse los puntos siguientes:
El principio del mtodo y en las reacciones en que est basado.
La composicin de los reactivos, las condiciones de almacenamiento y su
estabilidad.
El tipo de muestra que se utiliza y condiciones de recogida.
Las interferencias del mtodo (presencia de sustancias que puedan interferir, etc.). En algunos casos las interferencias no se encontrarn en el tipo de
muestra procesado, mientras que en otros s.
La instrumentacin necesaria.
Los riesgos fsicos, qumicos y biolgicos del mtodo.
La fiabilidad del mtodo (precisin, exactitud, etc.).
El lmite de deteccin del mtodo. Segn el tipo de muestra, un mtodo
no es aplicable bien porque los valores de la muestra estn por debajo del
lmite de deteccin o bien porque el mtodo es demasiado sensible para
la muestra que quiere determinarse (el factor de dilucin de la muestra
debera ser tan grande que la exactitud del mtodo queda comprometida).
El coste del mtodo (reactivos, instrumentacin, personal, etc.).
La rapidez del mtodo, tiempo que transcurre entre la toma de muestra y
la obtencin del resultado.
La eleccin del mtodo de anlisis requiere por parte del bioqumico la evaluacin y consideracin de un gran nmero de factores. As, por ejemplo, mientras que en un laboratorio de investigacin priman la exactitud y la precisin del
mtodo sobre el tiempo de procesamiento de las muestras, en un laboratorio de
anlisis clnicos prevalece en algunos casos la rapidez sobre la precisin, ya que
el tratamiento rpido del enfermo puede ser clave para salvarle la vida.
55
Captulo 3
PRESENTACIN DE LOS DATOS

Para que los datos analticos obtenidos sean utilizables, puede ser necesario
acompaarlos de un conjunto de informacin sobre la muestra y las condiciones
en que se han obtenido los resultados; deben elegirse las unidades adecuadas,
teniendo en cuenta que tan slo se deben precisar tres cifras significativas.
Adems, deben presentarse en unas unidades estandarizadas, las unidades
del Sistema Internacional de Unidades (S.I.), sistema universal que establece una
unidad para cada magnitud fsica. Se definen siete unidades bsicas que pueden
combinarse para dar unidades derivadas (Figura 3.16).
Figura 3.16. Unidades bsicas del S.I.
Otro aspecto importante es utilizar el mltiplo o submltiplo adecuado para

presentar tan slo tres cifras significativas (Figura 3.17).
Figura 3.17. Mltiplos y submltiplos de

unidades.
56
Obtencin de muestras
INTRODUCCIN
MUESTRAS DE SANGRE
Recogida de muestras de sangre
Puncin venosa
Puncin arterial
Puncin cutnea
Anticoagulantes
Alteraciones en las muestras de sangre durante la conservacin y el procesamiento
Agentes desproteinizantes
MUESTRAS DE ORINA
Composicin de la orina
Recogida de muestras de orina
Orina de una miccin

Orina de un tiempo determinado
Deterioro de las muestras de orina. Conservantes
58
4
INTRODUCCIN
La experimentacin bioqumica requiere la utilizacin de una gama prcticamente infinita de muestras. El bioqumico, a lo largo de su vida, puede tener que
enfrentarse con el estudio de muestras y materiales muy dispares. Por ejemplo:
muestras vegetales, de suelos, de agua, de alimentos, de animales, de microorganismos y de humanos. Adems, en funcin del objetivo del estudio y del tipo de
muestra, la obtencin de dichas muestras, su preparacin e incluso su conservacin pueden variar.
La recogida, manipulacin y el procesamiento de la muestra antes de realizar
el anlisis son fundamentales, ya que afectan a la validez de los resultados que se
obtengan. La recogida y el tratamiento dependen de la procedencia, el tipo y la
determinacin que quiera realizarse. As pues, la descripcin detallada de cada
tipo de muestra particular podra ocupar una gran parte del libro. Evidentemente, ste no es el objetivo del mismo. Por tanto, nos centraremos fundamentalmente en un tipo particular de muestras: las que se utilizan principalmente en
laboratorios de anlisis clnicos.
MUESTRAS DE SANGRE
La sangre es el fluido corporal ms utilizado con fines analticos por la informacin que puede obtenerse y por la facilidad de su obtencin, y es el principal
tipo de muestra que se obtiene en los laboratorios clnicos.
Recogida de muestras de sangre

La sangre puede obtenerse de las venas, de las arterias o de los capilares. Dependiendo del tipo de sangre que quiera extraerse, se utilizan diferentes procedimientos:
59
Captulo 4
Puncin venosa
Puncin arterial
Puncin cutnea
La sangre arterial y la venosa se diferencian en algunos aspectos que deben
tenerse en cuenta. Mientras que la sangre arterial tiene una composicin prcticamente uniforme en todo el organismo, la sangre venosa vara su composicin
segn la actividad metablica del tejido que ha irrigado. Por lo tanto, el lugar en
donde se extrae la sangre venosa puede influir en su composicin. La sangre venosa tiene menos oxgeno que la arterial, pero tambin se diferencian por el pH,
la concentracin de dixido de carbono y el hematocrito. A veces tambin
varan las concentraciones de glucosa, cido lctico, amonio, etc.
La sangre obtenida por puncin de la piel se denomina, incorrectamente,
sangre capilar, pero es una mezcla de sangre procedente de arteriolas, vnulas y
capilares y, por tanto, comprende parte venosa y parte arterial.
Puncin venosa
Figura 4.1. Venas de extraccin de sangre;

vC: vena ceflica; vCM: vena cubital
media; y vB: vena baslica.
La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta tcnica el
principal mtodo de obtencin de sangre en los laboratorios de anlisis clnicos.
La puncin venosa suele realizarse en una de las venas de la fosa cubital, por su
grosor y superficialidad (Figura 4.1).
Las muestras de sangre pueden extraerse por medio de jeringas o por tubos
de vaco desechables, para evitar contagios. Los pasos a realizar en una extraccin de sangre son los siguientes (Figura 4.2):
Se aplica un torniquete de goma, unos 1015 cm por encima del lugar de
puncin, para obstruir el retorno de la sangre venosa al corazn y para distender las venas. La vena se detecta por palpacin. En algunos casos pueden utilizarse venas de la parte superior de la mano, teniendo cuidado en
la extraccin, ya que pueden producirse hematomas con facilidad. La
zona donde va a realizarse la puncin debe desinfectarse con un algodn
empapado en alcohol, exceptuando aquellos casos en que deban realizarse pruebas de alcohol en sangre. En este ltimo caso, la limpieza con alcohol podra contaminar la muestra y producir una falsa elevacin de los
resultados; puede limpiarse la zona con agua y jabn, pero debe estar
seca antes de realizar la puncin.
Se procede a la puncin: jeringa y aguja deben alinearse con la vena e introducirse con un ngulo de unos 15. Una vez se supera la resistencia inicial de la pared de la vena, la sangre fluye fcilmente.
Si se utilizan tubos de vaco, se llenan los diferentes tipos necesarios (Figura 4.3), con el anticoagulante y el conservante adecuados.
Terminada la toma de sangre, se retira el torniquete y luego la aguja. Seguidamente debe sujetarse fuertemente un algodn sobre el lugar de la
puncin con el brazo extendido, para impedir la salida de la sangre.
Figura 4.2. Fases en la extraccin de

sangre venosa.
60
Si se ha utilizado una jeringa, se transfiere la sangre a los tubos adecuados.

Los que contengan anticoagulante deben taparse y mezclarse su contenido
por inversin.
El sistema de tubos de vaco (Vacutainer) es la forma ms frecuente de obtener muestras de sangre en la actualidad. Permite obtener sangre en diversas condiciones, usando la misma aguja y con un mnimo de molestias. Se prefiere al
sistema de aguja y jeringa porque permite que la sangre pase directamente de la
vena al tubo de vaco. Los tubos de vaco son ms cmodos de utilizar y evitan
que se escape la sangre cuando se cambian. El sistema consta de tres elementos
bsicos:
Aguja estril
Soporte o dispositivo de sujecin
Tubo de vaco
La aguja estril se enrosca en el soporte (Figura 4.4) y se inserta en la vena.
Luego se presiona el tubo de vaco sobre el extremo posterior de la aguja hasta
pinchar el tapn y utilizar el vaco en el proceso de extraccin. El tubo se llena
de sangre hasta que se agota el vaco. Entonces se puede sacar el tubo del dispositivo de sujecin y colocar otro tubo. Las agujas suelen llevar una camisa de
goma que se cierra para evitar salpicaduras de sangre cuando se cambian los
tubos.
Se pueden utilizar diferentes tubos de vaco; hay distintos tamaos (entre 3 y
7 mL de capacidad), pueden ser estriles o no y presentan tapones de caucho
de distintos colores que permiten identificar el tipo de anticoagulante o conservante que contiene el tubo (Figura 4.5).
Figura 4.3. Sistema de vaco para la

extraccin de sangre.
Figura 4.4. Aguja enroscada en el soporte.
Figura 4.5. Tubos de vaco para extraccin

de sangre.
A partir de la sangre sin anticoagulante, se obtiene el suero. Si la sangre contiene anticoagulante, lo que se obtiene es el plasma. El fibringeno forma parte
del plasma, mientras que no est presente en el suero. La heparina, en forma de
sal de litio, es el anticoagulante universal ideal, ya que es eficaz en pequeas
cantidades y no tiene efectos significativos sobre muchas determinaciones. Para
las determinaciones de glucosa se pueden aadir fluoruros a la heparina, que inhiben la gluclisis de los hemates. De todas maneras, la separacin inmediata
del plasma o del suero de las clulas sanguneas por centrifugacin es importante para la mayora de las determinaciones (Figura 4.6).
Las muestras de sangre durante su extraccin pueden hemolizarse. La hemolisis es la ruptura de los hemates con la consiguiente liberacin de la hemoglobina. Cuando se produce hemolisis, el suero o el plasma adquieren una tonalidad
rosada o roja. La hemolisis puede producirse por diferentes causas durante la extraccin de las muestras de sangre:
Si se extrae la sangre demasiado rpido, se produce espuma
Figura 4.6. Obtencin de plasma.
61
Captulo 4
Si se fuerza el paso de la sangre por una aguja demasiado fina

Si se agita con demasiada fuerza
Si se centrifuga la sangre antes de estar completamente coagulada
Algunas determinaciones realizadas sobre muestras de sangre hemolizadas pueden verse afectadas, al liberarse en el plasma y en el suero sustancias del interior
de los hemates o de las membranas rotas. As, las determinaciones de colesterol,
bilirrubina, fsforo, hierro y algunas enzimas, como las fosfatasas cida y alcalina y
la lactato deshidrogenasa entre otras, pueden verse afectadas por la hemolisis.
Puncin arterial
La sangre arterial se utiliza para medir la presin de oxgeno y de dixido de carbono y para establecer el valor del pH, que es una medida del equilibrio cido-bsico de la sangre. Estas determinaciones son tiles para evaluar los problemas
mdicos relacionados con el sistema respiratorio. Son fundamentales en el estudio
de problemas de oxigenacin que se producen en determinadas enfermedades.
En otros tiempos, la puncin arterial se consideraba peligrosa. Realmente, las
punciones arteriales son tcnicamente ms difciles de realizar que las venosas.
La mayor presin en las arterias dificulta la interrupcin de la hemorragia y provoca con mayor frecuencia la aparicin de hematomas. Hoy en da, los instrumentos de anlisis de gases en sangre estn automatizados, con lo cual son ms
rpidos, ms precisos y necesitan una menor cantidad de muestra. Una muestra
de sangre arterial para la determinacin de gases en sangre slo es til al mdico
si el paciente est preparado, si la muestra se recoge correctamente, si se extrae
una cantidad de muestra adecuada y si la manipulacin de la muestra es correcta. Las personas que realizan las punciones arteriales tienen que estar familiarizadas con los peligros de la tcnica y con las precauciones que hay que tomar para
evitar un perjuicio al paciente o que los resultados estn alterados.
Las muestras de sangre suelen tomarse de la arteria radial del brazo o de la
arteria femoral. La extraccin se lleva a cabo con una jeringa de vidrio heparinizada. No deben utilizarse jeringas de plstico normales ni tubos de vaco. La
razn es que el oxgeno difunde a travs de las paredes de las jeringas de plstico en 1 2 horas. Este factor tiene cada vez menor importancia, ya que los
avances tcnicos en la instrumentacin permiten realizar un anlisis en la muestra en 1 2 minutos. Los tubos de vaco no sirven para este tipo de anlisis, ya
que la presin parcial de los gases disueltos en sangre se altera notablemente
con la succin creada por el vaco del tubo.
Ya que el estado de los gases y del pH en sangre es pasajero in vivo, el paciente debe estar bien preparado. El paciente se debe encontrar en estado de
equilibrio, lo que se consigue despus de 20-30 minutos de reposo. Hay una serie de factores que pueden alterar los resultados: comer, padecer un dolor, los
estados de angustia, mantener la respiracin, toser o hacer ejercicio.
La heparina sdica es el anticoagulante ms utilizado para la toma de muestras
de gases en sangre, pues tiene un efecto mnimo sobre los valores de los componentes cido-bsicos. Existe un problema de dilucin si se utiliza heparina lquida.
Recientemente se estn utilizando jeringas que contienen heparina en polvo seco.
Otra fuente de error son las burbujas de aire, que pueden alterar el valor de
la presin de oxgeno y que se producen, normalmente, por una falta de ajuste
entre la aguja y la jeringa.
62
Adems, hay un problema que resolver, como es la eliminacin o la limitacin de los procesos metablicos, principalmente disminuyendo la actividad metablica de los leucocitos, que son los que consumen mayor cantidad de
oxgeno. La forma ms fcil de hacerlo es refrigerar la muestra.
Puncin cutnea
La puncin cutnea es el mtodo elegido en la extraccin de sangre en pacientes peditricos, especialmente en lactantes (Figura 4.7). Es importante evitar la
produccin de daos por el volumen de muestra extrada o por el mtodo de
recogida. La puncin cutnea resulta tambin til en adultos con obesidad extrema, con quemaduras graves o con tendencia trombtica. Tambin suele utilizarse en pacientes geritricos.
La puncin cutnea puede hacerse en el taln o en la falange distal de cualquier dedo. El taln del pie se pincha con una lanceta, a una profundidad no
mayor de 2,4 mm; se deja que fluya la sangre y se carga un capilar heparinizado. Tambin puede recogerse sobre un papel, como habitualmente se hace a los
nios recin nacidos. Para aumentar la circulacin de la sangre, puede caldearse
la zona del pinchazo con un pao seco y caliente. Las punciones en los dedos
pueden realizarse en los nios a partir de los 18 meses y en los adultos.
En estos casos, la hemolisis puede producirse:
Figura 4.7. Zonas del taln en las que

puede realizarse una puncin cutnea.
si se dejan residuos de alcohol sobre la piel y se mezclan con la muestra

de sangre
si se aprieta demasiado fuerte el taln o el dedo
La hemolisis en la sangre de los recin nacidos puede ser mayor que en la de
los adultos, debido a la mayor fragilidad de los hemates y a los niveles elevados
de hematocrito.
Anticoagulantes
Cuando se requiera sangre total o plasma, debe aadirse a la muestra un anticoagulante durante el proceso de recogida. Existen distintas sustancias capaces de impedir la coagulacin de la sangre (Figura 4.8). El anticoagulante debe elegirse de
acuerdo con las determinaciones que se vayan a realizar para que su presencia no
afecte a la medida. Por ejemplo, si se quieren medir los iones sodio o potasio, no
puede utilizarse como anticoagulante ninguna sustancia que contenga estos iones.
La heparina es el anticoagulante que menos interfiere en la mayora de las
determinaciones. Se presenta como sal sdica, potsica, de amonio o de litio y
Figura 4.8. Algunos anticoagulantes, su
accin, dosis en que se utilizan y su
aplicacin.
63
Captulo 4
se utilizan unas 20 U/mL de sangre extrada. Puede utilizarse como solucin o

secarse sobre las paredes de los tubos donde se recoge la sangre. Evita la transformacin de protrombina en trombina y, por tanto, evita la formacin de fibrina
a partir de fibringeno.
El oxalato es otro anticoagulante que acta formando complejos con el calcio,
que es un in fundamental en el mecanismo de coagulacin. La sal ms utilizada
es el oxalato potsico (2 mg por cada mL de sangre). Tambin puede utilizarse en
solucin, o secarse sobre las paredes de los tubos de recogida. Se utiliza en las
determinaciones hematolgicas de recuentos celulares y hematocrito.
El citrato tambin forma complejos con el calcio. Se utilizan 30 mg por mL
de sangre. En forma de sal sdica se utiliza para las medidas de velocidad de sedimentacin.
El EDTA (etileno diamina tetraacetato), sdico o potsico, se utiliza en concentraciones de 12 mg/mL de sangre para los recuentos hematolgicos. Su accin anticoagulante se debe tambin a la formacin de quelatos con el calcio.
Adems de la existencia de tubos con anticoagulantes, tambin hay tubos
con conservantes, como el fluoruro, que inhibe un gran nmero de enzimas, impidiendo el metabolismo de diversas sustancias sanguneas. Es til en las determinaciones de glucosa cuando entre la toma de la muestra y la centrifugacin ha
de transcurrir ms de una hora.
Alteraciones en las muestras de sangre

durante la conservacin y el procesamiento
Las muestras de sangre pueden sufrir toda una serie de alteraciones durante su
conservacin y procesamiento. Las alteraciones ms importantes que se dan en
las muestras de sangre, cmo pueden minimizarse y su conservacin se detallan
a continuacin:
Prdidas de gases. Para evitarlas, se recoge la sangre bajo parafina lquida y
se separa inmediatamente el plasma.
Conversin de glucosa en lactato. Si la sangre no se trata en 2 horas, se
pierde la mitad de la glucosa sangunea. Lo ms indicado es la utilizacin
de fluoruros y la desproteinizacin rpida de la muestra.
Formacin de amonio a partir de sustancias nitrogenadas. Por ejemplo, la
urea puede provocar este efecto en muestras con contaminacin bacteriana. La sangre debe mantenerse estril y refrigerada.
Conversin de piruvato en lactato. Puede aadirse a las muestras cido
iodoactico para conservar el piruvato.
En general, en el caso de que la sangre se deba conservar, se recomienda su
recogida en condiciones estriles. Como estabilizante puede utilizarse una mezcla de oxalato potsico y fluoruro sdico en proporcin 3:1, o bien slo el fluoruro sdico.
Las muestras se pueden separar en alcuotas. Algunas determinaciones requieren un anlisis inmediato, mientras que otras permiten que las muestras se
guarden para su posterior anlisis. Por lo tanto, dependiendo de la determinacin a realizar, las muestras deben guardarse, desproteinizadas o no, en congeladores de 20 C 80 C.
64
Agentes desproteinizantes
La desproteinizacin (eliminacin de las protenas) de las muestras de sangre,
suero o plasma es necesaria para la determinacin de diferentes metabolitos, y
conviene realizarla rpidamente despus de la recogida de cada una de las
muestras. La desproteinizacin de las muestras puede realizarse utilizando diferentes agentes caotrpicos (que provocan la precipitacin de las protenas) que
pueden separarse por centrifugacin, recogindose un sobrenadante libre de
protenas. Se detallan a continuacin distintos agentes caotrpicos:
cido tngstico (Na2WO2 2H2O). Las proporciones utilizadas son:
1 vol. sangre + 7 vol. de H2O + 1 vol. tungstato sdico al 10% + 1 vol.
H2SO4 0,66N.
cido tricloroactico.
1 vol. sangre + 9 vol. tricloroactico 10%.
cido perclrico.
1 vol. sangre + 1 vol. H2O + 2 vol. HClO4 6N.
ter y acetona. Es conveniente si se quieren extraer ciertos constituyentes
sanguneos como cidos grasos y colesterol.
Una vez desproteinizadas las muestras, stas se pueden guardar en congeladores de 20 C 80 C, dependiendo de las sustancias que quieran analizarse.
MUESTRAS DE ORINA
La orina constituye un material que permite obtener una considerable cantidad
de informacin, de forma rpida y econmica. Al igual que cualquier otro mtodo de laboratorio, los anlisis de orina deben llevarse a cabo de forma cuidadosa y perfectamente controlada.
El estudio de las muestras de orina puede plantearse desde dos puntos de
vista:
Diagnstico y tratamiento de enfermedades renales o del tracto urinario.
Deteccin de enfermedades metablicas o sistmicas no directamente relacionadas con el sistema urinario.
Las pruebas analticas de orina se pueden clasificar en tres categoras:
Pruebas qumicas
Pruebas bacteriolgicas
Pruebas de examen microscpico
Entre los procesos ms fciles de detectar mediante estudio bioqumico de la
orina hay que citar la proteinuria (signo frecuente de enfermedad renal), la glucosuria, la cetonuria y la presencia de pigmentos como la bilirrubina y la hemoglobina.
El estudio microscpico del sedimento urinario de una muestra recogida de
forma adecuada no slo permite determinar la posible presencia de una enfermedad renal, sino indicar tambin el tipo de lesin.
65
Captulo 4
Composicin de la orina
A travs de los riones se filtran unos 200 L de sangre diarios, producindose
como resultado ms de 1 L de orina cada 24 horas. El rin selecciona y retiene
las sustancias esenciales, excretando al mismo tiempo los productos de desecho
del metabolismo y el exceso de determinados productos ingeridos con la dieta.
Mantiene, adems, el equilibrio del agua y los electrolitos, y contribuye a la homeostasis cido-bsica. Por tanto, la composicin de la orina vara con la ingesta
de agua y sales, con la ingesta de protenas y con el estado metablico. Estas
fuentes de variabilidad suponen problemas prcticos en la seleccin del momento ms adecuado para recoger la muestra. Para exmenes rpidos y determinaciones cualitativas se suelen utilizar muestras de orina tomadas al azar. Para
estudios cuantitativos es preferible recoger la orina a horas fijas o tomar muestras
de orina de 24 horas.
La mayor parte del soluto de la orina est formado por urea y cloruro sdico.
Adems de urea, otras sustancias nitrogenadas presentes en la orina son cido rico, creatinina, aminocidos, amonaco y protenas. La excrecin diaria de creatinina est relacionada con la masa muscular y tiende a ser uniforme. Por eso, la
creatinina es un indicador til de haber recogido completamente la muestra de
orina durante un perodo determinado, y permite tambin expresar la concentracin en orina de determinadas sustancias respecto a ella. La orina contiene tambin potasio, sulfatos y fosfatos, adems de pequeas cantidades de azcares y
productos intermediarios del metabolismo (citrato, piruvato y cantidades mnimas
de colesterol y cidos grasos); vitaminas como el cido ascrbico se excretan por
la orina. Tambin pueden estar presentes bilirrubina y hemoglobina.
En orina normal concentrada, el cido rico y los fosfatos precipitan a temperatura ambiente o en refrigeracin. La orina normal contiene tambin elementos
formes: eritrocitos, leucocitos y clulas epiteliales.
Recogida de muestras de orina

La orina ha de recogerse de acuerdo con el anlisis que se va a realizar en ella.
Una correcta recogida de orina condicionar la adecuada interpretacin de los
datos obtenidos. En el pasado se utilizaban todo tipo de recipientes para su recogida, lo que originaba muchos errores por interferencias producidas por contaminantes. Para evitar estos problemas conviene usar recipientes de plstico
desechables, de un solo uso.
Orina de una miccin

La orina de una miccin es la orina recogida al azar, a cualquier hora del da, en
un recipiente no estril, para los llamados anlisis sistmicos. En este tipo de
muestra se analizan los niveles de glucosa, protenas, y otros compuestos; tambin puede utilizarse para determinar el pH, la densidad y el color. Se puede
comprobar en este tipo de muestra la presencia de sangre, pus o cristales.
En muchos casos se requieren muestras de la primera miccin del da, al reflejar este tipo de muestra con ms exactitud la concentracin de las diferentes
sustancias de la orina. En muchos casos no es necesario utilizar este tipo de
muestra, dando igual la hora de la recogida.
66
En este tipo de recogida no es importante el volumen de miccin. Las muestras se recogen en recipientes qumicamente limpios, en algunos casos estriles si
quieren realizarse cultivos bacteriolgicos; los recipientes suelen ser normalmente de unos 50 mL.
Orina de un tiempo determinado

Este tipo de orina se utiliza para las determinaciones cuantitativas metablicas,
en general, para la medida de todas aquellas sustancias que exhiben variaciones
durante el da en su excrecin. El tiempo de recogida ms utilizado son las
24 horas, y el protocolo ms comn es:
Desechar la primera orina de la maana.
Recoger toda la orina de las 24 horas siguientes.
Al cumplirse las 24 horas, orinar y aadir esta orina a la ya obtenida.
Una vez recogida toda la orina, se lleva al laboratorio, donde se mide el volumen, se mezcla bien, se separan alcuotas para las diferentes determinaciones y
lo que sobra se tira.
Dependiendo del tipo de determinaciones que vayan a realizarse, se aaden
a los recipientes de recogida diferentes estabilizadores y conservantes.
Deterioro de las muestras de orina. Conservantes

La conservacin de las muestras de orina es esencial para mantener su integridad
(Figura 4.9). Por lo general, la muestra debe refrigerarse durante su obtencin y
despus de sta, si es necesario, se le aadir el conservante que proceda. Si los
aditivos qumicos pueden afectar al anlisis, slo se utilizar la refrigeracin
como sistema de conservacin.
El anlisis de las muestras de orina de una sola miccin debe realizarse en la
hora siguiente a la emisin. Es debido a que los eritrocitos y leucocitos se descomponen en la orina cuando sta permanece varias horas a temperatura ambiente; la bilirrubina y el urobilingeno disminuyen tambin si existe exposicin
a la luz, y las clulas y bacterias presentes utilizan la glucosa. Otro problema es la
contaminacin bacteriana, que provoca la alcalinizacin de la orina debido a la
conversin de la urea en amonio y a la prdida de CO2. Se produce una mayor
turbidez debido a la multiplicacin bacteriana y a la precipitacin alcalina. El color se hace ms oscuro y el olor es ms fuerte. Si hay una elevada cantidad de
glucosa, las bacterias y levaduras la convertirn en alcohol y cidos, y el pH descender.
Los errores que se producen en las pruebas cuantitativas realizadas en muestras de 24 horas se deben principalmente a problemas de recogida:
Figura 4.9. Recipiente para la recogida de

muestras de orina.
Prdida de una muestra

No descartar la primera muestra
Mala conservacin
Refrigeracin insuficiente
67
Captulo 4
Durante el perodo de recogida hay que restringir la ingestin de lquidos y

evitar la ingestin de alcohol y de ciertos alimentos y frmacos.
Si el anlisis de la orina de una miccin no se analiza dentro de la primera
hora despus de la miccin, debe refrigerarse. Para muchas determinaciones la
refrigeracin debe ir acompaada de un pH cido.
Las determinaciones cuantitativas de creatinina, protenas, cido rico y fosfato se realizan en muestras de 24 horas, mantenidas en refrigeracin durante la
recogida y sin aadir conservantes. La congelacin de partes alcuotas de la orina
es til en las pruebas bioqumicas cuantitativas, porque retrasa la prdida de sustancias lbiles como la bilirrubina.
Los conservantes, dependiendo de la sustancia que vaya a ser analizada y del
mtodo que se use, pueden utilizarse en las muestras de orina de 24 horas. En
general, los conservantes actan como agentes antibacterianos y antimicticos,
adems de reducir la descomposicin qumica, solubilizar los constituyentes urinarios que puedan precipitar y evitar la oxidacin de compuestos inestables. Se
utilizan conservantes cidos como el cido actico para determinar hormonas
como aldosterona, cortisol, catecolaminas, esteroides, estrgenos, etc. El cido
clorhdrico se utiliza en caso de que la muestra sea para la determinacin de histamina. Disolventes orgnicos, como el tolueno, se usan para la determinacin
de cido rico, ctrico, creatina, urea y xantina.
68
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas

INTRODUCCIN
ESPECTROFOTOMETRA
La luz
Distribucin de la energa en los tomos y en las molculas
Distribucin de la energa en los tomos
Distribucin de la energa en las molculas
Absorcin de la radiacin
Emisin y absorcin atmica
Absorcin molecular. Regiones ultravioleta y visible
Absorciometra molecular. Ley de Beer-Lambert
TCNICAS DE FLUORESCENCIA MOLECULAR
70
5
INTRODUCCIN
La espectroscopa permite el estudio de la absorcin y la emisin de radiacin
electromagntica por la materia. La caracterstica de la materia ms fcilmente
apreciable respecto a la absorcin de luz es el color: una sustancia presenta el
color que corresponde a la longitud de onda del espectro visible que no absorbe; as, por ejemplo, la clorofila es verde porque absorbe todas las radiaciones
del visible excepto la correspondiente al verde (Figura 5.1).
Figura 5.1. Espectro de absorcin de la

molcula de clorofila.
Las tcnicas espectroscpicas fcilmente se refinan y automatizan. Son tcnicas de gran utilidad en los anlisis bioqumicos, ya que permiten analizar pequeas cantidades de las sustancias, incluso si stas se encuentran acompaadas
de otras. Las longitudes de onda absorbidas y la eficiencia con que se absorben
dependen tanto de la estructura de la molcula como del medio en el que se
encuentra, haciendo que la espectroscopa de absorcin constituya un instrumento til para la deteccin y caracterizacin de molculas.
71
Captulo 5
ESPECTROFOTOMETRA
La luz
La luz visible, y otras radiaciones del mismo tipo, consiste en ondas electromagnticas que viajan por el espacio a una velocidad de 3 108 m s1. La luz
consta de un campo magntico y un campo elctrico perpendiculares entre s,
que oscilan sinusoidalmente a medida que se propagan a travs del espacio (Figura 5.2).
Figura 5.2. Representacin de la radiacin

electromagntica con el campo elctrico
(E) y el magntico (M) oscilando en ngulo
recto respecto a la direccin de
propagacin de la onda. Los dos campos
oscilan con la misma frecuencia.
La energa (E) de la onda es:
E=
Donde: h:
c:
l:
u:
hc
=hu
l
constante de Planck = 6,63 1034 J s1

velocidad de la luz en el vaco (3,0 1010 cm s1)
longitud de onda expresada en cm
frecuencia expresada en cm1
La luz tambin consiste en un flujo de cantidades discretas de energa denominadas fotones o cuantos de luz. La cantidad de energa de cada cuanto de luz
determina la longitud de onda de la radiacin. En definitiva, la luz presenta una
dualidad como onda-corpsculo; tiene, por tanto, caractersticas de onda y de
materia. Mientras que la energa de la radiacin se encuentra asociada con la
forma de la onda (longitud de onda, l, que depende de la energa de cada
cuanto), la intensidad est relacionada con la amplitud de la onda (nmero de
cuantos o fotones presentes).
Cuando una de estas ondas electromagnticas encuentra en su camino una
molcula o un tomo, puede ser reflejada (es decir, alterada su direccin de propagacin) o bien absorbida (parte de su energa se transfiere a la molcula). Las
probabilidades relativas de estos dos procesos dependen de las propiedades de
la molcula o del tomo. La absorcin o la emisin de radiacin por la materia
implica el intercambio de energa, de modo que para comprender los principios
de este intercambio es necesario entender la distribucin de la energa en los
tomos o en las molculas.
72
Distribucin de la energa en los tomos y en las molculas

Distribucin de la energa en los tomos
La energa en un tomo est asociada a las posiciones de los electrones en el
mismo. En cada tomo, en el estado fundamental, los electrones ocupan los niveles energticos ms bajos, de acuerdo con las leyes de la mecnica cuntica
(orbitales atmicos). Un ejemplo concreto se ilustra en la figura 5.3: el estado
fundamental del tomo de sodio, que contiene once electrones.
Figura 5.3. Niveles energticos y reparto
electrnico en el tomo de sodio (Na) (11
electrones).
Los electrones pueden cambiar de nivel energtico por la absorcin o por la

emisin de energa en forma de radiacin y, debido a que los tomos slo pueden existir con sus electrones distribuidos en niveles energticos concretos, con
una energa asociada especfica, estas ganancias o prdidas de energa slo pueden realizarse en paquetes discretos o cuantos. Por tanto, la cantidad de energa
que debe aportar un fotn para que pueda realizarse el salto electrnico debe
ser exactamente igual a la diferencia energtica entre dos niveles discretos diferentes. Segn el electrn pase de un nivel energtico ms bajo a otro ms alto o
viceversa, la energa ser absorbida (a partir de un fotn) o emitida respectivamente. As pueden darse diferentes saltos; en el caso del Na, por ejemplo,
podrn darse transiciones entre 3s y 3p (siendo de 589 nm la longitud de onda
asociada), entre 3s y 3d (330 nm), entre 3p y 3d (819 nm), etc.
Distribucin de la energa en las molculas

Cuando se establecen los enlaces entre tomos para formar una molcula, los
electrones que intervienen en los enlaces adquieren nuevas posiciones en el sistema y, por tanto, nuevos niveles de energa, fundamentales y excitados.
Adems, los tomos en una molcula pueden vibrar y rotar alrededor de un eje
de enlace, dando lugar a subniveles energticos vibratorios y rotatorios, como se
representa en la figura 5.4.
As, la energa interna de una molcula es, al menos, de tres tipos:
La energa asociada a los electrones
La energa asociada a las vibraciones entre tomos
La energa asociada a la rotacin de unos grupos de tomos respecto a
otros de la misma molcula
73
Captulo 5
Figura 5.4. Niveles energticos y
transiciones electrnicas en una molcula.
Se pueden observar los diferentes niveles
energticos: estado fundamental E0 ,
primer estado excitado E1 y segundo
estado excitado E2. Cada estado presenta
diferentes subniveles vibratorios: V0 , V1 ,
V2 y V3. Los niveles vibratorios presentan
subniveles rotatorios, que, por razones de
claridad, tan slo se han representado en
el segundo estado excitado.
Absorcin de la radiacin
Cuando una radiacin incide en la materia, parte de la radiacin puede ser absorbida. En el caso de los elementos, la energa se invierte en producir cambios
en el estado energtico de los electrones. En el caso de las molculas, esta
energa puede utilizarse, adems, en cambios en los estados vibratorio y rotatorio. Es decir, en el caso de una molcula, cuando sta absorbe radiacin, la
energa puede distribuirse en cualquiera de los tres apartados siguientes: saltos
electrnicos, vibracin de los tomos o rotacin de unos grupos de tomos respecto a otros de la misma molcula.
As pues, la materia puede absorber energa en diferentes regiones de la radiacin electromagntica. En la figura 5.5, se representan las diferentes regiones
del espectro electromagntico, y cmo se distribuye la energa cuando es absorbida por la materia. Los rayos provocan transiciones nucleares, los rayos X provocan cambios de energa en los electrones internos, las radiaciones ultravioleta
y visible provocan cambios en los electrones de valencia (electrones que intervienen en los enlaces covalentes) y la radiacin infrarroja y las microondas provocan cambios debidos a vibraciones y rotaciones moleculares.
Si se representa la cantidad de energa absorbida o emitida por una molcula
o por un elemento frente a la longitud de onda, se obtiene un espectro tpico de
cada molcula (Figura 5.6). El rango de longitudes de onda en las que se absorbe
ms o menos energa es caracterstico de cada tipo de molcula y est asociado
con una regin bien definida del espectro electromagntico. Las molculas interFigura 5.5. Espectro de la radiacin
electromagntica. La energa asociada a
cada onda es inversamente proporcional a
la longitud de onda. Se indica cmo se
distribuye la energa absorbida.
74
actan con las radiaciones de una amplia gama de longitudes de onda, producindose espectros en varias regiones distintas y generando los tpicos espectros
de bandas. Por el contrario, los tomos absorben energa en regiones bien delimitadas del espectro, dando lugar a espectros de lneas.
Figura 5.6. Ejemplos de espectros tpicos
de bandas y de lneas.
Emisin y absorcin atmica

En los tomos aislados, la absorcin de energa est asociada nicamente con
transiciones electrnicas, tal y como ya se ha comentado. Es muy pequeo el
nmero de transiciones electrnicas posibles en un tomo y, como resultado,
cuando los electrones de los tomos excitados vuelven al estado fundamental,
emiten radiacin de la misma longitud de onda que la que han absorbido. La
primera transicin se conoce con el nombre de lnea de transicin D (Figura 5.7).
El salto de un electrn del estado fundamental a un estado excitado requiere
que la energa del electrn se eleve; la manera es absorbiendo un cuanto discreto de energa exactamente equivalente a la implicada en la transicin. Anlogamente, cuando un electrn excitado retorna a su estado fundamental, emite
radiacin de una longitud de onda especfica. La lnea de transicin D es caracterstica de cada tomo, lo que puede utilizarse para identificar y cuantificar los
diferentes tomos.
Se sabe que, cuando se introduce un tomo en una llama, la llama cambia
de color: el color que adquiere es caracterstico de cada elemento y se corresponde con el de la longitud de onda asociada a la energa de transicin D. Esta
cualidad puede utilizarse para su identificacin. Pero, adems, la cantidad de luz
emitida de un determinado color es proporcional a la cantidad de tomos del
elemento que se encuentran en la llama, por lo que puede utilizarse para su
cuantificacin. Se han diseado instrumentos para poder cuantificar la cantidad
de luz emitida correspondiente a la longitud de onda de la lnea de transicin.
Esta tcnica se conoce con el nombre de espectrofotometra de emisin a la
Figura 5.7. Diagrama tpico de niveles de
energa en un tomo, donde se muestra el
estado fundamental, el primer estado
excitado y la lnea de transicin D del
tomo de Na. La lnea de transicin D es
caracterstica de cada tomo.
75
Captulo 5
llama. Aunque es la ms utilizada para el estudio de tomos, est restringida casi

exclusivamente a la regin del visible del espectro y a los elementos que se excitan fcilmente a la temperatura de la llama.
De forma alternativa, puede utilizarse como elemento de excitacin un arco
elctrico de alto voltaje. Recientemente se han desarrollado los sistemas de descargas de plasma de argn, que alcanzan temperaturas de hasta 10.000 C y
permiten obtener mayor sensibilidad. Estos nuevos instrumentos consiguen temperaturas ms elevadas y evitan los problemas de interferencia de los tradicionales espectrofotmetros de llama. El estado de plasma se consigue por diferentes
medios (microondas, radiofrecuencia, etc.) y supone la coexistencia en un espacio determinado de iones positivos, electrones y especies inertes de un gas noble, generalmente argn o helio.
La fotometra de emisin a la llama se fundamenta en la excitacin que pueden sufrir los tomos por la llama y la posterior deteccin de emisin de radiacin por tales tomos. Hay que sealar que no todos los tomos son excitados
por la llama, aunque la cantidad de tomos excitados depende del nmero de
tomos que se introduzcan en sta.
Un espectrofotmetro de emisin a la llama tiene diferentes componentes,
que se representan de forma esquemtica en la figura 5.8.
Figura 5.8. Componentes de un
espectrofotmetro de emisin a la llama.
Los componentes principales de un espectrofotmetro de emisin atmica a

la llama se detallan a continuacin.
Nebulizadores (atomizadores). Mediante los nebulizadores o atomizadores se
fuerza el paso de aire por un tubo capilar con la punta sumergida en la disolucin de la muestra. Se producen gotas que, a travs de la corriente de aire, alcanzan el quemador, donde sus constituyentes se volatilizan y pueden sufrir la
excitacin.
Llamas. Se pueden utilizar varias mezclas gaseosas, que producen diferentes
temperaturas, dependiendo del elemento que se quiera estudiar (Figura 5.9).
Figura 5.9. Mezclas gaseosas utilizadas
para generar la llama. Se indica, adems,
la temperatura que se alcanza y los
elementos que suelen ensayarse con cada
tipo de llama.
76
Monocromadores. El monocromador es un filtro o un prisma, con una resolucin de 0,1-0,2 nm en un rango que va desde 200 a 1.000 nm. nicamente
deja pasar la radiacin de la longitud de onda de emisin del elemento que
quiere determinarse, mientras que las otras radiaciones (de diferente longitud de
onda) son absorbidas por el filtro. Por ejemplo, pueden observarse las longitudes
de onda que se utilizan para el anlisis de varios metales (ver figura 5.15).
Detectores. La seal filtrada de la longitud de onda deseada llega al detector,
que transforma la seal luminosa en elctrica. La transformacin puede llevarse
a cabo por una clula fotoelctrica, por una clula fotovoltaica, por un fototubo
o por un fotomultiplicador.
En una clula fotoelctrica, la incidencia de los fotones en una superficie
metlica situada en el vaco provoca la emisin de electrones. Por cada fotn
que incide se produce un electrn, que es atrado por un nodo, establecindose una diferencia de potencial que puede ser medida. La diferencia de potencial
detectada es proporcional a la intensidad de luz que llega a la clula fotoelctrica (Figura 5.10).
Figura 5.10. Esquema de funcionamiento
de una clula fotoelctrica.
Las clulas fotovoltaicas operan por el principio fotoelctrico, segn el cual,

cuando la luz incide en ciertos metales o semiconductores, se produce un flujo
de electrones que es proporcional a la intensidad de la luz. Las clulas fotovoltaicas constan de una capa de hierro o cobre sobre la que hay una capa de un semiconductor, como el selenio. La capa de selenio est recubierta por una capa
de metal, como por ejemplo la plata, que permite el paso de luz. Esta ltima
capa acta como nodo. Al incidir la luz sobre la capa del semiconductor se genera un flujo de electrones hacia la capa de plata, pudindose medir este flujo
con un ampermetro (Figura 5.11).
Un fototubo suele contener un fotoctodo cncavo de nquel recubierto de
plata, que absorbe bien los fotones. Los electrones que se desprenden de l son
atrados por el nodo, establecindose una diferencia de potencial, pudindose
de esta manera determinar la intensidad de la radiacin incidente (Figura 5.12).
Tambin pueden utilizarse fotomultiplicadores. En esencia, los fotomultiplicadores son tubos de vaco con una serie de placas denominadas dnodos (electrodos que generan una emisin secundaria de electrones), un fotoctodo y un
nodo (Figura 5.13). Cada una de las placas de los dnodos est conectada a un
voltaje distinto de manera que la diferencia de potencial se incrementa progresivamente. Los fotones, al llegar al fotoctodo, originan electrones, uno por cada
fotn que llega. Los electrones son atrados por el primer dnodo, con el que co-

de una clula fotovoltaica.
77
Captulo 5
de un fototubo.

de un fotomultiplicador. La incidencia de
luz sobre el fotoctodo genera la
liberacin de electrones, que se dirigen al
primer dnodo aumentado la emisin de
electrones a medida que stos chocan
con los diferentes dnodos, hasta alcanzar
el nodo.
lisionan, provocando la liberacin de ms electrones que, al chocar con el segundo dnodo, generan a su vez ms electrones, y as sucesivamente hasta alcanzar el nodo, provocando una diferencia de potencial mayor a la que se
produce en las clulas fotoelctricas. Por cada electrn que llega a un dnodo se
forman de 4 a 6 electrones secundarios. El proceso puede repetirse varias veces;
de esta manera se consigue amplificar la seal en varios millones de veces.
La tcnica de emisin a la llama a veces no es suficientemente sensible, por lo
que se desarroll una modificacin con el fin de incrementar su sensibilidad, recurriendo a la espectrofotometra de absorcin atmica a la llama, que se basa en
la capacidad de absorcin de radiacin de los tomos no excitados por la llama.
Estos ltimos son mucho ms abundantes que los excitados por la llama, por lo
que la sensibilidad potencial de esta tcnica es mayor que la basada en la emisin
a la llama. As, cuando un haz de luz blanca atraviesa la llama, los tomos en el estado fundamental absorben a las longitudes de onda propias, generndose bandas
de absorcin en la radiacin transmitida. Las longitudes de onda de las bandas de
absorcin coinciden con las de excitacin de los electrones de valencia.
Un espectrofotmetro de absorcin atmica tiene los mismos componentes
que uno de emisin pero, adems, se aade al diseo la presencia de una fuente de emisin de radiacin electromagntica. Los componentes de un espectrofotmetro de absorcin atmica se encuentran representados de forma
esquemtica en la figura 5.14. En la figura 5.15 pueden verse las condiciones
para determinar diferentes bioelementos, bien por absorcin, o bien por emisin
atmica a la llama.
78

espectrofotmetro de absorcin a la
llama.
Figura 5.15. Lneas de emisin y absorcin

utilizadas en la determinacin de
diferentes elementos. Gases utilizados
para la llama: A: aire; Ac: acetileno; N:
xido nitroso; H: hidrgeno.
Absorcin molecular. Regiones ultravioleta y visible

Al igual que ocurra en los tomos, cada uno de los electrones de una molcula
tiende a ocupar el nivel de menor energa posible, es decir, el estado fundamental. Anlogamente, en condiciones apropiadas, un electrn en una molcula
puede adquirir energa, lo que lo eleva a un nivel energtico superior, es decir, a
un estado excitado.
Dado que los electrones de las molculas, en cada estado fundamental y estado excitado, pueden estar en un cierto nmero de subniveles energticos (vibratorios y rotatorios), los saltos pueden darse en un abanico de longitudes de
onda (Figura 5.16). Este abanico comprende el salto entre los niveles de estado,
por lo que los espectros moleculares se ven generalmente como espectros de
Figura 5.16. Niveles de energa asociados

con las transiciones electrnicas. No todas
las molculas de la muestra tienen el
mismo cambio de energa (E) para una
transicin electrnica en particular, ya que
existen, en los mismos niveles de energa
electrnica, diferentes estados rotatorios y
vibratorios que hacen que, por tanto, se
requieran cantidades de energa diferentes
para alcanzar el nivel electrnico
siguiente. Cada cantidad de energa
corresponde a diferentes longitudes de
onda de la radiacin, dando lugar a
distintos picos de absorcin
caractersticos.
79
Captulo 5
bandas. Los electrones de una molcula solamente pueden cambiar su nivel de

energa cuando la molcula absorbe o emite cuantos definidos o radiaciones de
determinadas longitudes de onda.
Los espectros de absorcin de las molculas son de gran inters, tanto cualitativa como cuantitativamente, en las determinaciones analticas (Figura 5.17).
Figura 5.17. Espectro de absorcin de una
molcula. El mximo de absorbancia se
produce con la longitud de onda de la
radiacin incidente que corresponde a
una energa igual a la diferencia de
energa entre el estado fundamental y el
excitado.
Figura 5.18. Espectro de absorcin de la

molcula de triptfano.
Desde el punto de vista cualitativo, la forma del espectro de absorcin puede

utilizarse para identificar la presencia de un determinado compuesto, ya que dicha forma depende de la estructura qumica del mismo (Figura 5.18). Por otra
parte, la cantidad de energa absorbida por una muestra a una determinada longitud de onda puede utilizarse para determinar la cantidad presente de una determinada molcula.
La absorcin de la radiacin en la regin ultravioleta-visible del espectro ocasiona transiciones de los electrones de valencia desde los orbitales moleculares
enlazantes hasta los orbitales antienlazantes, de alta energa. En el caso de enlaces sencillos, los electrones se encuentran en orbitales de tipo , mientras que
en dobles y triples enlaces los electrones pueden encontrarse, adems de en los
, en orbitales . La energa necesaria para transiciones de a * (* indica antienlazante) es mayor que la necesaria para las transiciones de a *. Por otra
parte, la conjugacin de los dobles enlaces tambin afecta a este tipo de transiciones. As, cuando en una molcula aparecen diversos enlaces dobles, a medida que aumenta la conjugacin de stos, disminuye la energa necesaria para
provocar las transiciones de los electrones de a *.
Los compuestos que presentan coloracin en el visible se suelen caracterizar
por presentar un nmero importante de dobles enlaces conjugados. Un ejemplo
caracterstico lo constituyen los carotenos (Figura 5.19), que presentan color naranja.
Figura 5.19. Estructura molecular del bcaroteno. Ntese que posee un elevado
nmero de enlaces dobles conjugados.
Existen tambin transiciones electrnicas en las molculas entre los enlaces

conocidos como n y los enlaces *. Los orbitales n se presentan en molculas
que contienen tomos como el nitrgeno o el oxgeno, con pares de electrones
80
no compartidos, que no participan en el enlace. Por ello los orbitales n poseen

carcter de orbital atmico. La energa necesaria para provocar transiciones de
orbitales n a * (antienlazantes) es la asociada a radiaciones de 150 a 250 nm,
mientras que en las transiciones de tipo n a * se requieren longitudes de onda
de excitacin mayores, que se encuentran entre 300 y 400 nm. Estas ideas se esquematizan en la figura 5.20 y en la figura 5.21.
Figura 5.20. Representacin esquemtica
de los niveles energticos en que se
situaran los distintos orbitales (n, p y s)
en una molcula hipottica. La energa
requerida para las transiciones s s* es
ms alta que para las transiciones p p*,
n s* y n p*.
Figura 5.21. Longitud de onda a la que se

produce la absorcin mxima en diferentes
compuestos orgnicos y transicin
responsable de la absorcin. El smbolo *
identifica los orbitales de tipo antienlazante.
Los distintos sustituyentes influyen en la longitud de onda a la que absorben

estos compuestos (Figura 5.22).
Este desplazamiento de los mximos de absorcin por la introduccin de sustituyentes diferentes en un compuesto determinado permite su utilizacin para la
cuantificacin de compuestos por mtodos qumicos. As, al reaccionar la sustancia problema con un reactivo que, por ejemplo, presente dobles enlaces conjugados (que absorba en la regin ultravioleta-visible), el nuevo compuesto formado
presentar un mximo de absorcin diferente al del reactivo. La aparicin del
nuevo color puede utilizarse con fines tanto cualitativos como cuantitativos.
Figura 5.22. Longitud de onda a la que se

produce la absorcin mxima en diferentes
derivados del benceno. Ntese que el
mximo de absorcin vara en funcin del
sustituyente unido al anillo de benceno.
81
Captulo 5
Absorciometra molecular. Ley de Beer-Lambert
Figura 5.23. Absorcin y transmisin de

radiacin a una determinada longitud de
onda por una disolucin de un
compuesto.
La cantidad de energa absorbida o emitida por una disolucin de un compuesto

es el fundamento de un gran nmero de los mtodos cuantitativos en anlisis
bioqumico. La relacin entre la cantidad de energa absorbida y la cantidad de
materia viene establecida por las leyes de Beer y Lambert. La ley de Lambert establece que la cantidad de luz absorbida por un medio es independiente de la
intensidad de la radiacin y dependiente del espesor de la muestra y las caractersticas de la misma. La ley de Beer establece que la cantidad de radiacin absorbida es proporcional al nmero total de molculas que se encuentran en el
recorrido de la luz.
Al no poderse medir directamente la cantidad de radiacin absorbida por
una sustancia, normalmente se calcula la diferencia entre la intensidad de la radiacin que llega a la muestra (radiacin incidente, I0) y la residual que sale finalmente de la muestra (radiacin trasmitida, I) (Figura 5.23).
Utilizando ambas medidas, la ley de Beer-Lambert puede expresarse mediante la ecuacin:
log 10
I0
=cL
I
Donde: c: la concentracin de la sustancia [moles litro1]

L: longitud de paso de la luz (cm)
: coeficiente de extincin molar de la sustancia
[litros mol1 cm1]
Los valores de I0 e I no suelen medirse en trminos absolutos, siendo lo ms
comn expresar el valor I como porcentaje de I0. Este valor se conoce como
transmitancia (T).
T=
I
100
I0
Otra medida de la cantidad de radiacin es la absorbancia (A), que se define

como:
100
A = log 10
T
La absorbancia puede relacionarse con la concentracin de la sustancia por
la frmula:
I
100
A = log 10
= log 10 0 = c L
T
I
Para que la sensibilidad del mtodo sea mxima, interesa que, para una concentracin dada, la absorbancia medida sea la mxima posible. Para ello, es preferible efectuar la medida en el mximo de absorcin de la sustancia a
determinar. En algunos casos se puede elegir otra longitud de onda para evitar
las interferencias de otros compuestos que absorban tambin a la longitud de
onda del mximo de absorcin.
Los aparatos diseados para cuantificar la absorcin de luz por una muestra
son los espectrofotmetros. Los espectrofotmetros poseen una serie de componentes bsicos, que se detallan en la figura 5.24.
82

Figura 5.24. Componentes bsicos de un
espectrofotmetro.
Fuente de energa radiante. Emite la radiacin electromagntica, a partir de la

cual se seleccionar una determinada longitud de onda (por el siguiente componente, el monocromador). La fuente ms frecuente para trabajar con la regin del espectro del visible (360-950 nm) es la lmpara de wolframio. Para las
medidas de la regin del ultravioleta (220-360 nm) se utiliza la lmpara de
deuterio.
Monocromador o filtro. Es el componente que permite aislar la longitud de
onda necesaria para realizar la medida, es decir, la longitud de onda a la que el
compuesto a estudiar va a absorber luz. Los filtros de este tipo estn constituidos
por materiales que dejan pasar de forma selectiva las longitudes de onda deseadas, absorbiendo el resto. Es importante, puesto que la ley de Beer-Lambert se
cumple estrictamente slo en el caso de la radiacin monocromtica.
Cubetas para las muestras. Son los recipientes pticamente transparentes donde se colocan las diluciones de muestras para las medidas de absorbancia. Pueden ser de vidrio, de plstico o de cuarzo. Dependiendo del material con el que
est construida la cubeta, la cantidad de luz absorbida por la propia cubeta vara
significativamente. Por ejemplo, para lecturas por debajo de 310 nm se precisan
cubetas de cuarzo, porque las de plstico absorben por debajo de esa longitud
de onda. Las cubetas ms utilizadas poseen una longitud de paso de la luz (L) de
1 cm, lo que facilita el clculo de la concentracin de la sustancia a estudiar a
partir de su absorbancia.
Detectores. Son los componentes que convierten en energa elctrica la energa
luminosa que les llega. Los diferentes modelos de detectores fotoelctricos existentes se basan en que la llegada de la luz no absorbida provoca el desplazamiento de electrones, lo que da como consecuencia la aparicin de una
diferencia de potencial entre dos electrodos. Se pueden utilizar, en general, detectores fotovoltaicos, fototubos o fotomultiplicadores.
Dispositivos de lectura. La seal elctrica generada en el detector se lleva hasta
los dispositivos adecuados, que reflejan su valor. Los sistemas de aguja (analgicos) han ido siendo sustituidos por sistemas de lectura digital. En ambos casos la
seal elctrica se traduce en unidades de absorbancia o de transmitancia.
Los espectrofotmetros ms complejos son los de doble haz. En estos espectrofotmetros, el haz luminoso de la fuente se divide en dos haces, uno que pasa
por una cubeta de referencia (blanco) y otro que pasa por la cubeta de muestra,
lo que permite conocer exactamente la cantidad de energa absorbida por la
muestra (Figura 5.25).
En los mtodos espectrofotomtricos utilizados para anlisis cuantitativos se
procesa, paralelamente a las muestras, un patrn o estndar (aunque en algu83
Captulo 5
espectrofotmetro de doble haz.
Figura 5.26. Recta patrn tpica que se

obtiene al representar la absorbancia de
un compuesto que cumple la ley de BeerLambert frente a su concentracin.
nos casos se utiliza el coeficiente de extincin molar para el clculo de la concentracin de la sustancia analizada). En general, no se analiza un solo patrn
de composicin conocida, sino que se prepara un banco de diluciones a partir
de una solucin stock de la sustancia pura con una concentracin conocida.
Los tubos patrn deben procesarse a la vez que las muestras problema y deben
contener los mismos reactivos y componentes que ellas, exceptuando la muestra, que en el patrn se habr sustituido por el volumen adecuado de solucin
stock. El banco de diluciones patrn se prepara por duplicado y debe constar
de un mnimo de 5 diluciones. El primer tubo de patrn debe corresponder al
blanco. El volumen final de los tubos patrn debe ser el mismo que el de los tubos de muestra.
Una vez desarrollado el mtodo y efectuada la lectura de la absorbancia de
todos los tubos (muestra y patrn), se representan las lecturas del patrn grficamente en unos ejes de coordenadas. Se representan las unidades de absorbancia
respecto de la cantidad de sustancia pura contenida en cada tubo del patrn (Figura 5.26). Deben representarse todos los valores. Los puntos en la grfica se
ajustan a una recta (y = A + Bx), donde,
A:
B:
y:
x:
es la ordenada en el origen,
es la pendiente de la recta,
es el valor de la absorbancia y
es la cantidad de sustancia en cada tubo.
Debe calcularse tambin el coeficiente de regresin (r). Un valor de r aceptable es de 0,990 o superior.
Conociendo los valores de absorbancia de las muestras problema y utilizando
la ecuacin de la recta patrn, es posible calcular la concentracin de la sustancia en dichas muestras.
En algunos casos, los clculos de la concentracin de la muestra pueden realizarse a partir del coeficiente de extincin molar del cromforo formado. No
obstante, este procedimiento no permite un control fino de las diferencias de reactivos y procedimiento que puedan darse de un da por otro, pero, en contrapartida, es ms rpido.
84
TCNICAS DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

La fluorescencia molecular se basa en que, en algunos casos, la emisin de radiacin por los electrones excitados que vuelven al estado fundamental se realiza en varias etapas, de manera que se emite una radiacin de una longitud de
onda distinta a la absorbida (Figura 5.27). Al ser la longitud de onda de la radiacin emitida diferente de la longitud de onda de absorcin, puede utilizarse sta
tanto para identificar como para cuantificar sustancias.
Hay un gran nmero de sustancias que son fluorescentes y, adems, la fluorescencia proporciona un mtodo ms sensible para cuantificarlas que la espectrofotometra de absorcin. En algunos casos, la fluorescencia permite analizar
componentes celulares indetectables por otros mtodos.
Los compuestos fluorescentes se caracterizan por presentar dobles enlaces
conjugados (electrones deslocalizados en orbitales ) y, en algunos casos, estructuras planares rgidas con grupos dadores de electrones. As, la presencia de grupos amino e hidroxilo aumenta las posibilidades de que una sustancia sea
fluorescente. De esta forma, compuestos que por su estructura no son fluorescentes, pueden convertirse en fluorescentes mediante reacciones qumicas como
condensaciones, sustituciones, deshidrataciones u oxidaciones, o por simples
modificaciones del pH.
No todos los fotones absorbidos producen fluorescencia, pero la cantidad de
fluorescencia es proporcional a la cantidad de molculas de la sustancia fluorescente presente en la muestra.
La fluorescencia se emite en todas las direcciones, lo que puede aprovecharse al disear los aparatos de medida que, en principio, son similares a los usados
en espectroscopa de absorcin, con la diferencia de que, para evitar las interferencias que pueda causar la transmisin de la radiacin incidente sobre la muestra, se sita el sistema de deteccin en ngulo recto respecto a la luz incidente.
De esta manera, slo se detecta radiacin fluorescente (Figura 5.28). Si no se hiciera as, no se podra discriminar la radiacin fluorescente, al ser esta ltima de
menor magnitud que la radiacin no absorbida procedente de la fuente de radiacin (la cual, situando el detector en un ngulo de 90o con respecto a ella, no
ser prcticamente detectada). El hecho de que la fluorescencia ocurre en todas
las direcciones ayuda a mejorar la sensibilidad de los mtodos espectrofotomtricos. Las causas de esta mayor sensibilidad de la fluorimetra con respecto a la
espectrofotometra de absorcin estriban en que las medidas de fluorescencia
utilizan como blanco un compuesto no fluorescente, que da una seal cero, o
Figura 5.27. Esquema del mecanismo de

fluorescencia molecular. Los niveles de
energa entre el estado fundamental y el
primer estado excitado se representan por
lneas gruesas. Los niveles de vibracin se
representan por lneas finas. La molcula
experimenta fluorescencia de la siguiente
manera: se produce una excitacin (lnea
negra), tras sta, se producen prdidas
por vibracin (lnea gris claro) hasta un
nivel inferior del primer estado excitado y,
a partir de ste, se produce la emisin de
energa (gris oscuro) de otra longitud de
onda mayor (es decir, con una menor
energa asociada, ya que parte se ha
perdido).
85
Captulo 5
fluormetro.
prxima, en el detector. En cambio, en el caso de las medidas de absorcin, el

blanco transmite la mayor parte de la radiacin incidente y provoca una gran
respuesta en el detector. En los mtodos fluorimtricos es posible, por lo tanto,
aumentar significativamente la sensibilidad del detector, permitiendo medir con
precisin cantidades muy pequeas de radiacin.
A pesar de estas disposiciones geomtricas, es posible que una parte de la radiacin incidente, dispersada o reflejada, alcance el detector. Para evitar esto, los
fluormetros estn equipados con un segundo sistema monocromador entre la
muestra y el detector, que absorbe todas las radiaciones de longitudes de onda
diferentes a la que interesa determinar.
La principal ventaja de las tcnicas fluorimtricas es su sensibilidad, que permite detectar cantidades de sustancia del orden de nanogramos (109 g).
86
Tcnicas radioqumicas
INTRODUCCIN
TIPOS DE RADIACTIVIDAD
Partculas a
Partculas b
Positrones (b+)
Captura electrnica
Rayos g
DESINTEGRACIN RADIACTIVA
UNIDADES DE RADIACTIVIDAD
DETECCIN Y MEDICIN DE LA RADIACTIVIDAD
Contadores Geiger-Mller
Contadores de centelleo
Autorradiografa
88
6
INTRODUCCIN
La estructura del tomo se caracteriza por presentar un ncleo compacto que
contiene neutrones y protones (carga positiva) rodeado de una nube de electrones (carga negativa) (Figura 6.1). El nmero de electrones de un tomo coincide
con el nmero de protones del ncleo, de manera que el tomo en su conjunto
no tiene carga neta. El nmero de protones se conoce como nmero atmico
(Z). La masa del tomo se encuentra concentrada en el ncleo, a pesar de que
ste representa slo una pequea parte del tamao total del tomo (la masa del
protn es 1.850 veces superior a la del electrn). Los neutrones son partculas
sin carga con una masa aproximadamente igual a la de los protones. La suma del
nmero de protones (Z) y neutrones (N) de un ncleo determinado se conoce
como nmero msico (A).
Figura 6.1. Estructura del tomo: presenta
un ncleo compacto que contiene
neutrones y protones, rodeado de una
nube de electrones.
El nmero de protones de un tomo, que coincide con el de electrones, es el

que determina las propiedades qumicas del elemento. El nmero de neutrones
del ncleo no est directamente relacionado con el nmero atmico, y no cambia las propiedades qumicas del tomo, afectando tan slo a su masa.
Se denominan istopos a los tomos que tienen el mismo nmero atmico
nmero de electrones o de protones y, por lo tanto, son el mismo elemento, pero tienen diferente masa atmica diferente nmero de neutrones en el
ncleo.
89
Captulo 6
Un istopo determinado se expresa con un subndice que representa su nmero atmico y un superndice que corresponde a su nmero msico:
12
6C
Figura 6.2. Esquema representativo de

una desintegracin en un tomo
radiactivo.
14
6C
16
8O
18
8O
La estabilidad del ncleo atmico de los istopos depende del balance

de las fuerzas atractivas y repulsivas que se establecen entre protones y neutrones. As, cuando los elementos tienen nmeros atmicos bajos, los istopos son estables cuando la razn entre neutrones y protones (N/Z) es
prxima a la unidad. Cuando el nmero atmico aumenta, esta razn puede
alcanzar valores superiores, de 1,5. Cuando la razn entre el nmero de
neutrones y protones se aleja de estos valores, el ncleo experimenta una reaccin nuclear (desintegracin) para alcanzar un estado ms estable (Figura
6.2), y se dice entonces que el elemento es radiactivo. Adems de mantener
esta relacin, los tomos que presentan nmeros atmicos superiores a 82
son radiactivos.
Para determinados elementos existen, aparte de istopos estables, otros
istopos conocidos como istopos inestables, que son los que experimentan
desintegraciones radiactivas. La velocidad de desintegracin de los ncleos es
caracterstica de cada istopo. En este proceso de desintegracin pueden
emitirse diferentes tipos de partculas, que difieren en la masa y la carga (Figura 6.3).
TIPOS DE RADIACTIVIDAD
Partculas a
Figura 6.3. Principales istopos

radiactivos, partculas que emiten y
caractersticas de la radiacin. CE: captura
electrnica; b : partculas beta; b +:
positrones; g: rayos g.
226
88 Ra
o
222
86 Rn
42 He
Figura 6.4. El radio es un elemento

radiactivo, inestable, que, por emisin de
una partcula a (un ncleo de helio), se
convierte en radn.
Los tomos que tienen un nmero atmico superior a 82 pueden alcanzar una
situacin ms estable expulsando neutrones y protones. Esto se realiza emitiendo
una partcula D, formada por dos protones y dos neutrones (es decir, un ncleo
de helio 42He). El resultado es un nuevo compuesto, con un nmero atmico disminuido en dos unidades y una masa atmica reducida en cuatro unidades (Figura 6.4).
Las partculas D son relativamente grandes y transportan una doble carga positiva, por lo que atraen a los electrones de los tomos del material que atraviesan, causando efectos de ionizacin. Tienen un alcance muy pequeo (entre 15
y 40 Pm) debido al tamao que presentan; pueden ser retenidas incluso por el
aire y, por lo tanto, presentan poco riesgo de radiacin externa, aunque sus efectos en las clulas o tejidos vivos pueden ser muy graves.
Partculas b
Aquellos ncleos que presentan un exceso de neutrones pueden restaurar su
razn N/Z transformado un neutrn en un protn, proceso que lleva asociado la
prdida de un electrn para convertir el neutrn en un protn ms un electrn.
La emisin de estas partculas aumenta en una unidad el nmero atmico sin alterar el nmero msico. La partcula emitida es un electrn de alta velocidad,
denominado tambin radiacin E (Figura 6.5).
90
Las emisiones E recorren distancias superiores a las de las partculas D, unas

diez veces mayores. Por ejemplo, son comunes en ellas capacidades de penetracin de 5 a 10 mm. Como las partculas E son ligeras, son desviadas fcilmente por los tomos y tienen, por tanto, menor capacidad de ionizacin que
las partculas D.
14
6C
o
14
7N
E
Figura 6.5. Cuando el carbono-14 emite

una partcula b , se convierte en otro
elemento, el nitrgeno-14, de igual masa
atmica.
Positrones (b+)
Aquellos istopos con ncleos que tienen un exceso de protones, en comparacin con los neutrones, adquieren una razn N/Z ms estable transformando protones en neutrones mediante la emisin de una partcula cargada
positivamente, conocida como positrn (E+), y quedando de esta manera el
nmero atmico reducido en una unidad (Figura 6.6). El positrn tiene una
vida muy corta, ya que se combina inmediatamente con un electrn de un
tomo cercano. La masa y la energa de las dos partculas se convierten en
dos rayos J, emitidos a 180o el uno del otro. En definitiva, el resultado de esta
emisin es la prdida de un protn y la ganancia de un neutrn, de manera
que el nmero atmico se reduce en una unidad, mientras que se mantiene
la masa atmica.
11
6C
o
11
5B
E
Figura 6.6. Cuando el carbono-11 emite

un positrn, se convierte en boro-11; es
decir, el nmero atmico disminuye en
una unidad, pero el nmero msico se
mantiene.
Captura electrnica
Un mecanismo alternativo a la emisin de un positrn, para la conversin de un
protn en un neutrn, es la captura electrnica (CE), en la que el ncleo captura
un electrn (para transformar un protn en neutrn) de un orbital interior con el
fin de restablecer la relacin N/Z. Un electrn de otro orbital ms exterior ocupa
el hueco en el orbital interior y la energa liberada se emite en forma de rayos J
(Figura 6.7). El proceso global se caracteriza por la reduccin en una unidad del
nmero atmico.
125
53 I
o
125
52Te
J
Figura 6.7. El iodo-125, cuando sufre un

proceso de captura electrnica, se
transforma en teluro-125.
Rayos g
Aparte de las emisiones de rayos J asociadas a la emisin de positrones o a
la captura electrnica, a veces el ncleo presenta una razn N/Z dentro del
rango estable y, sin embargo, puede encontrarse en un estado de energa
inestable, emitiendo energa en forma de radiacin electromagntica de
tipo rayos J, que son de longitud de onda extremadamente corta. Los fotones no tienen masa ni carga y no producen ionizacin directamente, aunque la energa asociada con ellos puede ser absorbida por otro tomo que
emita, a su vez, un electrn, que puede producir efectos de ionizacin secundaria.
Al emitir radiacin J, los tomos no sufren ningn cambio ni en la masa ni en
el nmero atmico. Esta emisin no se da normalmente de manera aislada, sino
acoplada a otros procesos, como ya se ha comentado. Por ejemplo, el sodio-24
(2141Na) emite radiacin E, convirtindose en magnesio-24 (2142Mg) y emitindose
tambin radiacin J en el proceso (Figura 6.8).
24
11Na
o
24
12 Mg
E J
Figura 6.8. Emisin de radiacin g

asociada al proceso de emisin de
partculas b por parte del sodio-24, para
convertirse en magnesio-24.
91
Captulo 6
DESINTEGRACIN RADIACTIVA
Figura 6.9. Curva de desintegracin

radiactiva.
La desintegracin radiactiva es un proceso que lleva asociada energa y que tiene lugar a una velocidad caracterstica de cada istopo (Figura 6.9).
La unidad de medida de los niveles de energa asociados con la desintegracin radiactiva es el electrn-voltio. As, un electrn-voltio (eV) es la energa adquirida por un electrn cuando se acelera por una diferencia de potencial de 1
voltio, y equivale a 1,6 u 1019 J. En la mayora de los istopos debe utilizarse el
mltiplo MeV (mega-electrn-voltio).
La velocidad de desintegracin radiactiva es proporcional al nmero de tomos del istopo presentes en un momento dado, y depende de la fuente del istopo. Se puede expresar mediante la siguiente ecuacin:
dN
dt
lN
donde: l: es la constante de desintegracin, que depende de las caractersticas del istopo y se define como la fraccin del istopo
que se desintegra por unidad de tiempo.
N: representa el nmero de tomos de istopo presentes en un
momento determinado. Si se realiza la representacin de la variacin del nmero de istopos radiactivos presentes en un momento determinado en funcin del tiempo (t), se obtiene la
curva de desintegracin radiactiva, que tiene una forma exponencial (ver figura 6.9).
Resolviendo la ecuacin diferencial anterior, se obtiene la ecuacin:
Nt = N0elt
que puede transformarse en la siguiente ecuacin:
ln
Nt
N0
lt
donde: Nt: es el nmero de tomos del istopo radiactivo presentes en el

tiempo t
N0: es el nmero de tomos del istopo radiactivo originalmente
presentes.
Normalmente, para expresar la constante de desintegracin (l), se utiliza el
trmino de vida media (T1/2), que se define como el tiempo que debe transcurrir
para que se desintegren la mitad de los tomos radiactivos. As, cuando Nt es
igual a la mitad de los istopos inestables presentes inicialmente (es decir, que
Nt = N0 /2), t se corresponder con la vida media del istopo:
N0
ln 2
N0
lT1/2
ln
1
2
lT1/2
T1/2
0,693
l
Los valores de vida media varan ampliamente desde unos 1019 aos, para el
Pb, hasta 3 u 107 aos para el 212Po (ver otros ejemplos en la figura 6.3).
204
92
UNIDADES DE RADIACTIVIDAD
La unidad ms utilizada para medir la radiactividad es el curio (curie, Ci), que
equivale a la cantidad de radiactividad de 1 g de radio, es decir 3,7 u 1010 desintegraciones nucleares por segundo (dps = desintegraciones u s1). As, 1 Ci equivale a la cantidad de istopo que produce 3,7 u 1010 dps. Esta unidad resulta
demasiado elevada, por lo que normalmente se emplean submltiplos de la misma, como el microcurio (PCi) y el milicurio (mCi). Sin embargo, en el sistema internacional, la unidad para la radiactividad es el becquerel (Bq), que equivale a
una desintegracin nuclear por segundo. A partir de tal definicin se deduce:
1 Ci = 3,7 u 1010 Bq = 3,7 u 1010 dps
Al trabajar con radiactividad, normalmente, se utilizan istopos radiactivos
mezclados con istopos estables del mismo elemento un portador. Por lo tanto, normalmente se hace necesario expresar la cantidad de radioistopo presente por unidad de masa de elemento. Esta medida se conoce como radiactividad
especfica. As pues, la radiactividad especifica se da como velocidad de desintegracin en dpm (desintegraciones por minuto), en dps (desintegraciones por segundo), en Bq, o en curios o sus subunidades (mCi o PCi) por unidad de masa.
Es decir, que la radiactividad especfica puede representarse mediante las siguientes unidades:
dpm/mol, dps/mol Bq/mol, mCi/g o PCi/g, etc.
DETECCIN Y MEDICIN DE LA RADIACTIVIDAD

La radiactividad puede detectarse midiendo los efectos que sta provoca. Por
ejemplo, midiendo los efectos de la ionizacin directa o indirecta que la radiactividad produce sobre las molculas. Los mtodos ms utilizados se basan en determinar los efectos de la radiactividad sobre la ionizacin de gases, sobre la
excitacin de lquidos o slidos o sobre la induccin de cambios qumicos.
Los efectos de la radiactividad pueden determinarse por unidad de tiempo, o
bien pueden medirse los efectos acumulados a lo largo de un tiempo; se habla
entonces de medidas diferenciales o de medidas integrales. El sistema diferencial
es el que se utiliza habitualmente para realizar medidas cuantitativas, mientras
que las medidas integrales se utilizan en dosimetra vigilancia de la emisin de
radiactividad.
La propiedad ionizante de determinadas radiaciones puede utilizarse a la
hora de medir la radiactividad presente en una muestra. As pues, cuando las radiaciones ionizantes atraviesan, por ejemplo, un gas, provocan la ionizacin de
las molculas de ste por la prdida de electrones de los orbitales de los tomos
que se encuentran en su recorrido. La capacidad de inducir esta ionizacin es
mayor para las radiaciones D y menor para las radiaciones E y J, decreciendo en
el siguiente orden:
D!E!J
(10.000:100:1)
Debido a su baja capacidad para producir ionizacin, las radiaciones J no
pueden detectarse por mtodos de ionizacin de gases; en cambio, las partculas D y E s que pueden detectarse por estos mtodos, particularidad que podr
aprovecharse a la hora de cuantificar la radiactividad de una muestra de inters.
93
Captulo 6
Cabe comentar que, cuando se utilizan medidas de radiactividad en experimentacin, uno de los problemas que lleva asociada tal medida es la existencia
de un importante fondo, que puede enmascarar o enturbiar la medida que desea realizarse. As, la determinacin exacta de la radiactividad propia de una
muestra requiere el clculo de este fondo, utilizando un blanco que permite corregir los posibles errores derivados de este problema. A continuacin se detallan
una serie de mtodos, utilizados en bioqumica analtica, as como en otras disciplinas, para medir la radiactividad de una muestra de inters.
Contadores Geiger-Mller
Los contadores Geiger-Mller permiten medir los efectos ionizantes de la radiactividad sobre un gas. Consisten en un cilindro hueco de metal con dos electrodos entre los que se establece una diferencia de potencial, de manera que los
electrones liberados durante la ionizacin del gas son atrados por el nodo, establecindose una corriente entre los dos electrodos proporcional a la cantidad
de gas ionizado. El cilindro metlico presenta una ventana por la que puede pasar la radiacin y se encuentra lleno de una mezcla de gases ionizables, generalmente nen y argn. La radiacin incidente genera un flujo de corriente entre
los electrodos que es proporcional a la cantidad de radiacin (Figura 6.10).
La ventana del tubo metlico que permite el paso de la radiactividad debe ser
lo suficientemente delgada para no absorber la radiacin, pero, an as, no sirve
para las partculas E, de baja energa, que son absorbidas por la ventana; as, por
ejemplo, los istopos 14C y 3H no pueden detectarse con tubos Geiger-Mller.
Las radiaciones J s pueden atravesar la ventana y entrar en el tubo; aunque
su capacidad para ionizar el gas es baja, son capaces de provocar la emisin de
fotoelectrones desde las paredes del metal a los electrodos. Los fotoelectrones
emitidos son capaces de ionizar el gas, por lo que pueden determinarse con este
tipo de contadores.
Figura 6.10.Tubo de Geiger-Mller. El tubo

est lleno de una mezcla de gases que
pueden ionizarse, como son el nen y el
argn. La ionizacin del gas por la
radiacin incidente genera un flujo de
corriente entre los electrodos.
94
Contadores de centelleo
Las radiaciones E, de baja energa, se absorben en parte, o incluso totalmente,
por el material de la ventana de los contadores Geiger, de manera que, como ya
se ha comentado, stos no pueden utilizarse en la determinacin de las emisiones del 3H y 14C. Aunque existe un gran nmero de sustancias, denominadas
centelleantes, que responden a los efectos de ionizacin por las partculas D y E,
emitiendo destellos de luz centelleos. Este tipo de sustancias no son directamente sensibles a los rayos J, aunque s lo son a sus efectos secundarios de ionizacin, proporcionando por lo tanto un sistema de deteccin que puede
utilizarse tanto para la determinacin de partculas D y E, como J. Se han diseado diferentes tipos de instrumentacin para contabilizar el nmero de destellos que pueden provocar los diferentes istopos radiactivos, que se conocen
con el nombre de contadores de centelleo.
Los compuestos que presentan tal centelleo pueden ser lquidos o slidos,
por lo que se han diseado dos tipos de contadores de centelleo, los slidos y
los lquidos, dependiendo del tipo de centelleantes utilizados.
Contadores de centelleo slido

Los cristales de ioduro de sodio, mezclados con una pequea cantidad de ioduro de talio, son detectores muy eficaces para los rayos J, por lo que se han utilizado en el diseo de aparatos medidores de estos rayos J.
En la figura 6.11 puede observarse el diseo de un contador de centelleo slido. La muestra se coloca sobre un cristal centelleante que, a su vez, se encuentra situado cerca de un fotomultiplicador que permite determinar el nmero de
destellos producidos segn la cantidad de muestra radiactiva. El cristal est recubierto de un material opaco que permite el paso de la radiacin J.
Figura 6.11. Contador gamma o contador
de centelleo slido. Los centelleos son
provocados por la presencia de la muestra
radiactiva.
95
Captulo 6
Las partculas D pueden ser determinadas utilizando cristales de sulfuro de zinc,

mientras que las partculas E pueden detectarse por cristales de antraceno. Las radiaciones E y D a menudo no pueden atravesar la cubierta protectora, por lo que
para este tipo de radiaciones suelen utilizarse los contadores de centelleo lquido.
Contadores de centelleo lquido

En este tipo de contadores las muestras se mezclan con lquidos de centelleo, de
esta manera se consigue evitar que la radiacin sea absorbida por el material opaco. El contador est diseado de tal manera que la muestra se encuentra disuelta
en el lquido de centelleo, dentro de un vial de plstico o vidrio, que se coloca entre dos tubos fotomultiplicadores. As se consigue que toda la muestra est contenida en el detector y, por tanto, no se perder ninguna desintegracin. Al estar el
sistema protegido de la luz, los fotomultiplicadores detectan todos los centelleos
producidos por la radiactividad en el lquido centelleante. Tan slo se contabilizan
los centelleos que detectan simultneamente ambos fotomultiplicadores, pudindose diferenciar de esta manera las seales reales del ruido de fondo. Adems, el
ruido de fondo se reduce realizando la medicin a 4 oC (Figura 6.12).
Figura 6.12. Contador de centelleo
lquido.
Los centelleadores lquidos deben de ser miscibles con la muestra. As, se utilizan el tolueno y el xileno para muestras orgnicas, mientras que el dioxano es
el centelleador utilizado para muestras acuosas.
Al estar la muestra disuelta en el disolvente, las emisiones radiactivas ionizan
las molculas del propio disolvente, y estas ltimas utilizarn la energa asociada
a la radiacin para pasar a un estado excitado. El disolvente es fluorescente, por
lo que devuelve energa emitiendo a una longitud de onda mayor. El tolueno, el
xileno y el dioxano emiten a longitudes de onda muy cortas, por lo que son difciles de detectar de manera eficaz. Para subsanar este problema, lo que se hace
es aadir otro compuesto fluorescente, conocido como fluorforo primario, que
acepte la energa liberada por estos disolventes para fluorescer, emitiendo por
tanto a una longitud de onda superior, que todava es difcil de detectar por el
fotomultiplicador. Por ello se suele aadir otro compuesto fluorescente, el fluorforo secundario, que emite a una longitud de onda todava superior, que ya puede ser detectada de manera eficaz por el fotomultiplicador. Todos son
compuestos fluorescentes, porque las mediciones se basan en esta propiedad del
disolvente, que permite aumentar la longitud de onda de los fotones emitidos
por la muestra (Figura 6.13).
Como fluorforo primario se suele utilizar el 2,5-difeniloxazol (PPO). El
fluorforo secundario puede ser el 1,3-di-[2-(5-feniloxazol)]-benceno (POPOP).
96
Figura 6.13. Esquema de la transferencia
de energa en un contador de centelleo
lquido y espectros de emisin de los
diferentes componentes que forman la
mezcla que se utiliza en los contadores de
centelleo lquido.
Al fluorescer, los compuestos emiten energa en todas direcciones, por lo

que al disear los contadores de centelleo lquido se utilizan varios fotomultiplicadores.
Autorradiografa
La radiactividad es capaz de impresionar una placa fotogrfica, por lo que puede
emplearse esta propiedad tanto para seguir el destino de un compuesto radiactivo como para cuantificar, ya que la intensidad de la impresin en la placa fotogrfica ser proporcional a la cantidad de radiactividad presente en la muestra
(Figura 6.14).
La muestra se coloca sobre una placa fotogrfica en un cassette protegido de
la luz, se deja el sistema el tiempo suficiente para que la placa pueda ser impresionada por la radiactividad emitida por la muestra, y se revela la placa fotogrfica con los lquidos de revelado de uso normal en fotografa. Se obtiene as una
placa impresionada, y la intensidad de la impresin es proporcional a la radiacin presente en cada muestra.
Figura 6.14. Impresin sobre una placa o

un film fotogrfico de la seal emitida por
compuestos marcados radiactivamente.
97
Mtodos de determinacin de bioelementos

INTRODUCCIN
TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE METALES Y ELEMENTOS TRAZA
Determinacin de calcio
Determinacin de fsforo
Determinacin de sodio y potasio
Determinacin de hierro
98
7
INTRODUCCIN
La manera ms sencilla de realizar una determinacin de cualquier elemento o
compuesto consiste en aprovechar alguna propiedad fcilmente mensurable.
Para los bioelementos, los mtodos de determinacin se basan en su capacidad
para absorber o emitir luz a unas determinadas longitudes de onda, que coinciden con los saltos electrnicos entre los estados fundamental y excitado. Sin embargo, estas propiedades slo se manifiestan a elevadas temperaturas;
concretamente la absorcin se manifiesta a temperaturas entre (1.900-3.000) C,
y la emisin entre (2.000-3.000) C. En la figura 7.1 se indican las condiciones
para determinar diferentes elementos.
Tambin se han desarrollado mtodos qumicos de determinacin de bioelementos. En este caso, es necesario provocar la reaccin del elemento con
algn reactivo para dar un producto con alguna caracterstica mensurable. Por
ejemplo, el calcio, el hierro y el fsforo cuentan con mtodos qumicos espectrofotomtricos para su determinacin.
Otro tipo de mtodos para determinar los bioelementos son las tcnicas radioisotpicas por anlisis de dilucin isotpica. Las tcnicas de dilucin isotpica consisten en introducir una cantidad conocida de compuesto marcado
Figura 7.1. Longitudes de onda de
absorcin y de emisin de diversos
metales. Se indica, adems, el tipo de
llama que se utiliza para su
determinacin. A: aire; Acet: acetileno; N:
xido nitroso; H: hidrgeno.
99
Captulo 7
radiactivamente, del que se conoce su radiactividad especfica (dpm/mol de

compuesto), en un medio, y dejar que ste se diluya en tal medio. Tomando una
pequea muestra del medio y determinando la cantidad de compuesto marcado
y sin marcar, se podr calcular la nueva radiactividad especfica. La dilucin de
esta radiactividad especfica es provocada por la presencia de compuesto no
marcado en el medio, por lo que se puede determinar la cantidad de compuesto en el total de la muestra o en el organismo a analizar.
Un ejemplo de la aplicacin de esta tcnica es la determinacin del agua total en un organismo. Se utiliza agua marcada con deuterio, tritio u oxgeno-18
para la cuantificacin de agua total en el cuerpo a travs de la tcnica de dilucin isotpica. As, la concentracin en el equilibrio de deuterio, tritio u 18O en
muestras de sangre ser proporcional a la cantidad total de agua en el organismo
(despus de asumir la correccin debida a las perdidas del trazador que se producen por excrecin a travs de la orina).
Cabe comentar que la tcnica de dilucin isotpica es ampliamente utilizada
en los estudios de oligoelementos.
TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA

LA DETERMINACIN DE METALES Y ELEMENTOS TRAZA
El tratamiento de las muestras es sencillo, debido precisamente al hecho de que
se aprovechan propiedades qumicas propias de los elementos que se pretende
detectar. Para la determinacin de bioelementos en muestras biolgicas, deben
diferenciarse las muestras lquidas de las slidas. En el caso de las muestras lquidas, nicamente es necesario hacer una disolucin de la misma para tener el
bioelemento a estudiar en una concentracin idnea para la sensibilidad del
aparato a utilizar o, como mucho, si hay la posibilidad de interferencia debida a
algn componente de la muestra (protena, etc.), se puede realizar algn paso de
desproteinizacin (ver captulo 4).
Por el contrario, las muestras slidas de origen biolgico deben sufrir un proceso de descomposicin oxidativa con cido en caliente, para as conseguir la liberacin de los elementos a determinar sin prdidas. Para muestras de origen
orgnico, los agentes oxidantes ms utilizados son el cido ntrico y el cido
perclrico. Otra posibilidad consiste en utilizar disoluciones de las cenizas secas
de la muestra, obtenidas tras su incineracin en un horno mufla en presencia de
aire, a una temperatura entre (400-800) C (ver Anexo de Mtodos en el CD).

Hay diferentes mtodos para la determinacin de bioelementos, tanto mtodos
de absorcin, como de emisin atmica, de forma directa o indirecta, adems
de mtodos por dilucin isotpica. En muchos de ellos, un punto importante es
la determinacin del rango de linealidad entre la cantidad de sustancia a analizar
y la respuesta que proporciona el detector, ya que suele estar en un rango de valores muy estrecho. En este sentido, otro aspecto importante a considerar es la
utilizacin de un patrn interno (sustancia que se aadir a las muestras pero
que no se encuentra originalmente en stas), que servir para controlar las prdidas durante el proceso de manipulacin de las muestras. El patrn interno debe
100
presentar lneas o bandas de absorcin alejadas de las propias bandas de los elementos a analizar, para no interferir en su determinacin.
Determinacin de calcio
El calcio, adems de ser uno de los principales constituyentes del tejido seo,
participa en procesos fisiolgicos bsicos, como la coagulacin sangunea y la
contraccin muscular; acta tambin como segundo mensajero en la respuesta
hormonal, sobre la regulacin del equilibrio osmtico celular, etc.
Es habitual la determinacin del calcio en fluidos biolgicos como suero,
plasma y orina, pudiendo realizarse la determinacin tanto por mtodos espectrofotomtricos directos por absorcin atmica, o indirectos previa reaccin
del calcio con un compuesto con el que, al reaccionar, genere un producto coloreado o cromforo. Tanto en uno como en otro caso, pueden surgir problemas
de interferencias debido a otros elementos y sustancias de la muestra. En el caso
de la absorcin atmica, la presencia de Na+, K+, fosfatos o sulfatos puede provocar una determinacin errnea del calcio. Para evitar estos problemas se utilizan soluciones de cloruro de lantano, que reduce la interferencia de protenas y
aniones orgnicos e inorgnicos, ya que provoca la disociacin de los complejos
que el calcio forma con estos aniones. Es tambin importante evitar la presencia
de agentes quelantes, pues al secuestrar stos a los iones Ca++ pueden conducir
a la infravaloracin del mismo. As, en muestras problemticas, como las de pacientes con tratamientos con agentes quelantes (como el EDTA), las muestras deben sufrir un paso previo de precipitacin con oxalato y posterior resuspensin
en un medio cido.
La determinacin de calcio por espectrofotometra de absorcin atmica requiere la utilizacin de un espectrofotmetro con una llama de aire/gas natural a
1.500 oC y deteccin de la absorbancia a 423 nm.
El calcio puede determinarse tambin por mtodos qumicos espectrofotomtricos (indirectos), debido a que puede formar complejos coloreados con
varios reactivos que cambian de color selectivamente cuando forman quelatos
con l. Los mtodos ms utilizados son los de la o-cresolftalena y el arsenazo III
(Figura 7.2).
Figura 7.2. Molculas de o-cresolftalena y
de arsenazo III.
El calcio, al formar un quelato con la o-cresolftalena, produce un cromforo

de color rojo en solucin alcalina que puede cuantificarse a 580 nm. Por otra
parte, cuando el calcio forma un quelato con el arsenazo III, que originalmente
es de color rosa, produce un compuesto de coloracin azul, que puede cuantificarse a 650 nm.
El calcio tambin puede determinarse por un mtodo fluorescente, por titulacin del complejo fluorescente del calcio con calcena y con indicadores, como
101
Captulo 7
EDTA o EGTA (Figura 7.3). El calcio forma un complejo fluorescente con la calcena (bis[N,N-bis(carboximetil)aminometil]fluorescena) en solucin bsica, que
presenta una excitacin mxima a 490 nm y una emisin mxima a 520 nm. Al
unirse el EDTA y el EGTA al calcio con una afinidad mayor que la calcena, se reduce la fluorescencia del complejo. El punto final se da cuando no se observa
fluorescencia. La cantidad de EGTA o de EDTA utilizado ser, entonces, proporcional a la concentracin de calcio.
Figura 7.3. Estructuras de la calcena, el
EDTA y el EGTA.
Otra forma eficaz de determinar calcio en una muestra biolgica es por dilucin isotpica. Resulta muy adecuada ya que el calcio muchas veces est en
cantidades nfimas en los organismos vivos y forma parte de mezclas con otros
compuestos similares, por lo que los mtodos convencionales no permiten determinarlo con exactitud.
Determinacin de fsforo
Al igual que el calcio, el fsforo es uno de los elementos ms abundantes en los
seres vivos, y tambin forma parte de los huesos. Adems, el fsforo se encuentra combinado con un gran nmero de molculas biolgicas, desde lpidos (fosfolpidos) e hidratos de carbono, hasta protenas y cidos nucleicos.
Los mtodos de determinacin del fsforo ms utilizados son de tipo qumico-espectrofotomtrico y se basan en su capacidad de formar complejos con sales de molibdato, procedindose despus a la cuantificacin del molibdato que
ha reaccionado por reduccin, dando azul de molibdeno, que posee un mximo
de absorcin a 690 nm (ver Anexo de Mtodos en el CD). Se utilizan diferentes
agentes para reducir el complejo de fosfomolibdeno; entre ellos pueden citarse
el sulfato de metil-p-aminofenol, el cido 1-amino-2-naftol-4-sulfnico (ANS), y
el cido ascrbico. Debe evitarse la presencia en las muestras de citrato, oxalato
o EDTA y de ciertos pigmentos como la bilirrubina. Las muestras de sangre deben ser desproteinizadas con cido tricloroactico, debindose evitar la hemolisis en este tipo de muestras. Es conveniente acidificar las muestras de orina para
evitar problemas de precipitacin a pH alcalino.
102
Determinacin de sodio y potasio

Tanto el sodio como el potasio son los principales cationes del lquido extracelular e intracelular y se ven influidos por cualquier cambio en el metabolismo y en
el equilibrio hdrico del organismo.
El mtodo ms utilizado de determinacin de sodio y potasio es la espectrofotometra de emisin a la llama. Se utiliza una llama de aire y propano a
1.925 oC. Para la cuantificacin se utiliza cesio o litio como patrn interno, determinndose la emisin a 589 nm para el sodio, a 768 nm para el potasio, a
671 nm para el litio y a 852 nm para el cesio.
Determinacin de hierro
El hierro es un elemento esencial para el hombre, ya que forma parte de los grupos prostticos de muchas protenas, por ejemplo hemoprotenas como la hemoglobina y la mioglobina, flavoprotenas, etc. Sus niveles estn regulados al
nivel de la absorcin intestinal.
Al formar parte de protenas, su determinacin requiere una desproteinizacin previa de la muestra para liberarlo, siendo el cido tricloroactico el agente
desproteinizante utilizado. Su cuantificacin puede realizarse tanto por mtodos
de emisin atmica como por mtodos qumicos espectrofotomtricos, al reaccionar con un reactivo y producir un cromforo. Por ejemplo, la batofenantrolina (Figura 7.4) forma un complejo de color rojo con el hierro, por la presencia
del grupo N=CC=N, que puede cuantificarse por su absorbancia a 540 nm.
El hierro tambin forma un complejo con la ferrozina (Figura 7.4), de color magenta, que puede cuantificarse a 562 nm. Ambos mtodos requieren una reduccin previa del Fe3+ a Fe2+.
Figura 7.4. Estructura de la

batofenantrolina y de la ferrozina.
103
Mtodos de determinacin de aminocidos

INTRODUCCIN
Estructura de los aminocidos
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS TOTALES
Mtodo de la ninhidrina
Reaccin de Sanger
Reaccin del fenilisotiocianato
Mtodo del o-ftaldehdo
Reaccin de la fluorescamina
Reaccin del cloruro de dansilo
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDIVIDUALES
104
8
INTRODUCCIN
Los aminocidos son las molculas bsicas a partir de las cuales se construyen las
protenas. Este grupo de molculas se puede analizar, tanto cualitativa como
cuantitativamente, utilizando diferentes mtodos. La eleccin de un mtodo determinado depende del objetivo del estudio.
As pues, por una parte, existen mtodos para la determinacin del contenido total de aminocidos en una muestra. Los diferentes procedimientos utilizados para el aislamiento y determinacin de los aminocidos totales se
fundamentan en las propiedades qumicas y fsicas de stos que les confieren caractersticas diferenciales respecto del resto de biomolculas. Cabe comentar
que, a la hora de detectarlos y cuantificarlos, los aminocidos, en general, no
presentan una caracterstica fsica que sea fcilmente mensurable, a excepcin
de los tres aminocidos aromticos: fenilalanina, triptfano y tirosina. Por tanto,
las tcnicas para la determinacin de aminocidos totales se fundamentan en
hacerles adquirir una caracterstica mensurable. Como en otras ocasiones, pueden utilizarse los mtodos qumicos para desarrollar compuestos derivados de
aminocidos que absorban energa en la regin ultravioleta-visible del espectro.
Por otra parte, existen tambin mtodos que permiten la determinacin de
un aminocido concreto, as como mtodos que permiten la cuantificacin de
cada aminocido de forma individual. Estos mtodos se basan en las caractersticas que diferencian los aminocidos entre s.
Por todo ello, conviene repasar la estructura y las caractersticas qumicas y fsicas de los aminocidos antes de explicar los mtodos que se pueden utilizar
para su determinacin.
Estructura de los aminocidos

Los aminocidos son molculas orgnicas de peso molecular relativamente bajo
que contienen, por lo menos, un grupo carboxilo (COOH) y un grupo amino
(NH2) unidos a un mismo tomo de carbono al que, adems, se encuentra uni105
Captulo 8
da una cadena lateral (grupo R) diferente para cada aminocido. Este carbono,
se denomina genricamente carbono alfa (CD). As, los aminocidos responden a
la frmula general:
Las diferencias entre los distintos aminocidos se deben a la naturaleza de

su cadena lateral (R), que es la que confiere su individualidad a cada aminocido. A partir de la naturaleza qumica de la cadena lateral, se pueden predecir
las propiedades de un aminocido en particular; conociendo las propiedades
de un aminocido, se puede identificar el grupo R y, por tanto, el aminocido.
Los aminocidos se suelen clasificar en funcin de la polaridad de su cadena lateral:
Aminocidos de cadena lateral apolar (Figura 8.1)
Aminocidos de cadena lateral polar (Figura 8.2)
Aminocidos de cadena lateral bsica (Figura 8.3)
Aminocidos de cadena lateral cida (Figura 8.4)
Figura 8.1. Aminocidos de cadena lateral

no polar (hidrofbicos).
Debido a su estructura, los aminocidos no absorben energa en la regin

del espectro ultravioleta-visible, con las excepciones de la fenilalanina, el
triptfano y la tirosina, que absorben energa a longitudes de onda entre 180 y
280 nm.
106

polar (hidroflicos).

bsica.

cida.
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN

DE AMINOCIDOS TOTALES
Los reactivos que se utilizan para la determinacin de los aminocidos totales
son aquellos capaces de reaccionar con los grupos funcionales caractersticos de
estas molculas. Los aminocidos se diferencian del resto de biomolculas por
presentar el grupo D-amino respecto al grupo carboxilo, de manera que los mtodos generales de determinacin de todos los aminocidos se fundamentan en
107
Captulo 8
el uso de compuestos que reaccionen con dicho grupo D-amino. De esta manera los aminocidos adquieren una caracterstica que puede medirse y que
adems es proporcional a la cantidad de aminocidos presentes en una muestra.
Existen varios reactivos que reaccionan con los aminocidos de manera
especfica, confirindoles caractersticas apropiadas para su deteccin. Estos reactivos provocan la aparicin de derivados de aminocidos coloreados, fluorescentes o radiactivos y pueden utilizarse tanto con fines cualitativos como
cuantitativos. La mayora de los reactivos que se utilizan para la determinacin
de aminocidos totales pueden provocar la aparicin de interferencias debidas a
la presencia de protenas, que tambin pueden reaccionar con ellos. As pues,
para la determinacin de aminocidos totales, las muestras suelen desproteinizarse previamente. Por lo tanto, la mayora de los mtodos analticos para aminocidos incluyen una primera etapa de desproteinizacin, que puede
realizarse, como ya se ha comentado para el caso de las muestras de sangre (ver
captulo 4), por diferentes mtodos; por ejemplo, provocando la precipitacin
de las protenas por un aumento de la fuerza inica del medio, o bien con cidos, con disolventes orgnicos, o por la accin del calor (Figura 8.5), las protenas as precipitadas pueden separarse por filtracin o centrifugacin.
Figura 8.5. Algunos agentes caotrpicos
utilizados en la desproteinizacin de
muestras.
Tambin se han desarrollado mtodos que permiten la desproteinizacin

por filtracin directamente, utilizando filtros de pequeo tamao de poro que
permiten el paso de los aminocidos libres y no as de las protenas y de los
pptidos.
Mtodo de la ninhidrina
El mtodo de la ninhidrina permite la determinacin de aminocidos que presentan un grupo carboxilo y un grupo amino libres. Es una reaccin general para
todos los aminocidos, excepto para la prolina y la hidroxiprolina, que son iminocidos (Figura 8.6).
108

Figura 8.6. Estructura de los iminocidos
prolina e hidroxiprolina.
La ninhidrina hidrato de tricetohidrilideno reacciona con los aminocidos

en medio cido (pH 3-4) y en caliente, produciendo amonaco, dixido de carbono y un complejo de color prpura-azulado dicetohidrindilideno (Figura
8.7). Este compuesto de color azul-prpura absorbe a una longitud de onda de
570 nm, siendo la cantidad de color proporcional a la cantidad de aminocidos
presentes en la muestra.
Figura 8.7. Reaccin de la ninhidrina. La
reaccin global de los aminocidos con la
ninhidrina tiene lugar en dos etapas: 1) la
ninhidrina provoca la descarboxilacin
oxidativa de los aminocidos,
produciendo amonaco y reducindose;
2) el amonaco se combina con una
molcula de ninhidrina reducida y otra
molcula de ninhidrina, dando un
complejo de color prpura-azulado. La
reaccin transcurre a pH cido (3-4) y a
elevadas temperaturas.
La mayora de los aminocidos reaccionan con la ninhidrina a temperatura

ambiente formando un complejo azul que adquiere una tonalidad prpura
por el calor. La determinacin de los aminocidos requiere la eliminacin
previa de sustancias como protenas, amonaco y urea, que pueden reaccionar con el reactivo, interfiriendo en la determinacin cuantitativa de los aminocidos.
Reaccin de Sanger
El reactivo de Sanger, el flor2,4dinitrobenceno, reacciona en medio bsico
con el grupo amino libre de un aminocido o de un pptido para dar un dinitrofenil derivado (DNP) de color amarillo (Figura 8.8).
Figura 8.8. Reaccin del reactivo de
Sanger con un aminocido.
El coeficiente de extincin molar (H) de cada aminocido vara. Aunque el

mximo de absorcin est por debajo de 420 nm, las lecturas a 420 nm dan mejores resultados para una mezcla de aminocidos.
109
Captulo 8
Reaccin del fenilisotiocianato

Los aminocidos son capaces de reaccionar en medio bsico con el reactivo de
Edman, el fenilisotiocianato (PITC), produciendo los feniltiocarbamil aminocidos (Figura 8.9), que presentan un mximo de absorcin a 254 nm.
Figura 8.9. Reaccin del
fenilisotiocianato (PITC) con un
aminocido para obtener el
correspondiente feniltiocarbamiol
derivado (PTC-aa).
Mtodo del o-ftaldehdo

Los aminocidos pueden reaccionar con el o-ftaldehdo, en presencia de un reductor fuerte, el 2-mercaptoetanol, en condiciones alcalinas (pH 911), produciendo un compuesto fluorescente con un mximo de excitacin a 340 nm y
con un mximo de emisin a 455 nm (Figura 8.10).
Figura 8.10. Reaccin de los aminocidos
con o-ftaldehdo, en la que se producen
los OPA-aminocidos.
La reaccin se realiza rpidamente sin necesidad de calentamiento. El mtodo es aproximadamente 10 veces ms sensible que el de la ninhidrina y se
utiliza especialmente en la cuantificacin de aminocidos en analizadores automticos.
La prolina y la hidroxiprolina deben tratarse previamente con un agente oxidante adecuado, como el hipoclorito sdico, para que estn en condiciones de
reaccionar con el o-ftaldehdo. De la misma forma, la cistena y la cistina deben
oxidarse a cido cisteico.
Reaccin de la fluorescamina
Los aminocidos, al ser aminas primarias, pueden reaccionar con la fluorescamina en medio bsico, dando un derivado fluorescente con un mximo de excitacin a 390 nm y con un mximo de emisin a 475 nm (Figura 8.11). El producto
formado es inestable en disoluciones acuosas, por lo que el reactivo se prepara
en acetona. La reaccin tiene lugar rpidamente a temperatura ambiente.
Figura 8.11. Reaccin de los aminocidos
con la fluorescamina, en la que se forma
un compuesto fluorescente.
110
Las aminas secundarias, como la prolina y la hidroxiprolina, no reaccionan

con la fluorescamina, a menos que se conviertan en aminas primarias previamente, lo que puede llevarse a cabo mediante su reaccin con N-clorosuccinimida.
Reaccin del cloruro de dansilo

Los aminocidos, al presentar un grupo amino terminal, pueden reaccionar con
cloruro de dansilo en medio bsico (pH = 9,5), para producir un compuesto
fluorescente que puede utilizarse para su determinacin (Figura 8.12).
Figura 8.12. Reaccin del cloruro de
dansilo con los aminocidos, en la que se
produce un derivado fluorescente.
El color de emisin fluorescente depende del aminocido que reaccione con

el cloruro de dansilo, por lo que no hay una longitud de onda donde puedan
determinarse todos los aminocidos, aunque se suele utilizar una longitud de
onda de excitacin a 360 nm y una de emisin a 480 nm.
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN

DE AMINOCIDOS INDIVIDUALES
Hay diferentes mtodos que permiten la cuantificacin de un aminocido determinado; algunos ejemplos son los que aparecen a continuacin.
Determinacin de tirosina. La tirosina reacciona con el 1-nitroso-2-naftol en
presencia de nitrato sdico para formar un compuesto inestable de color rojo,
que se convierte, al calentar el medio, y en presencia de cido ntrico, en un
compuesto fluorescente amarillo. Una vez eliminado el reactivo en exceso, la
fluorescencia se mide a una longitud de onda de excitacin de 460 nm y 570
nm de emisin.
Determinacin de fenilalanina. La fenilalanina reacciona con la ninhidrina en
presencia de un dipptido (glicil-leucina o leucil-alanina) para formar un producto fluorescente. La fluorescencia se incrementa por la adicin de un reactivo, el
tartrato de cobre alcalino, ajustado el pH a 5,8. La florescencia se mide a una
longitud de onda de excitacin de 365 nm y a una longitud de onda de emisin
de 515 nm.
Determinacin de cistena. Los aminocidos sulfurados se pueden determinar
provocando su reaccin con nitroprusiato sdico, que produce un compuesto
rojo-prpura. A travs de esta reaccin pueden determinarse la cistena y la homocistena. La misma reaccin puede utilizarse para la determinacin de cistina
y homocistina, pero previamente deben de reducirse por la accin de cianuro
sdico.
111
Tcnicas de separacin: cromatografa

INTRODUCCIN
PRINCIPIO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN. TCNICAS FSICAS
Polaridad
Volatilidad
Solubilidad
Adsorcin
Carga
Tamao
DISEO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN DE MOLCULAS

TCNICAS CROMATOGRFICAS
Tcnicas cromatogrficas basadas en la polaridad
Cromatografa lquido-slido: cromatografa de adsorcin

Cromatografa gas-lquido: GLC
Cromatografa lquido-lquido. Cromatografa lquida de alta precisin: HPLC
Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de permeabilidad. Cribado molecular
112
9
INTRODUCCIN
Las tcnicas de separacin de molculas explotan las diferencias entre las caractersticas fsicas de los compuestos que forman una muestra biolgica, ya que
normalmente se asemejan en sus propiedades qumicas y no pueden diferenciarse por mtodos qumicos. As pues, los mtodos basados en las propiedades
qumicas, no permiten, en muchos casos, una buena diferenciacin de las molculas a estudiar, ya que, en el caso de las molculas biolgicas, muchas de ellas
presentan idnticos grupos funcionales. No obstante, aunque distintas molculas
muestren unos mismos grupos funcionales, no son iguales, ya que se diferencian
en distintos aspectos fsicos, entre los que se pueden sealar el tamao (peso
molecular), la forma (por ejemplo, en las protenas, debida a su plegamiento estructura tridimensional), la polaridad de una molcula (por ejemplo, las cadenas laterales de los aminocidos presentan diferente polaridad polar, apolar,
con carga), la carga neta que presenta una molcula a un determinado pH, etc.
De esta forma, las tcnicas fsicas son aquellas que tratan de separar las molculas aprovechando las diferentes propiedades fsicas que stas presentan. Estos
mtodos normalmente se acoplan a mtodos qumicos, que permitirn la cuantificacin de cada uno de los compuestos de la muestra biolgica, una vez separados. Cabe comentar que la reaccin qumica para la deteccin de los
compuestos de inters puede realizarse con anterioridad o con posteridad a la
separacin de los compuestos de la mezcla.
Las muestras biolgicas son una compleja mezcla de biomolculas, por lo
que la determinacin cualitativa o cuantitativa de las mismas requiere el fraccionamiento y separacin de las diferentes clases de biomolculas presentes. Las
primeras tcnicas de anlisis para la identificacin de molculas se fundamentaron en la solubilidad de las diferentes biomolculas en los distintos disolventes.
As, los lpidos se definen como aquellas sustancias biolgicas solubles en disolventes orgnicos e insolubles en disolventes polares. Las protenas se pueden aislar utilizando agentes caotrpicos, que provocan su precipitacin, lo que
permite separarlas por centrifugacin o filtracin del resto de biomolculas. Los
113
Captulo 9
cidos nucleicos pueden aislarse utilizando extracciones con cloroformo:fenol,

que posibilitan su separacin de lpidos y protenas al recuperarlos en la fase
acuosa de la extraccin. Posteriormente se pueden separar de las molculas polares, mediante precipitacin con isopropanol.
Estos procedimientos de aislamiento de los diferentes grupos de biomolculas
aprovechan, por lo tanto, la solubilidad de estas molculas en distintas mezclas
de disolventes. Sin embargo, no permiten discriminar entre molculas que presenten unas propiedades de solubilidad parecidas en los mismos disolventes,
como pueden ser los lpidos entre s, los diferentes cidos nucleicos, los aminocidos individuales, los diferentes carbohidratos, etc. La solucin a este problema
se encuentra en repetir el proceso de separacin n veces, lo que facilita una mejor discriminacin de molculas similares entre s, o bien en utilizar otras propiedades fsicas como principio de separacin, por ejemplo, el tamao, el punto
isoelctrico, la carga, la forma, etc.
PRINCIPIO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN.

TCNICAS FSICAS
Las tcnicas fsicas, como su nombre indica, se fundamentan en las diferencias
fsicas entre las distintas biomolculas, debido a que muchas veces las propiedades qumicas no son lo suficientemente discriminadoras para poder diferenciarlas. Entre las propiedades fsicas que pueden explotarse para la separacin de las
biomolculas, podemos citar la polaridad (que determina la solubilidad, la volatilidad y la adsorcin sobre slidos de un compuesto), el tamao de las molculas,
la carga, la afinidad, etc.
Polaridad
La polaridad es una caracterstica de las molculas, que depende del nmero de
enlaces polarizados que presentan y de su distribucin. Un enlace est polarizado cuando hay una distribucin desigual de los electrones entre los dos tomos
que lo forman, consecuencia de la diferente electronegatividad (caracterstica
que mide la capacidad de un tomo para aceptar los electrones de valencia) de
los tomos que intervienen en el enlace. As, la electronegatividad de los tomos
ms abundantes en las biomolculas es:
Oxgeno
Nitrgeno
Carbono
Azufre
Fsforo
Hidrgeno
Figura 9.1. Representacin de las

diferentes densidades de carga que se
establecen en una molcula de agua.
114
3,5
3,0
2,5
2,5
2,1
2,1
El ejemplo ms conocido de molcula polar es el agua, molcula que presenta dos enlaces polarizados OH. Debido a la mayor electronegatividad del oxgeno respecto al hidrgeno (3,5 frente a 2,1), que provoca que los electrones del
enlace OH se encuentren ms cercanos al oxgeno que al hidrgeno, existe una
cierta densidad de carga negativa sobre el oxgeno (0,82) y una cierta densidad
de carga positiva sobre los dos hidrgenos (+0,41 sobre cada uno) (Figura 9.1).
Esta distribucin de la carga en la molcula determina las interacciones que puede establecer con otras molculas.
La polaridad de una molcula determina las interacciones que puede establecer con otras. Las molculas polares pueden interaccionar con otras molculas polares, mientras que las molculas apolares establecen interacciones con
molculas apolares. Cuanto ms polar sea una molcula, mayor ser la fuerza de
interaccin que puede establecer con otras molculas polares, determinndose
de esta manera la volatilidad de un compuesto (que depender de la capacidad
de interaccin de sus molculas entre s), la solubilidad (dependiente de su interaccin con las molculas de disolvente), la adsorcin (que depender de su capacidad de interaccin con las molculas de un slido), etc.
Volatilidad
La volatilidad es la tendencia que tiene un compuesto a pasar al estado gaseoso.
Si la fuerza que mantiene unidas entre s a molculas iguales es pequea, la volatilidad es elevada. Un ejemplo es el metano (CH4); ya que una molcula de
metano es pequea y presenta enlaces muy poco polarizados, se establecen interacciones dbiles entre las molculas, por lo que a temperatura ambiente el
metano se encuentra en estado gaseoso. En cambio, la molcula de H2O, que
presenta dos enlaces polarizados, tiene la capacidad de establecer interacciones
ms fuertes con otras molculas de agua, por lo que, a diferencia del metano, el
agua se encuentra en estado lquido a temperatura ambiente.
Los puntos de ebullicin y fusin estn determinados por la polaridad de los
compuestos, de forma que sern ms altos cuanto mayor sea la fuerza de interaccin entre sus molculas. Los puntos de fusin y ebullicin son muy altos en
los compuestos con enlaces inicos, disminuyendo en aquellos que contienen
enlaces covalentes. Tambin dependen de la polaridad de los tomos: cuanto
ms polarizados se encuentran los enlaces, mayores son los puntos de fusin y
de ebullicin (Figura 9.2).
Figura 9.2. Puntos de fusin y ebullicin
de diferentes compuestos y relacin con
la polaridad de los enlaces entre
molculas (la polaridad aumenta de arriba
hacia abajo en la figura).
El tamao de las molculas tambin influye en los puntos de ebullicin y fusin: cuanto mayor es el tamao de una molcula (cuantos ms tomos la forman), ms puntos de unin pueden establecerse entre las distintas molculas de
un compuesto, y mayores son sus puntos de ebullicin y fusin (Figura 9.3).
Solubilidad
La solubilidad de una molcula en un disolvente depende de la polaridad de la
misma y del disolvente. Cuando los dos presentan un grado de polaridad similar,
pueden interaccionar y mezclarse; mientras que, si presentan polaridades diferentes, no pueden interaccionar y se mantienen separados, ya que las molculas
115
Captulo 9
Figura 9.3. Puntos de fusin y de
ebullicin de algunos hidrocarburos. Los
hidrocarburos se han ordenado en la
figura segn orden creciente de tamao.
de disolvente y soluto preferirn interaccionar entre s, antes que con el soluto o

el disolvente respectivamente. As, las molculas polares son solubles en disolventes polares como el agua; mientras que las molculas que no presentan enlaces polarizados no son solubles en agua, pero s en disolventes apolares
(benceno, hexano, cloroformo, etc.).
Adsorcin
Otra propiedad fsica interesante de las molculas, que tambin depende de la
polaridad, es la adsorcin, que se define como el fenmeno por el cual determinadas molculas interaccionan con las molculas de un soporte slido. La interaccin entre el slido (adsorbente) y la molcula es mayor cuanto ms similares
son sus polaridades.
Teniendo en cuenta todas estas distintas propiedades (volatilidad, solubilidad
y adsorcin), que van a depender, en mayor o menor grado, de la polaridad de
las molculas, pueden disearse mtodos para separar mezclas de molculas
fundamentados bsicamente en su distinta polaridad.
Carga
Algunas biomolculas presentan grupos cidos y/o bsicos dbiles y, en consecuencia, pueden presentar carga en funcin del pH del medio en que se encuentren. Por lo tanto, la variacin del pH del medio puede utilizarse como
herramienta para forzar a que la molcula presente o no carga, y as separarla de
manera diferencial del resto de molculas que se encuentran en una misma
muestra.
Tamao
A veces la diferencia bsica entre determinadas biomolculas radica en su tamao, como sucede, por ejemplo, en distintas especies de ARNm al compararlas
entre s o entre diferentes protenas que puedan ser similares en otras caractersticas. As pues, la diferencia de tamao es tambin una propiedad que puede
utilizarse para la separacin de biomolculas. De esta manera, las molculas que
difieren mucho en tamao pueden separarse, por ejemplo, por ultracentrifuga116
cin o por dilisis. Si la diferencia de tamao es relativamente pequea, pueden

utilizarse tcnicas de cribado molecular o filtracin en gel.
En resumen, las diferentes tcnicas fsicas de separacin basan sus principios
en estas propiedades fsicas comentadas: polaridad, carga, tamao, etc. En algunas tcnicas tan slo se hace uso de una de estas propiedades fsicas, mientras
que, en otras, la participacin de varias de estas propiedades fsicas permite una
mayor resolucin en la separacin de las molculas que forman parte de una
muestra biolgica.
DISEO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN DE MOLCULAS

Las tcnicas de separacin de molculas se han diseado de manera que la separacin se da por la diferente velocidad de migracin de las molculas a separar en
un medio determinado. Normalmente hay una fuerza impulsora del movimiento
de las molculas, a la que se opone una fuerza que retarda dicho movimiento,
siendo la fuerza resultante funcin de las caractersticas fsicas de las molculas y
del medio en el que se realiza la separacin (Figura 9.4). De esta manera se permite la separacin de las diferentes molculas que forman la mezcla.
Figura 9.4. Representacin del principio
de separacin de molculas. Sobre stas
actan dos tipos de fuerzas: una general
que impulsa el movimiento (fuerza
impulsora), y otra que se opone a ella y
retarda el movimiento (fuerza
retardadora). Adems, este segundo tipo
de fuerza es funcin de las caractersticas
fsicas de cada compuesto y del medio, de
manera que, a lo largo del tiempo (1, 2 y
3 en la figura), las molculas sobre las que
se ejerce una mayor fuerza neta migran
ms que las molculas sobre las que se
ejerce una menor fuerza neta.
El proceso puede llevarse a cabo en un sistema en una sola fase, es decir, la

molcula se encuentra distribuida en un nico medio. No obstante tambin
existen sistemas en dos fases (Figura 9.5), distribuyndose las molculas entre
dos fases o medios que no pueden mezclarse; uno de los cuales est en movimiento (fase mvil) y es el que impulsa el movimiento de las molculas a separar, mientras que el otro medio se encuentra inmvil (fase estacionaria) y,
adems, se opone al movimiento, estableciendo una fuerza de retardo. En este
sistema, las fases se encuentran en contacto, y las molculas a separar se distribuyen entre las dos fases. La afinidad que tienen las diferentes molculas de la
mezcla por cada una de las fases es la que determina su separacin.
117
Captulo 9
Figura 9.5. Separacin de molculas en
un sistema de dos fases inmiscibles. Hay
una fuerza impulsora del movimiento de
las molculas, que se ve impedido al
distribuirse stas entre las dos fases: mvil
(oscura) y estacionaria (clara). Cuanto
mayor sea la afinidad de las molculas
por la fase estacionaria, ms lentamente
migran, por lo que se separan a lo largo
del tiempo (1, 2 y 3 ).
Se pueden utilizar diferentes fuerzas para impulsar el movimiento de las

molculas: gravedad, electrocintica o hidrodinmica. La fuerza que retarda el
movimiento puede deberse a fricciones moleculares, a interacciones electroestticas, a que algunas molculas tengan que seguir un camino ms largo, etc. El resultado de la separacin de las diferentes molculas es funcin de las
caractersticas fsicas de las molculas (polaridad, carga, tamao o forma).
Como fases mviles pueden utilizarse lquidos o gases, mientras que las estacionarias pueden ser lquidos o slidos.
TCNICAS CROMATOGRFICAS
Tcnicas cromatogrficas basadas en la polaridad
Las tcnicas cromatogrficas basadas en la polaridad son tcnicas que permiten la
separacin de las molculas de una mezcla biolgica en funcin de la distinta polaridad de stas. En el proceso se establece la distribucin de las molculas entre
dos fases (una mvil y la otra estacionaria) que se encuentran en contacto y que
tienen diferente polaridad; como ejemplos, dos lquidos inmiscibles, un lquido y
un slido o un lquido y un gas. De esta manera, segn la polaridad de la molcula, sta establece interacciones ms fuertes con una de las dos fases, por lo que
un nmero mayor de molculas de un mismo tipo se encuentran en dicha fase.
El principio de la separacin cromatogrfica es el reparto de un soluto entre
dos fases inmiscibles (lquido:lquido, gas:lquido o slido:lquido). Este reparto
es funcin de la afinidad de las molculas por cada una de las fases, y se evala
con el coeficiente o constante de reparto (K), que mide cmo se distribuye un
compuesto entre las dos fases inmiscibles. En el caso de que este reparto se d
entre dos lquidos, 1 y 2, se define:
K
concentracin en el disolvente 1
concentracin en el disolvente 2
En un solo reparto pueden separarse dos sustancias muy distintas, A y B. Es

decir, si A se distribuye al 100% en el disolvente 1, mientras que B se distribuye
118
al 100% en un disolvente 2, al ser los dos lquidos inmiscibles, basta con separarlos para recuperar A en el disolvente 1 y B en el disolvente 2. Este es, por ejemplo, el principio de la extraccin con disolventes orgnicos de los lpidos con
respecto del resto de compuestos de una muestra. Esta tcnica, utilizando nicamente dos disolventes de polaridad distinta, no permite separar sustancias con
polaridades similares.
A partir de esta idea, si el proceso de extraccin con disolventes se repite n
veces, puede utilizarse para separar molculas con polaridades ms similares. El
procedimiento se simplifica si uno de los dos medios en los que se realiza el reparto est inmvil, por ejemplo una columna rellena de un slido (adsorbente) a
travs de la cual pasa un disolvente (eluyente), que es la fase mvil. A lo largo
del recorrido de eluyente a travs de la columna, se establecen un gran nmero
de repartos; cada una de las distintas zonas donde se establece el reparto se conoce como plato terico (Figura 9.6). De esta manera, se puede conseguir separar sustancias con polaridades similares (Figura 9.7).
El trmino cromatografa engloba las tcnicas en las que las molculas de una
mezcla, disueltas en una fase mvil (que se mueve por accin de alguna fuerza,
bien sea gravitatoria o hidrodinmica), se van desplazando a travs de una fase
estacionaria (que ejerce la fuerza de retardo), establecindose distintos procesos
de reparto entre las dos fases. El trmino cromatografa fue utilizado por primera
vez por el botnico ruso M. Tswett, en 1906, para designar la tcnica de separacin de pigmentos vegetales por una columna de vidrio rellena de carbonato
clcico utilizando disolventes para eluir los diferentes pigmentos, de manera que
se obtenan en el proceso una serie de bandas horizontales coloreadas.
Hay diferentes tipos de cromatografa de polaridad dependiendo de las caractersticas de las fases mvil y estacionaria que se utilizan. El estado de las di-
Figura 9.6. Fundamento del reparto en

columna. La columna rellena de un slido se
ha dividido, de forma arbitraria, en 20 platos
tericos pueden llegarse a establecer 20
repartos a lo largo del recorrido del eluyente.
Se depositan 1.000 molculas de A en la
columna, con una constante de reparto de 1
(entre la fase lquida color oscuro y la slida
color claro). En un primer reparto, las 1.000
molculas se distribuyen: 500 en la fase mvil y
500 en la fase estacionaria. En la segunda
transferencia se obtiene una distribucin
250:250 en el primer plato y 250:250 en el
segundo plato. Despus de 20 transferencias,
las distribuciones mayoritarias estn en torno a
los platos 10 y 11. El reparto de las molculas
de A se indica en cursiva. Tambin se depositan
en la columna 1.000 molculas de B, con una
constante de reparto de 4 (entre la fase lquida
color claro y la slida color oscuro). En el
primer reparto de las molculas de tipo B, las
1.000 molculas se distribuyen: 800 en la fase
mvil lquido y 200 en la fase estacionaria
slido. En la segunda transferencia, se
obtiene un reparto de 160:40 en el primer
plato y 640:160 en el segundo plato. Despus
de 20 transferencias, las distribuciones
mayoritarias del compuesto B estn en torno a
los platos 16 y 17.
Figura 9.7. Cromatograma de elucin de las

muestras A y B del ejemplo de la figura 9.6.
119
Captulo 9
ferentes fases (slido, lquido o gas) determina el principio de la separacin (Figura 9.8).
Figura 9.8. Diferentes tipos de
cromatografa de polaridad, fases y
principio de la separacin.
En la cromatografa de adsorcin, las molculas retardan ms su movimiento

cuanto ms retenidas quedan por el slido adsorbente. En la cromatografa lquido-lquido, las molculas migran ms lentamente cuanto ms solubles son
en la fase estacionaria y menos en la fase mvil. En la cromatografa de gases,
migran ms rpidamente las molculas ms voltiles, que tendrn menos afinidad por la fase estacionaria. Debe recordarse que todas estas propiedades dependen de la polaridad de las molculas y de los medios en los que se realiza la
separacin.
Las aplicaciones de las diferentes cromatografas dependen de las distintas fases alternativas que se puedan utilizar. As, la cromatografa de adsorcin est limitada a unos pocos adsorbentes, mientras que para la cromatografa de gases y
la cromatografa lquido-lquido pueden elegirse un gran nmero de fases estacionarias. En estos momentos, la cromatografa lquido-lquido, en su variante de
cromatografa lquida de alta precisin (HLPC), es la que ofrece la mayor flexibilidad, con una amplia gama de fases estacionarias y un nmero casi ilimitado de
fases mviles que pueden utilizarse.
Cromatografa lquido-slido: cromatografa de adsorcin

El principio de la cromatografa lquido-slido es la separacin de los compuestos por su distribucin entre un lquido (fase mvil) y un slido (fase estacionaria). As, cuando una disolucin que contiene distintos compuestos (con distintas
polaridades) se pone en contacto con un slido finamente dividido, las molculas de la disolucin interaccionan con las del slido. Dependiendo de su polaridad, se produce la adsorcin de algunos de los elementos de la mezcla.
Se pueden utilizar diferentes tipos de adsorbentes, que presentan distintos
grados de polaridad. Hay adsorbentes polares, como el gel de slice, la almina,
la celulosa, el almidn y las poliamidas; o apolares, como el carbn activo, las
resinas XAD (polmeros de estireno o vinilo), el acetato de celulosa, etc. El slido
debe estar finamente dividido para que pueda establecerse el mximo nmero
de interacciones.
La eleccin de la fase estacionaria (que provoca la fuerza retardadora) se realiza en funcin de la polaridad de las molculas a separar. Si se pretenden aislar
molculas polares, se elige una fase estacionaria polar, para que de esta manera
se pueda establecer una fuerza de retardo elevada que permita la separacin; si
la fase estacionaria fuera apolar, no podran separarse los elementos de la mezcla, al no producirse ninguna fuerza de retardo. La fase mvil debe presentar polaridad contraria a la de la estacionaria, ya que si presentara polaridad similar a
la de la estacionaria tampoco podra establecerse la fuerza retardadora y se
eluiran simultneamente todas las molculas de la mezcla. Se puede ir variando
la polaridad del disolvente a lo largo del proceso cromatogrfico para permitir la
120
elucin diferencial de todos componentes de la mezcla. La polaridad de un disolvente se mide mediante varios parmetros: uno es la constante dielctrica
(que es mayor cuanto ms polar es el disolvente); otro es lo que se conoce como
ndice de polaridad de Snyder (que tambin aumenta en concordancia con la
polaridad del disolvente) (Figura 9.9).
El nmero de adsorbentes que pueden utilizarse es pequeo (gel de slice,
almina, celulosa, almidn, resinas XAD, carbn activo, poliamidas, acetato de
celulosa). De hecho, la versatilidad en la separacin se debe a la gran cantidad
de mezclas de disolventes que se pueden realizar.
El diseo de la separacin por cromatografa de adsorcin puede realizarse
utilizando columnas o capas para inmovilizar la fase estacionaria.
Figura 9.9. Constante dielctrica e ndice
de polaridad de Snyder de diferentes
disolventes utilizados en la cromatografa
en columna. Valores elevados de la
constante dielctrica y del ndice de
polaridad de Snyder indican una
polaridad elevada del disolvente.
Cromatografa de adsorcin en columna

En la cromatografa de adsorcin en columna, el adsorbente se encuentra inmovilizado en una columna (Figura 9.10). El adsorbente, finamente dividido, se introduce en un tubo de vidrio, plstico o metal y est empaquetado de manera
que genere un lecho poroso que permita el paso del eluyente a travs de l, con
el fin de permitir el mximo de contacto entre las dos fases. El adsorbente queda
retenido en la columna colocando al final de la misma una placa porosa de vidrio o de lana de vidrio, que permite el paso del eluyente y no as del adsorbente. Se aade el eluyente a la columna, de manera que la columna est llena de
la fase mvil y de la estacionaria. La muestra que contiene los distintos componentes se deposita encima de la columna y se hace pasar ms eluyente. Los distintos compuestos de la mezcla se distribuyen entre las dos fases a medida que
son arrastrados por el eluyente (que cae, por ejemplo, por accin de la gravedad, o por el flujo generado por una bomba), de manera que los compuestos
con ms afinidad por el adsorbente (polaridad similar) migran ms lentamente
que los que tienen ms afinidad por el eluyente. Debe recordarse que, inicialmente, el eluyente y la columna deben tener polaridades distintas para permitir
la separacin, y que el adsorbente debe elegirse con la polaridad adecuada para
retener los diferentes componentes de la mezcla. La polaridad del disolvente
puede cambiarse a medida que avanza la cromatografa, de manera que los
compuestos ms adsorbidos por la fase estacionaria puedan irse eluyendo, debido a dos efectos: por un lado la cada vez mayor afinidad de los componentes de
Figura 9.10. Ejemplo de columnas para

cromatografa de adsorcin.
121
Captulo 9
la mezcla por el eluyente (puesto que se va cambiando por disolventes con polaridades distintas); y por otro lado el efecto de saturacin del eluyente sobre los
puntos de unin del adsorbente, al tener los dos una polaridad cada vez ms parecida. Este tipo de elucin se conoce como elucin en gradiente.
Los diferentes componentes de la mezcla pueden recuperarse de dos maneras. Una de ellas consiste en que, una vez separados los componentes en la columna, se deja secar sta; a continuacin, recortando distintas partes de la
columna, se pueden recuperar los componentes de la mezcla aislados y, posteriormente, pueden separarse del adsorbente utilizando el disolvente adecuado.
Otra manera es seguir aadiendo eluyente durante el proceso de la cromatografa, de modo que, recogiendo de forma fraccionada el eluyente que sale al final de la columna, se pueden ir recuperando los componentes de la mezcla por
separado.
La mayora de las veces, los elementos de la mezcla no poseen una propiedad que pueda ser detectada a simple vista (como el color), por lo que no puede apreciarse cmo van siendo eluidos. Lo que se suele hacer es recoger de
manera fraccionada el eluyente y aadir, a cada fraccin, un reactivo que permita la identificacin de los diferentes elementos de la muestra; esta misma reaccin puede utilizarse para cuantificar el componente eluido.
Este tipo de cromatografa suele utilizarse para el aislamiento de diferentes
elementos de una mezcla, como un mtodo alternativo a la extraccin con disolventes orgnicos. Puede utilizarse en el fraccionamiento de diferentes tipos de
molculas, como por ejemplo el fraccionamiento de las distintas clases de lpidos
(ver captulo 16).
Cromatografa de adsorcin en capa fina: TLC
La cromatografa en capa fina, tambin denominada TLC (Thin Layer Chromatography), es un tipo de cromatografa de adsorcin en la cual la fase mvil es lquida y sube por capilaridad a travs de una placa, en la que se ha depositado la
fase estacionaria, finamente dividida. Sobre la fase estacionaria se adsorben los
diferentes elementos de la mezcla que se pretenden separar. Esta tcnica se ha
utilizado frecuentemente para aislar molculas con un bajo peso molecular y
que se encuentren presentes en pequeas cantidades.
En este tipo de cromatografa de adsorcin, el adsorbente se encuentra dispuesto en una placa. En este caso debe aadirse al adsorbente un agente aglutinante, como el sulfato clcico, para facilitar su adherencia a la placa. La capa
de adsorbente se extiende uniformemente sobre un soporte liso e inerte, una
lmina de vidrio, plstico o aluminio. Actualmente las placas se compran ya
preparadas.
El procedimiento para realizar una cromatografa mediante la tcnica de TLC
es el siguiente: un pequeo volumen de la muestra (0,5-20 PL) se aplica con una
micropipeta o una jeringuilla en un extremo de la placa, dejando un pequeo
espacio entre el borde de la placa y la posicin donde se deposita la muestra; el
volumen de muestra se depone en varias veces y, entre deposicin y deposicin,
se seca el disolvente de la muestra con un secador. La placa se ha de situar en
una cmara de vidrio (cubeta) que contiene el disolvente o eluyente para la cromatografa, apoyada verticalmente en el fondo y procurando que la mancha de
muestra no quede dentro del eluyente. Previamente a la introduccin de la placa, la cubeta con el disolvente se mantiene cerrada para que el ambiente inte122
rior se sature con el vapor del disolvente por prdida de los componentes voltiles. Tras introducir la placa, se tapa la cubeta y se deja que tenga lugar la separacin de los compuestos a medida que el disolvente asciende por la placa por
capilaridad.
Puede mejorarse la resolucin de la separacin de los componentes de la
muestra efectuando una cromatografa bidireccional, de forma que distintos
componentes de la mezcla que migren exactamente hacia la misma posicin en
el primer desarrollo cromatogrfico, puedan separarse en un segundo desarrollo.
En tal caso, una vez la cromatografa se ha desarrollado en una direccin, la placa se saca de la cubeta y se deja secar; posteriormente se vuelve a desarrollar la
cromatografa en una direccin que forme ngulo recto con la del primer desarrollo (Figura 9.11), pero utilizando otro sistema de disolventes (ya que, si se utilizara el mismo sistema de disolventes que en el primer desarrollo
cromatogrfico, simplemente se conseguira el mismo resultado que en la primera etapa, pero dispuesto en diagonal). As, la muestra se encuentra de nuevo en
el extremo inferior de la cromatografa, pero sin estar en contacto directo con el
disolvente de la cubeta.
Figura 9.11. Cromatografa bidimensional.
Los diferentes componentes de la mezcla se pueden visualizar, bien porque

los compuestos separados presenten una caracterstica mensurable (color, fluorescencia o radiactividad), o bien porque se modifiquen al reaccionar con algn
reactivo que les confiera tal caracterstica (principio de los mtodos qumicos).
Hay reactivos generales, como son los vapores de iodo o el cido sulfrico caliente, que provocan la aparicin de manchas pardo-amarillentas y negruzcas
respectivamente. Tambin pueden utilizarse placas que presenten un indicador
fluorescente, de manera que, al colocar la placa bajo una luz ultravioleta, no se
observar fluorescencia precisamente all donde se encuentre un determinado
componente de la muestra. Segn el grupo de compuestos a analizar, pueden
utilizarse tambin determinados reactivos qumicos; por ejemplo, en el caso de
la separacin de aminocidos, puede utilizarse la ninhidrina, en el caso de fosfolpidos, molibdato amnico, etc.
Las manchas visualizadas pueden utilizarse para anlisis cualitativos; los diferentes componentes pueden identificarse comparando su migracin con una
muestra de referencia de composicin conocida. En ocasiones se utiliza el valor
Rf para la identificacin de las manchas, ya que representa el recorrido relativo
de un determinado componente en comparacin con el eluyente.
Rf =
Distancia recorrida por el compuesto

Distancia recorrida por el diluyente
123
Captulo 9
En principio este valor es constante para un compuesto y un eluyente dados,

independientemente de la distancia recorrida por el eluyente. Sin embargo, es
difcil normalizar todas las condiciones cromatogrficas, por lo que resulta complicado reproducir los valores de Rf. Adems, en dos compuestos que tengan valores de Rf iguales, ste no es una prueba concluyente de identidad.
Adems de un anlisis cualitativo, esta tcnica permite un anlisis cuantitativo. Las manchas pueden separarse de la placa raspndolas, recortndolas o
eluyndolas con un disolvente adecuado para, posteriormente, llevar a cabo la
determinacin cuantitativa de los componentes, ya por separado.
La cromatografa en capa fina se ha utilizado para la separacin de diferentes
compuestos como aminocidos, carbohidratos, lpidos, colorantes, drogas, etc.
Pueden verse algunos ejemplos en el captulo de determinacin de aminocidos
y en los captulos dedicados a la determinacin de carbohidratos y lpidos.
Cromatografa gas-lquido: GLC

El principio de la cromatografa gas-lquido (GLC, Gas-Liquid Chromatography)
tambin llamada cromatografa de gases (GC, Gas Chromatography) es la distribucin de los compuestos a separar entre dos fases inmiscibles, una fase estacionaria lquida y una fase mvil gaseosa. La fase estacionaria se encuentra
impregnando un soporte reticulado inerte, contenido en una columna de vidrio
o acero inoxidable. A travs de la columna circula la fase mvil, que es un gas
inerte (nitrgeno, helio o argn). La separacin de los componentes de la mezcla
se realiza en funcin de su afinidad por las dos fases, que en este caso viene determinada por su volatilidad, de manera que cuanto ms voltil es el compuesto,
ms afinidad tiene por la fase mvil. La resolucin cromatogrfica se incrementa
al estar la columna dentro de un horno, lo que permite que la temperatura vaya
aumentando durante el transcurso de la separacin, de manera que los componentes de la muestra se vayan volatilizado a tiempos diferentes, con lo que pasan a la fase mvil y se eluyen de manera diferencial. Este tipo de separacin
requiere, por motivos metodolgicos, que los compuestos a separar presenten
puntos de ebullicin no demasiado elevados.
El cromatgrafo de gases, que es el sistema automatizado para realizar este
tipo de tcnica, se disea de manera que permita la separacin y cuantificacin
de los compuestos a estudiar (Figura 9.12).
Figura 9.12. Esquema de los componentes
de un cromatgrafo de gases.
124
Los principales componentes de un cromatgrafo de gases son los que se detallan a continuacin:
Gas portador. La fase mvil es un gas inerte (nitrgeno, helio o argn) cuyo flujo a travs del sistema de separacin y cuantificacin, puede ser controlado.
Inyector. Las muestras a analizar son introducidas en el cromatgrafo por un sistema de inyeccin. Actualmente, los inyectores son automticos y permiten el
tratamiento secuencial de varias muestras sin requerir la intervencin de un operador.
Columna. La fase estacionaria consta de un lquido que se encuentra inmovilizado en una columna. El relleno de las columnas es un lquido que est impregnando un soporte inerte (tierra de diatomeas, polmeros porosos, perlas
de vidrio, etc.). Este tipo de relleno permite una gran superficie de contacto y
un sistema eficaz de empaquetamiento con muy poco volumen muerto (espacio en el que las molculas de soluto no se encuentran en contacto con el disolvente de la columna). La fase estacionaria debe cumplir, adems, una serie
de condiciones, como la de no ser voltil y ser trmicamente estable para las
temperaturas que se utilizan durante el anlisis. Las columnas tienen una longitud variable. As, por ejemplo, las columnas capilares tienen un dimetro interno de 0,02-0,05 cm y una longitud de 20 m o superior. Este tipo de
columnas tiene una capacidad de muestra muy pequea y su eficacia de separacin es muy alta.
Horno. La columna se encuentra situada en un horno capaz de alcanzar elevadas temperaturas, lo que permite que los compuestos que se analizan se volatilicen. La separacin de los compuestos volatilizados se basa en sus diferentes
coeficientes de distribucin entre la fase estacionaria lquida y la fase mvil gaseosa, a medida que son transportados a travs de la columna por el gas portador.
La elucin de los componentes de la muestra se produce en funcin de sus puntos de ebullicin. Durante el proceso cromatogrfico pueden programarse diferentes rampas (tramos o intervalos) de temperatura, que permiten ir
incrementado la temperatura de manera escalonada para mejorar la resolucin
de la separacin.
Detector. Los compuestos, cuando salen de la columna, pasan por un detector
unido a un amplificador y a un aparato de registro. El registro que se obtiene se
denomina cromatograma y en l cada componente aparece como un pico, al representarse los valores que proporciona el detector frente al tiempo.
Se utilizan diferentes tipos de detectores para poder determinar la elucin de
los compuestos a analizar: detectores de conductividad trmica, detectores de
ionizacin a la llama y detectores de captura electrnica.
Detector de conductividad trmica. El fundamento de este tipo de detector se basa en que la resistencia elctrica de un alambre es dependiente de la temperatura. Si un gas fluye con una velocidad constante a travs
de un alambre caliente, dicho alambre puede ser enfriado a una temperatura determinada por la velocidad de flujo y la conductividad trmica
del gas. Por lo tanto, a una velocidad de flujo constante, la temperatura
del alambre y, por consiguiente, la resistencia, es una caracterstica especfica de cada gas que pasa por el alambre. De esta manera, a medida
125
Captulo 9
que se van eluyendo los diferentes compuestos de la columna, cambia la

resistencia del alambre, que puede ser registrada por un controlador (Figura 9.13).
de un detector de conductividad trmica.
Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector). Es el

tipo de detector ms difundido. Se basa en que la energa trmica de una
llama produce un cierto grado de ionizacin de las molculas de la misma
llama. Los iones se recogen en un par de electrodos polarizados y la corriente producida se amplifica y registra (Figura 9.14). Para una composicin dada del gas, el grado de ionizacin es constante; pero, si la
composicin del gas cambia debido a la presencia de los componentes de
la muestra, el grado de ionizacin provocado por la llama tambin vara.
Para producir la llama se utiliza hidrgeno y oxgeno. Los detectores de ionizacin a la llama detectan virtualmente todos los compuestos orgnicos
(el lmite de deteccin es de 1 u 109 moles). La desventaja que presenta
es que destruyen la muestra y no permiten controlar el efecto de las impurezas, ya que stas tambin se ionizan en la llama.
Figura 9.14. Detector de ionizacin de
llama. Se introduce hidrgeno y oxgeno
en la mezcla gaseosa que sale de la
columna para permitir que sta se queme
en el detector. Algunas molculas se
ionizan en la llama y producen una
corriente que fluye entre los dos
electrodos polarizados. El grado de
ionizacin vara con la composicin de la
mezcla gaseosa, pudiendo seguirse los
cambios de corriente producidos, en
funcin de los cambios en la composicin
del eluido.
Detector de captura electrnica. Este tipo de detector depende tambin

de la ionizacin del gas portador, aunque utiliza como sistema de ionizacin un istopo que emite radiacin E, normalmente 63Ni o 3H. La ionizacin del gas portador produce, como resultado, el movimiento de
126
cargas y el establecimiento de una corriente entre los dos electrodos polarizados. Si se encuentra presente un compuesto electrfilo (por ejemplo,
que contenga oxgeno, nitrgeno, azufre o un halgeno), una parte de los
electrones libres sern capturados por ste, reduciendo la corriente entre
los electrodos. Estos detectores son tiles para compuestos electrfilos (Figura 9.15).
Figura 9.15. Esquema del funcionamiento
de un detector de captura electrnica.
Sistema registrador-integrador. Una vez detectados los compuestos, las seales recibidas se integran y aparecen en forma de picos, al representar la respuesta del detector frente al tiempo de retencin en la columna. El tiempo en
que aparece cada pico (eje X) permitir identificar cada compuesto (anlisis
cualitativo), mientras que el rea de cada pico permitir su cuantificacin (anlisis cuantitativo). El conjunto de picos obtenidos, que representan los distintos
compuestos detectados en una muestra, constituye el cromatograma de dicha
muestra. Los anlisis cuantitativos requieren la utilizacin de estndares externos e internos. El detector puede responder de forma diferente al estndar interno y a cada sustancia que quiere medirse, por lo que debe obtenerse un
factor de respuesta del detector para cada componente de la muestra en relacin con el estndar interno. Los factores de respuesta que se obtienen para
los distintos compuestos permiten corregir los resultados obtenidos en su deteccin.
La cromatografa de gases se puede aplicar a un gran nmero de biomolculas, aunque es preferible que las biomolculas a determinar presenten puntos de
ebullicin bajos. En algunos casos, antes de la separacin de las molculas por
cromatografa de gases, stas pueden modificarse mediante su reaccin con un
compuesto apropiado para aumentar su volatilidad y facilitar la separacin por
cromatografa de gases (Figura 9.16).
Figura 9.16. Ejemplos de reacciones de
derivatizacin con el fin de aumentar la
volatilidad de los compuestos a separar
por cromatografa de gases. Se indica el
grupo funcional de las molculas sobre el
que se producir la reaccin y los tipos de
reacciones posibles y sus productos.
127
Captulo 9
Cromatografa lquido-lquido.
Cromatografa lquida de alta precisin (HPLC)
En la cromatografa lquido-lquido, el principio de separacin es la solubilidad
diferencial de los componentes de una mezcla entre dos fases lquidas inmiscibles. Los componentes de la mezcla se distribuirn entre ambas fases en funcin
de su solubilidad en cada una de ellas; esta solubilidad diferencial depende de
la polaridad de los componentes y de cada una de las fases lquidas. As, los
componentes polares se disolvern mejor en la fase ms polar, mientras que los
apolares lo harn en la fase ms apolar.
El fundamento de la cromatografa lquido-lquido se basa en las extracciones
de molculas con disolventes orgnicos, lo que implica a dos disolventes inmiscibles. La cromatografa en papel es el proceso ms sencillo dentro de cromatografa lquido-lquido, en la que el agua unida a la celulosa acta como fase
estacionaria polar y la fase mvil menos polar puede ser una mezcla de disolventes orgnicos como butanol, cloroformo, etc. Con el tiempo, la cromatografa en papel ha sido reemplazada en muchas de sus aplicaciones por la
cromatografa en capa fina, debido a la mayor velocidad de separacin y la mejor resolucin de esta ltima.
La cromatografa lquido-lquido se ha ido sofisticando con el tiempo hasta
el desarrollo de la cromatografa lquida de alta precisin o HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Un sistema de HPLC es un instrumento que
permite la separacin y cuantificacin de los elementos de una mezcla biolgica mediante cromatografa lquida de alta precisin. El sistema de HPLC est diseado para permitir la separacin y cuantificacin de los compuestos de una
muestra (Figura 9.17).
Cada uno de los componentes del sistema cumple una funcin en el proceso
global de separacin y cuantificacin de compuestos. Hoy en da todos los componentes del sistema estn controlados por un ordenador, que controla el flujo
de la fase mvil y la seal obtenida por el detector en el tiempo; el ordenador
tambin interviene en el proceso de clculo de los resultados.
El tiempo que invierte una sustancia en recorrer la columna, como ya se ha
comentado anteriormente, es el tiempo de retencin, mientras que el volumen
de elucin es el volumen de fase mvil necesario para que se eluya un determinado compuesto de una mezcla. Estos dos parmetros se utilizan con fines cualitativos para identificar qu compuesto corresponde a cada uno de los picos que
se obtiene en la cromatografa lquida de alta precisin. El rea del pico se utiliza
con fines cuantitativos.
Figura 9.17. Componentes bsicos de un
sistema para HPLC.
128
A continuacin se detallan los componentes bsicos de un sistema de HPLC

y sus principales caractersticas.
Bomba impulsora. La separacin de compuestos en columna tradicionalmente
haca uso del flujo generado por la fuerza de la gravedad para mover la fase mvil, lo que provocaba que los tiempos necesarios para la separacin de los componentes de una mezcla fueran demasiado largos. As, la utilizacin de bombas
impulsoras de la fase mvil, de presin elevada, ha permitido reducir los tiempos
de separacin. Adems, el uso de estas bombas permite el control del flujo de la
fase mvil. Inicialmente tan slo poda utilizarse una mezcla de disolventes (dando como resultado una dilucin isocrtica de igual poder); con el tiempo se
construyeron sistemas con dos bombas que permitan introducir cambios en la
composicin de la fase mvil (dilucin en gradiente). Las bombas se han ido perfeccionado hasta conseguir sistemas formadores de gradientes con una nica
bomba, que son capaces de mezclar varios tipos de disolventes; estos sistemas se
encuentran controlados por microprocesadores, que permiten la programacin
de las condiciones deseadas para cada separacin cromatogrfica.
Inyector. El hecho de que la fase mvil se suministre a presin hace que sea necesario un sistema de inyeccin de muestra. Los primeros inyectores introducan la
muestra directamente en la corriente del disolvente. Actualmente se utilizan sistemas de vlvulas, que son ms precisos y permiten inyectar la muestra sin alterar las
condiciones de presin y flujo de la fase mvil. Los sistemas actuales permiten la
programacin del orden de inyeccin y de la cantidad de muestra que debe inyectarse en el sistema. Algunos inyectores permiten que las muestras se encuentren
refrigeradas mientras esperan ser procesadas; lo que posibilita dejar el sistema en
funcionamiento durante horas sin requerir la intervencin de un operador.
Columna. La separacin de los componentes de la mezcla tiene lugar en la columna, donde se encuentra la fase estacionaria. En la columna, el lquido de la
fase estacionaria queda inmovilizado por un soporte. La separacin eficaz de los
componentes de la mezcla requiere que esta fase sea regular y se encuentre finamente dividida; adems, el sistema ha de permitir el paso de la fase mvil a
travs de la misma y que se mantenga un flujo constante y adecuado. El espacio
muerto, es decir, el espacio no ocupado por el relleno de la columna, debe ser
mnimo, para evitar la dilucin de la muestra por la fase mvil. El material de relleno de la columna (Figura 9.18) se elige de acuerdo con las caractersticas de
las molculas que se van a separar y el tipo de cromatografa que se utiliza. Los
principales factores que deben considerarse son la solubilidad y la polaridad de
las molculas que se quieren separar (Figura 9.19).
La versatilidad de la tcnica de HPLC se basa sobre todo en el gran nmero
de fases estacionarias (rellenos de la columna) que existen y en el gran nmero
de mezclas de disolventes que pueden utilizarse como fase mvil.
La cromatografa de HPLC puede dividirse en dos grandes grupos dependiendo de las caractersticas de polaridad de la fase mvil y de la estacionaria:
Cromatografa lquida en fase normal:
Fase estacionaria: polar
Fase mvil: no polar
Cromatografa lquida en fase reversa:
Fase estacionaria: no polar
Fase mvil: polar
Figura 9.18. Estructura de un tipo de

relleno tpico para columnas de HPLC.
129
Captulo 9
Figura 9.19. Rellenos de diferentes
columnas para HPLC.
Detectores. El sistema requiere la deteccin de los diferentes componentes de

la mezcla a la salida de la columna. Hay diferentes sistemas de deteccin, que se
detallan a continuacin.
Detectores fotomtricos: se basan en la absorcin de energa radiante
por los compuestos que son eluidos. Los compuestos que no absorben se
pueden modificar con un reactivo antes o despus de la separacin en la
columna para que adquieran la caracterstica de absorcin de radiacin
electromagntica. Los fotmetros usados en HPLC utilizan radiacin ultravioleta o visible. Los fotmetros pueden ser de longitud de onda fija (generalmente 254 nm) o variable (en los cuales se puede seleccionar la
longitud de onda de trabajo).
Detectores fluorimtricos: se utilizan para la deteccin de compuestos fluorescentes. Los compuestos que no son fluorescentes pueden modificarse reaccionando con marcadores fluorescentes antes o despus de la separacin en la
columna. Estos detectores son mucho ms sensibles que los fotomtricos.
Diodo array: es un detector fotomtrico que, en vez de realizar las medidas
a una sola longitud de onda, realiza las lecturas entre un rango de longitudes
de onda. Esto permite separar y cuantificar en una nica vez un grupo de
sustancias que absorben a longitudes de onda diferentes (Figura 9.20).
de un diodo array.
130
Detectores electroqumicos: miden la electrolisis de las molculas a determinar, ya que se provoca una diferencia de potencial (Figura 9.21).
Detectores radioqumicos: se emplean para la deteccin de compuestos
radiactivos.
de un detector electroqumico.
Registrador-integrador. Este componente del sistema de HPLC permite registrar

la respuesta de los detectores, identificar los componentes, integrar las seales y
realizar todos los clculos cuantitativos.
Como ya se comentaba en el apartado dedicado a cromatografa de gases,
los anlisis cuantitativos requieren la utilizacin de estndares externos e internos. Se puede obtener un factor de respuesta del detector para cada componente de la muestra respecto al estndar interno, pudindose as corregir la seal del
detector para cada compuesto, para finalmente, obtener un cromatograma que
permite tanto la identificacin (a travs del tiempo de retencin) como la cuantificacin (rea de cada pico) de los compuestos presentes en la muestra. Si el detector utilizado es de tipo diodo array, el espectro de absorcin obtenido para
cada compuesto servir tambin para su identificacin.

La cromatografa de intercambio inico permite la separacin de compuestos en
funcin de su carga. Las biomolculas presentan grupos ionizables, grupos cidos y bsicos, normalmente con caractersticas dbiles, lo que determina que
presenten carga en funcin del pH. As, la intensidad de esta carga y, en muchos
casos, el signo (positivo o negativo) dependen sobre todo del pH y de la composicin de la solucin en que se encuentran las molculas, que pueden alterar significativamente la carga transportada por stas.
La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las interacciones
electrostticas que se establecen entre los grupos ionizables de las sustancias que
quieren separarse y los grupos cargados de una fase estacionaria, que se encuentran unidos al soporte slido de una columna.
Las fases estacionarias son polmeros de resinas orgnicas de pesos moleculares elevados, que presentan un gran nmero de grupos cargados. Estas resinas se
conocen con el nombre de intercambiadores ionizados. Existen dos grandes tipos
de resinas de intercambio: las intercambiadoras de aniones y las intercambiadoras de cationes. Los intercambiadores de cationes contienen grupos cargados ne131
Captulo 9
gativamente en la resina, los cuales atraen a las molculas con cargas positivas.
Los intercambiadores de aniones poseen grupos cargados positivamente en la resina, que atraen a las molculas cargadas negativamente. Tanto las resinas aninicas como las catinicas pueden ser fuertes (siempre ionizadas) o dbiles (que
estarn ionizadas en funcin del pH de los eluyentes).
As pues, una resina de intercambio inico consiste en una matriz porosa insoluble que tiene ligados un gran nmero de grupos inicos capaces de unir iones de carga opuesta procedentes del medio (Figura 9.22). La cromatografa de
intercambio inico es esencialmente una tcnica de desplazamiento en la que
los iones de la muestra o del tampn desplazan a los iones mviles asociados inicialmente a los iones fijos de la resina.
En teora, puede utilizarse cualquier grupo inico para obtener una resina de
intercambio inico pero, para que el intercambio tenga lugar, el grupo unido a la
resina debe ionizarse. Una resina de intercambio inico no puede utilizarse a un
pH en el que no se encuentre ionizada. Las resinas dbilmente inicas son nicamente efectivas en un rango estrecho de pH, mientras que las fuertes pueden
utilizarse en un rango de pH mucho ms amplio.
Al seleccionar una resina debe tenerse en cuenta la carga de los iones de la
muestra. Adems, hay tres factores fundamentales que determinan la unin de
los iones a la resina:
1. El valor de la carga. As, los iones divalentes tienen ms afinidad por la resina que los iones monovalentes.
2. El volumen en el que est distribuida la carga, lo que determina la capacidad de entrar en la resina. Por ejemplo, la fuerza de unin de cationes
monovalentes a una resina aninica disminuye en el siguiente orden:
Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH+4 > Na+ >H+ > Li+
3. La concentracin de los iones. A concentraciones altas, un in de baja afinidad es capaz de desplazar a un in en baja concentracin pero con alta
afinidad por la resina.
Figura 9.22. Esquema de una separacin
por intercambio inico.
132
El control de estos factores hace selectivas las separaciones por intercambio

inico. Adems, la elucin puede realizarse tambin cambiando el pH, porque
la mayora de biomolculas son cidos y bases dbiles, por lo que pequeos
cambios de pH pueden provocar la prdida de la carga que las mantiene retenidas a la columna. As, por ejemplo, los aminocidos pueden separarse por cromatografa de intercambio inico porque presentan grupos con pK diferentes (su
carga depende del pH), lo que permite, al realizar una elucin en gradiente de
pH, su elucin diferencial.
Por lo tanto, el mecanismo por el que se produce la separacin cromatogrfica es el siguiente: en una columna de intercambio inico activada (con un eluyente que mantiene los grupos de la columna cargados), se hace pasar una
mezcla de compuestos con diferentes cargas; los diferentes compuestos quedan
retenidos con mayor o menor fuerza dependiendo de las interacciones que se
establezcan con la resina. Los compuestos retenidos en la columna pueden eluirse, bien cambiando el pH de la disolucin, o bien aumentando la fuerza inica
del medio o ambos. La columna se regenera pasando contraiones que eliminen
las interacciones de los iones unidos a la resina con sta, dejndola preparada de
esta manera para la siguiente separacin.
Cromatografa de permeabilidad. Cribado molecular

La cromatografa de permeabilidad permite la separacin de las molculas en
funcin de su tamao molecular y forma. El proceso tiene lugar al pasar las
molculas a travs de un lecho poroso, formado por diferentes grnulos de un
material esponjoso, de manera que, en general, las molculas que tienen menor
tamao realizan un recorrido mayor, pasando a travs de los poros del lecho,
mientras que las molculas de mayor tamao, que no pueden pasar a travs de
todos los poros del lecho, lo recorren de manera ms rpida, ya que transitan
por los espacios entre los grnulos. Evidentemente, la forma de cada molcula
tambin influir en su capacidad de recorrer ms lenta o ms rpidamente el lecho. Esta tcnica tambin recibe el nombre de cribado molecular. Los lechos
que se utilizan en este tipo de cromatografa tienen caractersticas de gel.
Se ha utilizado un gran nmero de materiales para la realizacin de la cromatografa de permeabilidad. Se vara el tamao del poro, lo que permite discriminar entre diferentes tamaos de molculas, segn las molculas que se deseen
separar.
Los materiales ms usuales en la cromatografa de permeabilidad se muestran
en la figura 9.23. Un ejemplo caracterstico de un material utilizado en cromatografa de permeabilidad lo constituye el Sephadex (Figura 9.24), que se obtiene por entrecruzamiento entre el polisacrido dextrano y la epiclorhidrina,
convirtindose de esta manera en dextrano insoluble en agua. Al tener un carcter hidroflico, se hincha rpidamente en medios acuosos, y forma los grnulos
de gel que permiten el cribado molecular. Los enlaces cruzados no son regulares, sino que hay un componente debido al azar, lo que provoca la existencia de
una gama amplia de tamao de poro. Esto determina que las molculas, segn
su tamao, puedan penetrar ms o menos en el gel. Cuanto ms pequea sea
una molcula, ms podr penetrar en el gel. A medida que aumenta el tamao
de las molculas, su capacidad de penetracin en el gel ser menor, por lo que
cuanto mayor sea una molcula ms rpidamente se eluir. El grado de entrecruzamiento se puede modificar, lo que admite tener diferentes tipos de Sephadex, que permiten el cribado de rangos de pesos moleculares diferentes.
Esta tcnica de filtracin en gel puede emplearse, adems, para la determinacin de las masas moleculares de distintas protenas. Existe una relacin lineal
entre el volumen de elucin relativo de una sustancia y el logaritmo decimal de
su masa molecular en un intervalo considerable de masas moleculares (Figura
9.25). Si se representa, para una determinada columna de filtracin en gel, el
volumen de elucin relativo y la masa molecular de diferentes molculas, se obtiene una recta que puede utilizarse en la determinacin de la masa molecular
de una molcula desconocida.
Figura 9.23. Materiales ms usuales en la

cromatografa de permeabilidad.
Figura 9.24. Micrografas de un grnulo de

Sephadex. Reproducido de
Downstream 30 (1999), con permiso de
Amersham Biosciences.
Figura 9.25. Representacin del volumen

de elucin relativo frente al log de la
masa molecular de varias protenas. En el
ejemplo se determina la masa molecular
de la protena UCP1.
133
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales

INTRODUCCIN
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR TLC
Separacin unidimensional
Separacin bidimensional
Determinacin de aminocidos por TLC con reacciones mltiples
Separaciones de aminocidos derivatizados
Cromatografa de DNP-aminocidos
Cromatografa de dansil-aminocidos
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR HPLC

Ejemplo de determinacin de aminocidos individuales libres por HPLC: Pico-Tag
ANALIZADORES AUTOMTICOS DE AMINOCIDOS
134
10
INTRODUCCIN
Aunque existen diferentes mtodos para determinar un aminocido en concreto
en presencia del resto de aminocidos realizando reacciones especficas sobre
algunos de los grupos funcionales de su cadena lateral, o utilizando mtodos enzimticos especficos, a veces resulta ms ventajoso utilizar tcnicas separativas
(que permiten separar los diferentes aminocidos) acopladas a mtodos de
cuantificacin de aminocidos totales (por tcnicas qumicas) (Figura 10.1).
Figura 10.1. Esquema del procedimiento
general de determinacin de aminocidos
individuales.
Los aminocidos se diferencian entre s por sus cadenas laterales, cuyas caractersticas les confieren distintas polaridades, o diferentes puntos isoelctricos,
etc. (Figura 10.2).
Los mtodos de separacin de molculas basados en criterios de polaridad,
como por ejemplo las tcnicas cromatogrficas (TLC, HPLC y CG), permitirn separar los aminocidos entre s. Si se acopla a esta separacin un mtodo qumico para la determinacin de aminocidos, no slo se podrn identificar los
aminocidos individuales presentes en una muestra, sino que tambin se podrn
cuantificar. La cromatografa de intercambio inico tambin permite separar los
diferentes aminocidos de una mezcla y, de la misma forma que ocurre en el
caso de la aplicacin de tcnicas basadas en polaridad, si se acopla al proceso
135
Captulo 10
Figura 10.2. Propiedades de los
aminocidos. Masa molecular (M), pK de
los grupos cargados, punto isoelctrico e
ndice hidroptico. El ndice hidroptico
se determina por una escala que combina
la hidrofobicidad e hidrofilicidad; puede
utilizarse para predecir qu aminocidos
son polares y cules apolares. Los valores
negativos se dan en aminocidos polares,
mientras que los positivos en los apolares.
una reaccin qumica que se produzca sobre el grupo comn a todos los aminocidos, puede utilizarse tambin esta tcnica para identificar y cuantificar los
aminocidos individuales. Los analizadores automticos de aminocidos estn
basados en el principio general de acoplamiento de este tipo de tcnicas separativas y de determinacin de aminocidos totales.
La mayora de los mtodos analticos incluyen una primera etapa de desproteinizacin, que puede realizarse, como ya se ha visto para el caso de los aminocidos totales, utilizando diferentes agentes caotrpicos o diferentes tcnicas,
por ejemplo, el uso de elevadas concentraciones de sales, cidos orgnicos o determinados disolventes, por la accin del calor o por filtracin (ver captulo 8);
las protenas as precipitadas pueden separarse por filtracin o centrifugacin.
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR TLC

La cromatografa en capa fina ha sido ampliamente aplicada a la determinacin
de aminocidos individuales, ya que se obtienen buenos resultados con esta
tcnica en la determinacin tanto cualitativa como cuantitativa de aminocidos.
Es una tcnica rpida y que no requiere un gran instrumental para su aplicacin. La utilizacin de esta tcnica con fines cuantitativos es ms dificultosa,
pero pueden obtenerse resultados reproducibles incluso para pequeas cantidades de muestra (como se ver en el ejemplo de los dansil-aminocidos), donde la tcnica se acopla con una tcnica radioqumica para aumentar la
sensibilidad del mtodo. No obstante, es conveniente utilizar patrones internos
y externos, que permiten el control de prdidas durante el procesamiento de
las muestras y el control de la diferente respuesta de cada aminocido al sistema de cuantificacin.
Los aminocidos pueden separarse por cromatografa realizada en una sola
direccin o bien de forma bidireccional, dependiendo del nmero de aminocidos de la mezcla o el propsito de la determinacin. As, cuando se requiere determinar un grupo importante de aminocidos, es preferible realizar una
cromatografa bidireccional, que permite una mejor resolucin de la separacin
de aminocidos.
136
En la determinacin de aminocidos se han utilizado diferentes adsorbentes,

eluyentes y reactivos. En algunos casos, antes de proceder a su separacin, se
provocar la reaccin de los aminocidos con un reactivo (derivatizacin), lo que
ayuda a su posterior identificacin y cuantificacin. Veamos diferentes mtodos
que pueden utilizarse para la separacin de aminocidos por TLC.
Separacin unidimensional
Los aminocidos de una muestra se pueden separar por cromatografa en capa
fina realizada en placas de celulosa y utilizando como eluyente n-butanol:acetona:cido actico:agua (35:35:10:20, V:V:V:V) (Figura 10.3). Los distintos aminocidos pueden visualizarse al reaccionar con un reactivo de la ninhidrina
modificado, con 2,4,6-colidina (reactivo ninhidrina-colidina). Este reactivo provoca la aparicin de diferentes colores segn el aminocido, lo que ayuda a su
identificacin (Figura 10.4). Todos los D-aminocidos reaccionan en fro en pocas horas y, si se realiza la reaccin a 100 C durante 10 minutos, reaccionan
tambin los compuestos que tienen aminas primarias o secundarias unidas a un
tomo de carbono aliftico, originando distintos compuestos coloreados.
Separacin bidimensional
Los aminocidos se separan por cromatografa bidimensional sobre placas de celulosa utilizando como eluyentes:
Figura 10.3. Cromatograma de la

separacin de una mezcla de
aminocidos, en que se ha utilizado como
eluyente n-butanol:acetona:cido
actico:agua (35:35:10:20, V:V:V:V). Los
aminocidos han sido detectados con
ninhidrina-colidina.
1) t-butanol:metiletilcetona:amonaco 25%:agua (50:30:10:20, V:V:V:V).

2) 1-butanol:acetona:cido actico:agua (35:35:10:20, V:V:V:V).
Los aminocidos as separados pueden visualizarse con el reactivo modificado de la ninhidrina con 2,4,6-colidina (Figura 10.5).
Figura 10.4. Color resultante tras la

reaccin de algunos aminocidos con
ninhidrina-colidina.
Figura 10.5. Separacin bidimensional de

los aminocidos en placas de celulosa,
utilizando como eluyentes:
1) t-butanol:metiletilcetona:amonaco
25%:agua (50:30:10:20, V:V:V:V);
2) 1-butanol:acetona:cido actico:agua
(35:35:10:20, V:V:V:V). La identificacin
se realiza con el reactivo modificado de la
ninhidrina.
137
Captulo 10
Otra separacin de aminocidos que da una resolucin bastante buena en

placas de celulosa es la desarrollada utilizando como primer eluyente
piridina:acetona:hidroxido amnico:agua (40:30:5:20, V:V:V:V), y 2propanol:cido frmico concentrado:agua (66:15:15, V:V:V) como segundo eluyente (Figura 10.6).
Figura 10.6. Separacin bidimensional de
los aminocidos en placas de celulosa,
utilizando como eluyentes:
1) piridina:acetona:hidrxido
amnico:agua (40:30:5:20, V:V:V:V);
2) 2-propanol:cido frmico
concentrado:agua (66:15:15, V:V:V). La
identificacin se realiza con el reactivo
modificado de la ninhidrina.
Determinacin de aminocidos por TLC

con reacciones mltiples
Puede efectuarse la separacin de los aminocidos en cromatografa en capa
fina y proceder a realizar diferentes reacciones sobre la placa de cromatografa
para identificar los diferentes aminocidos y derivados, tal y como se hace, por
ejemplo, en el estudio de las metabolopatas. Otro ejemplo es el uso de las
muestras de orina para estudiar diferentes desordenes metablicos relacionados
con el metabolismo de los aminocidos como la fenilcetonuria, la tirosinuria, la
alcaptonuria, la histidinuria, la cistinuria y la homocistinuria. En estos casos, se
tratan las muestras de orina de la siguiente forma: las muestras son desproteinizadas con etanol absoluto; se procede a continuacin a realizar una extraccin
con cloroformo para eliminar la urea u otros compuestos orgnicos e inorgnicos. Los aminocidos recuperados en la fase acuosa se utilizan para realizar una
cromatografa bidimensional en placa de celulosa utilizando como primer eluyente: piridina:acetona:hidrxido amnico:agua (40:30:5:20, V:V:V:V), y como
segundo eluyente 2-propanol:cido frmico concentrado:agua (66:15:15,
V:V:V). Los aminocidos pueden visualizarse utilizando diferentes reactivos que
permiten identificar tanto los propios aminocidos como los derivados de la degradacin de stos para poder diagnosticar diferentes metabolopatas.
Se pueden utilizar distintos reactivos de localizacin o visualizacin de los
aminocidos del cromatograma ya seco. Estos reactivos se aplican por pulverizacin o por inmersin de la placa en los reactivos. Con la cromatografa en capa
fina pueden detectarse 5 nmoles o incluso cantidades ms pequeas de amino138
cidos. Se han descrito reactivos especficos para algunos aminocidos, lo que

ayuda a su identificacin. Los diferentes reactivos pueden aplicarse a distintos
cromatogramas, o bien a un mismo cromatograma siguiendo un orden para evitar interferencias entre reactivos. La posibilidad de realizar diferentes tinciones
permite una mejor determinacin de alteraciones en el patrn de aminocidos y
ayuda al diagnstico de la metabolopata a estudiar.
Reactivo de ninhidrina-colidina. Reacciona con los diferentes aminocidos produciendo diferentes colores. El reactivo se consigue mezclando 2,5 mL de colidina con 100 mL de ninhidrina 0,2%. Se pulverizan los cromatogramas a teir y se
calientan a 100 C durante 10 minutos.
Reactivo de isatina. Reacciona con diferentes aminocidos. El reactivo se prepara disolviendo 2 g de isatina en 1 L de acetona. Se pulveriza el cromatograma y
se calienta a 105 C durante 2 3 minutos. Los aminocidos toman diferentes
colores (Figura 10.7).
Reactivo de Ehrlich. Reacciona con indoles, produciendo coloracin prpura al
reaccionar con el triptfano y amarilla al reaccionar con aminas aromticas. El
reactivo se prepara mezclando 1 volumen de p-dimetilaminobenzaldehdo
(10 g/100 mL de HCl concentrado) con 4 volmenes de acetona. Se pulveriza
sobre el cromatograma.
Reactivo de Pauly. Reacciona con los imidazoles, como la histidina, dando un
producto de coloracin roja, y tambin con compuestos fenlicos, como la tirosina, produciendo un producto de color naranja claro. El reactivo se prepara
mezclando 1 volumen de cido sulfanlico (10 g/100 mL en HCl concentrado)
con 10 volmenes de agua, 1 volumen de nitrato sdico al 5% y 1 volumen de
carbonato sdico al 10%. Se pulveriza sobre el cromatograma.
Figura 10.7. Coloracin que adquieren

diferentes aminocidos al reaccionar con
el reactivo de isatina.
Cianuro-nitroprusiato. Reacciona con la cistena y sus derivados (cistina y homocistena), dando un producto de coloracin rojo cereza. El reactivo se prepara mezclando 1 volumen de cada una de las siguientes disoluciones: NaOH
10%, nitroprusiato sdico 10%, ferrocianuro potsico 10%, con 3 volumenes de
agua. Se pulveriza sobre el cromatograma.
Separaciones de aminocidos derivatizados

Antes de separar los aminocidos individuales, stos pueden ser modificados con
algn reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional presente en todos
ellos. Este proceso se conoce con el nombre de derivatizacin. As, por ejemplo,
puede realizarse la cromatografa de los dinitrofenil-derivados (DNP-derivados) o
los dansil-derivados de aminocidos. Este sistema est particularmente indicado
cuando la muestra contiene otras muchas sustancias. La formacin y la extraccin de los derivados son laboriosas, pero son muy convenientes para volmenes de muestra muy pequeos o para aminocidos presentes en muy baja
cantidad. Despus de la cromatografa no es necesario utilizar reactivos de localizacin, porque los derivados DNP son de color amarillo y los dansil-aminocidos son fluorescentes.
139
Captulo 10
Cromatografa de DNP-aminocidos
Se realiza en una placa de gel de slice. El primer eluyente que se utiliza es el
acetato n-butilo:metanol:cido actico (75:25:2, V:V:V) y el segundo eluyente es
el tampn NaH2PO4/Na2HPO4 1,5M a pH = 6. Los 2,4 dinitrofenil-aminocidos
son identificados por el color amarillo que presentan y por sus Rf. (Figura 10.8).
Las cromatografas en TLC de los aminocidos derivatizados pueden utilizarse
para cuantificar los aminocidos, pero requieren la utilizacin de patrones internos y externo. El patrn interno es una sustancia con las mismas caractersticas
de los aminocidos, pero que no se encuentra en las muestras biolgicas; se
aade al principio del tratamiento de la muestra en una cantidad conocida, y su
recuperacin al final del proceso permite cuantificar las prdidas que se puedan
producir en dicho proceso. Los patrones externos permiten controlar la seal
que produce cada aminocido en el proceso de cuantificacin.
Figura 10.8. Placa cromatogrfica de
dinitrofenil-aminocidos.
Cromatografa de dansil-aminocidos
El ejemplo representativo que se comenta a continuacin es un mtodo que
permite la cuantificacin de aminocidos en pequeas muestras de sangre o
plasma (10 PL). Este mtodo permite introducir una serie de conceptos importantes, como son el acoplamiento de tcnicas de separacin (cromatografa de
tipo TLC) y cuantificacin (tcnicas radioqumicas) de biomolculas, el concepto
de patrn interno y el de patrn externo. El protocolo completo del mtodo
puede leerse en el Anexo de Mtodos del CD que acompaa a este libro.
El mtodo se basa en la derivatizacin de los aminocidos con cloruro de
dansilo marcado con 14C y la posterior separacin de los dansil-aminocidos por
cromatografa en capa fina. Una vez se ha obtenido el cromatograma, las manchas correspondientes a los distintos aminocidos derivatizados (visualizados con
luz ultravioleta) se recortan y se determina la radiactividad presente en cada
mancha, que ser directamente proporcional a la concentracin de cada aminocido.
140
Utilizando una mezcla patrn de aminocidos (patrn externo) es posible

relacionar la radiactividad presente en cada mancha con la concentracin inicial de los aminocidos. Para que los resultados obtenidos sean correctos, es
decir, para obtener la concentracin real de los aminocidos en las muestras,
es necesario utilizar patrones internos. Los patrones internos que, como ya se
ha comentado, son compuestos con caractersticas similares a los que se determinan pero que no se encuentran en las muestras biolgicas, se aaden a
las muestras para controlar las prdidas que se dan durante el proceso. Se
pueden utilizar diferentes patrones internos en la determinacin de aminocidos individuales, entre ellos cabe mencionar la nitrotirosina, la norleucina o la
norvalina, que son aminocidos que no se encuentran presentes en las muestras biolgicas animales. Adems, la introduccin de patrones internos permite
estandarizar los resultados, corrigiendo las diferencias entre muestras distintas
y patrones externos. Los resultados de la cromatografa se corrigen a partir de
la recuperacin de cada aminocido en cada muestra respecto de su patrn
interno.
A continuacin se detalla cada uno de los pasos de este ejemplo, para comprender el diseo de este tipo de mtodos.
Desproteinizacin. Las muestras deben desproteinizarse para evitar las interferencias producidas por las protenas. La acetona en fro provoca la desnaturalizacin de las protenas al eliminar el agua de hidratacin de las mismas, de manera
que tienden a formar agregados que precipitan a bajas temperaturas. Las protenas precipitadas se sedimentan por centrifugacin en fro. El sobrenadante libre
de protenas se utiliza para cuantificar los aminocidos.
Antes de desproteinizar las muestras, se aade una cantidad determinada de
un patrn interno, por ejemplo la norvalina. La cantidad recuperada del patrn
interno al final del proceso permite controlar las prdidas durante el procesamiento de las muestras.
Al mismo tiempo que se desproteinizan las muestras, se desproteinizan tambin los patrones externos, que son mezclas de aminocidos de concentracin
conocida. A estos patrones externos, que sufren el mismo proceso que las muestras, se les aade tambin el patrn interno. Adems, se procesan tambin una
serie de tubos que contienen nicamente agua y el patrn interno para cuantificar el fondo de contaje de cada aminocido.
La acetona de los sobrenadantes es evaporada una vez eliminadas las protenas (por centrifugacin), para evitar las interferencias que puede tener en los
procesos posteriores de cuantificacin de los aminocidos.
Derivatizacin. Una vez secas las muestras, se procede a la derivatizacin de los
aminocidos con cloruro de dansilo marcado con 14C. La reaccin de derivatizacin se realiza durante 15 minutos a 42 C y a pH bsico, que proporciona las
condiciones ptimas del proceso de derivatizacin (Figura 10.9).
Figura 10.9. Reaccin de derivatizacin
con cloruro de dansilo. Las muestras se
pueden conservar a 20 C hasta el
momento de realizar la cromatografa.
141
Captulo 10
Cromatografa bidimensional en TLC. Las distintas muestras, una vez derivatizadas, se utilizan para la separacin de los aminocidos individuales por cromatografa en capa fina. Se realiza una cromatografa bidimensional para mejorar la
separacin de los diferentes aminocidos. Los dos eluyentes de la cromatografa
bidimensional se eligen con caractersticas distintas de polaridad, para poder separar mejor los diferentes dansil-aminocidos.
El primer eluyente es ms apolar que el segundo, por lo que los aminocidos
ms apolares migran ms durante este primer proceso de la cromatografa que
los polares, ya que stos ltimos sern ms fuertemente retenidos por el adsorbente. Como segundo eluyente se utiliza uno ms polar, que adems controla el
pH, separndose as los aminocidos por una segunda caracterstica, migrando
ms ahora los aminocidos que presentan ms polaridad (Figura 10.10).
Figura 10.10. Placa de una separacin de
dansil-aminocidos.
Visualizacin de las manchas y contaje de la radiactividad. Una vez secas

las placas, las manchas de los dansil-aminocidos se visualizan con ayuda de
una lmpara de luz ultravioleta a 254 nm (los dansil-aminocidos son fluorescentes). Los diferentes dansil-aminocidos aparecen como manchas de colores
variados (amarillo, amarillo-naranja, amarillo-verdoso, azul, ...), resaltando sobre un fondo de placa de color oscuro. Se marcan las reas correspondientes a
cada mancha y posteriormente se recortan con unas tijeras. Cada mancha se
deposita en un vial de centelleo de 5 mL de capacidad que se llena con 4 mL
de lquido de centelleo. Se determina la radiactividad con un contador de
centelleo lquido.
El mismo proceso se sigue con las placas de patrones y blancos. En las placas
de blancos se marcan las reas que corresponderan a las manchas de cada dansil-aminocido, aunque no sean perceptibles, se recortan y se cuentan. Se obtienen as fondos de contaje para cada aminocido individual. El fondo de contaje
de la norvalina se obtiene a partir de un vial de contaje sin mancha. El contaje
de las placas patrn permite obtener un factor de respuesta para cada aminocido, lo cual hace posible el clculo de la concentracin real de cada uno.
142
Clculo del factor de respuesta de cada aminocido. Los factores de respuesta

(Fr) relacionan la cantidad de cada aminocido en la placa patrn con el valor de
la radiactividad presente y la radiactividad del patrn interno norvalina.
Fr
donde: Dn:
Fn:
Q:
D:
F:
Qn:
( Dn Fn) u Q
(D F ) u Qn
radiactividad de la norvalina (dpm)

fondo de contaje para la norvalina (dpm)
cantidad del aminocido (nmol/placa)
radiactividad del aminocido (dpm)
fondo de contaje para el aminocido (dpm)
cantidad de norvalina (nmol/placa)
Clculo de las concentraciones de los aminocidos individuales. Una vez calculado el factor de respuesta para cada aminocido a partir de las placas de los
patrones externos, se puede calcular la concentracin de cada aminocido individual en la muestra problema a partir de la siguiente frmula:
C
donde: C:
D:
F:
Qn:
Dn:
Fn:
Fr:
V:
(D F ) u Qn
u Fr u V
( Dn Fn)
concentracin del aminocido

radiactividad del aminocido (dpm)
fondo de contaje del aminocido (dpm)
cantidad de norvalina (nmol/placa)
radiactividad de la norvalina (dpm)
fondo de contaje para la norvalina (dpm)
factor de respuesta del aminocido
factor de volumen y dilucin de la muestra
Este mtodo permite la cuantificacin de aminocidos en muestras tan pequeas como 10 PL de plasma o sangre al combinar una separacin cromatogrfica por TLC con tcnicas radioqumicas, que son ms sensibles que las
espectrofotomtricas y fluorimtricas.
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR HPLC

Los aminocidos pueden separarse y determinarse por HPLC debido a que se
diferencian en la polaridad y, por lo tanto, presentan solubilidades diferentes en
distintos disolventes. Para su cuantificacin los aminocidos deben adquirir una
caracterstica fcilmente mensurable (como la capacidad de absorcin en la regin del espectro UV-visible o la de emitir fluorescencia), bien con un reactivo
general como la ninhidrina, una vez separados, o bien por derivatizacin antes
de ser separados por su paso a travs de la columna de HPLC (derivatizacin
pre-columna).
Al igual que ocurra con la separacin de aminocidos por TLC, en la cuantificacin de aminocidos por HPLC deben utilizarse patrones tanto internos
como externos. El patrn interno no slo sirve para cuantificar las prdidas en el
tratamiento de las muestras, sino que tambin puede utilizarse para corregir los
143
Captulo 10
tiempos de retencin de los diferentes aminocidos, ya que los tiempos absolutos pueden variar por la temperatura, la edad de la columna, pequeos cambios
en los eluyentes, etc., mientras que los tiempos relativos (el tiempo de retencin
absoluto de cada aminocido respecto al de retencin del patrn interno) son
constantes.
Los reactivos utilizados habitualmente para la derivatizacin pre-columna
son: el flor 2,4-dinitrofenol, el o-ftaldehdo, el cloruro de dansilo y el fenilisotiocianato. As, por ejemplo, cuando los aminocidos libres reaccionan con el fenilisotiocianato (reactivo de Edman utilizado en la secuenciacin de protenas),
se obtienen los correspondientes feniltiocarbamil derivados de los aminocidos,
que pueden separarse en fase reversa y ser detectados mediante detectores fotomtricos a 254 nm (absorben a dicha longitud de onda) o bien mediante detectores electroqumicos (Figura 10.11). De esta forma se consigue la deteccin
de menos de 1 pmol de sustancia.
Figura 10.11. Reaccin del
fenilisotiocianato con los aminocidos
para obtener los correspondientes
feniltiocarbamil derivados.
Pueden obtenerse tambin los dansil-derivados de los aminocidos, y detectarse utilizando detectores fluorimtricos (excitacin a 360 nm y emisin a
480 nm) o fotomtricos (en la regin del ultravioleta). No obstante, la dansilacin presenta un problema que radica en la dificultad que supone obtener productos de reaccin reproducibles utilizando este tipo de reaccin. Adems, la
dansilacin de la lisina y de la arginina presenta algunos inconvenientes. Por otra
parte, un exceso de reactivo puede provocar la aparicin de productos que pueden interferir en la separacin y en la identificacin de los aminocidos.
Otro reactivo que se ha utilizado frecuentemente como agente derivatizante
es el o-ftaldehdo-mercaptoetanol. La fluorescena tambin se ha utilizado en la
separacin de aminocidos en fase reversa por HPLC.
Todos estos mtodos se basan en la realizacin de una cromatografa por
HPLC en fase reversa, es decir, utilizando columnas apolares y disolventes polares y, adems, se utilizan gradientes de elucin que van desde el inicio con eluyentes polares hasta la finalizacin con eluyentes apolares.
Ejemplo de determinacin de aminocidos

individuales libres por HPLC: Pico-Tag
A continuacin se presenta un mtodo desarrollado por Waters Associates para
la determinacin de aminocidos individuales libres, denominado PICO-TAG
amino acide Analysis System. Se basa en la derivatizacin pre-columna de los
aminocidos con fenilisotiocianato (PITC) para producir los feniltiocarbamil aminocidos, que son analizados por HPLC en fase reversa. Los PITC aminocidos
presentan un mximo de absorcin a 254 nm. La columna que se utiliza es una
Pico-Tag (C18), mantenida a 46 C.
El mtodo est diseado para un aparato de HPLC con dos bombas, o con
una bomba con la capacidad de crear gradientes de elucin de dos sistemas de
disolventes. Como ya se ha comentado, en una cromatografa en fase reversa, la
fase mvil es ms polar que la fase estacionaria. En el proceso se establece un
144
gradiente de eluyentes (Figura 10.12), que se inicia con un eluyente polar A, el

cual desplaza inicialmente de la columna los aminocidos ms polares. Se produce un aumento gradual del porcentaje de un eluyente apolar B, con lo que
aumenta la apolaridad de la fase mvil, producindose un desplazamiento gradual de la columna de los aminocidos ms hidrofbicos. Al final, el 100% de la
fase mvil pasa a ser del eluyente B. En la ltima parte de la cromatografa, la
fase mvil pasa del 100% de B al 100% de A; as la columna queda limpia y estabilizada para realizar la siguiente cromatografa. El flujo de la fase mvil se
mantiene en todo momento a 1 mL/min.
En el Anexo de Mtodos del CD se explica con mayor detalle la determinacin de aminocidos por el mtodo Pico-Tag.
Los pasos del mtodo son los siguientes:
Desproteinizacin. Las muestras y patrones se desproteinizan con acetona y se
mantienen en fro, para favorecer la precipitacin de las protenas. Las protenas
son separadas por centrifugacin, y el sobrenadante libre de protenas se puede
conservar a 20 C hasta su utilizacin.
Derivatizacin. Los aminocidos son derivatizados con fenilisotiocianato a temperatura ambiente y pH bsico. Antes de proceder a la reaccin de derivatizacin, la acetona es eliminada por evaporacin para que no interfiera en dicha
reaccin. Una vez derivatizadas las muestras, se vuelven a secar y, de esta manera, pueden guardarse durante das en el congelador a 20 C.
Figura 10.12. Ejemplo de programa de

elucin para una separacin
cromatogrfica de aminocidos por HPLC
utilizando el mtodo PICO-TAG. Se
indica el tiempo en que se inicia cada
nueva mezcla de los disolventes A y B
(respecto del tiempo de inicio de la
cromatografa), el flujo de cada mezcla y
sus porcentajes de A y B.
Separacin cromatogrfica. Los aminocidos secos se disuelven con diluyente

de muestra y se centrifugan para recoger un sobrenadante libre de partculas en
suspensin que podran afectar a la columna. La muestra se deposita en viales
de HPLC para separacin cromatogrfica en fase reversa y se utiliza para la cromatografa una columna Pico-TagTM.
El proceso de separacin tiene lugar a travs de un gradiente de elucin que
va desde una polaridad alta del eluyente a una polaridad baja; esto se consigue
utilizando dos eluyentes de diferente polaridad que se van mezclando, con un
programa de elucin.
Los aminocidos derivatizados son detectados por el detector gracias a su capacidad de absorcin de luz a 254 nm, obtenindose un cromatograma como el
que se representa en la figura 10.13. En general, los aminocidos ms polares
son eluidos durante los primeros minutos, mientras que los aminocidos ms
Figura 10.13. Cromatograma de los
feniltiocarbamil-aminocidos de una
muestra de sangre. Se representa el
tiempo de retencin frente a la
absorbancia de los feniltiocarbamilaminocidos a 254 nm (DO: densidad
ptica).
145
Captulo 10
apolares son eluidos al final del cromatograma, cuando la proporcin en la mezcla de eluyentes es mayoritariamente del eluyente B, que es ms apolar.
Clculos. El integrador del aparato de HPLC proporciona los clculos de concentracin de cada aminocido, a partir de los valores de las reas de los picos
producidos por los aminocidos derivatizados, y de la concentracin del patrn
interno y del factor de respuesta de cada aminocido, calculado este ltimo a
partir del paso de patrones externos de distintas concentraciones (de manera
anloga al clculo realizado para los dansil-aminocidos separados por TLC).
ANALIZADORES AUTOMTICOS DE AMINOCIDOS

Los analizadores automticos de aminocidos utilizan resinas de intercambio
inico para la separacin de stos. A la salida de la columna de separacin cromatogrfica, se acopla la entrada de reactivo de ninhidrina y se incuba el eluido
junto con el reactivo en un bao a 100 C. Los aminocidos reaccionan con la
ninhidrina, produciendo compuestos coloreados, cuya intensidad de absorcin
puede ser medida. Todas las operaciones se realizan de forma automtica en
estos aparatos, que se encuentran acoplados a un ordenador-controlador (Figura 10.14).
Figura 10.14. Esquema de un analizador
automtico de aminocidos.
El analizador de aminocidos utiliza una resina de intercambio catinico

fuerte. La variacin del pH del tampn eluyente permite separar los aminocidos. Los aminocidos son retenidos en la columna intercambiadora catinica
fuerte utilizando un pH cido en el medio, ya que ste provoca que los aminocidos presenten carga positiva y queden retenidos en la columna. Los aminocidos son eluidos de manera diferencial aumentado el pH del eluyente de manera
gradual, lo que provoca que los aminocidos con pI ms bajo sean eluidos en
primer lugar (ver figura 10.2). El pH inicial del eluyente es 3, de manera que los
aminocidos con un grupo cido presentan carga tanto positiva como negativa,
por lo que no son retenidos por la columna y se eluirn de forma rpida. Los
aminocidos bsicos, por el contrario, presentan a este pH una doble carga positiva, por lo que sern fuertemente retenidos por la columna y se eluirn nica146
mente cuando el pH aumente hasta el punto de reducir una de las cargas positivas del aminocido. La posicin relativa de los aminocidos en el cromatograma
no slo viene determinada por el pH del eluyente, sino tambin por la concentracin de cationes en ste. Generalmente, se utilizan tampones de citrato sdico e iones sodio positivos, que compiten con los aminocidos cargados
positivamente por la unin a las cargas negativas que la resina posee. Aunque los
aminocidos tienen una gran afinidad por la resina, los iones sodio pueden estar
presentes en mucha mayor concentracin; por tanto, los aminocidos se vern
desplazados de la resina. La molaridad del tampn eluyente influye tambin en
la elucin, de modo que, cuando la fuerza inica del eluyente aumenta, los aminocidos se eluyen ms rpidamente de la columna al haber ms interacciones
de iones del tampn con los puntos de unin de la columna, provocando la liberacin de aminocidos retenidos.
En el orden de elucin de los aminocidos tambin intervienen las interacciones no inicas de stos con el relleno de la columna, lo que provoca que se
eluyan de manera diferente aminocidos con el mismo pI. As, la polaridad de la
cadena lateral de un aminocido influye en su orden de elucin; los aminocidos con cadenas laterales hidrofbicas interaccionan ms con el relleno de la columna, ya que normalmente es hidrofbico (por ejemplo, poliestireno). Otros
factores pueden influir en la separacin de aminocidos por este tipo de cromatografa, como la temperatura y la velocidad del flujo o el tipo de catin utilizado
en el tampn eluyente.
Al salir de la columna, los aminocidos reaccionan con ninhidrina pasando a
travs de una espiral que se encuentra situada en un bao a 100 C. Adems, se
mide continuamente la absorbancia a 570 nm y 440 nm, para detectar aminocidos e iminocidos respectivamente (Figura 10.15).
En algunos instrumentos de este tipo se utiliza la reaccin del o-ftaldehdo
para derivatizar los aminocidos. Este reactivo es estable y soluble en agua, por
lo que se evita el uso de disolventes orgnicos txicos y no es necesario un almacenamiento bajo atmsfera de nitrgeno. Adems, la reaccin puede realizarse a temperatura ambiente. Es tambin una reaccin ms sensible y permite
detectar los aminocidos hasta un nivel de picomoles.
Al igual que en la separacin y cuantificacin por TLC y HPLC, se utilizan patrones internos y externos.
Figura 10.15. Cromatograma de la
separacin de aminocidos de una
muestra de suero obtenido tras su anlisis
en un analizador automtico de
aminocidos.
147
Mtodos de determinacin de protenas

INTRODUCCIN
Estructura de las protenas
Fuerzas determinantes de la estructura proteica
Fuerzas electrostticas
Puentes de hidrgeno
Fuerzas hidrofbicas
Fuerzas de Van der Waals
Puentes disulfuro
Desnaturalizacin de las protenas

MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Mtodo de Kjeldahl (determinacin del contenido en nitrgeno)
Mtodo del biuret
Mtodo de Lowry
Mtodo del BCA
Mtodo de Bradford
Nefelometra
Determinacin de albmina
Determinacin de hemoglobina
148
11
INTRODUCCIN
El nombre de protenas (del griego proteios) significa el primero o en primer lugar
y deriva del hecho de que son las macromolculas ms abundantes en las clulas y constituyen la mitad del peso seco de la mayor parte de los organismos. Las
protenas se caracterizan por encontrarse en todas las clulas. Existen centenares
de tipos de protenas diferentes, desempeando una gran cantidad de papeles
biolgicos, por formar parte de estructuras celulares y ser las herramientas moleculares de un gran nmero de procesos.
El nmero de protenas diferentes que se puede encontrar en una clula humana es considerablemente elevado; por ejemplo, slo en el plasma sanguneo
pueden ser identificadas ms de 300. Algunas protenas son sintetizadas o circulan en plasma nicamente en determinados momentos del desarrollo o en circunstancias fisiolgicas o patolgicas particulares.
Existe una variedad impresionante de protenas con funciones, tamaos, formas y estructuras diferentes, todo ello a pesar de que en su constitucin solamente intervienen unos pocos D-aminocidos diferentes. Este reducido nmero
de D-aminocidos puede combinarse en distintas secuencias para producir una
enorme diversidad de protenas. La secuencia de aminocidos es la que, en ltima instancia, determina las caractersticas de la protena, y se encuentra definida
por la informacin gentica contenida en el ADN de cada clula.
Los mtodos para la determinacin de protenas, al igual que los mtodos
destinados a aislar otros tipos de molculas, se basan en las caractersticas diferenciales de estas biomolculas respecto al resto de molculas biolgicas (lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos, etc.). Las protenas son polmeros de D-aminocidos y contienen carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y azufre. El nitrgeno
representa aproximadamente el 16% del peso de las protenas y su presencia diferencia a stas de los lpidos y los carbohidratos. As pues, las caractersticas comunes que las distintas protenas comparten han permitido el desarrollo de
diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas totales, tal y como se explica ampliamente en este captulo.
149
Captulo 11
Cuando deben separarse y analizarse distintas protenas (o distintos grupos de

protenas) entre s, se ha de recurrir a la explotacin de sus diferencias individuales, tal y como se explica en captulos posteriores. Estos anlisis pueden llevarse
a cabo tanto por mtodos que exacerben diferencias fsicas, como por mtodos
que hagan uso de las propiedades enzimticas de algunas protenas o mtodos
que se basen en la deteccin de una protena a travs del reconocimiento de su
estructura tridimensional (por mtodos inmunoqumicos, utilizando un tipo de
protenas las inmunoglobulinas para detectar otras).
Para poder entender los mtodos desarrollados para aislar y estudiar protenas, debe hacerse referencia primero a las caractersticas propias de estas macromolculas.
Estructura de las protenas

Las protenas estn formadas por aminocidos unidos entre s, de forma que el
grupo carboxilo de un aminocido reacciona con el grupo D-amino del aminocido contiguo, con prdida de una molcula de agua. El enlace formado es un
grupo amida (CONH) que se denomina enlace peptdico (Figura 11.1). La secuencia de aminocidos en cada protena es nica y est perfectamente definida. Esta secuencia estructura primaria es la que determina, en ltima
instancia, la funcin biolgica de la protena.
Figura 11.1. Formacin de un enlace
peptdico.
En algunos casos, aparte de la cadena polipeptdica propia, las protenas pueden estar conjugadas con otros compuestos. Este tipo de protenas se conoce
con el nombre de protenas conjugadas y la parte no polipeptdica recibe el
nombre de grupo prosttico (Figura 11.2).
Figura 11.2. Clasificacin de las protenas
conjugadas.
El enlace peptdico tiene caractersticas de doble enlace, debido a la presencia de una estructura resonante de dicho enlace, por lo que la distancia entre los
tomos es menor que la considerada normal para un enlace simple (Figura 11.3).
La estructura resonante I, cuyo enlace CN es sencillo y del tipo V, permite el
giro de grupos alrededor de dicho enlace, pero la estructura resonante II, que
contiene un enlace doble, enlace V y enlace S, impide la rotacin. En la estructura resultante de la hibridacin entre las formas resonantes I y II, los electrones
del orbital S estn deslocalizados a lo largo de los enlaces CO y CN, y la rota150

Figura 11.3. Estructura electrnica
resonante del enlace peptdico. I: forma
resonante I; II: forma resonante II; R:
forma resultante.
cin del enlace CN est impedida. Por este motivo, los seis tomos ms implicados en el enlace peptdico (Figuras 11.4 y 11.5) se hallan en el mismo plano.
La coplanaridad del enlace peptdico determina que las nicas libertades de
giro se siten en los enlaces de los carbonos D, que as sirven de nexo de unin
entre los distintos planos que componen el esqueleto de la protena. Para cada
uno de los carbonos D (CD) se definen dos ngulos, I (phi) y \ (psi), que corresponden a la rotacin de los enlaces CDiNi y CDiCi + 1 (Figura 11.5), respectivamente. Si se conoce el valor de estos ngulos para cada uno de los CD, la
disposicin espacial de la cadena polipeptdica queda definida exactamente. El
bioqumico indio Ramachandran populariz la idea de que la conformacin de
una cadena polipeptdica puede ser totalmente descrita representando cada residuo de aminocido en un grfico bidimensional por sus valores de I y \. Estos
grficos se conocen con el nombre de representaciones de Ramachandran.
Los ngulos I y \ no pueden tomar cualquier valor, debido a que se producen impedimentos estricos. El estudio de modelos moleculares slidos de tomos realizados a escala en funcin de sus radios de Van der Waals ha permitido
determinar qu valores de los ngulos estn prohibidos a causa del impedimento
estrico. Los valores permitidos son los que determinan el plegamiento de la
protena y la estructura tridimensional.
Hay seis niveles de organizacin de la estructura de las protenas (Figura 11.6):
Figura 11.4. Dimensiones y ngulos de

enlace del enlace peptdico.
Estructura primaria. Hace referencia a la secuencia de aminocidos que

forma la protena.
Estructura secundaria. Hace referencia a la disposicin regular del esqueleto polipeptdico; este nivel de estructura tambin se denomina grupo lineal.
Estructura supersecundaria. Hace referencia a la formacin de agregados
fsicos preferenciales de estructuras secundarias.
Dominios estructurales. Hace referencia a partes de la protena con regiones globulares bien diferenciadas.
Estructura terciaria. Hace referencia a la estructura tridimensional de una
protena.
Estructura cuaternaria o agregados proteicos. Se corresponde al nivel de
mxima complejidad y resulta de la asociacin de diferentes cadenas polipeptdicas para formar agregados.
Fuerzas determinantes de la estructura proteica

Aparte de los enlaces peptdicos, son tambin cruciales otras uniones en la estructura de las protenas; en este sentido, se puede hablar de fuerzas no covalentes y de puentes disulfuro. Las fuerzas no covalentes son de uno a tres
Figura 11.5. Representacin de los

ngulos de Ramanchandran.
151
Captulo 11
Figura 11.6. Diferentes niveles de
estructura de las protenas.
rdenes de magnitud ms dbiles que las correspondientes al enlace covalente

y son:
Puentes de hidrgeno
Fuerzas hidrofbicas
Figura 11.7. Interaccin electrosttica
entre el grupo amino terminal Ile 16 (con
carga positiva) y el residuo Asp 194 (con
carga negativa) de la estructura de la
quimotripsina, que presenta 4 cadenas
polipeptdicas.
Estas fuerzas se dan entre grupos cargados (las cadenas laterales de algunos aminocidos presentan carga a pH fisiolgicos, que puede ser positiva debida a
aminocidos bsicos, o negativa a aminocidos cidos). Estas interacciones se
conocen con el nombre de puentes salinos. La magnitud de estas fuerzas depende de la constante dielctrica del medio, de forma que en el medio no acuoso
del interior de la protena, la fuerza de atraccin entre grupos es mayor que en
su superficie (el agua tiene una constante dielctrica elevada). Los grupos cargados tienden a situarse en la superficie de la protena con objeto de estabilizar la
macromolcula en el entorno acuoso, y no tienen tanta importancia en el proceso de plegamiento de la protena como otras interacciones (Figura 11.7).
Puentes de hidrgeno
Figura 11.8. Interaccin por puente de

hidrgeno entre los grupos amino y
carbonilo de la Gly 211 y la Leu 199 en la
quimotripsina.
152
Los puentes de hidrgeno son enlaces que se establecen entre dos tomos electronegativos a travs del hidrgeno unido covalentemente a uno de ellos. Normalmente la distancia de un puente de hidrgeno en una protena es un
10-25% mayor que la que existe entre dos molculas de agua unidas por puente de hidrgeno. Las limitaciones de tipo geomtrico a la hora de formar estos
enlaces entre dos grupos del esqueleto proteico impiden, por otro lado, que los
dipolos se hallen perfectamente alineados, que sera la situacin de mxima
energa de enlace (Figura 11.8).
Desde el punto de vista estructural, las protenas siguen la estrategia de establecer el mximo nmero posible de puentes de hidrgeno intramoleculares entre los tomos componentes de sus enlaces peptdicos, y de mantener en su
superficie el mximo nmero de cadenas laterales con posibilidad de formar

puentes de hidrgeno con molculas de agua.
Fuerzas hidrofbicas
Algunos aminocidos tienen en su cadena lateral grupos hidrofbicos (todos los
aminocidos con cadena lateral apolar). Estos grupos se ordenan de tal manera
que forman un ncleo hidrofbico en el interior de la protena sin la presencia de
agua (Figura 11.9), mientras que los aminocidos cargados se sitan en el exterior
de la protena. La introduccin de aminocidos con cadenas laterales con grupos
polares en el interior hidrofbico de la protena suele compensarse con la formacin favorable de puentes de hidrgeno. Se ha comprobado que un 90% de los
grupos polares internos se hallan formando enlaces de hidrgeno intramoleculares.
Figura 11.9. Interaccin hidrofbica entre

la cadena lateral de la Phe 71 (apolar) y la
de la Pro 24 (apolar) de la quimotripsina.
En la figura se representan las distancias
de los radios de Van der Waals.
En el plegamiento de las protenas, puede darse tambin la situacin de que diferentes tomos se encuentren a la distancia adecuada para que se establezcan
entre ellos otras interacciones de tipo Van der Waals, encontrndose de esta manera la protena en un estado favorable desde el punto de vista termodinmico
(Figura 11.10).
Las fuerzas de Van der Waals son atracciones elctricas dbiles entre diferentes tomos. Estas fuerzas se deben a que cada tomo posee una nube electrnica que puede fluctuar, creando de esta manera dipolos temporales. El dipolo
transitorio en un enlace puede inducir un dipolo complementario en otro enlace, provocando que dos tomos de diferentes enlaces se mantengan juntos. Estas
atracciones de Van der Waals, aunque transitorias y dbiles, son un elemento
importante en la estructura de las protenas.
Puentes disulfuro
Los puentes disulfuro (SS) son enlaces de tipo covalente que se establecen entre los tomos de azufre de restos de cistena de una misma cadena o bien entre
restos de cadenas proteicas distintas. Aunque los puentes disulfuro no estn implicados en la direccin del proceso de plegamiento de la cadena polipeptdica,
son a menudo esenciales para el mantenimiento de la estructura nativa. La
abundancia de puentes disulfuro en protenas como las hormonas peptdicas, las
enzimas digestivas o las inmunoglobulinas, confiere a dichas protenas la estabilidad necesaria para que puedan ejercer su funcin en el medio extracelular.
Adems, los puentes disulfuro proporcionan a diversas protenas, como las Dqueratinas, muchas de sus propiedades elsticas caractersticas. Por el contrario,
aquellas protenas que no abandonan el medio celular suelen tener pocos puentes disulfuro, y normalmente stos se encuentran ms implicados en la funcin
de la protena que en el mantenimiento de su estructura nativa (Figura 11.11).
Figura 11.10. Interacciones de Van der

Waals entre los diferentes tomos que
forman la quimotripsina. En la figura se
representan las distancias de los radios de
Van der Waals de los diferentes tomos de
las cadenas polipeptdicas.
Desnaturalizacin de las protenas

El estudio de los procesos de desnaturalizacin y renaturalizacin de las protenas (prdida de la estructura tridimensional por la accin de agentes externos,
Figura 11.11. Enlace por puente disulfuro

entre la Cys 136 y la Cys 201 de la
quimotripsina.
153
Captulo 11
por calor, por cambios en el pH del medio, etc., y recuperacin de nuevo de

esta disposicin espacial) ha permitido obtener dos conclusiones de gran importancia para el conocimiento de la conformacin proteica. La primera es que su
conformacin espacial viene impuesta por la secuencia de los aminocidos en la
cadena. La segunda es que el proceso de plegamiento es energticamente favorable, y las fuerzas que lo gobiernan se encuentran establecidas por la cadena
polipeptdica y dependen del medio en que sta se encuentra. La protena naturalizada se llama nativa, mientras que la protena desnaturalizada se denomina
protena enrollada al azar (desordenada). La energa libre media necesaria para la
desnaturalizacin de una protena es tan slo de 5-12 kcal/mol, lo que equivale
a la ruptura de tres o cuatro enlaces por puente de hidrgeno. As, las protenas
se caracterizan por presentar un intervalo muy pequeo de estabilidad termodinmica. Los aumentos y las disminuciones del pH cambian la carga de las cadenas laterales ionizables de las protenas, lo que provoca la ruptura de enlaces
salinos que intervienen en el mantenimiento de su estructura tridimensional. El
calentamiento de una disolucin de protena aumenta las energas vibratorias y
rotatorias de las molculas de protena disueltas, rompiendo interacciones dbiles que estabilizan la conformacin plegada. Los agentes desnaturalizantes (tambin conocidos como agentes caotrpicos), como la urea y el cloruro de
guanidinio, desnaturalizan las protenas porque rompen los puentes de hidrgeno que poseen, provocando su desplegamiento. En el caso de los detergentes
como el dodecil sulfato sdico (SDS), sus colas hidrofbicas interaccionan con
las cadenas laterales apolares del interior de las protenas, lo que provoca un
desplegamiento de stas, generando un complejo protena-detergente que posee una superficie cargada (Figura 11.12).
Figura 11.12. Representacin del proceso
de desnaturalizacin de una protena.
Los procesos de renaturalizacin demuestran que la secuencia de aminocidos contiene toda la informacin relativa a la organizacin tridimensional de las
protenas, lo que indica que los distintos niveles de organizacin estructural son
dependientes unos de otros, y que los elementos que se encuentran en el nivel
ms bajo de la jerarqua estructural determinan los de nivel superior.
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Como ya se ha comentado, los mtodos de determinacin de protenas totales
estn basados en sus caractersticas diferenciales respecto del resto de biomolculas presentes en las muestras biolgicas. Hay mtodos que tienen su principio
en la determinacin de la cantidad de nitrgeno presente (mtodo de Kjeldahl),
en la presencia del enlace peptdico (mtodos del biuret, de Lowry y de BCA
cido bicinconnico), en la formacin de complejos con determinados agentes
(mtodo de Bradford) o en la capacidad de las protenas de precipitar en presencia de determinados agentes caotrpicos (nefelometra). En algunos casos es ne154
cesario que las protenas reaccionen con algn reactivo que les permita adquirir
una caracterstica que pueda medirse (como el color), ya que, aunque la presencia de los residuos de tirosina (que absorben radiacin electromagntica a
193 nm y, en menor medida, a 280 nm) y de triptfano (absorben a 219 nm y,
en menor medida, a 280 nm) provoca que las protenas absorban luz a una longitud de onda de 280 nm, esta absorcin es demasiado baja e inespecfica para
poder ser utilizada por s misma en la cuantificacin de las protenas.
Los primeros factores a considerar, como se ha venido diciendo repetidamente, para seleccionar un mtodo de anlisis, son la naturaleza de la muestra y
la presencia de sustancias que puedan interferir. Por ello a veces es necesaria
una etapa previa de purificacin para eliminar las sustancias que interfieren.
Existen varias posibilidades. Por ejemplo, se pueden precipitar las protenas solubles, lavarlas y cuantificarlas despus por un mtodo adecuado. Si la precipitacin se realiza por calor o con cidos fuertes, es irreversible, por lo que es
necesario utilizar un mtodo del tipo del mtodo de Kjeldahl para la cuantificacin de protenas. Si la precipitacin se produce con sales o alcohol, el precipitado proteico puede redisolverse en una base, con lo que despus puede utilizarse
un mtodo para la determinacin de protenas totales como el del biuret. Otra
posibilidad es eliminar las sustancias que producen la interferencia, que a menudo son molculas pequeas (como aminocidos), por dilisis (ver captulo 17).
Mtodo de Kjeldahl
(determinacin del contenido en nitrgeno)
El mtodo de Kjeldahl para la determinacin de protenas totales se basa en la
determinacin del nitrgeno proteico (Figura 11.13). Se trata de un mtodo que,
aunque resulta muy exacto, se emplea poco hoy en da debido a que es un mtodo lento para la determinacin de protenas totales en clnica. Sin embargo, su
uso est bastante extendido en la determinacin de protenas en alimentos, sobre todo con el uso de aparatos automatizados.
El mtodo de Kjeldahl sirve para determinar la cantidad total de nitrgeno
de un compuesto, aunque puede utilizarse para calcular la cantidad de protena que hay en una muestra, si se conoce la proporcin de nitrgeno en la protena que, por trmino medio, se sita en un 16%. Las determinaciones de
Figura 11.13. Esquema y aparato para
llevar a cabo el mtodo de Kjeldahl.
155
Captulo 11
protenas por este mtodo presentan interferencias debidas a la presencia de

nitrgeno no proteico; dichas interferencias pueden evitarse precipitando las
protenas y determinando la presencia de nitrgeno en el precipitado de protenas.
El mtodo se basa en una digestin cida de las muestras (ver Anexo de Mtodos del CD). Se transforma el nitrgeno presente en in amonio (NH 4+) mediante digestin en caliente con cido sulfrico; este proceso requiere la
presencia de iones cpricos y necesita varias horas. El in amonio se evapora
en forma de amonaco aadiendo NaOH; el vapor es recogido por destilacin
contra corriente en un frasco receptor que contiene cido brico (pasando nuevamente a NH4+). Los iones NH4+ son valorados con cido clorhdrico (HCl), utilizando como indicador rojo metilo. A partir del nmero de equivalentes de
HCl utilizados, se puede conocer la cantidad de nitrgeno presente y, multiplicando por el factor adecuado, la cantidad de protena presente. Es decir 1
equivalente de HCl equivale a 14 g de nitrgeno o, lo que es lo mismo, a
87,5 g de protena (si se supone que el contenido en nitrgeno de la protena
es del 16%).
El mtodo de Kjeldahl posee una elevada precisin, es capaz de discernir entre muestras con una variacin del orden del 1%, pero presenta el problema de
que se debe conocer el porcentaje de nitrgeno en las protenas de las muestras
analizadas. Como ya se ha comentado, su uso se encuentra muy extendido en el
estudio del contenido de protenas en alimentos.
Mtodo del biuret
Figura 11.14. Complejo del Cu+ con

cuatro molculas de biuret.
Figura 11.15. Estructura del biuret (A) y de

un tetrapptido (B).
156
El nombre del mtodo se lo da el compuesto conocido como biuret, que forma

complejos de coloracin azul con el Cu+ (Figura 11.14).
Los enlaces peptdicos de las protenas son estructuralmente similares a los
del biuret y reaccionan de la misma manera (Figura 11.15). La reaccin del biuret es una reaccin general de las protenas, y se produce con protenas que presentan al menos dos enlaces peptdicos o dos grupos amida consecutivos. Estos
grupos son capaces de reducir el Cu2+ a Cu+, igual que hacen las molculas de
biuret, formando el Cu+ un complejo con las protenas en medio alcalino, que
produce una coloracin azul con mximos de absorcin de radiacin electromagntica a 330 nm y a 545 nm (Figura 11.16). Aunque en este mtodo las medidas de absorcin de luz a la menor longitud de onda de absorcin (330 nm)
proporcionan mayor sensibilidad (ya que el coeficiente de extincin molar es
mayor), a dicha longitud de onda es tambin ms fcil que se presenten interferencias debidas a la presencia de otros compuestos.
La cantidad de luz absorbida por el complejo es directamente proporcional

al color producido, el cual, a la vez, es proporcional al nmero de enlaces
peptdicos. El contenido total de protena es proporcional al nmero de enlaces peptdicos. Por lo tanto, la reaccin del biuret permite la determinacin
cuantitativa de protena total por espectrofotometra. Debido a que al menos
se requieren dos enlaces peptdicos para que tenga lugar la reaccin, los aminocidos y los dipptidos no reaccionan de esta manera. Los pptidos pequeos reaccionan formando complejos con el Cu+ pero, en el caso de que se
determinen las protenas en suero, su concentracin en suero es tan baja que
contribuyen poco. Los iones amonio interfieren en este mtodo, pero no a las
concentraciones a las que se encuentran en el suero (ver Anexo de Mtodos
del CD).
El mtodo es poco susceptible de errores, es muy fiable y cumple la ley de
Beer-Lambert hasta concentraciones finales de protena en tubo de aproximadamente 2 g/L, aunque muestras con concentraciones finales de menos de
100 Pg/L de protena son difciles de medir. El color alcanza su intensidad mxima a los 10 minutos del inicio de la reaccin y es estable durante al menos
varias horas.
Figura 11.16. Espectro de absorcin de los

complejos de molculas de biuret con Cu+.
Mtodo de Lowry
El mtodo de Lowry (1951) utiliza tres sistemas para producir coloracin por la
presencia de protenas. En primer lugar, el Cu+, forma complejos de coordinacin con dos enlaces peptdicos consecutivos de las protenas, dando lugar a un
compuesto coloreado azul de manera similar al mtodo del biuret. En segundo lugar, este compuesto es capaz de reducir al reactivo de Folin-Ciocalteu (cido fosfotngstico y fosfomolbdico), dando un color ms azulado. Por ltimo, el
reactivo de Folin-Ciocalteu tambin reacciona con los restos tirosinil (residuos de
tirosina) de la cadena polipeptdica, produciendo asimismo un color azul por la
reduccin del fosfomolibdato en medio bsico.
El espectro de absorcin no corresponde a una nica sustancia, por lo que
puede emplearse un amplio margen de longitudes de onda, entre 500 y
700 nm, para la lectura de la absorbancia (ver Anexo de Mtodos del CD).
El mtodo de Lowry es unas 100 veces ms sensible que el del biuret. La sensibilidad es una ventaja cuando se miden concentraciones muy bajas de protena. El mtodo de Lowry es muy utilizado en investigacin, sobre todo para la
determinacin cuantitativa de protenas tisulares y enzimas en preparaciones purificadas. Por otra parte, ciertos frmacos interfieren en el proceso y por ello el
mtodo no suele utilizarse en los laboratorios clnicos.
Mtodo del BCA

El mtodo del cido bicinconnico (BCA) es un mtodo que permite la determinacin colorimtrica de la protena total de una muestra. Combina la reduccin
del Cu2+ a Cu+ por las protenas en un medio alcalino (reaccin del biuret) y la
determinacin de los iones cuprosos formados por el establecimiento de un
complejo con el BCA (Figura 11.17). ste presenta coloracin prpura, con un
mximo de absorcin a 562 nm (ver Anexo de Mtodos del CD).
Figura 11.17. Reduccin del in cprico a

cuproso por accin de las protenas (en
medio alcalino) y posterior
acomplejamiento del in cuproso con dos
molculas de cido bicinconnico (BCA).
157
Captulo 11
Mtodo de Bradford
Este mtodo se fundamenta en que la unin de las protenas al colorante azul
brillante de Coomassie G-250 provoca un desplazamiento del mximo de absorcin de este compuesto, desde 465 nm a 595 nm (Figura 11.18). Por lo tanto las
medidas de absorbancia del complejo protena-colorante se realizarn a 595 nm
(ver Anexo de Mtodos del CD).
Nefelometra
Figura 11.18. Espectro de absorcin del
complejo protena-azul de Coomassie G250. A: azul de Coomassie; B: complejo
protena-colorante.
Algunos mtodos para la cuantificacin de protenas se basan en la facilidad que

presentan muchas de ellas para precipitar en determinadas condiciones. Se utilizan reactivos especficos de precipitacin, generalmente cidos orgnicos, como
el cido tricloroactico, y la turbidez producida se compara fotomtricamente
con la producida por una concentracin conocida de protena.
Cuando la luz choca contra una partcula en suspensin, parte de esta luz es
dispersada. La dispersin de la luz por una partcula depende de su tamao, de
su ndice de refraccin con relacin al del lquido que la rodea y de la longitud
de onda de la luz. La luz dispersada por las partculas en suspensin puede medirse por dos tcnicas, que son la turbidometra y la nefelometra.
La turbidometra se basa en la medida de la disminucin de la luz transmitida
a travs de una solucin con partculas. Las medidas turbidomtricas se realizan
con espectrofotmetros.
La nefelometra se basa en la medida de la luz dispersada a diversos ngulos
por una suspensin de partculas. En la figura 11.19 se muestran esquemticamente los componentes de un nefelmetro, que son los siguientes:
Figura 11.19. Esquema de un nefelmetro

y sus componentes.
158
Fuente de luz
Filtro de excitacin
Cubeta de muestra
Filtro
Detector
Sistema de registro
Los componentes pticos de los turbidmetros y nefelmetros son semejantes a los de los espectrofotmetros y los de los fluormetros. La principal diferencia es que la longitud de onda de excitacin y la de deteccin en los
nefelmetros es la misma.
En el Anexo de Mtodos del CD de este libro se puede encontrar un mtodo
para la determinacin de protenas en orina por nefelometra.
Determinacin de albmina
La albmina de las muestras de plasma se puede determinar por el cambio de
coloracin del verde de bromocresol cuando se une selectivamente a sta a pH
4,2. El cambio de coloracin se refleja en que se provoca un cambio en la absorbancia del verde de bromocresol, que tiene un mximo de absorcin a
440 nm y pasa a presentar su mximo a 630 nm. El verde de bromocresol es
amarillo, mientras que el complejo protena-colorante tiene un intenso color
azul. Este mtodo permite detectar de 50 Pg a 0,2 g de albmina (ver Anexo de
Mtodos del CD).
Determinacin de hemoglobina
Los niveles de hemoglobina en sangre pueden determinarse por un mtodo espectrofotomtrico que se fundamenta en la capacidad que presentan la hemoglobina y sus derivados (excepto la sulfohemoglobina), en medio alcalino y en
presencia de ferrocianuro potsico, de ser oxidados a metahemoglobina; esta
ltima reacciona con el cianuro potsico para producir cianohemoglobina, la
cual presenta un mximo de absorcin a 540 nm. La absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina presente en las muestras (ver Anexo de Mtodos del CD).
159
Tcnicas de separacin: electroforesis

INTRODUCCIN
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
Componentes de un sistema electrofortico
Migracin electrofortica
Naturaleza de los compuestos a separar
Campo elctrico
Tampn
Soporte
TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis en papel de filtro
Electroforesis en membranas de acetato de celulosa
Electroforesis en geles de almidn
Electroforesis en geles de agarosa
Electroforesis en geles de poliacrilamida
VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN DE LOS RESULTADOS
APLICACIONES PARTICULARES DE LA ELECTROFORESIS
Isoelectroenfoque
Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE
Electroforesis en gradiente
Electroforesis bidimensional
Electroforesis capilar (CE)
160
12
INTRODUCCIN
Uno de los rasgos diferenciales entre las distintas biomolculas es la carga
que presentan, y que puede cambiar en funcin del pH del medio en que se
encuentren. La mayora de las biomolculas presentan grupos cidos y bsicos dbiles, lo que determina que el signo (positivo o negativo) de la carga
de cada una depender, sobre todo, del pH y de la composicin de la disolucin en la que se encuentre, pudindose alterar significativamente. As, se
han desarrollado y diseado una serie de mtodos que permiten la separacin de molculas en funcin de su carga. Uno de esos mtodos ya se ha comentado en el presente libro, la cromatografa de intercambio inico (ver
captulo 9); a continuacin nos centraremos en otro mtodo de gran inters:
la electroforesis.
La electroforesis consiste en la migracin de molculas cargadas a travs de
un medio por la accin de un campo elctrico. Las tcnicas electroforticas tienen como fuerza impulsora la generada por el campo elctrico y como fuerza
retardante la que puede ejercer el medio contra el movimiento. De esta manera,
las tcnicas electroforticas se fundamentan en una velocidad de migracin diferencial de las biomolculas cuando son sometidas a un campo elctrico. Tanto la
direccin como la velocidad de migracin de cada molcula dependen del signo
y de la intensidad de la carga que presenta, as como de las caractersticas del
medio en el que migra.
La tcnica de la electroforesis se ha ido refinando con el tiempo, de forma
que se pueden separar las molculas no nicamente por su carga, sino tambin por su tamao, pudindose as diferenciar molculas con el mismo tipo
de carga gracias al uso de medios que permitan el cribado molecular. Actualmente, la electroforesis se ha automatizado de manera similar al HPLC, de forma que se ha desarrollado la llamada electroforesis capilar, que permite la
separacin y cuantificacin de molculas por electroforesis de manera automtica.
161
Captulo 12
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
La electroforesis consiste en la migracin de partculas cargadas sometidas a la
influencia de un campo elctrico, de tal forma que las molculas con carga positiva migran al ctodo (electrodo con carga negativa) y las molculas con carga
negativa migran al nodo (electrodo con carga positiva). La velocidad de esta migracin se encuentra influenciada por las caractersticas de la biomolcula que
migra (la carga que transporta), la intensidad del campo elctrico y las caractersticas del medio en la que tiene lugar la migracin.
La velocidad de migracin de una molcula cargada es el resultado de una
fuerza impulsora del movimiento, de tipo electrosttico:
Fimpulsora
QuE
donde: Q: carga elctrica de la molcula

E: intensidad del campo elctrico
y de una fuerza que retarda el movimiento, fuerza de friccin. En el caso de que

la molcula sea esfrica, segn la ley de Stoke, esta fuerza es:
Fretardadora
donde: r: radio de la molcula (esfrica)

K: viscosidad del medio
v: velocidad de la molcula
6uSu ruKu v
La fuerza retardadora contrarresta la fuerza impulsora. Inicialmente, la fuerza

impulsora es mayor que la retardadora, de manera que la molcula cargada migra cada vez ms rpido, con lo que aumenta la fuerza retardadora, llegando un
momento en que sta contrarresta la impulsora; a partir de este momento la
molcula migra a una velocidad constante.
Fimpulsora = Fretardadora
QuE=6uSuruKuv
QuE
6uSuruK
La velocidad constante a la que migra una molcula es funcin de su forma (del

radio r si es esfrica), de la carga de la molcula (Q), de la intensidad del campo
elctrico (E) y de la viscosidad del medio a travs del cual migra la molcula (K).
Se conoce como movilidad electrofortica de una molcula P a la velocidad de migracin corregida por la intensidad del campo elctrico:
P
v
E
Q
6uSuruK
Por consiguiente, la movilidad electrofortica de una molcula es directamente proporcional a la carga que presenta, e inversamente proporcional a su
tamao y a la viscosidad del medio en el que transcurre la electroforesis.
La electroforesis, por lo tanto, es una tcnica que permite separar molculas
con carga neta y que presentan diferencias de carga, forma y tamao. As, mediante esta tcnica pueden separarse protenas, cidos nucleicos, pptidos, nucletidos, aminocidos, etc.
162
Componentes de un sistema electrofortico

La realizacin de una separacin electrofortica requiere dos dispositivos:
uno que genera el campo elctrico (fuente electrofortica) y otro, que contiene el soporte con las muestras, donde se realiza la separacin propiamente
dicha (Figura 12.1). Adems, la separacin electrofortica se realiza con la
ayuda de un tampn, que juega un papel clave manteniendo el pH del sistema, estando tambin los iones de dicho tampn sometidos a migracin en el
campo elctrico.
Figura 12.1. Ejemplo de sistema para

electroforesis.
Las fuentes electroforticas son dispositivos que proporcionan una corriente

elctrica continua estabilizada. Hay diferentes tipos de fuentes, pero en general
proporcionan corriente elctrica de 0 a 150 mA y de 0 a 500 voltios, y permiten
controlar tanto el amperaje como el voltaje.
El dispositivo donde tiene lugar la electroforesis propiamente dicha consta de
un recipiente o cubeta en el que se introducen el medio de soporte de las muestras en el que se producir la separacin electrofortica, y el medio o tampn de
electroforesis, que debe encontrarse en contacto con los electrodos (ctodo y
nodo) y baar el sistema.
Normalmente, las molculas que son separadas por electroforesis se encuentran, a su vez, disueltas en un tampn. Las molculas que se pretenden
separar migran, junto con el tampn de electroforesis, entre los dos electrodos.
Como ya se ha comentado, el tampn de electroforesis mantiene constante el
pH del medio, lo que permite que los componentes de la mezcla de molculas migren al ctodo o al nodo durante la separacin dependiendo de su carga a dicho pH.
En los electrodos del sistema, al estar sumergidos en el tampn de electroforesis, se produce la electrolisis del agua. La reaccin que se da en el nodo produce electrones, que son utilizados en la reaccin que tiene lugar en el ctodo,
de la siguiente forma:
nodo: H2O o 2H+ O 2 2e
Ctodo: 2e 2H2O o 2OH H2
163
Captulo 12
Migracin electrofortica
La velocidad de migracin electrofortica es funcin de diferentes factores, tal y
como se refleja en la frmula ya vista:
v
QuE
6uSuruK
Por lo tanto, a la hora de plantear una electroforesis, se ha de considerar la

naturaleza de los compuestos a separar, la intensidad del campo elctrico y las
caractersticas del medio en que tiene lugar la separacin.
Naturaleza de los compuestos a separar

La naturaleza de los compuestos afecta a la velocidad de migracin; adems, la
carga neta de dichos compuestos y, en general, la magnitud de la carga dependen del pH del medio en que se realiza la electroforesis. La carga transportada
por cada molcula es uno de los factores ms importantes a tener en cuenta en
la tcnica de electroforesis. La naturaleza de la carga positiva o negativa determina el sentido de la migracin, mientras que su magnitud determina la velocidad relativa de migracin de la molcula.
Las biomolculas presentan grupos cargados. En algunos casos, como el de las
protenas y el de los aminocidos, las molculas pueden estar cargadas positivamente (cationes) o negativamente (aniones), y pueden ser tambin molculas neutras, en funcin del pH de la solucin. El pH al cual una protena o un aminocido
no presentan carga neta se denomina punto isoelctrico (pI). Si el pH de la solucin en que se encuentra una molcula es mayor (ms bsico) que su pI, dicha
molcula transportar una carga neta negativa y migrar hacia el nodo. Si el pH
del medio es menor (ms cido) que el pI de la molcula, sta transportar una
carga neta positiva y migrar hacia el ctodo. Es evidente que, si el pH del medio
es igual al pI de la molcula, sta no presentar carga neta y, por tanto, no migrar
en respuesta a un campo elctrico. En el caso, por ejemplo, de las protenas, al estar compuestas por muchos aminocidos que, en algunos casos, presentan grupos
ionizables, la carga neta ser variable y vendr determinada por el pH del tampn
en que se encuentre. La carga de una protena ser ms negativa cuanto ms bsico sea el pH del tampn, y ms positiva cuanto ms cido sea ste.
La forma y el tamao de las molculas a separar tambin influyen en la velocidad de migracin. Las molculas grandes migran a menor velocidad debido al incremento de las fuerzas electrostticas y de friccin ejercidas por su interaccin con
el medio circundante. Las molculas de tamao similar pero con diferentes formas
tales como protenas de tamao parecido, pero que sean bien de tipo fibroso o
bien de tipo globular, exhiben distintas caractersticas migratorias a causa tambin
de las fuerzas de friccin y electrostticas que se establecen, y que van a depender,
por tanto, tambin de la forma. Estas dos caractersticas pueden explotarse para que
la tcnica sea ms fina a la hora de separar, por ejemplo, las protenas.
Campo elctrico
El campo elctrico influye en una serie de aspectos importantes. La diferencia de
potencial que se establece entre los dos electrodos no es el nico factor a tener
164
en cuenta, ya que, si se repasa la ley de Ohm (Figura 12.2) se puede observar

que la cantidad de carga que puede transportarse entre los dos electrodos depende tambin de la resistencia que encuentran en su camino las cargas.
En la separacin electrofortica ha de tenerse en cuenta que se produce una
resistencia al movimiento de las cargas, de forma que la velocidad de migracin
de las cargas entre los electrodos es directamente proporcional a la diferencia de
potencial entre los dos electrodos e inversamente proporcional a la resistencia
que se produce en el medio. Aparte de la resistencia que opone el soporte al
movimiento de las cargas, tiene tambin influencia la fuerza inica del tampn.
La resistencia durante la electroforesis puede variar, ya que, al calentarse el soporte sta disminuye; por ello en el diseo de las fuentes electroforticas se tiene en cuenta la posibilidad de elegir entre mantener constante el voltaje durante
el proceso o bien mantener constante la intensidad.
V
R
Figura 12.2. Ley de Ohm. I: intensidad de

corriente (en amperios); V: voltaje (en
voltios); R: resistencia (en ohmios).
Tampn
El tampn utilizado en la separacin electrofortica establece el pH del medio
en el que tiene lugar la separacin; adems, tambin interviene transportando
carga entre los dos electrodos. Por lo tanto, la concentracin del tampn juega
un papel importante, ya que, al aumentar la concentracin del tampn, es mayor la proporcin de carga debida al tampn transportada entre los electrodos y,
en consecuencia, disminuye la velocidad de migracin de la muestra. Disminuir
la concentracin del tampn puede mejorar la resolucin electrofortica; aunque si se reduce demasiado, disminuye tambin la resolucin de la electroforesis
al transportarse una parte importante de la carga con la muestra y migra sta ms
rpidamente. Por lo tanto, debe llegarse a un compromiso a la hora de elegir el
tampn apropiado y su concentracin de iones segn el tipo de separacin electrofortica que se persiga.
El pH del tampn tambin es muy importante, ya que determina la magnitud
de la ionizacin y la carga neta de las molculas que se separan y, de esta forma,
define la direccin de la migracin electrofortica. El tampn presente en los recipientes de la electroforesis es normalmente el mismo que se emplea para saturar el medio de soporte. Sin embargo, en la electroforesis en gel, en la que el
tampn acta como parte del medio de soporte, se emplea con frecuencia un
tampn diferente del que se usa en los recipientes de electroforesis.
Soporte
El medio de soporte donde tiene lugar la separacin tambin influye en la resolucin electrofortica. Se han utilizado diferentes soportes y, aunque son relativamente inertes, son capaces de ejercer varios efectos sobre la resolucin de la
electroforesis. Entre los efectos que pueden producirse se pueden sealar los siguientes: adsorcin, electroendsmosis y cribado molecular.
Algunos soportes pueden adsorber las molculas que se separan por electroforesis, lo que conduce a la formacin de colas en la separacin de sustancias,
adems de reducir la velocidad de migracin de las molculas. El grado de adsorcin depende del tipo de soporte que se utiliza. As, por ejemplo, el papel
presenta fenmenos de adsorcin sobre muchas molculas debido a su polaridad, efecto que puede reducirse utilizando acetato de celulosa como soporte en
lugar de papel.
165
Captulo 12
Ciertos soportes electroforticos presentan cargas negativas, debidas a la presencia de grupos cidos (COO o SO2
4 ); estos grupos cargados se rodean de
cargas positivas, provocando una redistribucin de las cargas de la disolucin,
habiendo ms cargas positivas cerca del soporte (Figura 12.3). Las cargas ms
cercanas al medio de soporte son inmviles, mientras que las ms alejadas son
ms mviles. Al encontrarse hidratadas las cargas en disolucin, el movimiento
de stas al electrodo correspondiente provoca un desplazamiento del disolvente.
El movimiento del disolvente induce el arrastre de las molculas no cargadas o
dbilmente cargadas. Este fenmeno se conoce con el nombre de electroendsmosis. La electroendsmosis se produce en soportes como el papel, el acetato
de celulosa y los geles de agarosa que presentan grupos cidos cargados a pH
bsicos. Estos efectos pueden reducirse modificando los soportes qumicamente
para reducir estos grupos cargados.
Figura 12.3. El fenmeno de
electroendsmosis es debido a que
algunos soportes presentan cargas
negativas. Sobre estos soportes se
redistribuyen las cargas positivas de la
disolucin, quedando las cargas ms
cercanas inmovilizadas, pero el resto de
cargas pueden migrar al ctodo,
arrastrando consigo molculas no
cargadas o dbilmente cargadas.
Algunos soportes empleados son geles, y los compuestos migran a travs de

los poros de dichos geles. Se produce un efecto de cribado molecular, ya que,
en algunos casos, estos poros son ms pequeos que las molculas que se separan, de manera que las molculas ms grandes tienen mayor dificultad para migrar por el gel. De esta forma se genera una separacin no slo por la carga y la
cantidad de carga que presenta cada molcula diferente, sino tambin por el tamao y la forma de tales molculas. As, se establece una separacin tanto por
diferencia de carga como por cribado molecular.
TIPOS DE ELECTROFORESIS
La principal diferencia entre los distintos tipos de electroforesis estriba en el
medio de soporte. El medio de soporte determina el tipo de equipamiento necesario, la resolucin que va a obtenerse (es decir, la capacidad de discriminacin en la separacin de molculas), la separacin entre las distintas bandas, el
tipo de tampn y las tcnicas de visualizacin de dichas bandas. Ya que la
electroforesis, por s misma, tan slo proporciona el medio de separacin,
debe aadirse a la tcnica un sistema de visualizacin y cuantificacin de los
resultados.
Pueden utilizarse distintos medios de soporte. Entre ellos cabe mencionar:
166
Papel de filtro
Membranas de acetato de celulosa
Geles de almidn
Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida
Cabe comentar que, segn el tipo de electroforesis, la separacin de molculas suele depender, bsicamente, de su carga. No obstante, muchas veces la separacin basada en diferencias de carga no es suficiente para diferenciar
molculas con una carga similar. Muchos soportes para electroforesis proporcionan gran versatilidad, ya que permiten una separacin segn la carga de las
molculas, y adems una separacin en funcin del tamao y la forma de dichas
molculas. El uso de geles como los formados a partir de almidn, agarosa o poliacrilamida, aumenta la resolucin de la separacin de biomolculas tales como
cidos nucleicos y protenas, al intervenir en la separacin adems de posibles
diferencias de carga, el proceso de cribado molecular. Esto se debe a que el tamao de la malla generada (por ejemplo, por poliacrilamida o por agarosa) puede especificarse. De esta manera, segn el tamao de las molculas a separar, se
puede elegir el tamao de los poros del gel en que ha de producirse la separacin, que normalmente depende de la concentracin de agarosa o de poliacrilamida que se emplee. Con este sistema se separan las molculas de una muestra
no slo en funcin de su carga, sino que su tamao y su forma determinan tambin la mayor o menor velocidad de migracin de las molculas a separar. En estos sistemas, la velocidad de migracin de cada molcula depende bsicamente
de los dos factores: filtrado en gel y campo elctrico. Al contrario de lo que ocurre en el proceso de filtracin en gel, durante la electroforesis en gel se retrasa la
migracin de las molculas grandes con respecto a la migracin de las menores.
Esta circunstancia es debida a que en este tipo de electroforesis las molculas
deben pasar por los poros del gel: las molculas de tamao mayor encuentran
impedido su movimiento, por lo que migran de una manera ms lenta que las
molculas ms pequeas.

El papel de filtro se ha utilizado como medio de soporte durante muchos aos.
Permite utilizar volmenes de muestra relativamente grandes, aunque la separacin de las muestras suele ser algo irregular. En este tipo de electroforesis, es frecuente el fenmeno de adsorcin y, por tanto, se produce la formacin de colas.
Son necesarios tiempos de separacin largos, entre 12 y 18 horas.
Para llevar a cabo este tipo de electroforesis se utiliza una tira de papel, que
se sumerge primero en una disolucin tampn y luego se coloca en una cubeta,
tal como se indica en la figura 12.4. La muestra se aplica bien como una mancha, o bien como una tira. El papel se encierra en la cubeta para evitar la evaporacin y se aplica el voltaje deseado. Una vez finalizada la electroforesis se saca
el papel y se seca. Si la muestra contiene suficiente material y ste presenta alguna caracterstica mensurable (color, fluorescencia, radiactividad, etc.) puede ser
localizada; si no presenta dicha caracterstica, la tira de papel puede teirse con
un mtodo adecuado para el tipo de molculas separadas y, de esta manera, localizar los diferentes elementos de la muestra. Pueden eluirse los elementos y ser
cuantificados, por ejemplo, con un espectrofotmetro, o bien realizar la cuantificacin directamente sobre la tira de papel por densitometra.
La electroforesis en papel a bajo voltaje se utiliz, en un principio, como una
tcnica alternativa a la separacin de protenas por cromatografa en papel, ya que
sta proporcionaba una mala resolucin. Sin embargo, con el tiempo, el papel ha
sido sustituido por otros tipos de soportes que permiten una mejor resolucin.
Figura 12.4. Dispositivo para la

electroforesis en papel a bajo voltaje. La
muestra se aplica en un punto
determinado, al igual que en la
cromatografa en papel, pero en este caso
se coloca en el centro del recorrido. El
papel se moja con el tampn y los
extremos se colocan en cubetas con el
mismo tampn, en las que se encuentran
los electrodos (nodo y ctodo), para
establecer as los contactos con la fuente
de voltaje. El sistema puede taparse para
evitar que el papel se seque por
evaporacin del tampn. Se establece una
corriente continua y se desarrolla la
electroforesis; al cabo de un tiempo, se
saca el papel y se seca y, a continuacin,
se procede a la tincin adecuada de las
muestras para su visualizacin y
cuantificacin.
167
Captulo 12
La separacin de molculas pequeas requiere la utilizacin de voltajes elevados para permitir una velocidad de migracin lo suficientemente diferencial
de dichas molculas, ya que al ser pequeas presentan muy poca carga total y la
fuerza impulsora es demasiado dbil; adems, por el mismo hecho de tener un
tamao pequeo, se producen fenmenos de difusin que disminuyen la resolucin de la tcnica separativa. La utilizacin de voltajes elevados aumenta la velocidad de migracin pero, en contrapartida, aumenta la cantidad de calor que se
produce durante la separacin, lo que obliga a utilizar sistemas de refrigeracin.
Electroforesis en membranas de acetato de celulosa

El papel (celulosa) presenta una desventaja importante para su uso como soporte
en una electroforesis debido a su capacidad de adsorber diferentes molculas, a
causa de la presencia de los grupos hidroxilo propios de la estructura del papel.
Esta adsorcin impide el movimiento de las molculas y, por tanto, reduce la resolucin de las separaciones. Para solucionar este problema se recurre a la esterificacin de los grupos hidroxilo con cido actico, dando lugar a lo que se
conoce como membrana de acetato de celulosa, que es un material apolar. El
uso de dicho material evita los problemas de adsorcin que provocaba el papel,
ya que dejan de existir los numerosos grupos hidroxilo que interaccionaban con
las molculas a separar, que presentan carga, y que tendrn muy poca capacidad
de adsorcin sobre materiales apolares, como el acetato de celulosa.
La resolucin de las electroforesis sobre acetato de celulosa mejora con respecto a la que se consigue con electroforesis en papel, permitiendo una mayor
separacin de las molculas. Las membranas de acetato de celulosa presentan,
adems, la ventaja de que pueden volverse transparentes por la accin de diferentes agentes como el metanol y el cido actico, lo que permite una mejor
lectura mediante fotodensitometra de las bandas obtenidas en la membrana por
la separacin de los distintos componentes de una muestra. Es ms, este tipo de
electroforesis permite realizar separaciones muy rpidas, de 30-60 minutos, y las
membranas pueden guardarse durante algn tiempo y ser todava analizables.
Uno de los problemas de las tiras de acetato de celulosa es que pueden provocar la aparicin del fenmeno de electroendsmosis, pudiendo dar lugar a un
cierto grado de difusin en la separacin de los compuestos.
Electroforesis en geles de almidn

Los geles de almidn son polmeros de glucosa con dos tipos de estructura, la
amilosa y la amilopectina. El problema ms importante de estos geles es el hecho de que resulta difcil preparar distintos geles con la misma concentracin y
la misma proporcin de los dos componentes, la amilosa y la amilopectina. Estas
molculas se obtienen mediante la hidrlisis parcial del almidn de la patata, de
tal forma que aumentando el grado de hidrlisis, los fragmentos de estas molculas pueden ser mayores o menores; por lo tanto, los geles que se formen a
partir de ellas presentarn tamaos de poro mayores o menores respectivamente. As pues, en esta tcnica puede variarse tambin el tamao de poro de los
geles para realizar un cribado molecular apropiado al tipo de molculas a separar. Los geles de almidn se preparan disolviendo la amilosa y la amilopectina en
168
un tampn adecuado y al bao mara, hasta que la mezcla se vuelve translcida;

posteriormente se vierte en un molde adecuado y se deja enfriar. Este tipo de
geles es extremadamente frgil y no puede calentarse en exceso.
Variando el tamao de poro de un gel de almidn, pueden separarse protenas o cidos nucleicos tanto por tamao como por carga. No obstante, el problema ms importante derivado del uso de este tipo de geles es la falta de
reproducibilidad en la obtencin de tamaos de poro determinados. A pesar de
ello, s que puede regularse en cierto grado el tamao de los poros; por ejemplo,
disoluciones de almidn al 2% permiten obtener geles de gran porosidad, mientras que disoluciones entre el 8 y el 15% dan lugar a geles de baja porosidad,
aunque es difcil conocer el tamao exacto de los poros.

Otro tipo de soporte en gel lo constituyen los geles de agarosa, que son utilizados con frecuencia en la separacin de protenas y cidos nucleicos. El tamao
de los poros puede ser variable en funcin de la concentracin de agarosa que
se utilice; de esta manera, puede elegirse el tamao de poro adecuado (es decir
la concentracin de agarosa adecuada para formar el gel) segn el rango de tamao de las molculas a separar. Dependiendo del tamao de poro que se defina, la electroforesis en geles de agarosa puede utilizarse para separar distintos
tipos de cidos nucleicos (Figura 12.5).
Los geles de agarosa tambin se utilizan en la separacin de protenas sricas,
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa (ver captulo 13), diferentes fracciones
de las lipoprotenas (ver captulo 18), etc.
El tamao de poro de estos geles es grande en comparacin con otros tipos
de geles, lo que permite la separacin por cribado molecular, aparte de por carga, de biomolculas grandes (peso molecular >200 kDa), como son los cidos
nucleicos y las lipoprotenas. En cambio, las protenas sricas, al ser molculas
ms pequeas, no se separan por cribado molecular en estos tipos de geles, aunque con ellos se consiguen mejores separaciones que con el acetato de celulosa,
no obstante, en contrapartida, el soporte de agarosa es ms frgil.
Figura 12.5. Concentracin de agarosa

recomendada para llevar a cabo una
correcta separacin de cidos nucleicos
mediante electroforesis en funcin del
rango de tamao de las molculas a
separar. kb: kilobases.

Los geles de poliacrilamida son otro ejemplo frecuente de geles que pueden utilizarse en la separacin de biomolculas. Al igual que los geles de agarosa, pueden prepararse con diferentes tamaos de poro pero, en este caso, los tamaos
de poro que se consiguen son ms pequeos que en el caso de la agarosa, lo
que permite la separacin, por forma y tamao, de molculas ms pequeas
que en los geles de agarosa, como es el caso de muchas protenas.
Los geles de poliacrilamida habitualmente se obtienen por la polimerizacin
de molculas de acrilamida y N,Ncmetiln-bis-acrilamida, disueltas en un
tampn adecuado. Requieren la accin de un polimerizador, que suele ser el
persulfato amnico. Al disolverse en agua, produce radicales libres, que a su vez
inducen la formacin de numerosos radicales libres en la acrilamida, permitiendo de esta manera su polimerizacin. La gelificacin se consigue debido a la formacin de enlaces cruzados por la presencia de la bisacrilamida. De esta
169
Captulo 12
manera se obtiene una malla de cadenas de acrilamida. Al proceso de polimerizacin tambin se aade tetrametiln diamina (TEMED), que es un estabilizador
de los radicales libres (Figura 12.6).
Figura 12.6. Polimerizacin de acrilamida

y bisacrilamida, que permite la formacin
de geles de poliacrilamida, a travs del
establecimiento de enlaces entrecruzados
entre estas molculas. El inicio de la
polimerizacin es inducido por los
radicales libres que aparecen a partir de
la descomposicin qumica del persulfato
amnico (S2O2
8 o 2SO4 ). El N,N,Nc,Nctetrametiln diamina (TEMED),
estabilizador de radicales libres, se aade
habitualmente a la mezcla del gel para
que la reaccin se d en las mejores
condiciones posibles.
Figura 12.7. Tamao de poro medio (en

) para diferentes concentraciones de
acrilamida y bisacrilamida.
Figura 12.8. Esquema de un sistema de

electroforesis en columna. Se polimeriza
el gel en el tubo, que se sita entre los
recipientes que contienen el tampn de
electroforesis. La muestra se deposita en
la parte superior del gel en forma de
columna, procedindose despus a la
separacin de las biomolculas, tras la
aplicacin del campo elctrico.
170
El tamao de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la

concentracin de poliacrilamida (acrilamida y bisacrilamida) en el gel y el nmero de entrecruzamientos entre molculas. Normalmente se utilizan concentraciones de poliacrilamida entre el 3 y el 15% y la concentracin de
bisacrilamida se encuentra habitualmente alrededor del 5% del total de acrilamida presente (Figura 12.7). Existen modificaciones interesantes a la hora
de realizar separaciones en geles de poliacrilamida, como por ejemplo la formacin de geles con gradiente de tamao de poro, en los que las molculas
se van encontrando, en su migracin, un tamao de poro cada vez menor.
Otro ejemplo son los geles en los que existe un gradiente de pH, para realizar
la tcnica conocida como isoelectroenfoque (ver ms adelante).
La electroforesis en gel de poliacrilamida se conoce tambin como PAGE
(Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis). En esta tcnica son posibles diferentes diseos de los geles: se pueden formar geles tanto en columna como en lminas.
Los geles en columna se obtienen realizando la reaccin de polimerizacin de la
acrilamida en tubos de 3 a 10 cm de longitud; el tubo se sita entre dos recipientes, uno superior y otro inferior, que contienen el tampn de separacin (Figura 12.8).
Los geles pueden confeccionarse tambin en forma de lmina rectangular
delgada, entre dos cristales; con este tipo de geles se consigue analizar ms de
una muestra en cada separacin, ya que permiten realizar varias separaciones en
paralelo (Figura 12.9).
VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN DE LOS RESULTADOS

Las bandas resultantes de la separacin por electroforesis pueden localizarse por
varias tcnicas: aparicin de color, deteccin de fluorescencia, de radiactividad,
etc. Normalmente las molculas separadas no presentan ninguna caracterstica
que permita su localizacin, por lo que se recurre al uso de distintas sustancias
que les proporcionen caractersticas que las hagan localizables y/o mensurables.
Antes de procesar las molculas para que adquieran dichas caractersticas, deben fijarse al medio de soporte. Hay que tener en cuenta que los soportes electroforticos deben permitir el libre movimiento de las molculas; ventaja que
puede convertirse en un inconveniente una vez finalizada la electroforesis si se
quiere seguir trabajando con las sustancias separadas. Por lo tanto, antes de proceder al procesamiento para su deteccin, conviene inmovilizarlas. Esta inmovilizacin puede realizarse mediante el uso de sustancias como el cido
tricloroactico, el cido sulfosaliclico, el formaldehdo, el cido actico, etc.
Una vez fijadas las biomolculas, se procede a la reaccin con distintas sustancias para su visualizacin (Figura 12.10).

electroforesis en lmina vertical. Pueden
formarse diferentes pocillos en la parte
superior del gel en forma de lmina, que
determinarn diferentes carriles de
recorrido, de manera que pueden
cargarse distintas muestras al mismo
tiempo, pudindose realizar varias
separaciones en paralelo en un mismo
proceso de electroforesis.
Figura 12.10. Reactivos tpicos utilizados

para la deteccin y/o cuantificacin de
diferentes biomolculas. Varios de estos
reactivos son tiles precisamente por su
capacidad de absorcin de radiacin
electromagntica, por lo que se indica su
mximo de absorcin cuando estn
combinados con las biomolculas.
Una vez detectadas las diferentes bandas utilizando los reactivos apropiados,
pueden utilizarse dichas bandas tanto para identificar las diferentes sustancias de
una muestra como para cuantificarlas, bien eluyndolas primero o bien por deteccin directa sobre el medio de soporte electrofortico (por ejemplo, por fotodensitometra sobre el mismo soporte).
APLICACIONES PARTICULARES DE LA ELECTROFORESIS

Existen diferentes modificaciones de la electroforesis que permiten su utilizacin
en separaciones especficas de biomolculas.
Isoelectroenfoque
El isoelectroenfoque es un sistema de separacin electrofortica que separa las
molculas en funcin de su punto isoelctrico. Un ejemplo claro de su aplica171
Captulo 12
cin es la separacin de protenas, ya que para cada una existe un pH al cual

presenta carga neta cero (punto isoelctrico, pI). As, una mezcla de molculas
con diferentes pIs, puede separarse en un sistema electrofortico en el que exista un gradiente de pH. Las diferentes molculas de la mezcla migrarn al ctodo
o al nodo en funcin de su carga; pero, al existir dicho gradiente, al tiempo que
migran va cambiando el pH del medio en que se encuentran, de manera que en
su camino hacia el electrodo llegarn a un punto del medio cuyo pH coincidir
con su pI. En ese momento, las molculas presentarn carga neta cero y, por lo
tanto, se detendr su migracin, quedando, por decirlo de alguna manera, enfocadas (Figura 12.11).
Figura 12.11. Fundamento del

isoelectroenfoque. Si se deposita, por
ejemplo, una protena en una zona del
medio de electroforesis con un pH inferior
a su punto isoelctrico, presentar carga
positiva, por lo que migrar hacia el
ctodo. En su camino hacia el ctodo, el
pH se va incrementado, de manera que
llega a un punto del medio cuyo pH
corresponde al punto isoelctrico de la
protena, adquiriendo carga neta cero y
detenindose en su migracin. Por el
contrario, si se deposita la protena en
una zona con un pH superior a su punto
isoelctrico, dicha protena presenta carga
neta negativa, por lo que migra hacia el
nodo pero, en esta ocasin, a medida
que migra, el pH va disminuyendo, por lo
que llega tambin a una zona que
presenta un pH igual a su punto
isoelctrico, adquiriendo carga neta cero y
parando de esta manera su migracin.
172
El isoelectroenfoque permite separar protenas que presenten diferencias de

tan slo 0,01 unidades en el pI. Constituye una tcnica especial utilizada cuando
se hace necesario obtener una gran resolucin, por ejemplo en el caso de la separacin de isoenzimas.
La preparacin de los soportes con gradiente de pH se lleva a cabo aadiendo a la agarosa o a la poliacrilamida una mezcla de anfolitos sintticos (50100 compuestos individuales), que son compuestos poliamino-policarboxlicos
de bajo peso molecular (300-1.000 kDa) cuyos puntos isoelctricos cubren una
gama determinada de pH. Adems, los anfolitos presentan la capacidad de tamponar el pH que se corresponde con su pI y muestran una buena conductividad.
El pH de una mezcla de anfolitos es la media del pI de cada uno de sus componentes, de manera que, al exponerlos a un campo elctrico, algunos anfolitos
migran al ctodo (aquellos con un pI superior al pH medio, ya que presentan
carga neta positiva) y otros al nodo (aquellos con un pI inferior al pH medio,
que presentan carga neta negativa). As pues, los anfolitos de la mezcla migran y
en su camino se detienen cuando alcanzan el pH correspondiente a su pI. De
esta manera, se genera un gradiente estable de pH, que va de una disolucin
cida alrededor del nodo a una disolucin bsica alrededor del ctodo. Este
tipo de soporte se conoce con el nombre de isogel.
Si se quiere separar una mezcla de protenas en este tipo de soportes, las
protenas migrarn ms lentamente que los anfolitos, dado que presentan masas
moleculares superiores a las de stos ltimos. De esta forma, las protenas migran sobre un gradiente de pH previamente generado por los anfolitos. Cuando
una protena se encuentra a un pH superior a su punto isoelctrico presenta carga negativa, por lo que se mueve hacia el nodo; a medida que avance en su recorrido el pH disminuir y, cuando alcance una zona de pH igual a su pI, se
detendr, quedando enfocada la protena sobre su punto isoelctrico. Por el
contrario, si la protena se encuentra a un pH inferior a su punto isoelctrico
presentar carga positiva y migrar hacia el ctodo; a medida que se desplace, el
pH ir aumentado, hasta que alcance la zona de pH correspondiente a su pI,
donde detendr su migracin (Figura 12.12).
Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE

La separacin de protenas por electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
es funcin de su carga y de su forma, y esta ltima depende del plegamiento de
la protena. Si todas las protenas presentaran la misma densidad de carga y la
misma forma, la separacin tendra lugar exclusivamente por tamao, es decir,
slo por diferencias de peso molecular. Los jabones y los detergentes son molculas anfipticas (con zonas apolares y con zonas cargadas) y pueden desnaturalizar las protenas (romper el plegamiento de las protenas) al asociarse con las
zonas hidrofbicas de stas, haciendo que todas las protenas adquieran la misma forma y, adems, una densidad de carga muy similar. El dodecil sulfato de
sodio o SDS (Figura 12.13) es un detergente que se une muy fuertemente a las
protenas, desnaturalizndolas e inducindolas a adoptar una forma cilndrica.
Se sabe que la mayor parte de las protenas se unen al SDS en la misma proporcin: 1,4 g de SDS por 1 g de protena, aproximadamente una molcula de SDS
por cada dos restos de aminocidos. Esta proporcin hace que las protenas unidas al SDS tengan una relacin carga/tamao muy similar (ya que el nmero de
grupos cargados de las protenas es muy pequeo en comparacin al nmero de
molculas de SDS unidas a las mismas).
As pues, al realizar una electroforesis de protenas en un gel que contenga
SDS, stas se separan solamente en funcin de sus masas moleculares, como en
la filtracin en gel. Este tipo de electroforesis puede utilizarse para la determinacin de las masas moleculares de las protenas con una exactitud entre el 5%
y el 10%.
Las movilidades Me/M0 relativas de las protenas en este tipo de geles varan
de forma lineal respecto al logaritmo de sus pesos moleculares. Representando
la masa molecular (en una escala logartmica) frente a la movilidad relativa de
las protenas de masa molecular conocida, se obtiene una lnea recta que puede servir para determinar la masa molecular de una protena problema (Figura
12.14). Normalmente, en la prctica, la determinacin de la masa de una protena se realiza mediante una electroforesis de la muestra y de marcadores
moleculares protenas de masa molecular conocida, ya que el uso de estos
marcadores permite realizar una estimacin de la masa molecular de una protena determinada.
El rango lineal de separacin depende de la concentracin de la acrilamida y bisacrilamida. En la figura 12.15 se presentan los valores de lineali-
Figura 12.12. Esquema de un proceso de

isoelectroenfoque. En primer lugar, se
aplica en el gel una mezcla de anfolitos
de rango de pH 6-8, con las protenas de
la muestra (con pI de 6,3, 7,3 y 7,8
respectivamente). Se somete a
continuacin al campo elctrico, y los
anfolitos, en funcin de su pI, migran
hacia el ctodo o hacia el nodo hasta
alcanzar un pH que corresponde con su
pI. Con este proceso se genera un
gradiente de pH, que va desde una zona
cida alrededor del nodo a una zona
bsica alrededor del ctodo. Las
protenas, que migran ms lentamente
que los anfolitos, migran hasta la zona de
pH que se corresponde con su pI,
quedando de esta manera enfocadas.
Figura 12.13. Frmula del dodecil sulfato

de sodio (SDS).
Figura 12.14. Representacin logartmica

de las masas moleculares de protenas
frente a sus movilidades electroforticas
relativas (M) sobre un gel de SDSpoliacrilamida. Se muestra, como ejemplo,
la interpolacin del peso molecular de una
protena problema (la protena UCP1).
173
Captulo 12
Figura 12.15. Rangos de linealidad de

separacin segn el tamao de una protena
dependiendo de los porcentajes de
acrilamida y bisacrilamida en un SDS-PAGE.
dad de la separacin. En el caso de que la protena sea oligomrica, el tratamiento con SDS no slo la desnaturaliza, sino que adems separa las subunidades que la componen (si stas se encuentran unidas por uniones no
covalentes), de manera que, tras la electroforesis, se obtiene informacin
sobre el peso molecular de cada subunidad en vez de la masa global de la
protena total. Esta ltima puede ser calculada cuando las protenas estn
unidas por puentes disulfuro (enlaces covalentes), que no se rompen por la
presencia de SDS, pero que pueden romperse tratando las muestras con
E-mercaptoetanol.
En la realizacin de un SDS-PAGE convencional, antes de someter una
muestra a electroforesis, se diluye esta ltima en un tampn que contiene
SDS y E-mercaptoetanol, que reduce los puentes disulfuro, separando as las
subunidades de la protena. Seguidamente, la muestra se calienta de 2 a
5 minutos para desnaturalizar completamente las protenas por calor y hacer
accesible al detergente el total de la longitud de la cadena polipeptdica. Una
vez enfriada la muestra, se corre la electroforesis en un gel de poliacrilamida
y posteriormente se visualizan las bandas con un mtodo de visualizacin
apropiado.
Electroforesis en gradiente
En algunos casos puede interesar que el soporte vaya cambiando en sus propiedades a medida que se realiza la separacin. Una muestra de ello lo constituye
la electroforesis en geles de poliacrialamida en gradiente. Los gradientes se obtienen variando la concentracin de acrilamida, por ejemplo del 3 al 30%. El
gradiente puede ser, por ejemplo, lineal cncavo; este gradiente de concentracin provoca cambios en el tamao de poro, que disminuye a medida que aumenta la concentracin de acrilamida. Se elige la concentracin en funcin del
tamao de las sustancias que quieren separarse. Con este tipo de geles, cada
sustancia migra hasta alcanzar una posicin en que el tamao de poro en el gel
no le permita seguir avanzando, aunque la migracin no se detiene totalmente.
La ventaja de estos tipos de geles es que, una vez que las sustancias a separar alcanzan la zona del tamao de poro lmite, al no producirse migracin apreciable, las bandas se estrechan y se obtiene una mejor resolucin de las
biomolculas.
Electroforesis bidimensional
La resolucin electrofortica puede mejorarse realizando una separacin bidimensional de la muestra. Esto se consigue llevando a cabo la separacin en
funcin de dos propiedades distintas; por ejemplo, la primera propiedad en la
que basar la separacin puede ser el fundamento de un isoelectroenfoque, y la
segunda las diferencias de masa molecular segn la tcnica de SDS-PAGE (Figura 12.16).
As, por ejemplo, puede realizarse una primera separacin por isoelectroenfoque, que puede hacerse en placa o en columna. Una vez finalizada esta primera separacin, se corta la tira de inters (si la separacin se ha realizado en
placa), o se extrae el gel de la columna (en caso de que la primera separacin se
haya realizado en columna). Tanto en un caso como en otro se coloca el gel en174

Figura 12.16. Esquema de realizacin de
una electroforesis bidimensional.
tre dos lminas de vidrio que soportan entre ellas el segundo gel, donde se realiza una separacin de tipo SDS-PAGE. Una vez finalizado todo el proceso, se
procede a la deteccin de las sustancias separadas en el gel con el reactivo adecuado.
La visualizacin e interpretacin de los resultados es difcil en este tipo de
electroforesis, pero hoy en da existen programas de ordenador que ayudan a la
identificacin de las manchas en el gel y a la caracterizacin de las biomolculas
separadas por este tipo de electroforesis.
Electroforesis capilar (CE)

La electroforesis de alto voltaje presenta el problema de que produce demasiado calor, el cual no puede disiparse de manera fcil. Para mitigar este problema, existe la posibilidad de realizar la electroforesis en tubos ms estrechos, lo
que permite una mayor disipacin del calor. De acuerdo con esta idea, en la
dcada de los 80 empezaron a utilizarse tubos capilares, de 2200 mm de dimetro interior y de una longitud entre 7-100 cm, para la separacin de molculas por electroforesis; estos tubos dan la posibilidad de utilizar campos
elctricos entre 100 y 500 voltios por cm de capilar, lo que permite separaciones mucho ms rpidas de las biomolculas, en cuestin de minutos. No obstante, este tipo de electroforesis tan slo permite la separacin de cantidades
pequeas de muestra, por lo que se utiliza con fines analticos ms que preparativos.
Una ventaja interesante de la electroforesis capilar es que ha permitido la automatizacin de la tcnica. La electroforesis capilar, aunque es de uso rutinario
en el laboratorio, es larga y requiere una intervencin importante por parte del
usuario. La automatizacin se realiza de una manera anloga a como se hace en
la cromatografa lquido-lquido para dar lugar a la tcnica de HPLC. La migracin de las molculas puede seguirse por detectores; adems, puede utilizarse
cualquier tipo de soporte electrofortico.
El equipo para electroforesis capilar se encuentra totalmente automatizado
(Figura 12.17) y un ordenador controla la inyeccin de la muestra, la temperatura, el voltaje, el tiempo, la respuesta del detector, etc.
175
Captulo 12
Figura 12.17. Sistema automatizado para
la realizacin de una electroforesis capilar.
176
Tcnicas enzimticas
INTRODUCCIN
ENZIMAS
Especificidad de accin y de sustrato
Estructura de las enzimas
Cintica enzimtica
Modelo de Michaelis-Menten
Significado de las constantes cinticas del modelo Michaelis-Menten: Km y Vmx
Clasificacin de las enzimas
DISEO DE LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Medio de reaccin
Medida de la velocidad de reaccin
Deteccin del sustrato o del producto de una reaccin enzimtica
LAS ENZIMAS COMO REACTIVOS
178
13
INTRODUCCIN
No siempre es posible determinar una protena concreta en presencia de otras
protenas mediante tcnicas basadas en sus propiedades qumicas o fsicas, ya
que no se consigue una diferenciacin o separacin lo suficientemente fina
como para discriminar una nica protena. La solucin tiene que buscarse en
otra caracterstica que haga diferentes a las protenas entre s, como son sus
propiedades bioqumicas, que determinan la funcin que realizan. En esta lnea, un caso concreto y especial es el estudio de la funcin de las enzimas
como catalizadores bioqumicos. De hecho, la cantidad de una enzima presente en un fluido biolgico es, en general, muy pequea, por lo que su medida se
hace prcticamente imposible por mtodos clsicos de aislamiento y purificacin. Sin embargo, aprovechando la propiedad fundamental de las enzimas de
catalizar reacciones qumicas, es posible medir su actividad y relacionarla con
su cantidad.
Se han diseado diferentes mtodos para la determinacin de la actividad de
una enzima especfica. En muchos de ellos se tiene presente que la actividad de
una enzima, cuando la concentracin de sustrato es saturante, es proporcional a
la cantidad de enzima presente. De esta manera, la medida de la actividad de
una enzima en condiciones saturantes permite inferir la cantidad de protena
(enzima) presente en la muestra. Este es uno de los principios bsicos de la Enzimologa, que es la parte de la bioqumica analtica que estudia las enzimas; su
desarrollo ha permitido, entre otras cosas, poder detectar y cuantificar este grupo especial de protenas.
Por otra parte, la utilizacin de la medida de la actividad enzimtica para estudiar las propias enzimas abre la puerta al desarrollo de mtodos que utilizan
las enzimas como reactivos y que permiten utilizar determinadas enzimas para el
estudio indirecto de otras biomolculas. La metodologa analtica da en este
punto un salto cualitativo y cuantitativo, encontrando en la propia bioqumica
las soluciones que permiten una mayor especificidad que los mtodos qumicos
y fsicos en la determinacin de biomolculas. Las enzimas son especficas de
179
Captulo 13
sustrato y reaccin, de forma que la utilizacin de enzimas evita la falta de especificidad de las tcnicas qumicas (basadas en la reaccin con grupos funcionales
determinados). Debido a que las enzimas son especficas de reaccin (sobre un
determinado grupo funcional) y de sustrato (reconocen un sustrato o un pequeo grupo de sustratos por la distribucin espacial de los distintos elementos
de ste), se evitan las interferencias de compuestos diferentes a los de inters y
que posean los mismos grupos funcionales.
ENZIMAS
Las enzimas son protenas especiales capaces de catalizar reacciones qumicas.
Un catalizador es la sustancia que acelera la velocidad de una reaccin sin modificar las condiciones del equilibrio y que, al final de la reaccin, se recupera
sin alterarse. En los seres vivos, gran parte de los catalizadores son sustancias de
carcter proteico que se denominan enzimas.
De forma general puede simplificarse el esquema de una reaccin en un ser vivo
de la siguiente forma: un sustrato S se transforma en un producto P. Para que esta
transformacin tenga lugar, el sustrato debe pasar por un estado activado, de energa
superior a la del sustrato antes de la reaccin y a la del producto (Figura 13.1).
Por lo tanto, la velocidad de la reaccin ser directamente proporcional a la
concentracin de sustrato activado:
Figura 13.1. Representacin de los
cambios de energa durante el curso de
una reaccin tpica. S: sustrato;
P: producto; S*: sustrato activado;
DG0c: energa libre estndar de Gibbs. El
sustrato tiene que alcanzar un estado
transitorio de alta energa para que la
reaccin pueda tener lugar.
Figura 13.2. La energa de activacin es

menor para formar el complejo ES*
(enzima-sustrato activado) que para
alcanzar el estado activado del sustrato
sin enzima (S*), de manera que la
reaccin es ms rpida en presencia de la
enzima, puesto que un mayor nmero de
molculas de sustrato pueden alcanzar el
estado activado en un mismo intervalo de
tiempo.
180
k u S*
donde: v:
velocidad de reaccin
k:
una constante
[S*]: la concentracin de sustrato activado
Cuanto mayor es el salto energtico que se debe producir para que el sustrato
(S) alcance este estado transitorio que le permite transformarse en producto (P)
energa de activacin, ms lenta es la reaccin. Cuanto menor es esta energa
ms rpida es la reaccin. La velocidad de reaccin puede incrementarse aumentado la temperatura del medio de reaccin, lo que favorecer que haya un mayor
nmero de molculas de sustrato que adquieran la suficiente energa para alcanzar el estado activado, o bien utilizando catalizadores, como las enzimas.
Las enzimas se unen al sustrato formando un complejo enzima-sustrato. Esta
unin estabiliza al sustrato en el estado transitorio, es decir, disminuye la energa
libre del estado activado. De esta manera, la energa de activacin es menor, lo
que permite que el sustrato se transforme en producto ms rpidamente. As
pues, la enzima, al unirse al sustrato, facilita que ste alcance el estado transitorio, al tiempo que crea las condiciones adecuadas para que la reaccin se d
ms rpidamente. En la figura 13.2 se han representado, en trminos de energa,
las distintas etapas de una reaccin enzimtica en comparacin con una reaccin no enzimtica.
Especificidad de accin y de sustrato

Las enzimas son especficas, tanto para la reaccin que catalizan especificidad
de accin, como para la eleccin de las sustancias implicadas en la reaccin
especificidad de sustrato.
Tcnicas enzimticas
Especificidad de accin. Una enzima tan slo es capaz de realizar un tipo de

reaccin sobre un mismo sustrato; as, un sustrato requiere distintas enzimas
para transformarse en diferentes productos, cada una de dichas reacciones estar catalizada por una enzima diferente, especfica (Figura 13.3).
Especificidad de sustrato. Una enzima tan slo es capaz de acelerar la transformacin de un nico sustrato. Por ejemplo, existen diferentes transaminasas, y
cada una ellas slo es capaz de catalizar la reaccin de transaminacin sobre un
aminocido en concreto. As pues, siguiendo este ejemplo, podemos hablar de
alanina transaminasa, aspartato transaminasa, etc. En algunos casos, hay enzimas
capaces de transformar un nmero reducido de sustratos, como por ejemplo las
proteasas, que presentan una especificidad sobre un enlace peptdico formado
por determinados aminocidos.
Figura 13.3. Ejemplos de la especificidad
de accin de las enzimas. Se muestran
reacciones tpicas que se producen sobre
los aminocidos, as como la enzima que
cataliza cada reaccin especfica.
Estructura de las enzimas

La especificidad de accin y de sustrato de las enzimas se debe a la estructura de su centro activo, que es el lugar en la conformacin espacial de la enzima donde se da el reconocimiento del sustrato y el proceso de catlisis
(Figura 13.4). En el proceso de catlisis interviene directamente alguno de los
residuos de aminocidos de la enzima. Los centros activos de las enzimas se
caracterizan por:
suponer una pequea parte de la enzima total,
estar formados por diferentes grupos funcionales de diversos residuos de
aminocidos, que generan una entidad tridimensional en la protena,
unir los sustratos a la enzima con enlaces no covalentes,
ser, generalmente, cavidades en la superficie de la enzima; en estas cavidades se crea un entorno adecuado que favorece la reaccin enzimtica,
uniendo al sustrato y dejndolo a la distancia adecuada de los grupos funcionales de la enzima que intervienen en el proceso de catlisis,
depender su especificidad y el proceso de catlisis de la situacin exacta
en el espacio de los grupos funcionales del sustrato y de la enzima. Cualquier contingencia que provoque una alteracin de la conformacin espacial tendr repercusiones en la actividad de la enzima.
Figura 13.4. Estructura tridimensional de

la enzima lisozima unida a su sustrato.
El mecanismo de accin de una enzima implica que la enzima y el sustrato se

unan por el establecimiento de fuerzas dbiles entre algunos tomos del sustrato
y algunos grupos de los residuos de la enzima que forman el centro de reconocimiento. En esta unin no se producen enlaces covalentes. De esta manera, el
sustrato queda retenido en el interior de la enzima, y el enlace que tiene que
modificarse o formarse queda a la distancia adecuada de los grupos de los residuos de la enzima que forman el centro de catlisis. Estos grupos intervienen en
la reaccin a travs de diferentes tipos de catlisis: cido-base (cediendo o acep181
Captulo 13
tando H+), covalente (estableciendo un enlace covalente enzima-sustrato que facilita la modificacin del sustrato), por estabilizacin del sustrato activado, etc.
Una vez realizada la modificacin del sustrato para transformarlo en producto,
ste debe liberarse de la enzima.
La actividad de una enzima depende, por lo tanto, de su estructura tridimensional. Al ser una protena, dicha estructura es lbil y se ve afectada por factores
externos como son el pH, la temperatura, la fuerza inica del medio, etc. La correcta determinacin de la actividad de una enzima requiere que estos factores
estn perfectamente controlados.
Cintica enzimtica
Figura 13.5. Curva tpica que se obtiene

al representar la velocidad de reaccin (v)
frente a la concentracin de sustrato [S]
de una reaccin con cintica de
saturacin.
El estudio de la cintica enzimtica se basa en encontrar una relacin entre la

velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y la concentracin de sustrato participante. Si se representa la velocidad de reaccin en funcin de la
concentracin de sustrato, se obtiene una curva tpica de una cintica de saturacin (Figura 13.5).
La velocidad mxima es la velocidad que no se puede sobrepasar por mucho
que aumente la concentracin de sustrato. Cuando se alcanza la velocidad mxima, todos los centros activos de la enzima se encuentran ocupados por el sustrato.
En la curva que se obtiene al representar la velocidad de reaccin frente a la
concentracin de sustrato se pueden distinguir tres etapas, que se representan
en la figura 13.6.
Etapa 1. En esta primera etapa, v (velocidad de reaccin) es directamente proporcional a [S] (concentracin de sustrato), cumpliendo la frmula:
v = k [S]1, siendo k una constante. Se habla de una cintica de primer
orden.
Etapa 2. v puede depender o no de [S]. Se habla de una cintica de orden cambiante, tpica de las reacciones catalizadas por enzimas.
Etapa 3. v ya no depende de [S]. Se habla de una cintica de orden cero, que
responde a la frmula: v = kc [S]0.
El proceso enzimtico puede esquematizarse en varias etapas:
Figura 13.6. Etapas bsicas en una

reaccin en funcin de la representacin
de la velocidad de reaccin frente a la
concentracin de sustrato.
182
En primer lugar, el sustrato y la enzima se unen y forman un complejo enzima-sustrato (ES). La velocidad de este proceso es proporcional a la cantidad de
enzima y de sustrato, y depende tambin de la facilidad con que el sustrato alcanza el centro activo y de las fuerzas que intervienen en mantenerlos unidos
(que se reflejan en la constante k1). Una vez formado el complejo ES, el sustrato
se transforma en producto, dando lugar al complejo enzima-producto (EP); la velocidad de este proceso depende del poder cataltico de la enzima (que se refleja en el valor de k2) y de la cantidad de complejo ES formado. Pero el complejo
ES se puede disociar, lo que depende tanto de las fuerzas que mantienen el complejo como de las que lo desestabilizan (todo ello se refleja en la constante k1),
as como de la cantidad de complejo ES. Finalmente, una vez formado el producto, ste puede disociarse de la enzima (con una constante de disociacin k3).
Tcnicas enzimticas
Modelo de Michaelis-Menten
La velocidad global de transformacin del sustrato en producto depende de todos estos procesos. Michaelis y Menten propusieron un modelo para explicar la
curva de la velocidad de una reaccin en la que intervenga una enzima en funcin de la concentracin de sustrato.
El modelo aplica la teora del estado estacionario, donde la [ES] permanece
constante en el tiempo, para encontrar una ecuacin de la velocidad de reaccin. En la figura 13.7 se ha representado la evolucin en el tiempo de la cantidad de los diferentes elementos que intervienen en una reaccin enzimtica,
donde puede observarse cmo, en el estado estacionario, a partir de un momento determinado las cantidades de ES y E no se modifican con el tiempo porque se forma tanta cantidad de ES como la que se destruye. El estado
estacionario facilita el estudio de las cinticas enzimticas.
El modelo de Michaelis-Menten se aplica al estado estacionario y se fundamenta en las siguientes premisas:
La etapa limitante de la velocidad de transformacin de sustrato (S) en
producto (P) es el paso de:
k2
ES
o EP
Por lo tanto, la velocidad del proceso depende de la cantidad de complejo

ES en el estado estacionario ([ES]e y del poder cataltico de la enzima (k2).
v = k2 u [ES]e
La concentracin de sustrato es muy superior a la cantidad de enzima; la
diferencia es aproximadamente de tres rdenes de magnitud. Por lo tanto
en los primeros instantes del estado estacionario:
[S]e = [S] [ES]e = [S]
Figura 13.7. Evolucin en el tiempo de la

cantidad de los diferentes compuestos
que intervienen en una reaccin
enzimtica. A medida que transcurre el
tiempo, la cantidad de sustrato disminuye
mientras que aumenta la cantidad de
producto formado. La enzima libre, que
se encuentra en muy pequea cantidad,
disminuye hasta un nivel determinado,
mientras que el complejo enzima-sustrato
aumenta hasta un valor concreto; en el
momento que la cantidad de complejo
enzima-sustrato alcanza este valor
mximo, la reaccin se encuentra en el
estado estacionario, se produce tanto
complejo enzima-sustrato como el que se
destruye.
[E]e = [E] [ES]e

Siendo [S]e la cantidad de sustrato en el estado estacionario, de tal manera
que, al ser la cantidad de sustrato tan superior a la cantidad de enzima inicial, se puede despreciar la cantidad de sustrato unido a la enzima ([ES]e),
y por tanto se puede considerar que [S]e es igual a la cantidad de sustrato
inicial, en las primeras fases del estado estacionario.
La [E]e es la cantidad de enzima presente en el estado estacionario, y es
igual a la cantidad de enzima inicial ([E]) menos la cantidad de complejo
ES en el estado estacionario ([ES]e).
El objetivo, a la hora de estudiar la cintica propia de la reaccin de una enzima, es conocer la velocidad de reaccin, que es: v = k2 [ES]e. Cabe destacar
que es muy difcil averiguar la cantidad de ES presente en el estado estacionario
([ES]e), aunque s que puede conocerse la cantidad de sustrato que se aade al
inicio de la reaccin enzimtica, as como una serie de constantes del proceso.
Aplicando la teora del estado estacionario, la velocidad de formacin del complejo ES es igual a la velocidad de transformacin del mismo complejo ES; por lo
tanto, se tiene que:
183
Captulo 13
La velocidad de formacin de ES:
v fES
d [ES]
dt
k 1 [E]e [S]e
La velocidad de transformacin de ES:

v tES
Por lo que:
d [ES]
dt
k 1 [ES]e k 2 [ES]e
k1 [E]e [S] = k1 [ES]e + k2 [ES]e
Sustituyendo:
[E]e = [E] [ES]e
Se obtiene:
[S]e = [S] [ES]e = [S]
k1 ([E] [ES]e) [S] = (k1 + k2) [ES]e

[E] [ES]e
[S]
[ES]e
k 1 k 2
k1
El cociente de constantes es la constante de Michaelis-Menten, llamada Km:

k 1 k 2
k1
Km
La constante de Michaelis-Menten es propia de cada enzima.

Operando en la ecuacin
[E] [ES]e
[S]
[ES]e
se obtiene que:
k 1 k 2
k1
[E] [S] [ES]e [S] = Km [ES]e

[E] [S] = Km [ES]e + [ES]e [S]
[E] [S] = [ES]e (Km + [S])
[ES]e
[E] [S]
Km [S]
Recordando que v = k2 [ES]e, y sustituyendo, se obtiene:

v
k 2 [E] [S]
Km [S]
La velocidad mxima de una reaccin enzimtica se alcanzar cuando toda

la enzima se encuentre en forma de ES; por lo tanto, dicha velocidad mxima
ser Vmx = k2 [E], que es, tal y como sucede con la constante Km, una constante
para cada enzima. Sustituyendo en la ecuacin:
v
Vmx [S]
Km [S]
Ecuacin de Michaelis - Menten
Representado la ecuacin de Michaelis-Menten, v frente a la [S], se obtiene

la curva caracterstica de saturacin de una reaccin catalizada por una enzima
(Figura 13.8).
184
Tcnicas enzimticas
Cuando v = Vmx ocurre que:

Vmax
Operando:
Vmx [S]
Km [S]
Vmx Km + Vmx [S] = Vmx [S]

Vmx Km = Vmx [S] Vmx [S]
Vmx Km = Vmx [S]
Km = [S]
Significado de las constantes cinticas del modelo

Michaelis-Menten: Km y Vmx
Figura 13.8. Representacin de la

ecuacin de Michaelis-Menten, velocidad
de una reaccin catalizada por una
enzima frente a la concentracin de
sustrato. Se observa la tpica curva de
saturacin. Se destacan los valores de las
constantes Vmx y Km.
La Km se ha definido como:
Km
k 1 k 2
k1
Recordemos tambin el esquema general de una reaccin catalizada por una

enzima:
El proceso ms lento de una transformacin enzimtica, como ya se ha comentado, es la transformacin de ES en EP, y no la separacin de ES en E + S.
Por lo tanto, se cumple que k1 !!! k2, y entonces:
Km
k 1 k 2
k1
k 1
k1
Keq
[E] [S]
[ES]
La Km da una idea de la afinidad que tiene la enzima por su sustrato; cuanto

mayor es Km, menor es dicha afinidad (predominan las formas E y S libres); y
cuanto menor es Km, mayor es la afinidad (predomina la forma ES).
La velocidad mxima, Vmx = k2 [E], estima el nmero de centros activos de la
enzima. Hay que recordar que se ha definido la Vmx como la velocidad que se
alcanzara cuando toda la enzima se encontrara unida al sustrato. La constante k2
(que define el poder cataltico de la enzima) es conocida con el nombre de nmero de recambio; es el nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo. Por lo tanto, la Vmx depende de dos factores: de la
cantidad de enzima presente y de la capacidad cataltica de dicha enzima, es
decir, de la velocidad con que transforma al sustrato en producto.
Clasificacin de las enzimas

Las enzimas se clasifican haciendo referencia a las reacciones que catalizan.
Muchas enzimas se han designado simplemente aadiendo el sufijo asa al
nombre del sustrato sobre el que catalizan una reaccin. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrlisis de la argini185
Captulo 13
na. Aunque tambin existen enzimas a las que se les ha dado un nombre que
no tiene relacin con el sustrato que catalizan; por ejemplo, la pepsina y la
tripsina son enzimas que provocan la ruptura de enlaces peptdicos. Adems,
podemos encontrarnos con el problema de que se conozca a una misma enzima con dos o ms nombres, o que a dos enzimas diferentes se les haya dado
el mismo nombre. Con el fin de evitar errores y ambigedades, la Comisin de
Enzimas (EC) de la International Union of Biochemistry (IUB) propuso adoptar
un convenio sistemtico para la designacin y la clasificacin de las enzimas,
aunque muchas enzimas se conocen todava de forma habitual por sus nombres comunes.
Las enzimas se clasifican en funcin de seis clases principales de tipos de reacciones (Figura 13.9), cada una de las cuales presenta diferentes subclases.
Figura 13.9. Se muestran las seis clases
principales de reacciones catalizadas por
las enzimas en los seres vivos, indicndose
el tipo de reaccin catalizada por cada
clase de enzimas.
La nomenclatura de la EC asigna a cada enzima un nmero de cuatro cifras y

un nombre sistemtico, que permiten identificar la reaccin que cataliza. Por
ejemplo, la glucoquinasa (nombre comn) cataliza la siguiente reaccin:
ATP D - glucosa o ADP D - glucosa - 6 - fosfato
El nombre sistemtico de esta enzima es ATP; glucosa fosfotransferasa. Con

el nombre sistemtico se identifica el tipo de reaccin que cataliza, que es la
transferencia de un grupo fosfato, y los sustratos que intervienen en la reaccin,
que son el ATP y D-glucosa. El nmero de cdigo es EC 2.7.1.2.; la primera cifra
se refiere al nombre de la clase (2, transferasa), la segunda hace referencia a la
subclase (7, fosfotransferasa), la tercera a la sub-subclase (1, fosfotransferasas con
un grupo hidroxilo como aceptor), y la cuarta cifra hace referencia al sustrato (2,
para la D-glucosa como aceptor del grupo fosfato).
DISEO DE LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

El objetivo bsico de los mtodos enzimticos es determinar la velocidad mxima de una enzima (actividad mxima), lo que permite inferir la cantidad de enzima presente. En el diseo y desarrollo de las tcnicas enzimticas hay que
tener en cuenta que las enzimas son muy sensibles a las condiciones de reaccin
(pH, temperatura, etc.) debido a que su estructura tridimensional juega un papel
clave en su actividad. Si uno de estos factores cambia, la actividad de la enzima
puede verse comprometida, por lo que las medidas de actividades enzimticas
deben realizarse en condiciones muy bien definidas, para que los resultados de
distintas determinaciones puedan ser comparables.
186
Tcnicas enzimticas
Medio de reaccin
El medio donde transcurre la reaccin enzimtica requiere la presencia de diferentes compuestos y condiciones: sustrato, cosustratos, condiciones ptimas de
pH y temperatura, la presencia de iones, etc. As, el medio donde se va a realizar la medida de una actividad enzimtica debe disearse a partir de los conocimientos bioqumicos sobre la enzima a estudiar; no slo deben encontrarse en
el medio todos los sustratos e iones necesarios para que la reaccin pueda establecerse, sino que adems deben hallarse en condiciones saturantes, es decir, en
cantidades tales que la velocidad de reaccin dependa tan slo de la cantidad
de enzima presente y no de los otros elementos participantes en la reaccin.
De esta forma, desde el punto de vista del diseo metodolgico, los sustratos
son como los reactivos de los mtodos qumicos y se aaden en exceso. Se prepara un tubo donde se desee realizar una reaccin enzimtica, con todos los ingredientes necesarios para que tenga lugar dicha reaccin; el medio se tampona
al pH ptimo de accin de la enzima y se controla la temperatura (suele ser
25 C o 37 C). Deben aadirse, adems, los iones necesarios para el correcto
funcionamiento de la enzima, los cosustratos de la reaccin y la muestra, que
contiene la enzima de la cual quiere determinarse la actividad. Por motivos operativos, se prepara el medio sin uno de los cosustratos de la reaccin que quiere
estudiarse y ste no se aade hasta el momento inicial del proceso; as es posible
determinar el tiempo inicial de la reaccin.
Las condiciones que requiere la enzima se pueden encontrar, por lo general,
en la bibliografa, y es necesario respetar dichas condiciones para poder comparar los resultados de diferentes estudios, ya que los ingredientes y las condiciones
del medio de reaccin han de ser los mismos; si no, no son comparables los resultados de diferentes determinaciones.
Un aspecto importante es determinar la cantidad de sustratos y cosustratos
que tienen que aadirse para que la velocidad de reaccin no sea dependiente
de ellos. Adems, algunas enzimas son inhibidas por su sustrato, por lo que la
concentracin de sustrato tiene que elegirse con cuidado. Normalmente puede
tomarse una concentracin de sustrato que sea 10 veces mayor que la Km de la
enzima; a estas concentraciones, la velocidad es el 91% de la velocidad mxima,
ya que:
v
Vmx u [S]
Km [S]
Vmx u 10 Km
Km 10 Km
Vmx u 10
1 10
0,91 u Vmx
Medida de la velocidad de reaccin

La velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima, en condiciones
saturantes de sustrato, permite determinar la velocidad mxima, la cual, a su
vez, permite inferir la cantidad de enzima presente. La velocidad se puede determinar siguiendo la aparicin de producto o la desaparicin de sustrato en el
tiempo.
v
d [S]
dt
d [P]
dt
Siendo [S] la concentracin de sustrato, [P] la de producto y t el tiempo.

187
Captulo 13
El seguimiento de la reaccin se puede realizar fcilmente si el producto o el

sustrato presentan una caracterstica mensurable que sea proporcional a la cantidad de compuesto presente y que nicamente la presente uno de ellos, bien el
sustrato o bien el producto. Si ninguno de los dos presenta esta caracterstica, o
bien se hace adquirir a uno de ellos una caracterstica mensurable, o bien se
puede acoplar una segunda reaccin enzimtica que utilice alguno de los productos de la reaccin objeto de estudio; esta segunda reaccin debe poder ser
seguida, bien porque presente un producto, o un cosustrato, que posea o pueda
adquirir una propiedad mensurable.
Si se representa la variacin de la concentracin de sustrato o de producto
respecto al tiempo (Figura 13.10) se observa cmo la velocidad vara en funcin
del tiempo.
variacin de la concentracin de sustrato
y de producto con respecto al tiempo en
una reaccin enzimtica. Se indica la
recta tangente a la curva cuando t = 0,
cuya pendiente corresponde a la
velocidad inicial ( v0 ) de reaccin.
La velocidad, en cada momento de la reaccin, corresponde a la pendiente

de la recta tangente a la curva en cada punto, es decir, su derivada. Como se
puede observar en la figura 13.10, tanto por la forma de la curva de desaparicin de sustrato, como por la forma de la curva de aparicin de producto, la
velocidad de reaccin va cambiado a lo largo del tiempo. Esto es debido a que,
a medida que transcurre la reaccin, el producto producido puede ir inhibiendo a la propia enzima; adems la enzima se desnaturaliza, inactivndose parcialmente al cambiar su estructura tridimensional. Por otra parte, no se debe
olvidar que, si la cantidad de sustrato no es superior a la saturante, la disminucin de la velocidad de reaccin tambin puede deberse al propio agotamiento
del sustrato.
Siempre que sea posible, las enzimas se ensayan empleando sistemas en que
el pH es ptimo y la concentracin de sustrato se halla por encima del nivel de
saturacin; de esta manera la velocidad inicial de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de enzima. En el caso de que sean necesarios cofactores para la reaccin, stos deben encontrarse en concentracin superior a la
de saturacin, de manera que el factor limitante de la velocidad de reaccin sea
exclusivamente la concentracin de la enzima, que es lo que se quiere llegar a
conocer. Si se representa [S] vs. t, o bien [P] vs. t, la pendiente de la recta tangente a la curva es la velocidad de la reaccin en cada momento, ya que:
v
d [S]
dt
d [P]
dt
Las unidades utilizadas para medir la actividad enzimtica son:

La unidad de actividad enzimtica (U) es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de un micromol de sustrato en un minuto.
188
Tcnicas enzimticas
El katal (kat) es la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato

por segundo. Es la unidad del sistema internacional (SI).
1 kat = 60.000.000 U
El katal es una unidad demasiado grande para las actividades que se pueden
encontrar en los homogeneizados de diferentes tejidos animales y en el suero,
as que normalmente se utilizan submltiplos de estas unidades:
1 Pkat = 106 kat = 60 U
1 nkat = 109 kat = 0,06 U
Los cambios de la concentracin de sustrato o de producto pueden seguirse
de dos formas diferentes: de manera continuada, o a un tiempo determinado.
Si el sustrato o el producto poseen una caracterstica que puede medirse (por
ejemplo absorbancia de radiacin electromagntica o fluorescencia), el seguimiento puede realizarse tanto siguiendo la aparicin de producto como la desaparicin de sustrato, de forma que se realiza un anlisis continuo. No obstante,
si el producto o el sustrato no tienen una propiedad que pueda medirse, tan
slo pueden calcularse las variaciones de sus concentraciones en un tiempo determinado, tomando una alcuota del medio de reaccin y aadiendo un reactivo adecuado para que el sustrato o el producto adquiera una caracterstica
mensurable; este tipo de seguimiento se conoce con el nombre de anlisis de
punto final.
Anlisis continuo. En este tipo de anlisis de enzimas, se registra el cambio de
concentracin del sustrato o del producto y se representa en funcin del tiempo
(Figuras 13.11 y 13.12). La medida ms precisa de la velocidad de reaccin es la
de la velocidad inicial (v0), que se puede determinar trazando la tangente de la
curva en el tiempo cero y calculando su pendiente o utilizando programas para
ajustes de curvas que permitan calcular la velocidad inicial.
Anlisis de punto final. No siempre es posible medir de manera continuada las
variaciones de la concentracin de sustrato o de producto. En tal caso se mide la
cantidad de sustrato o de producto al inicio de la reaccin y despus de un
perodo de tiempo determinado y, a partir de estos dos valores, se calcula la velocidad de reaccin. La desventaja que presenta este tipo de seguimiento es que
se pueden cometer errores debido a la disminucin de la velocidad con el tiempo, aunque se puede utilizar como mtodo analtico, ya que la primera parte de
las curvas de desaparicin de sustrato o de aparicin de producto respecto al
tiempo es relativamente lineal (ver figuras 13.11 y 13.12). Este error puede evitarse realizando ms determinaciones a diferentes tiempos y ajustando los resultados al tipo de curva de aparicin de producto, [P] = [Pf] u (1 ekt), o de
desaparicin de sustrato, [S] = [S0] u ekt; utilizando programas de ajustes de curvas se puede determinar la velocidad inicial.
Deteccin del sustrato o del producto

de una reaccin enzimtica
El seguimiento de una reaccin catalizada por una enzima requiere medir la disminucin de sustrato, o de un cosustrato, o el aumento de producto o de un co-
Figura 13.11. Curva caracterstica de

desaparicin de sustrato de una reaccin
catalizada por enzimas. Se ajusta a la
frmula: [S] = [S0] u ekt; siendo [S] la
concentracin de sustrato, [S0] la
concentracin inicial de sustrato, t el
tiempo y k una constante. La velocidad de
reaccin decae desde la velocidad inicial
mxima, v0 , que puede representarse
como la pendiente de la tangente de la
curva en el tiempo cero.
Figura 13.12. Curva caracterstica de la

aparicin de producto de una reaccin
catalizada por enzimas, que se ajusta a la
frmula: [P] = [Pf] u (1 ekt); siendo [P] la
concentracin de producto, [Pf] la
concentracin de producto cuando el
tiempo tiende a infinito, t el tiempo y k
una constante. La velocidad de reaccin
decae desde la velocidad inicial mxima,
v0 , que puede representarse como la
pendiente de la tangente de la curva en el
tiempo cero.
189
Captulo 13
Figura 13.13. Reaccin de xidoreduccin del NAD+ o del NADP+ y

espectros de absorcin del NAD+ y del
NADH.
producto. La espectrofotometra y la fluorimetra son los mtodos ms utilizados

para el seguimiento de las reacciones enzimticas. Aunque nicamente un nmero reducido de sustratos o de productos tienen mximos de absorcin en la
regin del UV-visible del espectro de radiacin electromagntica o fluorescencia,
existe la posibilidad de aadir un reactivo adecuado a alguno de los productos o
de los sustratos, para que le haga adquirir tales capacidades. Este reactivo debe
reaccionar nicamente con el sustrato o con el producto, ya que si reaccionara
con los dos no se podra distinguir la aparicin de producto o la desaparicin de
sustrato.
De esta forma, en las reacciones enzimticas de xido-reduccin, que utilizan como cosustratos los dinucletidos de nicotinamida y adenina (NAD+ y
NADP+) resulta fcil realizar un seguimiento del transcurso de la reaccin, ya
que la forma reducida de estos cosustratos presenta un espectro de absorcin de
radiacin distinto al de la oxidada (Figura 13.13). Por ejemplo, el NADH (forma
reducida) presenta un mximo de absorcin a 340 nm que no presenta el NAD+
(forma oxidada). Asimismo, si se lleva a cabo un seguimiento de la reaccin leyendo la absorbancia a 340 nm de una muestra en la que se analice dicha reaccin, se puede constatar la aparicin o desaparicin (dependiendo del sentido
de la reaccin) de la coenzima reducida. A partir de los valores de absorbancia,
en funcin del tiempo, se puede calcular la velocidad inicial del proceso.
Un ejemplo de este tipo de seguimientos lo constituye el estudio de la reaccin de la lactato deshidrogenasa, que puede medirse por este sistema ya que,
concomitantemente, la oxidacin de lactato a piruvato por accin de esta enzima provoca la transformacin de NAD+ en NADH (Figura 13.14) (ver Anexo de
Mtodos en el CD).
Figura 13.14. Reaccin catalizada por la

lactato deshidrogenasa.
La adquisicin de una caracterstica mensurable por parte de los reactivos o

de los productos, permitira realizar el seguimiento de la reaccin por un anlisis
de punto final, como por ejemplo ocurre con el estudio de la glutamina sintasa
(Figura 13.15).
Figura 13.15. La actividad de la glutamina
sintasa se determina por un mtodo de
punto final, donde la enzima cataliza la
formacin de g-glutamil hidroxamato a
partir de glutamina. La reaccin se
detiene en fro y aadiendo reactivo
frrico en medio cido. Los complejos de
hierro y g-glutamil hidroxamato presentan
coloracin azul, pudiendo determinarse a
500 nm.
190
Tcnicas enzimticas
En los casos en que los componentes de la reaccin no presenten una caracterstica que se pueda medir, ni sea posible su reaccin para adquirirla, o bien
aparezcan interferencias en la muestra, la solucin se encuentra en acoplar una
segunda reaccin a la primera que s presente un sustrato o un producto que permita realizar un seguimiento de las reacciones, o bien que permita evitar las interferencias. El principio de este tipo de tcnicas enzimticas es que alguno de los
productos de la primera reaccin intervenga como sustrato en la segunda. As, en
el medio de incubacin se incluye el tampn adecuado para el funcionamiento
de las dos enzimas, los sustratos de la primera reaccin (con excepcin del que se
aadir para iniciar el proceso), los sustratos de la segunda reaccin (con excepcin del que se forma como producto de la primera reaccin) y la enzima de la
segunda reaccin, as como los iones necesarios para el correcto funcionamiento
de las dos reacciones enzimticas. El proceso se inicia aadiendo el sustrato de la
primera reaccin; la enzima que quiere estudiarse transforma los sustratos en productos a una velocidad que se encuentra limitada por la cantidad presente de dicha enzima. Uno de los productos formados en la primera reaccin es el sustrato
que falta para que pueda darse la segunda reaccin, cuya enzima se encuentra
en exceso, de manera que la velocidad de transformacin de sustrato en esta segunda reaccin tan slo depende de la cantidad de uno de los productos de la
primera reaccin. En esta segunda reaccin, tal y como ya se ha comentado, puede seguirse la desaparicin o la aparicin de uno de los sustratos o productos y,
de esta manera, calcular, al final, la velocidad de la primera reaccin. A la segunda reaccin enzimtica se le da el nombre de reaccin indicadora.
Por ejemplo, un gran nmero de estas reacciones acopladas, tiles para el seguimiento de una reaccin de inters, son las catalizadas por deshidrogenasas,
en las que intervienen como cosustratos los coenzimas de nucletidos de adenina, NADH/NAD+ (Figura 13.16) (ver Anexo de Mtodos en el CD).
A veces es necesario acoplar ms reacciones enzimticas al proceso para poder realizar el seguimiento de la primera reaccin. La cantidad de enzima en estas reacciones auxiliares debe ser suficiente en todos los casos para que la
velocidad de transformacin dependa nicamente de los sucesivos productos
formados, en definitiva, de la cantidad de enzima responsable de la reaccin
que se pretenda seguir.
Figura 13.16. Medida de la actividad
aspartato aminotransferasa (AST)
utilizando una reaccin indicadora, la
catalizada por la malato deshidrogenasa
(MDH). El descenso de absorbancia a 340
nm ser directamente proporcional a la
aparicin del producto de la primera
reaccin enzimtica (oxalacetato); este
descenso permitir calcular la velocidad
inicial de la primera reaccin.
191
Captulo 13
Algunos de los mtodos de seguimiento de la actividad enzimtica pueden

ser fluorescentes, con lo que se aumenta la sensibilidad de la determinacin.
Por ejemplo, los nucletidos de adenina son fluorescentes, se excitan a
340 nm, emitiendo luz a 460 nm. Los mtodos fluorimtricos presentan el inconveniente de que la presencia en la muestra de otros compuestos fluorescentes puede ocasionar ruido de fondo, que reduce la sensibilidad de las
medidas realizadas. Se han desarrollado tambin mtodos luminomtricos, microcalorimtricos, etc.
LAS ENZIMAS COMO REACTIVOS

El conocimiento de las enzimas abre la puerta a los mtodos enzimticos, una alternativa ms especfica a los mtodos qumicos. Recordemos que la especificidad de los mtodos qumicos es el resultado de la presencia de un grupo
funcional: grupo aldehdo, grupo amino, enlace peptdico, grupo alcohol, etc.
Muchas veces, las biomolculas presentan grupos funcionales muy similares, por
lo que ms de una biomolcula puede reaccionar con un mismo reactivo. Este
problema se reduce utilizando las enzimas como reactivos, ya que stas son especficas de sustrato y no de grupo funcional, es decir, reconocen una agrupacin de grupos funcionales y su distribucin tridimensional, debido a que el
centro activo de la enzima es una entidad tridimensional. As, se pueden disear
mtodos en los que el reactivo responsable de la transformacin de un compuesto sea una enzima. Como siempre, dicha transformacin debe provocar que
un compuesto que presentaba una caracterstica mensurable la pierda, o viceversa. De esta manera, para disear un mtodo enzimtico, basta con conocer
las enzimas que pueden actuar sobre el compuesto a determinar y elegir la que
permita cuantificar la desaparicin de sustrato o la aparicin de producto. Al actuar la enzima como reactivo, debe aadirse en la cantidad suficiente para transformar todo el sustrato en producto, es decir, en exceso. La ventaja de los
mtodos enzimticos es su elevada especificidad, por lo que permiten obviar,
muchas veces, pasos previos de purificacin.
El diseo de los mtodos enzimticos se basa en establecer un medio de reaccin que contenga todos los componentes necesarios para que sta tenga lugar: tampn, temperatura, iones, cosustratos adecuados, etc. Normalmente, en
estos casos, lo ltimo que se aade es la enzima. Adems, se requiere que el
sustrato o el producto formado presenten una caracterstica que pueda medirse,
aunque puede realizarse una reaccin qumica sobre el sustrato o el producto, o
acoplarse otra reaccin enzimtica que acte como reaccin indicadora. As
pues, las posibilidades son mltiples, acoplando y combinando los diferentes
mtodos que hemos visto. Normalmente se procede a la lectura de la caracterstica mensurable antes y despus de aadir la enzima como reactivo. En algunos
casos, si se utiliza un reactivo qumico una vez transcurrida la reaccin, se procesan dos tubos de muestra en paralelo, con la nica diferencia de que a uno no
se le aade la enzima, de manera que la diferencia de medida entre los dos tubos se atribuye nicamente al efecto de la accin de la enzima, la reaccin especfica.
Como ejemplo de la determinacin de la concentracin de un sustrato utilizando un mtodo enzimtico, veamos la determinacin de glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa, en el que tienen lugar las siguientes reacciones:
192
Tcnicas enzimticas
Glucosa oxidasa
a) Glucosa O 2 H2O

o Gluconato H2O2
b) 2H2O 2 4 - Aminofenazona Fenol Peroxidasa
o Cromgeno 4 H2O
El reactivo que se utiliza contiene las enzimas glucosa oxidasa (que se usa en
a) y peroxidasa (b), y los sustratos necesarios para que la reaccin tenga lugar en
condiciones definidas y ptimas para que el sistema funcione (ver Anexo de Mtodos en el CD).
Cuando se aade la muestra, es decir, el suero que contiene la glucosa que
se desea medir, se desencadena la reaccin. El color que aparece por formacin
de un cromforo puede medirse espectrofotomtricamente. Como patrones se
utilizan soluciones de glucosa de concentracin conocida.
El anlisis de la glucosa se puede realizar tambin por el mtodo de la hexoquinasa:
Hexoquinasa
a) Glucosa ATP

o Glucosa - 6 -P ADP
Glucosa-6-P DH
b) Glucosa - 6 -P NADP

o 6 -Fosfogluconato NADPH
Donde en la primera reaccin (a) se utiliza la hexoquinasa y, en la segunda
(b), la glucosa-6-P deshidrogenasa. En este caso, se mide la aparicin de NADPH
(ver Anexo de Mtodos en el CD).
Adems de la glucosa, en el laboratorio pueden medirse otros sustratos utilizando mtodos similares: urea, colesterol, triacilglicridos, cido rico, etc. En el
Anexo de Mtodos del CD se pueden encontrar mtodos enzimticos para la
determinacin de diferentes biomolculas.
Uno de los inconvenientes de las tcnicas enzimticas es el elevado coste de
la determinacin en comparacin con los mtodos qumicos, ya que las enzimas, normalmente, son reactivos caros y, adems, no pueden recuperarse tras
cada determinacin. Una manera de eludir este ltimo problema es la utilizacin de enzimas inmovilizadas, que permite la recuperacin y reutilizacin de
las mismas en varias determinaciones. Las enzimas se inmovilizan sobre diferentes soportes como cristales de celulosa, carboximetil celulosa, dietilaminoetil celulosa (DEAE celulosa), agarosa, etc. La enzima de inters puede inmovilizarse
sobre el adsorbente de diferentes maneras; una de ellas consiste en unirla covalentemente a travs de la formacin de enlaces entre los aminocidos de la pro-
Figura 13.17. Ejemplo de utilizacin de

enzimas como reactivos en las tcnicas de
inmunoensayo.
193
Captulo 13
pia enzima (eligiendo aquellos que no sean esenciales para su funcionamiento) y

de la matriz. Las enzimas pueden tambin inmovilizarse por adsorcin o
atrapndolas dentro de la matriz adecuada.
Las enzimas utilizadas como reactivos de marcaje (Figura 13.17) tienen tambin aplicaciones en las tcnicas inmunoqumicas. De esta manera, una enzima
puede utilizarse como molcula marcadora al unirse covalentemente a un anticuerpo que detecte una molcula de inters, pudindose utilizar su actividad
enzimtica como seal de deteccin de dicha molcula. Este tipo de estrategias
se desarrolla de forma ms amplia en el captulo 14.
194
Tcnicas inmunoqumicas
INTRODUCCIN
Anticuerpos
Obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales
Interacciones antgeno-anticuerpo
TCNICAS ANALTICAS INMUNOQUMICAS
Reacciones de precipitacin
Inmunoprecipitacin en solucin
Inmunoprecipitacin en gel
Ensayos inmunoqumicos que utilizan marcadores
Radioinmunoensayo (RIA) y ensayo inmunorradiomtrico (IRMA)

Inmunoensayo enzimtico (EIA): marcaje con enzimas
Fluoroinmunoensayos
Western blot
196
14
INTRODUCCIN
Las tcnicas separativas, como las electroforticas y las cromatogrficas, no permiten separar con la suficiente resolucin todos los tipos de protenas, impidiendo, por tanto, la determinacin y cuantificacin de ciertas protenas. Aunque las
tcnicas enzimticas son tiles para el anlisis de ciertas protenas, no todas las
protenas son enzimas, o simplemente no se puede cuantificar su actividad. Por
tanto, antes de la aparicin de los mtodos inmunolgicos, quedaba un amplio
nmero de protenas que no se podan determinar de manera sencilla y rpida.
Tena que acudirse a tediosas tcnicas de aislamiento, que consuman grandes
cantidades de muestra y tiempo, aparte de que existan protenas que difcilmente se podan cuantificar o determinar.
Los mtodos analticos para la determinacin de un compuesto especfico
deben basarse en sus caractersticas diferenciales en relacin con el resto de
compuestos que lo acompaan. La diferencia fundamental entre las distintas
protenas radica en su estructura tridimensional y sta depende de la estructura
primaria, es decir, de la secuencia de aminocidos. Por tanto, la cuantificacin
de protenas concretas puede basarse en su estructura primaria, que determina
la estructura terciaria. As pues, una manera de resolver el problema de la cuantificacin de una protena determinada radica en descubrir qu compuestos son
capaces de reconocerla por su estructura terciaria, es decir, por la disposicin tridimensional de sus grupos funcionales. La respuesta es clara: las inmunoglobulinas o anticuerpos seran candidatos a poder solucionar el problema.
De esta manera, las reacciones inmunoqumicas constituyen el fundamento
de una amplia gama de ensayos sensibles y especficos para una gran variedad
de mtodos, incluidos mtodos aplicados en clnica.
Anticuerpos
Los anticuerpos son un grupo especial de protenas: las inmunoglobulinas (Ig). Los
anticuerpos son capaces de unirse de manera especfica a una amplia variedad de
197
Captulo 14
antgenos naturales y sintticos, entre ellos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos, lpidos y otras molculas. Las inmunoglobulinas pueden dividirse en 5 clases:
inmunoglobulinas G (IgG), A (IgA), M (IgM), D (IgD) y E (IgE). De todas ellas, las IgG
constituyen el reactivo inmunoqumico ms utilizado, mientras que las dems inmunoglobulinas no juegan un papel importante en los anlisis inmunoqumicos.
Las IgG son glucoprotenas compuestas de dos cadenas dobles. Cada una de
las dos cadenas presenta una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L), que se
mantienen unidas por puentes disulfuro. Las dos cadenas ligeras y las dos cadenas pesadas son idnticas entre s.
Las cadenas se caracterizan por presentar una regin variable (V) que se sita
en los dominios N terminales de cada cadena (VL y VH); estas secuencias variables son caractersticas de cada anticuerpo. Los dominios C terminales son secuencias de aminocidos casi constantes, que constituyen la regin constante del
anticuerpo (C), y denominada CH o CL segn el tipo de cadena; estas regiones
presentan la misma secuencia de aminocidos en todos los anticuerpos pertenecientes a la misma clase de inmunoglobulinas, difiriendo en los distintos tipos de
inmunoglobulinas (Figura 14.1).
Figura 14.1. Diagrama esquemtico de

una IgG. Se puede observar la zona con
carbohidratos, los puentes disulfuro y las
regiones de las que se compone la
molcula.
La secuencia variable del extremo amino terminal de cada cadena determina

la especificidad antignica de un anticuerpo concreto. Cada secuencia nica de
aminocidos es producida por una nica lnea celular o clon de linfocitos B. La
respuesta normal del hospedador a un inmungeno cualquier sustancia capaz
de inducir una respuesta inmune da lugar a la estimulacin de una o ms clases
de linfocitos B, que son capaces de dividirse y diferenciarse para dar lugar a clulas plasmticas capaces de secretar anticuerpos. Cada clon de linfocitos B produce anticuerpos con una nica especificidad. Un antgeno complejo dar lugar
a una multiplicidad de anticuerpos con diferentes especificidades que derivan
de diferentes clones. Estos anticuerpos se denominan policlonales y exhiben diversas especificidades en su reactividad con el inmungeno. Cada regin nica
198
de la molcula del antgeno capaz de unir un anticuerpo complementario se denomina eptopo o determinante antignico.
El trmino inmungeno (en lugar de antgeno) se utiliza actualmente para hacer referencia a los compuestos capaces de inducir la formacin de anticuerpos
cuando son inyectados en el hospedador. El trmino antgeno (Ag) es utilizado
para designar cualquier compuesto capaz de reaccionar con un anticuerpo (Ac),
sin que necesariamente sea capaz de inducir la formacin de anticuerpos. Por
ejemplo, la albmina de huevo es un inmungeno, ya que es capaz de inducir la
formacin de anticuerpos anti-albmina de huevo; en cambio, la morfina es un
antgeno, ya que reacciona con anticuerpos anti-morfina, pero no es un inmungeno, ya que no induce la formacin de anticuerpos, a no ser que previamente
se haya conjugado con una protena. En este punto cabe introducir el concepto
de hapteno, que es la porcin de molcula o complejo antignico que determina su especificidad inmunolgica, capaz de unirse al anticuerpo, pero que por s
solo no puede estimular la respuesta inmune.
Obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales

Los anticuerpos se obtienen por la activacin de la respuesta inmune en un animal. Normalmente, se consigue inmunizando varias veces el mismo animal (por
ejemplo un ratn o un conejo) con un inmungeno. Se inyecta una disolucin del
inmungeno y, al cabo de 15 das, se vuelve a inyectar (normalmente a una concentracin menor que la primera dosis); se extrae sangre del animal una semana
despus, se deja coagular y se recoge el suero. En este caso, se obtiene un suero
con una mezcla de anticuerpos frente a distintos eptopos del inmungeno, llamado antisuero. Cuando se obtiene esta mezcla de anticuerpos, se habla de anticuerpos policlonales (Figura 14.2), ya que provienen de diferentes clones de clulas B.
Figura 14.2. Esquema representativo de la
obtencin de anticuerpos policlonales,
que son una mezcla de anticuerpos que
reconocen distintos eptopos de un
mismo antgeno. En la figura, cada
anticuerpo representado es especfico de
cada uno de los 4 eptopos del
inmungeno.
199
Captulo 14
La obtencin de anticuerpos monoclonales es ms compleja y requiere ms

etapas (Figura 14.3). Una vez inmunizado el animal, se recogen linfocitos (del
bazo o de los nodos linfticos) y se fusionan con clulas procedentes de un mieloma de ratn (lnea inmortal). La fusin se realiza en presencia de polietiln glicol, que favorece dicha fusin. Las clulas de mieloma utilizadas son deficientes
en una enzima, la hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, lo que determina
que no sean capaces de sintetizar bases pricas a partir de timidina e hipoxantina en presencia de aminopterina, es decir, no son capaces de sobrevivir en un
medio HAT (un medio selectivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina).
Figura 14.3. La obtencin de anticuerpos
monoclonales implica una serie de etapas:
inmunizacin del animal, obtencin de
los linfocitos y su fusin con clulas de
mieloma, seleccin de los hibridomas
usando un medio HAT, y produccin de
los anticuerpos monoclonales.
Una vez fusionadas las clulas del mieloma con los linfocitos, se someten a
un proceso de seleccin en un medio HAT. Las clulas hbridas (hibridomas)
pueden sobrevivir en el medio selectivo, ya que estas clulas combinan la inmortalidad de las clulas del mieloma y el material gentico de los linfocitos, necesario para la sntesis de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa
200
(Figura 14.4). Las clulas no fusionadas se mueren en este medio, bien porque
no son inmortales (linfocitos fusionados entre ellos o simplemente no fusionados
con clulas inmortales), o bien por la carencia de la enzima (clulas inmortales
no fusionadas con linfocitos). Los hibridomas, despus de unas tres semanas de
crecimiento, son seleccionados segn el anticuerpo que producen. Para esta seleccin, existe una amplia variedad de tests disponibles, entre ellos, el radioinmunoensayo o el inmunoensayo enzimtico. Las lneas celulares que secretan el
anticuerpo con la especificidad deseada son clonadas en subcultivos. De esta
manera, es posible aislar una nica lnea celular que produce un anticuerpo con
una especificidad por un nico eptopo de un inmungeno, es decir, un anticuerpo monoclonal (Figura 14.3).
La utilizacin de uno u otro tipo de anticuerpos depende de la finalidad de la
tcnica a utilizar. As, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterognea
de anticuerpos y es difcil obtener siempre la misma especificidad de unin
cuando se comparan diferentes lotes de anticuerpos; de hecho, los resultados
obtenidos con anticuerpos policlonales se basan en una media de las propiedades de los diferentes anticuerpos formados. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales, aunque son ms difciles de obtener que los policlonales, presentan
una serie de ventajas sobre stos, ya que reconocen un nico eptopo del inmungeno y se pueden cultivar y subcultivar los hibridomas obtenidos, lo que
permite obtener anticuerpos con las mismas caractersticas aunque procedan de
diferentes lotes de produccin.
Figura 14.4. Esquema de la fusin de una

clula B y una clula cancerosa para
producir una lnea celular productora de
anticuerpos con una determinada
especificidad.
Interacciones antgeno-anticuerpo
La unin entre el anticuerpo y el antgeno se establece por fuerzas dbiles entre
distintos grupos funcionales de ambos; esta unin tiene lugar en un espacio tridimensional. Las interacciones que se producen pueden ser hidrofbicas (entre
grupos apolares), dipolo-dipolo (entre grupos polares) o por enlaces salinos (entre grupos cargados). Cuanto mayor es el nmero de interacciones que se establecen entre las dos molculas, y cuanto ms ptima sea la distancia de estas
interacciones en conjunto, mayor ser la especificidad de unin entre el antgeno y el anticuerpo.
La reaccin entre el antgeno y el anticuerpo es una reaccin de equilibrio
que transcurre en varias fases (Figura 14.5). En la fase inicial, un antgeno multivalente se une a un anticuerpo bivalente; en la segunda fase se van aglutinando
ms antgenos y anticuerpos para formar un complejo mltiple (esta segunda
fase es mucho ms lenta que la primera); en la tercera fase se produce la precipitacin del complejo formado despus de que ste alcance un tamao crtico.
Las interacciones que se establecen entre el antgeno y el anticuerpo se pueden ver afectadas por cambios de pH, temperatura, fuerza inica del medio,
presencia de polmeros lineales, etc. Estos factores pueden utilizarse para aumentar la especificidad de las interacciones antgeno-anticuerpo, disminuyendo
las interacciones no deseadas o inespecficas.
Un ejemplo de esto ltimo es el hecho de que la presencia de cationes inhibe
la unin entre el antgeno y el anticuerpo. El valor de esta inhibicin depende del
tipo de catin que se utilice, de forma que si se ordenan diferentes cationes en
funcin del grado de inhibicin que provocan se obtiene la siguiente secuencia:
Cs+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+
Figura 14.5. Representacin de las fases

de una interaccin antgeno-anticuerpo,
donde n es el nmero de eptopos por
molcula y a y b son el nmero de
molculas de antgeno y anticuerpo por
complejo respectivamente. Inicialmente se
unen el antgeno y el anticuerpo y, en una
segunda fase, se forma una agrupacin
macromolecular entre los antgenos y los
anticuerpos.
201
Captulo 14
Esto se debe a que, cuanto menor es el radio inico, ms se incrementa el radio de hidratacin de los iones, de manera que cuanto ms pequeo es el radio de hidratacin, las interacciones de los cationes con los grupos aninicos
del sitio de unin del anticuerpo son mayores. Un efecto similar puede observarse con los aniones, por ejemplo, una secuencia como la anterior sera:
I > Br > Cl > F, de manera que, al disminuir el radio de hidratacin, mayor es la probabilidad de que interfieran los aniones en la unin antgeno-anticuerpo.
La presencia de polmeros lineales y solubles en agua en el medio donde se
encuentra una protena y un anticuerpo especfico frente a ella, favorece la precipitacin del complejo. La solubilidad de una protena en esta mezcla es inversamente proporcional al peso molecular de tales polmeros, es decir, cuanto
mayor sean los polmeros, menor ser la solubilidad de la protena. Este fenmeno se debe a una mayor concentracin del anticuerpo en la disolucin, provocada por una disminucin del agua libre de la misma, ya que parte del agua
interacciona con el polmero lineal y no est libre para disolver el anticuerpo. Al
aumentar la concentracin de protenas, por la disminucin del agua libre, se favorecen los choques entre ellas, facilitndose de esta manera la precipitacin de
una protena antignica en presencia de anticuerpos contra ella. En la figura 14.6
se recogen algunos de los polmeros utilizados en la precipitacin de anticuerpos, aunque cabe comentar que el ms utilizado es el polietiln glicol 6000, a
concentraciones de 3 a 5 g/dL.
Figura 14.6. Algunos polmeros utilizados
en la precipitacin de protenas.
La fuerza o la energa de interaccin entre el anticuerpo y el antgeno se pueden describir utilizando dos trminos. Uno de los trminos es la afinidad, que
define la energa de interaccin entre un nico lugar de combinacin en el anticuerpo y su correspondiente eptopo en el antgeno. El otro trmino es la avidez,
que se refiere a la fuerza total de unin entre el anticuerpo y el antgeno e incluye la suma de las afinidades de unin de todos los lugares individuales en el anticuerpo a sus eptopos. Por lo tanto, la afinidad hace referencia a una unin en
concreto, mientras que la avidez hace referencia al conjunto de todas las uniones que pueden darse.
Otro aspecto interesante es que las caractersticas de la protena y su entorno
cambian con respecto a la protena en disolucin cuando el antgeno o el anticuerpo se unen a una fase slida, como puede ser una membrana de celulosa.
Al encontrarse la protena inmovilizada, se favorecen las interacciones anticuerpo-antgeno, favoreciendo as la formacin de complejos tanto con anticuerpos
de alta como de baja avidez, y mejorando de esta manera la sensibilidad de las
aplicaciones analticas, aunque disminuye la especificidad de las mismas.
TCNICAS ANALTICAS INMUNOQUMICAS

Los anticuerpos han solucionado el problema que poda plantearse en determinadas tcnicas analticas, para reconocer especficamente una protena u otros
202
compuestos. La unin especfica antgeno-anticuerpo puede utilizarse para

cuantificar el compuesto, midiendo la cantidad de complejo antgeno-anticuerpo formado.
La unin de los antgenos con los anticuerpos produce complejos supramoleculares, por lo que cabe esperar que, al aumentar el tamao de los complejos,
se produzca una disminucin de la solubilidad de las molculas implicadas, provocndose su precipitacin. Es posible utilizar esta propiedad para realizar una
medida de la cantidad de complejo antgeno-anticuerpo formado, de manera
anloga a la determinacin de protenas por mtodos fsicos de turbidez. No
obstante, muchas veces se aade un sistema de cuantificacin diferente al de los
mtodos de turbidez, ms especfico y sensible.
As pues, puede recurrirse a los sistemas de marcaje que conocemos de los
diferentes mtodos que hemos ido desarrollando a lo largo del libro, que son:
Radiactividad
Color o fluorescencia
Uso de enzimas como marcadores
De forma que se puede decir que:
Ag Ac * o Ag: Ac *
Donde * es cualquier sistema de marcaje que permita cuantificar la cantidad

de complejos antgeno-anticuerpo (Ag:Ac). De esta manera, la especificidad de
deteccin del compuesto de inters la proporcionan los anticuerpos, mientras
que el sistema de deteccin final se da a travs de un marcaje realizado sobre
los propios anticuerpos, pudindose inferir la cantidad del compuesto presente
en una muestra.
El problema de la utilizacin de estas tcnicas se encuentra en poder diferenciar entre la forma libre del anticuerpo y la unida al antgeno; esto puede solucionarse, por ejemplo, uniendo el complejo antgeno-anticuerpo a un soporte.
Reacciones de precipitacin
Inmunoprecipitacin en solucin
Es posible detectar y medir muchos antgenos solubles precipitndolos de manera selectiva con anticuerpos. Para ello, es necesario que los antgenos sean grandes y que tengan mltiples determinantes antignicos. Como las
inmunoglobulinas tambin son protenas, es posible preparar anticuerpos especficos dirigidos contra ellas mismas, que se pueden utilizar para su cuantificacin.
La precipitacin de un antgeno soluble por un anticuerpo provoca turbidez
en la solucin. El grado de turbidez es proporcional a la cantidad de antgeno
unida al anticuerpo.
Esta relacin es la base de los mtodos turbidomtricos o nefelomtricos de
cuantificacin (ver captulo 11). La reaccin se realiza en solucin acuosa, en
presencia de un exceso de anticuerpo, y la curva de calibrado se prepara utilizando las medidas turbidomtricas de una serie de soluciones estndar de antgeno (Figura 14.7).
203
Captulo 14
Figura 14.7. Curva de precipitacin de los
complejos antgeno-anticuerpo, para una
cantidad dada de anticuerpo. La
precipitacin es mxima cuando el
antgeno y el anticuerpo estn presentes
en cantidades equivalentes, debido a la
formacin de grandes estructuras de tipo
red. Para cantidades menores o superiores
de antgeno la precipitacin se reduce al
no poderse formar agregados tan grandes.
La turbidez puede medirse utilizando espectrofotmetros normales, en los

que la cantidad de luz incidente perdida se considera que se debe al efecto de
dispersin de la solucin turbia. Estas medidas siguen un patrn semejante al de
la ley de Beer-Lambert, pero generalmente tienen escasos niveles de precisin y
sensibilidad.
La inmunoprecipitacin es una tcnica que permite cuantificar una protena
concreta en presencia de muchas otras, de manera ms especfica que las tcnicas de precipitacin y tubidez para cuantificar protenas totales. Para conseguir
la mxima sensibilidad, el antisuero que se utilice debe tener una gran afinidad
por el antgeno y debe usarse a concentraciones muy bajas. Esto ltimo es importante, no slo desde el punto de vista de los costes, sino tambin de la eliminacin de la turbidez debida simplemente a los reactantes.
Inmunoprecipitacin en gel
Esta tcnica combina la electroforesis y la inmunodifusin. Permite diferenciar sustancias de movilidad electrofortica similar mediante reacciones de precipitacin
especficas. La inmunoelectroforesis implica la utilizacin de anticuerpos para fijar
el antgeno en el gel y para identificarlo. La mezcla de protenas se aplica al gel de
electroforesis, se procede a realizar la electroforesis y, una vez finalizada, se cubre
el gel con un anticuerpo especfico, o bien el anticuerpo se coloca en un canal o
surco paralelo, permitiendo que difunda en el gel. El anticuerpo, en su difusin, se
encuentra con el antgeno, dando lugar a la formacin de complejos antgeno-anticuerpo, lo que provoca la aparicin de arcos de precipitacin (Figura 14.8).
Ensayos inmunoqumicos que utilizan marcadores

Las tcnicas de precipitacin no proporcionan una buena sensibilidad, por lo
que, en un momento dado, se hizo necesario buscar sistemas alternativos que
permitieran utilizar los anticuerpos como reactivos, al tiempo que permitieran
aumentar la sensibilidad.
En este caso, la cuestin est en encontrar un sistema de marcaje que permita un grado de sensibilidad adecuado. Recordemos que en los mtodos cuantita204
Figura 14.8. Fases del desarrollo de una
inmunoelectrofresis. a) separacin
electrofortica de las protenas, b) difusin
de anticuerpo y c) visualizacin de los
arcos de precipitacin.
tivos era importante marcar de alguna manera el compuesto a determinar; en el

caso del uso de anticuerpos se resumira como:
Ag Ac * o Ag: Ac *
El complejo Ag-Ac* tiene que tener una caracterstica fsica que se pueda utilizar para determinar en qu cantidad se encuentra presente. En dicha situacin,
hay que recordar que esta caracterstica fsica no debe presentarla el antgeno o
el anticuerpo en su forma libre, o bien las formas libres deben poder separarse
de las formas unidas.
La primera idea fue emplear el marcaje radiactivo para poder utilizar la tcnica cuantitativamente, de forma que se desarrollaron las tcnicas de radioinmunoensayo y de ensayo inmunorradiomtrico.
Radioinmunoensayo (RIA) y ensayo inmunorradiomtrico (IRMA)

El marcaje del antgeno o del anticuerpo con radiactividad supuso un avance
para la deteccin y cuantificacin de molculas. Inicialmente era ms sencillo
marcar con radiactividad el antgeno que el anticuerpo, debido a que resulta
ms fcil sintetizar en el laboratorio el antgeno que modificar el anticuerpo. As,
205
Captulo 14
disponiendo del antgeno marcado, se podra conocer la cantidad de antgeno

no marcado en la muestra utilizando adems un anticuerpo:
Ac Ag Ag * o Ac: Ag Ac: Ag *
Libre
Unido
En este sistema, si el anticuerpo se aade en pequeas cantidades (cantidades limitantes, menos cantidad de anticuerpo que de antgeno), habr ms anticuerpo unido al antgeno marcado cuanto menos antgeno no marcado se
encuentre en el medio. Es decir, se establece una competencia entre el antgeno
no marcado y el marcado; cuanto ms antgeno no marcado haya en el medio,
menos anticuerpo se unir al antgeno marcado. De alguna manera, se puede
establecer una relacin entre la cantidad de complejo anticuerpo-antgeno* y la
cantidad de antgeno libre del medio (Figura 14.9). Este tipo de tcnicas se denominan tcnicas competitivas. Hay diferentes variantes de este tipo de ensayos
(simultneo, secuencial, etc.) que veremos ms adelante.
Figura 14.9. Curvas que se obtienen para
los patrones de radioinmunoensayo (RIA),
que es un ensayo competitivo, y de
ensayo inmunorradiomtrico (IRMA), que
puede ser un ensayo no competitivo.
El siguiente paso sera diferenciar entre el antgeno* unido y el libre, porque

es el unido el que permite inferir la cantidad de antgeno no marcado presente
en la muestra. Cuando la reaccin alcanza el equilibrio, se separan las formas libre y ligada del antgeno marcado y se determina la radiactividad en ambas fracciones. En la tcnica del RIA es necesario disponer de una muestra pura de
antgeno para marcarlo con el istopo adecuado, adems de tal forma que no se
altere la inmunorreactividad del antgeno una vez marcado.
El punto crtico de esta tcnica es la separacin de la fraccin de antgeno
que permanece unida al anticuerpo respecto de la fraccin de antgeno que permanece libre. Todos los mtodos de separacin consisten en hacer insoluble una
de las dos fracciones y finalmente sedimentarla, por ejemplo por centrifugacin.
Hay distintos mtodos de separacin, que aparecen indicados en la figura 14.10.
Figura 14.10. Diferentes mtodos para la
separacin de la fraccin de antgeno que
queda unida al anticuerpo respecto de la
fraccin de antgeno que permanece libre.
206
Un mtodo consiste en la adsorcin del antgeno libre utilizando carbones

vegetales particulares. Otros mtodos de separacin se fundamentan en la precipitacin del antgeno unido al anticuerpo. Puede recurrirse a una precipitacin
qumica diferencial. Otra posibilidad de precipitacin es utilizar un segundo anticuerpo que reacciona con el complejo antgeno-anticuerpo y lo precipita. Finalmente, otra opcin es tener un primer o un segundo anticuerpo unido a una
fase slida (Figura 14.11).
Figura 14.11. Representacin de un
proceso de radioinmunoensayo (RIA)
competitivo en que el anticuerpo se ha
unido a una fase slida.
El ensayo de tipo RIA es un ensayo de tipo competitivo, que puede realizarse

en dos versiones diferentes, simultneo y secuencial, tal y como se detalla en la
figura 14.12.
Figura 14.12. Ensayo RIA simultneo y
secuencial.
En el ensayo competitivo simultneo se mezclan, a la vez, el anticuerpo y las

fracciones de antgeno no marcado y marcado. En el ensayo competitivo secuencial, el antgeno no marcado se mezcla primero con un exceso de anticuerpo.
Despus se aade el antgeno marcado, habiendo eliminado antes el exceso de
anticuerpo. A continuacin de la separacin, el marcaje de la fraccin unida es
determinado y utilizado para calcular la concentracin de antgeno no marcado.
Se utilizan istopos radiactivos para el marcaje de los antgenos o de los anticuerpos. Los istopos habitualmente utilizados son el carbono 14 (14C), el tritio
(3H) y el iodo 125 (125I).
En un principio, se utilizaba el radioinmunoensayo (RIA), porque era ms fcil marcar el antgeno que el anticuerpo, tal y como ya se ha comentado. Inicialmente, el RIA se aplic a la cuantificacin de hormonas peptdicas,
particularmente insulina, aunque posteriormente el mtodo se ha extendido a la
medida de drogas y hormonas no polipeptdicas, como las esteroideas.
Otra posibilidad desarrollada ms recientemente consiste en marcar el anticuerpo. Entonces hablamos de ensayo inmunorradiomtrico (IRMA) (ver figura
207
Captulo 14
14.9). Est tcnica presenta la ventaja de que no se necesita tener una cantidad
de antgeno purificado, ya que el antgeno no necesita ser marcado. El marcaje
de anticuerpos, actualmente, supone menos problemas ya que los anticuerpos
son molculas relativamente estables, de manera que es ms fcil marcarlos sin
alterar su funcin como protenas. De una manera esquemtica, se puede representar el principio bsico de la tcnica del IRMA tal y como se indica en la figura 14.13, en la que se representa un mtodo no competitivo, aunque del IRMA
tambin existe una versin competitiva. En un ensayo no competitivo, el reactivo se aade en exceso.
Figura 14.13. Representacin de un
proceso de ensayo inmunorradiomtrico
(IRMA) no competitivo en forma de
sndwich.
Inmunoensayo enzimtico (EIA): marcaje con enzimas

Este tipo de inmunoensayo utiliza una enzima como marcador del antgeno o
del anticuerpo en lugar de un radioistopo (Figura 14.14). Existen dos categoras
fundamentales: pueden ser ensayos heterogneos u homogneos, segn requieran o no la separacin de las fracciones libre y ligada antes de realizar la medida
de la actividad enzimtica.
Los inmunoensayos homogneos son aquellos en los que el compuesto
marcado se comporta de forma diferente segn est unido o no, de manera que no se requiere la separacin fsica de las sustancias reaccionantes
en dos fracciones, la ligada y la libre.
Figura 14.14. Algunas enzimas
habitualmente utilizadas en
inmunoensayos enzimticos. Se indican
tambin los tipos de ensayo en que se
utilizan (segn el tipo de seal emitida) y
sus lmites de deteccin (en zeptomoles
1021 moles).
208
Los inmunoensayos heterogneos son aquellos en los que el compuesto

marcado se comporta de forma anloga est o no unido, de manera que
es necesaria la separacin fsica de las fracciones ligada y libre.
Este tipo de inmunoensayos consta de dos etapas: una primera etapa inmunolgica, en la que tiene lugar la reaccin antgeno-anticuerpo, y una segunda
etapa en la que se determina la actividad de la enzima marcadora, una vez que
se ha aadido el sustrato de la reaccin catalizada por ella. La disminucin en la
cantidad de sustrato o el incremento en la cantidad de producto se utiliza para
detectar o cuantificar la reaccin antgeno-anticuerpo.
Figura 14.15. Reaccin luminiscente
catalizada por la peroxidasa, utilizando
luminol como sustrato, que puede ser
utilizada en los inmunoensayos
enzimticos.
Los inmunoensayos enzimticos tienen un amplio rango de aplicaciones (Figuras 14.15, 14.16 y 14.17). Suelen ser menos sensibles que los radioinmunoensayos, pero tienen la ventaja de ser fciles y rpidos de realizar, adems de no
utilizar radiactividad, evitando de esta manera los peligros y la problemtica asociada al uso de la misma. Adems, la utilizacin de enzimas da lugar a un efecto
de amplificacin de la seal a detectar, con lo que el grado de sensibilidad es, en
realidad, relativamente elevado.
El factor ms importante a la hora de elegir una enzima como marcador es
disponer de un sustrato que permita medir su actividad fcilmente. Lo ms til
es que los productos de la reaccin enzimtica tengan mximos de absorcin de
radiacin electromagntica en la regin del visible. La sensibilidad del sistema
puede aumentarse si los productos de reaccin son quimioluminiscentes, es decir, por ejemplo, compuestos que tienen la propiedad de emitir luz cuando son
oxidados por perxidos en presencia de algunos catalizadores (peroxidasas, catalasas, etc.). La luz emitida por estos compuestos puede utilizarse para impresionar una placa fotogrfica, o ser recogida por una cmara para proceder
posteriormente a la cuantificacin de las seales por un programa de tratamiento de imgenes.
Figura 14.16. Reaccin colorimtrica de la

fosfatasa alcalina, que puede ser utilizada
en los inmunoensayos enzimticos.

catalizada por la fosfatasa alcalina a partir
del sustrato CDP-Star (Roche), que
puede ser utilizada en los inmunoensayos
enzimticos.
Inmunoensayo enzimtico heterogneo

El inmunoensayo enzimtico heterogneo ms ampliamente utilizado en los
anlisis clnicos es el ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay). En este tipo
de ensayo, uno de los componentes de la reaccin est adsorbido a la superficie
209
Captulo 14
de una fase slida; esto facilita la separacin de las fracciones unida y libre del
reactante marcado. Hay distintas posibilidades para realizar un ELISA.
Una opcin es hacer el mtodo de ELISA en sndwich (Figura 14.18). Se aade una alcuota de la muestra que contiene el antgeno, el cual se unir al correspondiente anticuerpo, que en este caso se encuentra unido a la fase slida. A
continuacin, se aade otro anticuerpo contra el mismo antgeno, diferente del
anticuerpo unido a la fase slida, y que est marcado con una enzima. Se formar un complejo tipo sndwich: fase slida-Anticuerpo-Antgeno-AnticuerpoEnzima. Se lava el sistema, para retirar el exceso de anticuerpo marcado no
unido, y despus se aade el sustrato de la enzima. La enzima convierte el sustrato en producto, que ser mensurable y cuya cantidad ser proporcional a la
cantidad de antgeno presente en la muestra.
Figura 14.18. Fases en el desarrollo de un

ELISA en sndwich. En la primera etapa se
aade el antgeno a los pocillos; el
anticuerpo especfico se encuentra unido
al soporte y reconocer al antgeno,
desarrollndose la reaccin antgenoanticuerpo. En una segunda etapa, se
aade un anticuerpo marcado contra el
antgeno, se deja que se desarrolle una
segunda reaccin antgeno-anticuerpo y se
procede a eliminar por lavado el segundo
anticuerpo no unido. En la ltima etapa,
se aade el sustrato de la enzima y se deja
que transcurra la reaccin enzimtica
antes de proceder a la lectura de los
resultados por medicin del compuesto
formado, que puede ser, por ejemplo,
coloreado. La cantidad de producto
formado ser directamente proporcional a
la cantidad de antgeno presente.
Figura 14.19. Fases en el desarrollo de un

ELISA competitivo. A los pocillos con el
anticuerpo inmovilizado se aade
antgeno no marcado y marcado con una
enzima en cantidad superior a la de
anticuerpo, de manera que tengan que
competir los dos tipos de antgeno por los
lugares de unin. Se deja transcurrir la
reaccin antgeno-anticuerpo, para
proceder a continuacin a lavar con el fin
de eliminar los antgenos no unidos (tanto
con enzima como sin enzima). En una
segunda fase, se aade el sustrato de la
enzima y, tras dejar que transcurra la
reaccin, se procede a la lectura de la
seal producida, por ejemplo, color. La
cantidad de color producido ser
inversamente proporcional a la cantidad
de antgeno no marcado.
210
Tambin es posible realizar un ELISA competitivo, tal y como se explica en la

figura 14.19. Se pueden realizar diferentes variaciones del sistema; por ejemplo
pueden utilizarse hasta tres anticuerpos diferentes (Figura 14.20).
Figura 14.20. Mtodo de ELISA en
sndwich con triple anticuerpo.
La sensibilidad de los mtodos de ELISA puede mejorarse utilizando sustratos

que sean fluorescentes o luminiscentes (Figura 14.21). Un ejemplo de este tipo
de mtodos, en el cual se utiliza un marcaje con una enzima, es un mtodo para
la determinacin de los niveles de la protena desacoplante 1, UCP1, en tejido
adiposo marrn de roedores por un ELISA competitivo que puede encontrarse
en el captulo 15 y en el Anexo de Mtodos del CD.
Figura 14.21. Esquema del proceso de
deteccin marcando con enzimas que
catalizan una reaccin que da lugar a un
producto fluorescente.
Inmunoensayo enzimtico homogneo

Un tipo de proceso ampliamente utilizado en los anlisis clnicos es el EMIAT
(Enzyme Multiplied Inmunoassay Technique). El EMIAT es un inmunoensayo muy
simple y sencillo, ya que no requiere un paso de separacin de las fracciones libre y unida. Esto es debido a que el antgeno conjugado con la enzima hace que
sta presente mayor o menor actividad precisamente segn se encuentre el antgeno libre o unido al anticuerpo en el inmunoensayo.
El antgeno se marca con una enzima cuya actividad es fcilmente mensurable; sin embargo, cuando el antgeno marcado se une al anticuerpo, puede inhibirse la actividad cataltica de la enzima (Figura 14.22). Puede darse tambin el
caso contrario, es decir, que la enzima que marca al antgeno libre est inactiva y
se active cuando el antgeno se une al anticuerpo.
Se han venido utilizando diferentes enzimas en los ensayos inmunoenzimticos homogneos: lisozima, malato deshidrogenasa, glucosa-6-P-deshidrogenasa,
etc. La condicin que debe cumplir la enzima marcadora es que su actividad sea
diferente si se encuentra unido el anticuerpo al antgeno o no.
211
Captulo 14
Figura 14.22. Ejemplo de anlisis por
inmunoensayo enzimtico homogneo
por EMIAT. En este tipo de anlisis la
actividad de la enzima cambia segn el
antgeno est unido o no al anticuerpo.
Amplificacin de la seal obtenida por inmunoensayo enzimtico

La utilizacin de enzimas como marcadores proporciona un sistema que produce una amplificacin de la respuesta que se obtiene en los inmunoensayos, ya
que cada molcula de enzima produce muchas molculas de producto, que es
lo que al final se detecta. Adems, el lmite de deteccin puede mejorarse si la
deteccin colorimtrica convencional es sustituida por una reaccin de quimioluminiscencia o de obtencin de un producto fluorescente. Esta combinacin de
amplificacin y deteccin ultrasensible hace del inmunoensayo enzimtico no
competitivo uno de los inmunoensayos ms sensibles. No obstante, a pesar de
ser bastante sensible, no alcanza los niveles del radioinmunoensayo. La sensibilidad se ha conseguido aumentar an ms utilizando sistemas de amplificacin de
seal; entre ellos, se encuentran los sistemas biotina-avidina y biotina-estreptavidina. La biotina se puede unir fcilmente a los anticuerpos, generando formas
biotiniladas. Adems, se pueden obtener fcilmente polmeros de avidina (o de
estreptavidina) con biotina, lo que permite marcar con una enzima tanto las
molculas de avidina como las de biotina no unidas directamente al anticuerpo;
de esta manera se consiguen disear sistemas que amplifican la seal, tal y como
se esquematiza en la figura 14.23.
Figura 14.23. Diferentes sistemas para
aumentar la seal de tcnicas
inmunolgicas utilizando la biotina y la
avidina (o la estreptavidina).
212
Fluoroinmunoensayos
En los fluoroinmunoensayos se utilizan compuestos fluorescentes como marcadores de los antgenos o de los anticuerpos (Figura 14.24). Los marcadores fluorescentes deben ser estables y no deben interferir en la formacin del complejo
antgeno-anticuerpo.
Figura 14.24. Compuestos fluorescentes
habitualmente utilizados en los
fluoroinmunoensayos.
Los fluoroinmunoensayos pueden ser homogneos (cuando las propiedades

de fluorescencia cambian segn el antgeno y el anticuerpo estn libres o unidos)
y heterogneos (las propiedades de fluorescencia no son diferentes dependiendo
de que el antgeno y el anticuerpo se encuentren o no unidos). El sistema heterogneo requiere la separacin de las fracciones libre y ligada del antgeno marcado. Generalmente se utilizan sistemas en fase slida, en los que el anticuerpo
se une a un soporte y se mide la fluorescencia del antgeno marcado.
Western blot
Una aplicacin especfica de los procesos inmunolgicos se da en la tcnica conocida como Western blot o inmunoblot, en que se realiza una separacin previa de las protenas a determinar por electroforesis de tipo SDS-poliacrilamida y,
a continuacin, se transfieren y fijan las protenas a soportes como la celulosa y
otros, para despus realizar una incubacin con el anticuerpo que detecta la
protena que se desea estudiar. Para detectar la unin antgeno-anticuerpo ha de
hacerse uso de un marcaje determinado, que puede encontrarse directamente
sobre el anticuerpo especfico contra la protena de inters o bien, tal y como
sucede muchas veces, sobre un anticuerpo secundario que detecte el anticuerpo
especfico.
En el captulo 15 se presenta un mtodo para la determinacin semicuantitativa de los niveles de UCP1 por transferencia Western (Western blotting), cuyo
protocolo puede encontrarse tambin en el Anexo de Mtodos del CD.
213
Mtodos de determinacin de protenas individuales

INTRODUCCIN
TCNICAS DE SEPARACIN DE PROTENAS
Cromatografa de protenas
Cromatografa de cribado molecular
Cromatografa de afinidad
Electroforesis de protenas

Electroforesis en acetato de celulosa
Electroforesis en geles de polacrilamida
TCNICAS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS ESPECFICAS

Determinacin en clnica de enzimas plasmticas
Enzimas de baja concentracin
Transaminasas
Lactato deshidrogenasa
Determinacin de protenas por tcnicas inmunoqumicas

Determinacin de insulina por ELISA en sndwich
Determinacin de la protena UCP1 por ELISA competitivo
Determinacin de la protena UCP1 por Western blot
214
15
INTRODUCCIN
Las protenas pueden determinarse de forma individual de diferentes formas
como, por ejemplo, mediante tcnicas enzimticas y tcnicas inmunoqumicas
(ver captulos 13 y 14), aunque en el anlisis de protenas es tambin importante
el uso de tcnicas separativas que permiten discriminar molculas en funcin de
sus diferencias fsicas. Las protenas difieren entre s por su carga y punto isoelctrico (pI) (que dependen de los aminocidos que forman la protena), tamao y
forma. Estas diferencias fsicas entre las distintas protenas podran llegar a explotarse para separarlas finamente entre ellas y determinar, incluso, una protena en
concreto. Estas tcnicas, adems, pueden combinarse con la aplicacin de otras
tcnicas, como las inmunoqumicas, etc.
En la separacin de protenas, la tcnica ms habitualmente utilizada es la
electroforesis, que supone una separacin de molculas por la carga, que puede
combinarse con el cribado molecular (separacin de molculas por tamao).
Adems, como ya se comenta en el captulo 12, se han desarrollado tcnicas
electroforticas que permiten la separacin de molculas por su pI, lo cual se
aplica tambin a las protenas. No obstante, en la separacin de protenas tambin pueden utilizarse tcnicas cromatogrficas como la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa de cribado molecular y la de afinidad.
Ya hemos visto que, en muchos casos, las tcnicas separativas habitualmente
aplicadas no permiten determinar una protena concreta en presencia de otras.
Algunas protenas pueden entonces determinarse por la funcin que realizan, ya
que sta, en muchas ocasiones, es nica o prcticamente nica, como ocurre
con las enzimas. De esta forma, puede determinarse la cantidad presente de una
protena concreta que presente funciones catalticas midiendo la cantidad de
funcin en una muestra determinada, ya que sta ser proporcional a la cantidad de protena presente. Sin embargo, no todas las protenas presentan una
funcin que puede cuantificarse, por lo que debe hacerse uso de otra caracterstica para su determinacin, como su estructura tridimensional, ya que los anticuerpos son capaces de reconocer determinadas disposiciones espaciales de
215
Captulo 15
grupos funcionales. As, las tcnicas inmunoqumicas permiten determinar la

cantidad de una protena determinada presente en una muestra. Como ejemplo
de todo ello, en este tema veremos algunos casos especficos de la determinacin de protenas individuales.
TCNICAS DE SEPARACIN DE PROTENAS

Cromatografa de protenas
Se utilizan diferentes tcnicas cromatogrficas en la separacin de protenas,
aunque normalmente ms como tcnicas separativas que como analticas. Existen tcnicas cromatogrficas que permiten separar molculas por su carga y por
su tamao. A continuacin se comentan las ms importantes.

Las protenas pueden separarse mediante el uso de columnas de intercambio inico, ya que presentan distinta carga en funcin del pH (Figura 15.1), de manera
que se pueden eluir de la columna de manera diferencial cambiando el pH del
eluyente (ver captulo 9).
Figura 15.1. Proceso de separacin de
protenas en columnas de intercambio
inico. En el ejemplo, las protenas que
presentan carga positiva son retenidas en
la columna de intercambio de cationes,
mientras que las protenas sin carga o con
carga negativa se eluyen. Las protenas
retenidas pueden ser eluidas
posteriormente cambiando el pH del
eluyente o aumentando la presencia de
iones cargados positivamente.
Cromatografa de cribado molecular
Figura 15.2. Materiales para cromatografa

de filtracin en gel e intervalo de
fraccionamiento de protenas que
proporciona cada uno.
216
La cromatografa de cribado molecular se utiliza para separar molculas con diferentes tamaos. Este tipo de cromatografa, adems, permite determinar la
masa molecular de las protenas, ya que las molculas se eluyen de la columna
de forma diferencial segn su tamao. Las protenas de mayor peso molecular se
eluyen ms rpidamente que las protenas ms pequeas, ya que estas ltimas
realizan un recorrido ms largo por la columna que las primeras. Un criterio importante en la separacin de protenas es elegir un tamao de poro que permita
discriminar segn el rango de tamao de las protenas que se pretendan separar
(Figura 15.2).
A la salida de la columna las molculas pueden ser recogidas en diferentes
fracciones, en las que se puede determinar el contenido de protena. Otra opcin es acoplar en serie un espectrofotmetro con un sistema de registro que
permita conocer cundo son eluidas las diferentes protenas y en qu cantidad.
Esta tcnica permite, adems, determinar la masa molecular de las protenas,

debido a que existe una relacin lineal entre el volumen de elucin relativo de
una sustancia y el logaritmo de su masa molecular en un intervalo considerable
de masas moleculares, como ya se comentaba en el captulo 12. Si se representa, para una determinada columna de filtracin en gel, el volumen de elucin relativo y la masa molecular de molculas conocidas, se obtiene una recta que
puede utilizarse como patrn en la determinacin de la masa molecular de
molculas problema (Figura 15.3).
Cromatografa de afinidad
La presencia en las protenas de diferentes grupos funcionales (cadenas laterales
de los aminocidos y elementos que forman parte del enlace peptdico) y su disposicin tridimensional, determina que puedan establecerse diferentes tipos de
interacciones con otras molculas (puentes de hidrgeno, fuerzas hidrofbicas,
interacciones inicas, etc.). Cuanto mayor es el nmero de interacciones que
pueden establecerse, ms fuerte es la unin con otras molculas. Esta propiedad
puede utilizarse para purificar protenas a travs de la cromatografa de afinidad
(Figura 15.4). Dicha tcnica se caracteriza por utilizar como relleno una matriz
porosa e inerte unida covalentemente a una sustancia conocida como ligando
que reconocer especficamente la protena de inters. El ligando debe tener
una afinidad elevada por la protena, de manera que se establezca un alto nmero de interacciones para poder inmovilizarla, aunque no debe ser tan elevada
como para no permitir su liberacin cambiando las condiciones de elucin.
Figura 15.3. Representacin del volumen

de elucin relativo (Ve/Vo, es decir,
volumen de elucin de cada protena
partido por el volumen muerto) de
diferentes protenas frente al logaritmo
decimal de su masa molecular. Se muestra
como ejemplo la interpolacin del peso
molecular de una protena problema (la
protena UCP1).
Figura 15.4. Separacin de protenas

utilizando una columna de afinidad. Las
protenas retenidas pueden eluirse
aumentado la fuerza inica del medio.
Al hacer pasar las molculas de la muestra a travs de la columna, las protenas que tienen afinidad por el relleno quedan retenidas, mientras que las protenas que no tienen afinidad son eluidas. La protena unida puede recuperarse
cambiando las condiciones de elucin, de manera que la protena unida se libere. Puede conseguirse, por ejemplo, aadiendo una sustancia que presente una
mayor afinidad por la columna, aumentando la fuerza inica del eluyente, etc.
Este tipo de procesos es muy til a la hora de purificar una protena concreta.
Electroforesis de protenas
La principal diferencia entre los distintos tipos de electroforesis de protenas radica en el soporte elegido para la separacin electrofortica. El soporte determina
la separacin que se da entre las distintas protenas. Los soportes utilizados son:
217
Captulo 15
Papel de filtro
Membranas de acetato de celulosa
Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida pueden ser utilizados en diferentes variedades de

mtodos electroforticos, como la realizacin de una electroforesis en gradiente,
una electroforesis discontinua, un SDS-PAGE, un isolectroenfoque, etc.
La eleccin del soporte de electroforesis es determinante para la resolucin
de protenas. Nos centraremos en el anlisis electrofortico de protenas sricas,
ya que es muy til en el diagnstico de enfermedades. Normalmente, al separar
las protenas sricas humanas a pH bsicos en soportes como el papel, el acetato
de celulosa o la agarosa se obtienen de 5 a 7 bandas diferentes (Figura 15.5).
Figura 15.5. Bandas que se obtienen tras
la realizacin de una electroforesis para la
separacin de protenas del suero
sanguneo con fines analticos. Se indica la
denominacin de cada banda, as como
su concentracin en suero y su porcentaje
normal respecto del total de protenas
sricas.
Cada una de estas bandas no se corresponde con una nica protena, sino
que comprende varias protenas (Figura 15.6), ya que las protenas de una misma banda, a pH bsicos, presentan migraciones similares.
Figura 15.6. Principales protenas
integrantes de cada una de las bandas
que se obtienen por separacin de
protenas del suero humano y principales
funciones en las que se encuentran
implicadas.
218
Desde el punto de vista diagnstico, determinadas protenas predominan

en cada una de las bandas; la variacin de la cantidad relativa de una banda
con respecto a las otras es caracterstica de determinadas enfermedades (Figuras 15.7 y 15.8).
Figura 15.7. Variacin de la cantidad
relativa de cada una de las bandas con
respecto al patrn normal de protenas
plasmticas, en funcin del tipo de
enfermedad con que se relaciona.
Las bandas resultantes de la separacin por electroforesis de protenas en los

diferentes soportes en que se realiza, se pueden teir con diferentes colorantes.
En la figura 15.9 se muestra una lista de los ms utilizados, as como la longitud
de onda que se emplea en la cuantificacin por densitometra o por espectrofotometra.
Tambin se utiliza el nitrato de plata para la tincin de protenas y polipptidos en procedimientos electroforticos. Este tipo de tincin ofrece una mayor
sensibilidad que los colorantes habituales, unas 50 veces superior; aunque es
ms complicada de llevar a cabo.
Es habitual dar los resultados obtenidos en una separacin electrofortica
en forma del porcentaje que representa cada fraccin separada respecto del
total, o en concentracin absoluta si la cantidad total de protena es un valor
conocido.
Figura 15.8. Ejemplos de proteinogramas

segn el resultado que se obtiene en
diferentes enfermedades.
Figura 15.9. Colorantes ms utilizados

para la determinacin de protenas
mediante densitometra y
espectrofotometra. Se muestra tambin la
longitud de onda de mxima absorcin en
funcin de la tcnica de cuantificacin
utilizada.
219
Captulo 15

Las protenas pueden ser separadas por electroforesis en papel de filtro; por
ejemplo, la separacin de protenas sricas sobre papel de filtro da lugar a una
resolucin de cinco a siete bandas diferentes. El problema de este tipo de soporte es que la separacin es irregular, adems de que se produce la adsorcin de
las protenas sobre su superficie lo que provoca que las bandas presenten colas, y el hecho de requerir tiempos elevados de separacin, debido a los mismos fenmenos de adsorcin. Otro de los problemas de este tipo de soporte es
que no es transparente, lo que dificulta la cuantificacin de las bandas por densitometra.
Electroforesis en acetato de celulosa

La separacin de protenas sobre acetato de celulosa proporciona un soporte
que permite una resolucin mejor y ms rpida de las protenas sricas, al disminuir los procesos de adsorcin con respecto a los que se producan en papel gracias a que los grupos hidroxilo se encuentran esterificados. Se obtienen tambin
de cinco a siete bandas diferentes. La ventaja de este tipo de soporte es el aumento de la resolucin electrofortica y la rapidez del mtodo (se obtienen buenas separaciones entre 30 y 60 minutos). Otro de los factores importantes de
este tipo de soporte es que puede volverse transparente tratndolo con diferentes disolventes, como el metanol y el cido actico.
Un mtodo para la separacin de protenas sricas en acetato de celulosa
puede verse en el Anexo de Mtodos del CD que acompaa a este libro.
Las protenas sricas se separan en soportes de acetato de celulosa, que presentan una baja adsorcin de la muestra y permiten una separacin rpida. Al
producirse la separacin tan slo por diferencias de carga, se obtienen cinco
bandas principales (ver figura 15.5).

En geles de agarosa, las protenas se separan nicamente por carga, ya que el tamao de poro de los geles de agarosa es demasiado grande para permitir el cribado molecular de las protenas. Con este tipo de soporte se consiguen
separaciones similares a las de acetato de celulosa, aunque de mayor resolucin.
La desventaja de la agarosa es que los geles son muy frgiles y deben ser manejados con mucho cuidado. Habitualmente, 0,5-1 g de agarosa/dL de tampn
proporciona un gel con unas buenas propiedades para la migracin de protenas. El volumen de muestra que suele aplicarse es pequeo, del orden de 0,63 PL, y el tiempo de electroforesis es relativamente corto, entre 30-90 minutos,
dependiendo de las condiciones experimentales. Este tipo de soporte se aplica,
adems, a la separacin de las variantes de hemoglobina, de las isoenzimas de la
lactato deshidrogenasa y de las lipoprotenas.

La separacin de las protenas en geles de poliacrilamida, que son menos frgiles
que los de agarosa, presenta una mayor resolucin de las fracciones de protenas
a separar. Los geles de poliacrilamida ofrecen la posibilidad de generar tamaos
220
de poro inferiores a los que se pueden producir con agarosa. As pues, se usan
siempre y cuando no se requieran grandes tamaos de poro. El tamao de poro
de la poliacrilamida puede especificarse a partir de las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida.
Con la electroforesis de protenas sricas en gel de poliacrilamida pueden separarse veinte o ms fracciones proteicas (Figura 15.10). Por ello, esta tcnica es
muy utilizada en el estudio de las protenas individuales del suero, especialmente en los estudios de isoenzimas.
Las protenas pueden separarse segn todas las variantes de electroforesis en
geles de poliacrilamida: SDS-PAGE, geles en gradiente, isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional. Se utiliza un tipo u otro de electroforesis en funcin de
las protenas que se pretenda separar y de la finalidad de la separacin.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo para la separacin
de protenas sricas en SDS-PAGE discontinua o en disco, que se realiza en geles de poliacrilamida y utilizando un sistema de dos tampones diferentes. Las
protenas se separan en funcin de su tamao al utilizar un detergente como el
SDS. Este sistema permite la separacin de las protenas por el tamao de sus cadenas polipeptdicas (las protenas se disocian en sus diferentes cadenas al tratarse con E-mercaptoetanol) y se obtiene una elevada resolucin al utilizar un
sistema con dos tampones.
En dicho mtodo, las protenas se desnaturalizan utilizando SDS y E-mercaptoetanol, calentando a 100 C. Estas condiciones determinan la disociacin de
las diferentes cadenas polipeptdicas de las protenas, al tiempo que se produce
la desnaturalizacin de stas al unirse al SDS en una proporcin constante (1,4 g
de SDS por gramo de polipptido, lo que equivale aproximadamente a una
molcula de SDS por cada dos restos de aminocidos). La carga propia de las cadenas polipeptdicas es insignificante en comparacin con la cargas negativas
que proporciona la unin al SDS, de manera que los complejos SDS-polipptido
tienen todos aproximadamente la misma densidad de carga (carga por gramo de
complejo). El tratamiento con SDS tambin provoca que las diferentes cadenas
polipeptdicas adopten la misma forma, cilndrica. De esta forma, el principio de
este tipo de separacin electrofortica es nicamente la diferencia de tamao
entre las protenas, migrando ms rpidamente las de menor tamao.
Otro aspecto reseable de este tipo de separacin es la utilizacin de un sistema con dos geles: concentrador (stacking) y separador (resolving). Mientras el
gel concentrador provoca el apilamiento de las protenas antes de que se resuelvan, el separador permite la separacin de las diferentes protenas por su tamao (resolucin).
Los dos geles presentan tamaos de poro y pH diferentes, ya que su funcin
es distinta. El gel concentrador tiene un tamao de poro grande, para permitir la
concentracin de la muestra en una banda muy estrecha, y no la separacin de
sus componentes; su pH es dos unidades inferior al del gel destinado a la separacin, para provocar que la carga se transporte ms por las protenas que por el
tampn. El gel concentrador se prepara con una concentracin de acrilamida del
orden del 3% y bisacrilamida 0,08% y a un pH de 6,8; mientras que el gel separador se prepara con una concentracin de acrilamida del orden del 10% y bisacrilamida 0,27%, y a un pH = 8,8. El principio de la concentracin de la
muestra se da por la diferencia de pH establecida entre los dos geles, que determina que al pH del gel concentrador (pH = 6,8), la glicina (principal componente del tampn de electroforesis) se encuentre mayoritariamente en forma de
Figura 15.10. Esquema de bandas

producidas tras electroforesis de protenas
sricas en un gel de poliacrilamida.
Algunas zonas contienen ms de una
protena diferente.
221
Captulo 15
zwitterin, al encontrarse a un pH ligeramente por encima de su pI (5,97) (Figura 15.11), por lo que presenta poca carga neta.
Figura 15.11. Esquema de la disociacin
de protones a partir de molculas de
glicina. Se indican el pK1 y el pK2 de la
glicina.
En cambio, los iones cloruro contenidos en los tampones en los que se preparan los geles (concentrador y separador), migran rpidamente hacia el nodo,
mientras que las protenas, que tienen menor densidad de carga, migran ms
lentamente, de manera que las velocidades de migracin de los diferentes iones,
al inicio de la electroforesis, son:
H3N+CH2COO < Protena-SDS < Cl
Hay que tener en cuenta que el tamao de poro de la poliacrilamida no supone ninguna separacin por cribado molecular cuando las muestras se encuentran todava en el gel concentrador.
Al cabo de un tiempo (Figura 15.12), se diferencian tres zonas de migracin
de iones: una zona correspondiente a una alta concentracin de iones cloruro
(que han migrado, al principio, a mayor velocidad), una zona intermedia con las
protenas-SDS, y una ltima zona, en que las molculas que se encuentran en
ella han migrado ms lentamente, con una alta concentracin de iones glicinato.
En este momento, en la zona de las protenas, la migracin de stas es muy rpida, ya que la corriente slo puede ser transportada por las propias protenas. Al
Figura 15.12. Esquema de los procesos

que se dan en una separacin de
protenas por electroforesis discontinua o
en disco. En la figura se representan las
diferentes zonas de migracin que se
establecen en diferentes etapas de la
separacin electrofortica.
222
migrar tan rpido las protenas, llegan a alcanzar la zona de migracin de los iones cloruro, por lo que se retarda su migracin debido al aumento de la concentracin de los iones cloruro que tambin pueden transportar la corriente
elctrica. Como consecuencia se produce un agrupamiento de las protenas,
atrapadas entre los frentes de iones glicinato e iones cloruro, concentrndose en
franjas o discos estrechos; de ah el nombre de la tcnica.
Al alcanzar las protenas el gel separador (menor tamao de poro y diferente
pH dos unidades ms elevado), migran ms lentamente, y la velocidad de migracin de cada protena ahora s que depender de su tamao. Al migrar ms
lentamente las protenas, son alcanzadas por los iones glicinato que, al encontrarse ahora con un pH = 8,8, pasan a su forma cargada negativamente y adelantan a las protenas en su migracin. De esta manera, se separan ms
lentamente an las protenas, ya que ahora el transporte de la carga elctrica
tambin se lleva a cabo por los iones glicinato aparte de por las protenas; hay
que tener en cuenta el continuo aporte de iones glicinato por parte del tampn
del ctodo. Esta migracin ms lenta de las protenas permite una mejor resolucin de las mismas.
TCNICAS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS ESPECFICAS

Como ya se ha comentado, aplicar simplemente una tcnica separativa, por muy
fina que sta sea, normalmente no permite la determinacin de una protena especfica, es decir, el poder discriminarla del resto de protenas que la acompaan. En este sentido, los conocimientos bioqumicos proporcionan soluciones
adecuadas. As pues, puede determinarse una protena individual detectndola,
e incluso cuantificndola, a travs de la determinacin de su funcin (como puede hacerse en el caso de las enzimas) o a travs de su deteccin por reconocimiento de la disposicin espacial de determinadas regiones mediante el uso de
anticuerpos especficos. De esta forma, se han desarrollado mltiples tcnicas
para la determinacin de protenas especficas basadas en estos principios que,
adems, tambin permiten mltiples posibilidades en el diseo de las tcnicas,
con lo que continuamente se pueden desarrollar nuevos mtodos para la determinacin de distintas protenas de inters. A continuacin, se muestran algunos
ejemplos de determinacin de protenas especficas, tanto por la medida de su
funcin (como ocurre con las enzimas, de las cules veremos algunos ejemplo
de su determinacin en clnica) como por su deteccin a travs de tcnicas inmunolgicas.
Determinacin en clnica de enzimas plasmticas

La mayora de enzimas se sintetizan y actan en el interior de las clulas, aunque en el plasma sanguneo de personas sanas se puede detectar la presencia de
una serie de enzimas de diferente procedencia. Muchas de ellas pueden ser utilizadas para el estudio de diferentes desrdenes.
Las enzimas plasmticas son enzimas secretadas por diferentes tejidos y
rganos, y posteriormente vertidas al plasma, donde ejercen su funcin. As,
las enzimas de la coagulacin sangunea constituyen un ejemplo de este tipo
de enzimas. Tambin se pueden destacar las enzimas que intervienen en el
223
Captulo 15
aclaramiento plasmtico de las lipoprotenas (por ejemplo, lecitn colesterol

aciltransferasa). Los niveles de esta enzima dependen de la produccin de diferentes tejidos, por lo que su cantidad puede verse comprometida por diferentes situaciones o enfermedades.
Enzimas de baja concentracin

Algunas enzimas se encuentran en el plasma a baja concentracin, siendo
sta muy constante. Estas enzimas proceden de la renovacin celular que
continuamente se da en el organismo. En algunos casos, cuando se produce
una lesin de la membrana celular de determinadas clulas, el contenido del
citoplasma y, con l, las enzimas intracelulares, es vertido al medio que las
rodea: tejido intersticial, capilares sanguneos y vasos linfticos. Dependiendo de la distancia a la que se encuentren tales clulas de los capilares sanguneos, se producir mayor o menor desfase entre el momento en el que se
produce el dao celular y la deteccin del aumento de la actividad enzimtica de las enzimas liberadas al plasma sanguneo. Por ejemplo, si se produce
una lesin en las clulas hepticas, se podr constatar en pocos minutos la
elevacin de determinadas enzimas en el torrente circulatorio, mientras que
si las clulas afectadas se encuentran en rganos como el corazn o el pncreas, ser cuestin de horas su deteccin en sangre. Este tiempo se puede
alargar a varios das, como en el caso de que la lesin celular se produzca en
el msculo.
Por otro lado, cuando las enzimas no propias del plasma llegan al torrente
circulatorio, existen sistemas encargados de captarlas, metabolizarlas y eliminarlas hgado, rin, macrfagos del sistema retculoendotelial, lo que provoca
que dichas enzimas se encuentren en la sangre un tiempo limitado.
Por tanto, el conocimiento de la procedencia celular de las enzimas y de su
distribucin y difusin a travs de la sangre, linfa y tejido intersticial, as como de
su va de eliminacin, ofrecer datos para estudiar un fenmeno patolgico y su
posterior evaluacin. En clnica se realiza el anlisis de 15-20 enzimas para el
diagnstico de diferentes enfermedades (Figura 15.13).
Figura 15.13. Algunas enzimas cuyos

niveles en plasma son tiles para el
diagnstico y la evaluacin de diferentes
patologas.
224
Transaminasas
Segn los diferentes tipos de nomenclatura, estas enzimas se conocen como:
EC2.6.1.2., L-Alanina:2-cetoglutarato aminotransferasa (ALT) o glutamato
piruvato transaminasa (GPT). Alanina transaminasa.
EC2.6.1.1., L-Aspartato:2-cetoglutarato aminotransferasa (AST) o glutamato
oxalacetato transaminasa (GOT). Aspartato transaminasa.
Las transaminasas son enzimas clave en la interconversin de aminocidos y
sus cetocidos por transferencia del grupo amino al par formado por el glutamato/2-cetoglutarato (Figura 15.14). La determinacin de estas enzimas es muy til,
por ejemplo, para el diagnstico de enfermedades hepticas agudas y crnicas.
La ALT, por ejemplo, se encuentra aumentada entre 10 y 100 veces con respecto a sus niveles normales en infarto de miocardio, hepatitis vrica, necrosis txica
heptica y en casos de shock e hipoxia.
ALT (alanina transaminasa) acoplada a la
reaccin de la LDH (lactato
deshidrogenasa); sta ltima se puede
utilizar para la medida de la actividad
enzimtica de la primera.
Las determinaciones de estas transaminasas suelen realizarse en suero, aunque pueden valorarse tambin en plasma conteniendo heparina, oxalato, EDTA
o citrato. El suero hemolizado no puede utilizarse para las determinaciones, debido a la elevada actividad de estas enzimas en los eritrocitos.
Un mtodo para la determinacin de la actividad de la alanina transaminasa
puede verse en el Anexo de Mtodos del CD de este libro. El mtodo se fundamenta en el acoplamiento de una segunda reaccin enzimtica como indicadora
del proceso, la catalizada por la lactato deshidrogenasa, que transforma el piruvato producido en la primera reaccin enzimtica en lactato; al mismo tiempo,
la reduccin del piruvato va acompaada de la oxidacin del NADH a NAD+, lo
que permite seguir el transcurso de la reaccin determinando la desaparicin de
absorbancia a 340 nm, ya que el NADH absorbe a esta longitud de onda, mientras que el NAD+ no (Figura 15.15).
Figura 15.15. Espectros de absorcin del

NAD+ y del NADH.
Lactato deshidrogenasa
La actividad de la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, L-lactato:NAD+ oxidoreductasa, LDH) puede aumentar en distintos desrdenes, como son, entre otros,
225
Captulo 15
el infarto de miocardio, la hepatitis, la cirrosis, el cncer con metstasis, el trauma muscular, la distrofia muscular, etc.
El aumento de la actividad de la LDH en el plasma puede ser de la LDH absoluta (un incremento en la LDH total) o relativa (un cambio en la proporcin de
las cinco isoenzimas de esta enzima). La hemolisis eleva la actividad LDH; sin
embargo, un incremento marcado en la LDH total ocurre en el infarto de miocardio y en desrdenes hematolgicos tales como la leucemia. Una ayuda importante para el diagnstico de diversos desrdenes la constituye la
determinacin de las distintas isoenzimas de la LDH. Por ejemplo, al infarto de
miocardio se encuentran asociados las isoenzimas LDH-1 y LDH-2, mientras que
un aumento de la LDH-5 se asocia a una ruptura muscular; de manera que si se
conoce la fraccin de LDH que aumenta, se puede identificar el tejido causante
de la subida de los niveles plasmticos. En la figura 15.16 se representa la abundancia de las diferentes isoenzimas en distintos tejidos.
Figura 15.16. Porcentajes de distribucin
de las isoenzimas de la LDH en diferentes
rganos y tejidos.
Figura 15.17. Resultado de una

electroforesis de las diferentes isoformas
de la LDH.
226
Los mtodos ms habituales para la determinacin de la LDH total se basan

en cuantificar la interconversin entre el NAD+ y el NADH mediante la lectura
de absorbancias a 340 nm. En cambio, para la separacin de las isoenzimas de
la LDH, el mtodo utilizado de forma ms habitual es la electroforesis (Figura
15.17). La separacin electrofortica se realiza en gel de agarosa o en acetato de
celulosa. Una vez ha tenido lugar la migracin electrofortica, se aplica sobre el
gel una mezcla de reaccin que contiene lactato y NAD+. As, las cantidades relativas de cada isoenzima, que han migrado a diferente velocidad, pueden determinarse por densitometra o detectando la cantidad de fluorescencia
generada por el NADH.
Otro mtodo para la determinacin de las formas isoenzimticas de la lactato
deshidrogenasa por isoelectroenfoque se presenta en el Anexo de Mtodos del
CD de este libro. El mtodo se fundamenta en la separacin previa de las diferentes formas isoenzimticas de esta enzima, debido a que stas presentan un
diferente punto isolectrico, lo que permite su separacin. La visualizacin y
cuantificacin de las isoformas se realiza por medida de la actividad enzimtica
utilizando un cromforo insoluble en el propio gel, y se acoplan una serie de reactivos que se reducen y oxidan: el NADH reduce al metasulfato de fenazina
(PMS); este compuesto reducido es capaz de reducir al azulnitro de tetrazolio
(TNBT) que, en su forma reducida, TNBT-formazn, presenta un color oscuro y
precipita sobre el gel (Figura 15.18). La cantidad de color producido puede determinarse utilizando un fotodensitmetro (Figura 15.19).
Figura 15.18. Reacciones utilizadas en la
determinacin de la actividad de la
lactato deshidrogenasa (LDH) sobre geles.
Se utiliza como sistema indicador la
reduccin del TNBT a TNBT-formazn.
Figura 15.19. Zimograma de la separacin

de las distintas isoformas de la lactato
deshidrogenasa en diferentes tejidos.
Determinacin de protenas por tcnicas inmunoqumicas

A continuacin se desarrollan algunos ejemplos representativos de la determinacin de protenas especficas mediante tcnicas inmunoqumicas.
Determinacin de insulina por ELISA en sndwich

El ejemplo que aqu se muestra, y que puede verse de forma ms amplia en el Anexo de Mtodos del CD, es un ELISA no competitivo tipo sndwich que permite
cuantificar los niveles sricos de insulina. El mtodo se basa en la utilizacin de dos
anticuerpos monoclonales con especificidad para diferentes eptopos de la insulina.
Uno de los anticuerpos sirve para inmovilizar el antgeno, ya que se encuentra adherido a las paredes de los pocillos en que se realiza la determinacin; el otro se utiliza
como marcador, ya que tiene unida peroxidasa de rbano. Durante la reaccin se
forman complejos Anticuerpo 1-insulina-Anticuerpo 2, tipo sndwich (Figura 15.20).
227
Captulo 15
Figura 15.20. Formacin de un complejo
tipo sndwich para la deteccin y
cuantificacin de insulina srica. Un
anticuerpo anti-insulina se encuentra unido
a los pocillos de una placa de ELISA y un
segundo anticuerpo, marcado con
peroxidasa de rbano, se une tambin a la
insulina, a travs de un eptopo diferente al
de unin del primer anticuerpo. Mediante
una reaccin en la que intervienen el
sustrato de la peroxidasa (H2O2) y tetrametil
benzidina, se obtiene un producto
coloreado en cantidad proporcional a la
cantidad de insulina de cada muestra.
Determinacin de la protena UCP1 por ELISA competitivo

la competencia que se establece entre la
UCP1 unida a los pocillos, y la UCP1 de
la muestra en su determinacin por un
mtodo competitivo de ELISA.
Figura 15.22. Uniones que se establecen

entre la UCP1 unida a los pocillos, el
anticuerpo anti-UCP1 (que en este
ejemplo sera una inmunoglobulina de
conejo) y un anticuerpo secundario contra
el primer anticuerpo, que lleva unido una
enzima, que se utiliza como marcador.
228
Un ejemplo de la determinacin de protenas por mtodos inmunoqumicos es

el de la determinacin de los niveles de la protena desacoplante 1 (UCP1), en
tejido adiposo marrn de roedores, por un ELISA competitivo (Figura 15.21),
que puede encontrarse en el Anexo de Mtodos del CD. El mtodo se fundamenta en el establecimiento de una competicin por la unin con el anticuerpo
entre la UCP1 procedente de la muestra y molculas de UCP1 unidas a los pocillos de la placa de ELISA. El seguimiento del proceso requiere la inmovilizacin
de los anticuerpos, que se consigue utilizando placas de poliestireno de 96 pocillos (que une protenas por interacciones hidrofbicas), que se recubren con
UCP1; de esta manera se puede distinguir la fraccin de anticuerpo unido del libre. Se utiliza un mtodo competitivo, en el que el anticuerpo (que debe encontrarse en defecto) se une tanto al antgeno libre como al que se encuentra unido
al soporte. Se utiliza un segundo anticuerpo contra el primero, marcado con fosfatasa alcalina, que permite determinar la cantidad de anti-UCP1 unido a los pocillos (Figura 15.22).
Determinacin de la protena UCP1 por Western blot

Se puede potenciar la especificidad de los procesos inmunolgicos realizando
una separacin previa de las protenas a determinar por electroforesis de tipo
SDS-PAGE y, a continuacin, transfiriendo y fijando las protenas a soportes
(como la nitrocelulosa y otros), para despus realizar una incubacin con el anticuerpo que detecta la protena que se desea estudiar. El ltimo paso de la tcnica sera proceder a la deteccin del marcaje empleado, que puede encontrarse
directamente sobre el anticuerpo especfico contra la protena de inters o bien,
lo que es ms comn, sobre un anticuerpo secundario que detecte el anticuerpo
especfico (Figura 15.23).
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo para la determinacin semicuantitativa de los niveles de UCP1 por transferencia Western (Western
blotting). El mtodo se fundamenta en la inmovilizacin de las protenas sobre
una membrana de nitrocelulosa, previa separacin por electroforesis SDS-PAGE
discontinua. Una vez inmovilizadas las protenas, se procede a su determinacin
utilizando un proceso inmunolgico con dos anticuerpos: un anticuerpo primario especfico de la protena que quiere estudiarse, y un anticuerpo secundario
comercial contra las inmunoglobulinas de la especie en la que se ha obtenido el

Figura 15.23. Determinacin de protenas
en un gel de electroforesis SDS-PAGE por
transferencia Western. Las protenas
separadas en el gel se transfieren a una
hoja o membrana de un polmero
determinado (por ejemplo, de
nitrocelulosa) y se tien con un
anticuerpo marcado con radiactividad,
fluorescencia o enzimticamente. Por
ejemplo, en el caso de utilizar un
anticuerpo marcado con radiactividad, en
un autorradiograma de la membrana
aparece una banda oscura que
corresponde a la posicin de la protena
estudiada.
anticuerpo primario, el anticuerpo secundario se encuentra conjugado con una

enzima, en este caso peroxidasa de rbano (Figura 15.24) que, utilizando el sustrato adecuado, provoca la emisin de luz.
Figura 15.24. Deteccin especfica de la
protena UCP1 inmovilizada sobre una
membrana de nitrocelulosa, tras su
resolucin por una electroforesis de tipo
SDS-PAGE. Se utiliza un anticuerpo
primario anti-UCP1, que despus es
detectado con un anticuerpo secundario
contra l, que lleva unida la enzima
peroxidasa de rbano, capaz de producir
luz con la adicin del sustrato adecuado.
229
Mtodos generales de determinacin de lpidos

INTRODUCCIN
Clasificacin y estructura de los lpidos
Lpidos simples
Lpidos complejos
Lipoprotenas plasmticas
DETERMINACIN DE LPIDOS
Obtencin y preparacin de las muestras
Mtodos de extraccin de lpidos
Cuantificacin de lpidos totales
Determinacin de glicerol
Determinacin de triacilgliceroles
Mtodos qumicos para la determinacin de triacilgliceroles

Mtodos enzimticos para la determinacin de triacilgliceroles
Determinacin de cidos grasos libres

Determinacin de colesterol
Mtodos qumicos para la determinacin de colesterol

Mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol
Determinacin de cuerpos cetnicos
230
16
INTRODUCCIN
Los lpidos constituyen un amplio grupo heterogneo de compuestos que tienen
en comn la caracterstica de ser solubles en disolventes orgnicos y no en agua.
La misma definicin de lpido seala una de las particularidades fundamentales
de estas molculas: su apolaridad. Dentro de este grupo existe un gran nmero
de sustancias qumicas distintas: cidos grasos, triacilgliceroles, fosfolpidos, esteroides, prostaglandinas y las vitaminas liposolubles (A, D, E y K) entre otros.
Al igual que en el resto de biomolculas estudiadas, los mtodos de determinacin y cuantificacin de los lpidos se fundamentan en sus propiedades diferenciales respecto al resto de biocompuestos. En el caso de los lpidos, su propia
definicin indica cmo pueden determinarse los lpidos totales, ya que engloba
a todos los compuestos solubles en disolventes orgnicos.
El estudio de una clase concreta de lpidos requiere su fraccionamiento por
tcnicas de separacin fundamentadas en mtodos que permiten discriminar entre los distintos tipos de lpidos, normalmente por diferencias en el grado de polaridad. As, tcnicas separativas tales como la cromatografa, en sus diferentes
vertientes, son de gran utilidad para estudiar y fragmentar las distintas clases de
lpidos. En el estudio de las lipoprotenas pueden utilizarse tcnicas de electroforesis, de centrifugacin e inmunolgicas. Por otra parte, algunos lpidos en concreto pueden determinarse por tcnicas qumicas y enzimticas (por ejemplo:
colesterol, glicerol, triacilgliceroles totales, etc.).
Clasificacin y estructura de los lpidos

Al ser tan heterogneo este grupo de compuestos, resulta difcil realizar su clasificacin, aunque pueden dividirse en dos grandes grupos: simples y complejos.
Dentro del grupo de los simples, se encuentran todos aquellos lpidos cuya estructura es unitaria o que son steres a partir de una estructura unitaria, mientras
que los complejos estn formados por dos o ms componentes claramente diferenciados, en la que uno de los componentes presenta caractersticas de lpido.
231
Captulo 16
Lpidos simples
Dentro de este grupo de lpidos se encuentran los cidos grasos, las ceras, los
acilgliceroles o grasas neutras, los isoprenoides y los esteroides.
cidos grasos
Los cidos grasos son compuestos monocarboxlicos, que pueden encontrarse libres, aunque normalmente suelen hallarse formando parte de otros lpidos. Los
cidos grasos responden a la frmula general RCOOH, donde R es una cadena
carbonada de estructura muy variada (lineal, ramificada o alicclica) y que puede
presentar dobles enlaces. Segn el nmero de dobles enlaces que posean, se
clasifican en cidos grasos saturados (Saturated Fatty Acids, SFA), cidos grasos
monoinsaturados (Mono-Unsaturated Fatty Acids, MUFA) y cidos grasos poliinsaturados (Poly-Unsaturated Fatty Acids, PUFA).
La cadena carbonada de los cidos grasos puede presentar grupos hidroxilo,
ceto o epoxi, y el nmero de carbonos que la forma tambin es muy variado.
Los cidos grasos ms abundantes son los de cadena lineal con un nmero par
de tomos de carbono (entre 12 y 24 carbonos). Se nombran a partir del hidrocarburo correspondiente con la terminacin anoico para los saturados y enoico para los insaturados. En el caso de los cidos grasos insaturados se utilizan
diferentes nomenclaturas: se pueden nombrar con el smbolo ' y el exponente
correspondiente a la posicin del doble enlace; o pueden nombrase con la nomenclatura Z y un nmero que indica el carbono junto al que se da el doble enlace contando desde el tomo de carbono Z (carbono metlico terminal, que se
conoce como carbono Z o carbono n). Adems, se puede utilizar una nomenclatura abreviada, en la que figura el nmero de tomos de carbono separado
por dos puntos del nmero de dobles enlaces y la posicin de stos en forma de
exponente. As, por ejemplo, los cidos grasos hexadecanoico, octadecanoico y
octadecenoico seran denominados 16:0, 18:0 y 18:19 respectivamente. En la figura 16.1 pueden observarse la nomenclatura y frmula de los principales cidos
grasos en los seres vivos, tanto saturados como insaturados.
El nmero de tomos de carbono, as como el nmero de enlaces dobles que
presentan, determina una serie de propiedades fsicas de los cidos grasos. Al
aumentar el tamao de la cadena carbonada de un cido graso, disminuye su
polaridad, es decir, es ms apolar. Los puntos de ebullicin y fusin aumentan a
medida que se incrementa el nmero de tomos de carbono, de manera que los
cidos grasos de cadena corta se encuentran en estado lquido a temperatura
ambiente, mientras que los de cadena larga se encuentran en estado slido. El
nmero de insaturaciones y la presencia de ramificaciones en la cadena influyen
en estas caractersticas, de forma que los cidos grasos insaturados y los ramificados tienen un punto de fusin inferior al de los saturados y los lineales respectivamente con el mismo nmero de tomos de carbono.
Los dobles enlaces de los cidos grasos insaturados pueden adoptar dos
configuraciones espaciales distintas, si bien stas no son interconvertibles de
forma espontnea: son las llamadas configuraciones cis y trans. El doble enlace
en trans distorsiona slo ligeramente la estructura regular quebrada de la cadena del cido graso; el enlace cis, sin embargo, determina un marcado giro o
desviacin del eje longitudinal de la molcula, tal como se esquematiza en la
figura 16.2.
232

Figura 16.1. Nomenclatura comn y
sistemtica y frmula de los principales
cidos grasos que aparecen en los seres
vivos.
Figura 16.2. Estructura de un cido graso

saturado, uno insaturado con un doble
enlace en trans y uno insaturado con un
doble enlace en cis.
Ceras
Las ceras son steres de los cidos grasos con alcoholes primarios de cadena larga y responden a la formula general:
O
||
R O C Rc
El alcohol implicado es normalmente una molcula de elevado peso molecular, lo que provoca que las ceras sean muy insolubles en agua.
233
Captulo 16
Acilgliceroles
Los acilgliceroles, tambin conocidos con el nombre de acilglicridos o grasas
neutras, son steres de glicerol con cidos grasos (Figura 16.3). Al poder establecer el glicerol tres enlaces ster, los acilgliceroles pueden presentar uno, dos o
tres cidos grasos en su estructura, por lo que se habla de mono, di o triacilgliceroles (mono, di o triacilglicridos).
Figura 16.3. Estructura de un
monoacilglicerol, de un diacilglicerol y de
un triacilglicerol.
Figura 16.4. Estructura del isopreno o

2-metil-1,3-butadieno.
Un triacilglicerol normalmente no tiene los tres sustituyentes iguales entre s,

dndose una combinacin de cidos grasos saturados e insaturados.
Los di y triacilgliceroles son bastante insolubles en agua, mientras que los monoacilgliceroles, por su carcter anfiptico, llegan a dispersarse formando agregados. Los acilgliceroles pueden hidrolizarse tanto por la accin de productos
qumicos, como bases por ejemplo KOH y cidos H2SO4, o por enzimas
como las lipasas.
Lpidos isoprenoides
Figura 16.5. Estructura del limoneno, un

monoterpeno.
Figura 16.6. Estructura de la vitamina A1,

un diterpeno.
Figura 16.7. Estructura de la vitamina E (atocoferol) y la vitamina K1 (filoquinona).
234
Este grupo de lpidos se caracteriza por ser derivados del isopreno (Figura 16.4),
aunque tambin se les conoce con el nombre de lpidos de poliprenilo, y constituyen un grupo heterogneo.
Por la condensacin de varias unidades de isopreno activo (isopreno fosforilado) se sintetizan los diferentes lpidos isoprenoides. Cada dos unidades de isopreno dan lugar a un terpeno, de manera que hay monoterpenos, sesquiterpenos,
diterpenos, etc. segn contengan, respectivamente, dos, tres, cuatro, etc., isoprenos. Entre ellos tambin los hay acclicos, ramificados y cclicos, que adems pueden contener otras funciones orgnicas (como grupos cetona y alcohol).
Entre los monoterpenos figuran diversos compuestos voltiles con aromas caractersticos, como el limoneno del limn (Figura 16.5) y el alcanfor.
Otros ejemplos interesantes son el retinol o vitamina A1 (Figura 16.6) y el
deshidro-3-retinol o vitamina A2, que son diterpenos parcialmente ciclados,
mientras que el fitol es un diterpeno lineal.
Son tambin terpenoides la vitamina E o D-tocoferol y derivados quinnicos,
como las ubiquinonas, la plastoquinona y las vitaminas K (Figura 16.7).
Los carotenoides son derivados poliisoprnicos de 40 tomos de carbono (tetraterpenos). La estructura del E-caroteno se muestra en la figura 16.8.
Figura 16.8. Estructura del b-caroteno.
Esteroides
Los esteroides pueden considerarse tambin lpidos isoprenoides, puesto que,
en ltima instancia, proceden del isopentenilpirofosfato. Sin embargo dada su
relevancia biolgica, podran formar un grupo independiente y, adems, su estructura est relacionada con la del anillo esterano o ciclopentano-perhidrofenantreno (Figura 16.9).
Los esteroides presentan un grupo hidroxilo en el C-3 y diferentes sustituyentes en el C-17. En la figura 16.10 puede observarse una serie de esteroles: colesterol, hormonas sexuales, un mineralocorticoide y un glucocorticoide.
El colesterol o 3-hidroxi-5,6-colesteno es un esterol de 27 tomos de carbono, cuyo grupo hidroxilo adopta configuracin E. Adems, el colesterol puede
ser esterificado por cidos grasos, dando steres de colesterol (Figura 16.11).
El colecalciferol o vitamina D3 (Figura 16.12), los cidos biliares y sus sales y
las diversas hormonas esteroideas (corticoides, andrgenos y estrgenos y progestgenos) son derivados del colesterol.
Figura 16.9. Estructura del esterano o

ciclopentano-perhidrofenantreno.
Figura 16.11. Estructura genrica de un

ster de colesterol.
Figura 16.10. Diferentes esteroles.
Figura 16.12. Estructura del colecalciferol

o vitamina D3.
235
Captulo 16
Lpidos complejos
Los lpidos complejos son aquellos cuya molcula presenta dos o ms componentes claramente diferenciados, de los cuales uno de ellos, si se separa del resto, presenta propiedades de lpido. Dentro de este grupo se encuentran los
fosfolpidos y los glucolpidos.
Fosfolpidos
Figura 16.13. Ejemplos de

fosfoacilgliceroles.
Figura 16.14. Estructura general de un

fosfoacilglicerol y las diferentes familias de
fosfolpidos, en funcin de la naturaleza
del radical hidroflico (A) que esterifica al
grupo fosfato.
236
Este grupo de lpidos se caracteriza por presentar el grupo fosfato en su estructura, esterificado con un alcohol. Dependiendo del alcohol que haya en la molcula, se diferencian dos grupos de fosfolpidos: fosfoacilgliceroles (con glicerol) y
esfingomielinas (con esfingosina).
Los fosfolpidos de glicerol o fosfoacilgliceroles o fosfoacilglicridos son lpidos habitualmente de membrana, que presentan en su estructura glicerol, el cual
se encuentra esterificado con cido fosfrico y cidos grasos (Figura 16.13).
El grupo fosfato, a su vez, puede estar esterificado con un radical hidroflico.
Dependiendo de la naturaleza de dicho radical existen diferentes familias de fosfoacilgliceroles, tal y como se representa en la figura 16.14.
Los fosfoacilgliceroles son molculas anfipticas, al tener simultneamente
una zona apolar (restos acilo) y una zona polar (grupo fosfato y sustituyente A),
presentando, por tanto, carga negativa por el grupo fosfato y, en algunos casos,
tambin carga positiva dependiendo de la familia de fosfolpidos y del pH a que
se encuentren.
Los fosfatidilinositoles y los fosfatidilgliceroles pueden estar fosforilados en los
grupos alcohol del glicerol y de los inositoles, lo que les confiere una elevada
densidad de carga negativa.
Este grupo de lpidos presenta una solubilidad algo diferente de la del resto;
si bien son solubles en disolventes orgnicos, no lo son en acetona, propiedad
que se utiliza para su fraccionamiento. Los cidos grasos que forman los fosfoacilgliceroles pueden ser muy diversos, siendo el palmtico y el esterico los ms
abundantes, aunque tambin se encuentran en ellos cidos grasos insaturados
(normalmente esterificando el carbono 2).
Las esfingiomielinas son fosfolpidos donde los cidos grasos esterifican a un
alcohol aminado, la esfingosina o esfingenina, a travs de un enlace amida, dando lugar a las ceramidas (Figura 16.15).
Si el grupo hidroxilo terminal de las ceramidas se une a la fosforilcolina, forma la esfingomielina (Figura 16.16), presente en las membranas biolgicas.
Figura 16.15. Estructura de la esfingosina

y de una ceramida.

esfingomielina.
Glucolpidos
Los glucolpidos son lpidos que presentan carbohidratos en su estructura y se
forman por la unin de los carbohidratos al carbono 1 de la esfingosina. Entre
ellos encontramos:
Los cerebrsidos, que se caracterizan por contener en su estructura azcares
neutros como glucosa o galactosa, dando los glucocerebrsidos o los galactocerebrsidos, respectivamente; los ms sencillos tienen una nica molcula de
azcar, aunque tambin pueden presentar de 2 a 10 cadenas de azcares (Figura 16.17).
Figura 16.17. Estructura de algunos

cerebrsidos.
Los sulftidos son los steres sulfricos de los cerebrsidos (un sulfato esterifica el carbono 3 de la hexosa). Los ms abundantes son los derivados de los cerebrogalactsidos, que constituyen una parte importante de los cerebrsidos del
cerebro.
237
Captulo 16
Los ganglisidos, que se diferencian de los cerebrsidos en que contienen

una o varias molculas de cido N-acetilneuramnico (cido silico) (Figura
16.18). El nmero de hexosas que presentan vara entre uno y cuatro.
Lipoprotenas plasmticas
Figura 16.18. Estructura del cido

N-acetilneuramnico.
Las lipoprotenas son agrupaciones de lpidos y protenas. Existen cuatro tipos

principales en el plasma, que, en densidades crecientes y tamao decreciente,
son: los quilomicrones, las VLDL (Very Low Density Lipoproteins), las LDL (Low
Density Lipoproteins), y las HDL (High Density Lipoproteins). Sus caractersticas y
composicin aparecen resumidas en la figura 16.19.
Figura 16.19. Caractersticas de las lipoprotenas plasmticas. VLDL: lipoprotenas de muy baja densidad (very low density lipoproteins); LDL:
lipoprotenas de baja densidad (low density lipoproteins); HDL: lipoprotenas de alta densidad (high density lipoproteins). TG: triacilgliceroles.
DETERMINACIN DE LPIDOS
Obtencin y preparacin de las muestras
El procedimiento para la determinacin de los lpidos no difiere en sus lneas
maestras de los mtodos para la determinacin de protenas o de aminocidos;
adems, la evaluacin cuantitativa de cualquier tipo de lpido precisa normalmente que ste se extraiga de la muestra. El procedimiento de extraccin debe
estar diseado con un especial cuidado para evitar la oxidacin de los lpidos de
las muestras; esto puede conseguirse realizando extracciones rpidas o evitando
en lo posible la exposicin innecesaria al aire, a la luz y al calor. Adems, las
muestras deben mantenerse en fro y conservarse congeladas (a 20 C o, mejor
an, a 70 C, en atmsfera de nitrgeno).
Los lpidos de las muestras se extraen con disolventes orgnicos, que en muchos casos deben ser evaporados antes de realizar las determinaciones analticas; esta evaporacin se debe realizar en las condiciones menos oxidantes
posibles (atmsfera de nitrgeno) y a temperaturas no superiores a 50 C. Es recomendable, segn la determinacin que quiera realizarse, aadir compuestos
antioxidantes como el BHA (ter-butil-4-hidroxianisol) o el BHT (2,6-di-ter-butilp-cresol) al disolvente de extraccin, evitndose as la oxidacin de los cidos
grasos insaturados. En el proceso de extraccin se aade un alcohol (metanol o
isopropanol) para desproteinizar y eliminar as las enzimas lipolticas, que
podran provocar cambios en la composicin de la muestra.
238
Mtodos de extraccin de lpidos

Los lpidos de los diferentes tipos de muestras, plasma, sangre o tejidos, se pueden separar del resto de biomolculas realizando una extraccin, como ya se ha
indicado, con disolventes orgnicos. Si se trabaja con muestras de tejidos, en primer lugar se ha de llevar a cabo una ruptura de las clulas por medios mecnicos (homogeneizadores, dispersores o sonicadores). Pueden utilizarse diferentes
mtodos con disolventes orgnicos para realizar la extraccin de los lpidos de
una muestra; el ms utilizado es el mtodo de Folch, por el que se realiza una
extraccin con cloroformo:metanol (2:1, V:V). El metanol rompe los enlaces que
se dan entre los lpidos y las protenas de las membranas e inhibe la accin de
las enzimas lipasas (desnaturalizndolas), mientras que el cloroformo permite la
disolucin de los lpidos. En el Anexo de Mtodos del CD se encuentran indicados los diferentes pasos del mtodo de Folch. Cabe destacar una serie de aspectos de este mtodos: los lavados con NaCl permiten la eliminacin de los
materiales polares disueltos por el metanol, de manera que al aadir una disolucin acuosa de NaCl al extracto de Folch y agitar vigorosamente, se forman dos
fases inmiscibles: en la fase superior acuosa se encuentran las sustancias ms polares y parte del metanol, mientras que en la fase inferior se encuentra el cloroformo con los lpidos. Los lavados se repiten varias veces, y se elimina la fase
acuosa despus de cada lavado. Se obtiene al final una mezcla de cloroformo:metanol (2:1, V:V) con los lpidos en ella, siendo ste el extracto de Folch o
extracto de lpidos purificados.
Cuantificacin de lpidos totales

El mtodo de cuantificacin ms sencillo y habitualmente utilizado para la cuantificacin de los lpidos totales es la gravimetra, es decir, pesar una sustancia
pura. El mtodo consiste en producir una evaporacin de los disolventes que
acompaan a los lpidos sobre el extracto de lpidos purificados de Folch a bajas
temperaturas bajo atmsfera de nitrgeno hasta obtener un peso constante.
Los lpidos totales pueden determinarse colorimtricamente gracias a que los
lpidos insaturados provocan la aparicin de coloracin rosa con un reactivo que
contiene cido sulfrico, cido fosfrico y vainillina, aunque este reactivo tan
slo permite determinar lpidos insaturados y no as saturados.
Determinacin de glicerol
El glicerol puede determinarse tanto por mtodos qumicos como enzimticos,
siendo estos ltimos ms precisos.
La determinacin colorimtrica del glicerol se fundamenta en la capacidad
que presenta de ser oxidado por el cido perydico a formaldehdo, el cual puede cuantificarse espectrofotomtricamente a longitudes de onda entre 500 y 600
nm (zona en la que no interfieren sustancias como la bilirrubina y la hemoglobina) despus de aadir acetilacetona y amonaco, ya que se produce un compuesto cclico coloreado (Figura 16.20).
El glicerol puede determinarse tambin por mtodos enzimticos. En
este sentido, hay diferentes posibilidades dependiendo de las reacciones
239
Captulo 16
Figura 16.20. Representacin esquemtica
de la determinacin colorimtrica del
glicerol.
que se acoplen. Adems, la determinacin enzimtica de glicerol puede ser

colorimtrica, fluorimtrica o luminomtrica. Una posibilidad consiste en
acoplar las reacciones de la glicerol quinasa, la piruvato quinasa y la lactato
deshidrogenasa, de forma que se puede medir la cantidad de glicerol, determinando la desaparicin de NADH (Figura 16.21) (ver Anexo de Mtodos en el CD).
Figura 16.21. Determinacin enzimtica

de glicerol acoplando las reacciones de la
glicerol quinasa, la piruvato quinasa y la
lactato deshidrogenasa, de forma que se
puede medir la cantidad de glicerol
determinando la desaparicin de NADH.
Otra posibilidad sera acoplar la reaccin de la glicerol quinasa con la de la

glicerol-fosfato deshidrogenasa y medir el NADH formado utilizando un indicador rdox (Figura 16.22). Se utiliza una enzima, la diaforasa, que cataliza la reduccin del colorante p-iodonitrotetrazolio (INT, color amarillo), a otro producto
de diferente color, el formazn (INTH), de color violeta, y que presenta un mximo de absorcin a 500 nm.
240

Figura 16.22. Determinacin de glicerol
acoplando las reacciones de las enzimas
glicerol quinasa, glicerol-fosfato
deshidrogenasa y diaforasa.
Determinacin de triacilgliceroles
Todos los mtodos empleados para la determinacin de triacilgliceroles, sean
qumicos o enzimticos, implican dos procedimientos generales:
1. Hidrlisis de los triacilgliceroles para formar glicerol y cidos grasos libres.
2. Medida del glicerol liberado, ya sea directamente o bien una vez que ste
se ha convertido en otro producto.
El principal problema que se plantea en la cuantificacin de los triacilgliceroles es la falta de un material de referencia adecuado. Esto se explica porque los
triacilgliceroles de prcticamente cualquier muestra estn constituidos por una
mezcla compleja de distintos cidos grasos. Los estndares comerciales tratan de
reflejar esta heterogeneidad y, al mismo tiempo, controlar la cantidad de glicerol
libre que puedan contener.
Mtodos qumicos para la determinacin de triacilgliceroles

Para medir la cantidad de triacilgliceroles en una muestra, el extracto de Folch
obtenido a partir de dicha muestra, o bien el extracto obtenido a partir de cualquier otro tipo de extraccin posible, se saponifica en condiciones adecuadas
para que no se vean afectados los steres de fosfato; de no ser as, se medira
tambin el glicerol procedente de los fosfolpidos. La saponificacin consiste en
una hidrlisis en medio bsico a temperatura elevada. Se obtienen buenos resultados calentado los lpidos a 70 C durante 30 minutos con hidrxido potsico
0,5 M en etanol. De esta manera, se libera glicerol de los triacilgliceroles y se forman las sales potsicas de cidos grasos. El glicerol es oxidado con cido perydico a formaldehdo, que puede medirse espectrofotomtricamente a longitudes de
onda entre 500 y 600 nm (zona en la que no interfieren sustancias como la bilirrubina y la hemoglobina) despus de aadir acetilacetona (Figura 16.23). Esquemticamente, los pasos a seguir seran:
241
Captulo 16
Extraccin con disolventes orgnicos

Saponificacin
Oxidacin con cido perydico
Formacin de un compuesto coloreado
Lectura a 500 nm y cuantificacin
Figura 16.23. Etapas en la determinacin

de triacilgliceroles.
Mtodos enzimticos para la determinacin de triacilgliceroles

Existen varios mtodos enzimticos para la cuantificacin de triacilgliceroles, y algunos de ellos estn comercializados. Suelen ser mtodos que se desarrollan en un
solo paso, con lo que se elimina la fase de extraccin de lpidos de las muestras.
La hidrlisis de los triacilgliceroles se efecta enzimticamente, utilizando generalmente una lipasa microbiana. El glicerol formado reacciona entonces con
un sistema indicador que se compone de una serie de reacciones enzimticas
acopladas. Los productos que se cuantifican con ms frecuencia son NAD+ o
NADH, bien midiendo la variacin de la absorcin a 340 nm, o bien mediante
su reaccin para formar un producto coloreado (ver Anexo de Mtodos del CD y
figura 16.22).
Una posibilidad es utilizar la glicerol-fosfato deshidrogenasa y medir el
NADH formado, que est relacionado con la cantidad de glicerol; otra alternativa es utilizar una diaforasa que cataliza la reduccin de un colorante, el p-iodonitrotetrazolio (INT), produciendo as un complejo coloreado, el formazn
(INTH), con un mximo de absorcin a 500 nm. La serie de reacciones se representa en la figura 16.22.
Para diferenciar el glicerol libre que pueda tener una muestra del que se encuentra formando triacilgliceroles, el ensayo se hace antes y despus de la hidrlisis de los triacilgliceroles, de modo que la diferencia de los resultados indica el
glicerol derivado de estos ltimos.
242
Determinacin de cidos grasos libres

Existen diferentes mtodos para la determinacin de cidos grasos libres y, entre ellos, han sido utilizados frecuentemente los mtodos basados en una extraccin previa de dichos cidos grasos; no obstante, suelen ser mtodos que
requieren tiempo, conllevan ciertos peligros y, adems, difcilmente pueden automatizarse. En este sentido, el uso de mtodos enzimticos supone una ventaja, ya que en ellos se puede eliminar la fase previa de extraccin y son, adems,
ms precisos, rpidos y simples; incluso pueden presentarse comercialmente en
forma de kit. Un ejemplo de este tipo de mtodos enzimticos para la cuantificacin de cidos grasos libres en suero es el mtodo NEFA C de Wako (puede
verse el desarrollo del mtodo en su integridad en el Anexo de Mtodos del
CD). En este mtodo, el primer paso corresponde a una acilacin de coenzima
A (CoA) por los cidos grasos de la muestra, en presencia de acil-CoA sintasa,
que se aade a la reaccin. Se agrega, a continuacin, acil-CoA oxidasa, que
provoca la generacin de perxido de hidrgeno a partir de la oxidacin del
acil-CoA formado anteriormente. El perxido de hidrgeno, en presencia de
peroxidasa, permite la condensacin oxidativa de la 3-metil-N-etil-N-(E-hidroxietil)-anilina (MEHA) con 4-aminoantipirina para formar un producto de color
prpura que puede cuantificarse colorimtricamente midiendo su absorcin a
550 nm. Las reacciones que se producen al utilizar este mtodo son las que se
detallan en la figura 16.24.
Figura 16.24. Cadena de reacciones en la
que se basa el mtodo NEFA C de Wako
para la determinacin de cidos grasos
libres.
Determinacin de colesterol
La determinacin de colesterol puede llevarse a cabo, fundamentalmente, mediante dos tipos de mtodos: qumicos y enzimticos. Los enzimticos son ms
precisos, pero tambin ms costosos.
El colesterol, al igual que otros esteroles, se encuentra en muchos tejidos y
puede existir tanto en forma libre, como en forma esterificada con un cido graso de cadena larga. Por tanto, en una muestra se puede analizar cada fraccin
independientemente o bien puede determinarse el colesterol total. Para la separacin de las fracciones libre y esterificada se puede utilizar digitonina, que es un
glucsido natural que forma con el colesterol libre un complejo insoluble en la
243
Captulo 16
mayora de los disolventes, incluso el agua, pudindose separar de esta manera

el colesterol libre del esterificado.
El colesterol total (libre ms esterificado) puede extraerse de una muestra utilizando un disolvente orgnico como el ter de petrleo, el cloroformo o el alcohol isoproplico. La cuantificacin puede realizarse directamente en el extracto
obtenido utilizando un mtodo qumico. Los resultados pueden mejorarse si,
previamente a la cuantificacin, los steres de colesterol se hidrolizan, ya sea calentando la muestra a reflujo con hidrxido potsico 1 M en etanol 95% o bien
sea utilizando la enzima ster colesterol hidrolasa.
Los mtodos enzimticos no miden el colesterol esterificado, de manera que
cuando se utiliza este tipo de mtodos para la determinacin del colesterol total
es necesaria una etapa previa de hidrlisis. Para medir el colesterol libre no se
requiere realizar una precipitacin con digitonina.
Mtodos qumicos para la determinacin de colesterol

Los mtodos qumicos se basan en la reaccin de Liebermann-Burchard. El colesterol libre y el esterificado son oxidados con una mezcla de cido sulfrico y
anhdrido actico para formar un producto coloreado, del que puede determinarse la absorbancia (Figura 16.25) (ver Anexo de Mtodos en el CD). Esta reaccin no es muy especfica ya que reaccionan tambin otros esteroles. Adems,
cuando se utilizan muestras de sangre, la hemoglobina y la bilirrubina absorben
en la misma regin que el producto coloreado, por lo que se pueden obtener resultados errneamente elevados.
Figura 16.25. Determinacin de colesterol

por un mtodo basado en la reaccin de
Liebermann-Burchard.
Mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol

En general, los mtodos enzimticos son ms fiables y exactos que los qumicos.
Como slo permiten la determinacin del colesterol libre, para determinar colesterol total es necesaria la hidrlisis previa de los steres de colesterol (Figura
16.26). Posteriormente, el colesterol libre (total) se oxida por accin de la enzima colesterol oxidasa a 4-colesten-3-ona, producindose simultneamente perxido de hidrgeno. La 4-colesten-3-ona tiene un mximo de absorcin a
240 nm, pero alternativamente puede medirse la cantidad de perxido de
hidrgeno utilizando un indicador. En el Anexo de Mtodos del CD se presenta
un mtodo en que se utiliza como indicador la oxidacin del metanol a formaldehdo, que puede medirse adicionando NH+4 y acetilacetona, ya que se forma
un complejo coloreado amarillo que puede determinarse a 405 nm.
Este tipo de anlisis es especfico, de manera que no es preciso realizar un
proceso previo de extraccin. Es el mtodo ms utilizado hoy en da. Si el indi244

Figura 16.26. Esquema de mtodo
enzimtico para la determinacin de
colesterol.
cador oxidado tiene color, se mide su absorbancia en un espectrofotmetro.

Tambin puede realizarse una medida por fluorimetra e, incluso, puede utilizase un electrodo de oxgeno que mida su consumo en la segunda reaccin.
Determinacin de cuerpos ctonicos

Los cuerpos cetnicos (derivados del metabolismo lipdico), E-hidroxibutirato y
acetoacetato, se pueden determinar tanto por mtodos qumicos como enzimticos. Los mtodos qumicos se basan en la conversin de E-hidroxibutirato en
acetoacetato, la descarboxilacin de ste a acetona y la valoracin de sta por
mtodos qumicos. Los mtodos enzimticos se basan en la interconversin entre estos dos compuestos por la accin de la E-hidroxibutirato deshidrogenasa,
en la que el NADH/NAD+ acta como cosustrato. La utilizacin de esta reaccin
para la determinacin de un compuesto en otro se basa en la utilizacin de un
tampn que determina el desplazamiento en un sentido o en otro, ya que la reaccin se encuentra normalmente desplazada hacia la formacin de E-hidroxibutirato (Figura 16.27).
As, la determinacin de acetotacetato se fundamenta en la reaccin catalizada por la E-hidroxibutirato deshidrogenasa, de manera que la disminucin de
absorbancia a 340 nm o la fluorescencia (longitud de onda de excitacin de
245
Captulo 16
enzima b-hidroxibutirato deshidrogenasa.
360 nm y de emisin de 460 nm) permiten determinar la cantidad de acetoacetato presente en una muestra.
La reaccin puede desplazarse hacia la formacin de acetoacetato, adicionando en el medio de reaccin hidrato de hidracina, que reacciona con el acetoacetato para formar una hidrazona (Figura 16.28), lo que determina que la
reaccin ya no sea reversible, por lo que la aparicin de NADH puede utilizarse
para medir la cantidad de E-hidroxibutirato presente en la muestra, bien sea colorimtrica o fluorimtricamente.
Figura 16.28. Esquema de la conversion
de b-hidroxibutirato en hidrazona de
acetoacetato utilizando la enzima
b-hidroxibutirato deshidrogenasa y
adicionando al medio hidracina.
246
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin

INTRODUCCIN
DILISIS
FILTRACIN
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin
Diseo de la instrumentacin para tcnicas de centrifugacin
Tipos de rotores
Tipos de centrifugacin
Centrifugacin preparativa
Centrifugacin analtica
248
17
INTRODUCCIN
Ya se ha destacado en temas anteriores que una de las propiedades fsicas que
puede utilizarse para separar biomolculas es su tamao. La diferencia de tamao entre biomolculas puede ser muy grande, si se compara un cido nucleico con un metabolito, o bien muy pequea, si lo que se compara son dos
protenas o dos ARNm entre s. Por tanto, se han desarrollado mtodos que permiten separar molculas de muy distinto tamao (por ejemplo por dilisis),
mientras que otros mtodos permiten separar molculas de tamao similar (por
ejemplo, por cribado molecular, electroforesis en gel o centrifugacin). Las tcnicas de separacin por tamao se fundamentan en la alteracin de la fuerza de
retardo que se ejerce sobre las molculas por efecto de la difusin de stas a
travs de poros, o bien en la velocidad de sedimentacin en un medio determinado cuando son sometidas a un campo gravitatorio.
DILISIS
Las tcnicas de dilisis se basan en la separacin de molculas en funcin de su
tamao mediante el uso de membranas semipermeables, que son membranas
con poros que permiten el paso de molculas ms pequeas que los poros y no
el de molculas con un tamao superior a stos (Figura 17.1). El paso de las
molculas pequeas a travs de los poros viene determinado por la diferencia de
concentracin de tales molculas a ambos lados de la membrana y por el movimiento browniano asociado a ellas (movimiento anrquico).
Cuando las molculas chocan con la membrana semipermeable (que presenta poros de un tamao determinado), las de dimetro o tamao menor al de
los poros de la membrana podrn atravesarla, mientras que las molculas ms
grandes chocarn con la membrana y cambiarn la direccin de su movimiento. De esta forma, las molculas pequeas pueden separarse de las ms grandes
(Figura 17.2).
Figura 17.1. Las molculas en disolucin

se encuentran en continuo movimiento
debido a la temperatura de la disolucin
energa cintica de las molculas. La
direccin del movimiento de las partculas
se encuentra determinada por los
diferentes choques que se dan entre las
molculas, y entre stas y las paredes del
recipiente que contiene la disolucin;
todo ello provoca un movimiento
anrquico de las molculas, que se
conoce como movimiento browniano.
249
Captulo 17
separacin de molculas por dilisis.
Mientras las molculas grandes no pueden
atravesar la membrana semipermeable, las
pequeas s que pueden hacerlo.
Las molculas pequeas, como iones de sales y metabolitos (glucosa, aminocidos, lactato, piruvato, etc.), pueden atravesar membranas semipermeables
para dilisis comunes, separndose de manera diferencial de macromolculas tales como protenas y cidos nucleicos.
El celofn (acetato de celulosa) es un ejemplo dentro de los materiales porosos que permiten la separacin de biomolculas por dilisis. El tamao de los
poros del celofn es tal que no permite el paso de molculas cuyo peso molecular sea igual o superior a 10.000 Da. Se pueden utilizar otros materiales para realizar separaciones de biomolculas por dilisis; materiales como la nitrocelulosa
y el colidin, presentan tamaos de poro variados, que permiten la separacin
de molculas con tamaos moleculares similares.
FILTRACIN
La filtracin es otro sistema de separacin de molculas basado en el tamao
molecular de stas. Se fundamenta en separar las molculas de una disolucin a
travs de un material poroso, que slo permitir el paso de las molculas de tamao inferior al de los poros (disolvente y solutos pequeos), quedando retenidas las molculas ms grandes (Figura 17.3).
Las primeras tcnicas de filtracin hacan uso de papel de filtro, que permita la
separacin de materiales precipitados a partir de una suspensin. Con el paso de los
aos, se ha incorporado el uso de nuevos materiales a la tcnica, tales como membranas diseadas para presentar tamaos de poro determinados. Estas membranas
son de polmeros de polivinilo, steres de celulosa, acetato de celulosa, etc., y permiten la discriminacin de sustancias con un tamao molecular parecido.
La fuerza impulsora del movimiento en este tipo de tcnicas puede ser la
fuerza de la gravedad, o bien puede realizarse una presin, o una aspiracin realizando el vaco. A esta fuerza impulsora se opone una fuerza de retardo, determinada por el tamao de los poros, la superficie de filtracin, el nmero de
Figura 17.3. Esquema del fundamento
para llevar a cabo una separacin de
biomolculas por filtracin.
250
partculas en disolucin, la viscosidad de la disolucin, la temperatura, la fuerza

inica de la disolucin, etc.
Algunos de los filtros actuales para llevar a cabo este tipo de tcnicas se han
diseado de tal manera que pueden acoplarse a jeringuillas o a tubos de centrifugacin (Figura 17.4), lo que permite aumentar la fuerza que impulsa el movimiento de las molculas a travs del filtro.
Las tcnicas de separacin de biomolculas por filtracin pueden tener utilidades variadas en un laboratorio, tales como:
La concentracin de disoluciones de macromolculas, eliminando parte del
disolvente.
La eliminacin de sales y otros solutos de pequeo tamao presentes en
una disolucin de inters.
El fraccionamiento de mezclas complejas de macromolculas.
Actualmente, el tamao de los poros de los filtros utilizados en tcnicas de filtracin puede ser extremadamente reducido, por lo que permiten separar macromolculas como distintas protenas. En estos casos se habla de ultrafiltracin.
Este tipo de tcnicas puede utilizarse, por ejemplo, para la desproteinizacin de
muestras biolgicas sin necesidad de recurrir a la utilizacin de agentes caotrpicos para precipitar las protenas.
Figura 17.4. Algunos sistemas comerciales

de separacin de biomolculas por
filtracin.
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin
La centrifugacin es otro tipo de tcnica que permite la separacin de molculas
por su tamao molecular. Cuando un conjunto de molculas en suspensin se
somete a un campo gravitatorio lo suficientemente elevado, puede conseguirse
que tales molculas sedimenten (Figura 17.5). El campo gravitatorio para lograr
la sedimentacin de las molculas ha de contrarrestar el efecto del movimiento
trmico anrquico de stas (movimiento browniano) que las mantiene uniformemente distribuidas en el conjunto de la disolucin.
El campo centrfugo que permite la separacin de las molculas se consigue
por la rotacin a elevadas velocidades de un componente fundamental de las
centrfugas denominado rotor. ste contiene los tubos con las molculas en susFigura 17.5. Principio de la centrifugacin.
251
Captulo 17
pensin. El principio de las tcnicas de separacin de molculas por centrifugacin es sencillo. Sobre la partcula en suspensin actan diferentes fuerzas y el
resultado neto de estas fuerzas es el que determina su movimiento. De esta forma, las partculas que se encuentran en una suspensin tienen una fuerza de
empuje hacia abajo generada por la accin de la gravedad.
Fabajo
mug
rp u V u g
Donde: Fabajo: fuerza de empuje hacia abajo sobre una partcula en

suspensin
m:
masa de la partcula
g:
aceleracin de la gravedad (9,8 m/s2)
rp:
densidad de la partcula
V:
volumen de la partcula
A esta fuerza se opone un conjunto de fuerzas:
Segn el principio de Arqumedes, todo cuerpo en un fluido experimenta
una fuerza de flotacin hacia arriba igual a la masa del volumen del fluido
desplazado.
Segn la ley de Stoke, todo cuerpo en movimiento en un fluido sufre una
fuerza de friccin en sentido contrario al movimiento y directamente proporcional a la velocidad de sedimentacin (v) y a la viscosidad del medio
(h). Esta fuerza tambin depende de la forma y tamao de la partcula (K).
Farriba
rf u V u g K u v u h
Donde: Farriba: fuerza de empuje hacia arriba sobre una partcula en

suspensin
rf:
densidad del fluido
V:
volumen de la partcula
g:
aceleracin de la gravedad (9,8 m/s2)
K:
constante dependiente de la forma y el tamao
de la partcula
v:
velocidad de la partcula en movimiento
h:
viscosidad del fluido
Al someter partculas a una centrifugacin, stas se aceleran rpidamente
hasta alcanzar una velocidad constante, momento en que las dos fuerzas (hacia
abajo y hacia arriba) se igualan. En tal momento tenemos que:
rp u V u g
rf u V u g K u v u h
Operando, se puede calcular cul es la velocidad de sedimentacin de una

partcula en funcin de la aceleracin del campo (en este caso centrfugo), su
densidad, volumen, forma-tamao y caractersticas del medio (densidad, viscosidad):
v
252
( rp rf )
Kuh
uV ug
De la ecuacin se deduce que la velocidad de sedimentacin de una partcula, v, en un medio determinado es,
directamente proporcional a:
la aceleracin provocada por el campo, gravitatorio o centrfugo (G)
la diferencia de densidades entre la partcula y el medio en que se encuentra (rp rf )
el volumen de la partcula (V)
inversamente proporcional a:
un factor que depende del tamao y forma de la partcula (K)
la viscosidad del medio donde tiene lugar la separacin (h)
Por consiguiente, la centrifugacin es una tcnica de separacin en la que la
fuerza impulsora del movimiento es la ejercida por el campo centrfugo, mientras que las fuerzas que se oponen al movimiento de cada uno de los diferentes
tipos de partculas a separar son funcin de las caractersticas del medio (viscosidad, densidad) y de las propias partculas a separar (tamao, forma y densidad).
Por tanto, este tipo de tcnica permite separar las molculas en funcin de su tamao y densidad.
El campo gravitatorio G campo centrfugo se genera por el giro de las partculas, lo que provoca que stas presenten una velocidad angular (w, en radianes
por segundo), que vendr determinada por la velocidad de giro del rotor en que
se encuentren las muestras. Hay que tener en cuenta tambin el radio de giro
distancia de las partculas al eje de rotacin (r, en cm). Por lo tanto, el valor
del campo gravitatorio ser:
G
Z2 u r
Una vuelta del rotor se corresponde con 2S radianes, por lo que la relacin
entre las revoluciones por minuto (rpm) y la velocidad angular (radianes por segundo) del rotor es:
2S u ( rpm)
Z
60
Por lo que:
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
3600
expresado en cm /s 2
El valor de este campo centrfugo viene en cm/s2, aunque generalmente se

expresa como mltiplo del campo gravitatorio terrestre (la constante gravitatoria
terrestre es de 980 cm/s2), conocindose con el nombre de campo centrfugo relativo (CCR) y midindose en las unidades conocidas como g:
CCR
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
3600 u 980
expresado en g
El campo centrfugo o gravitatorio depende del radio de giro de la partcula,

pero ste ltimo cambia a lo largo de la separacin, por lo que se utiliza el radio
medio de rotacin (rmed ). ste se corresponde a la distancia desde el eje de rotacin al centro de la columna de disolucin del tubo en el que tiene lugar la separacin.
253
Captulo 17
Diseo de la instrumentacin para tcnicas de centrifugacin

Los instrumentos diseados para llevar a cabo tcnicas de centrifugacin se
conocen con el nombre de centrfugas. Existen diferentes tipos de centrfugas, dependiendo de la finalidad de la separacin que quiera realizarse y de
las revoluciones por minuto que sean capaces de alcanzar. Hay desde pequeas centrfugas de mesa (1.000-5.000 rpm), que permiten la mezcla de
disoluciones o la precipitacin de determinados materiales, hasta ultracentrfugas (que pueden alcanzar hasta 100.000 rpm), que permiten no slo la separacin de diferentes biomolculas, sino tambin la determinacin de sus
pesos moleculares.
Tipos de rotores
Los rotores son componentes fundamentales de las centrfugas. Existen distintos
tipos de rotores; rotores basculantes, rotores angulares y rotores verticales (Figura 17.6).
Figura 17.6. Distintos tipos de rotores

utilizados en las tcnicas de
centrifugacin.
Rotores basculantes. Los rotores de tipo basculante se caracterizan por presentar recipientes para los tubos de muestra que se encuentran en posicin vertical
cuando el rotor se encuentra parado, pero con capacidad de bascular, de forma
que al empezar a girar la centrfuga se disponen de forma horizontal por accin
de la fuerza centrfuga, es decir formando un ngulo de 90 con el eje de giro.
En este tipo de rotores el campo centrfugo que acta sobre las diferentes molculas no es uniforme, cambia a medida que las molculas van desplazndose a
lo largo del tubo. Para comprender este ltimo concepto, debe recordarse que el
campo gravitatorio depende del radio de giro:
G
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
3600
Cuando se utiliza este tipo de rotores, el radio que suele considerarse es el

correspondiente al radio medio de giro.
El uso de los rotores basculantes tan slo permite la separacin de molculas
en pequeos volmenes de muestra (como mximo unos 200 mL), puesto que
debe tenerse en cuenta que el peso de cada uno de los tubos se multiplica por
el valor del campo centrfugo cuando la centrfuga se encuentra en marcha, lo
que lleva al eje de giro a soportar pesos elevados.
Rotores angulares. En los rotores angulares los tubos se mantienen formando un
ngulo fijo con el eje de rotacin (normalmente de 20 a 35). Al igual que
ocurra en el caso de los rotores basculantes, el campo centrfugo es variable
segn la posicin de una molcula en el tubo, pero en menor medida, dado que
las molculas pueden recorrer un camino mucho ms corto dentro de la direccin del radio de giro, desde la pared interna del tubo hasta la pared externa.
De esta manera, cuando las molculas chocan con la pared externa del tubo,
resbalan, bajando hacia el fondo de ste y formado all un pellet o precipitado.
Este tipo de rotores permite el uso de mayores volmenes de muestra, de forma
que existen centrfugas que permiten utilizar hasta 5 litros, al encontrarse los tubos dentro del cuerpo del rotor.
254
Rotores verticales. En los rotores verticales, los tubos de muestra se encuentran

dispuestos en paralelo al eje de giro, de forma que el campo centrfugo es ms
uniforme que en los anteriores tipos de rotores y la variacin de la distancia de
giro dentro de los tubos es menor. Las partculas, al chocar con la pared externa
del rotor, resbalan al fondo de los tubos, por lo que se permite una sedimentacin ms rpida de las muestras, ya que las partculas tan slo recorren una distancia, como mximo, igual al dimetro del tubo. Permiten la separacin de
mayores cantidades de muestra que los rotores presentados anteriormente pero,
en contrapartida, los pellet formados quedan menos compactados.
Tipos de centrifugacin
La centrifugacin se puede utilizar para alcanzar diferentes fines. Cuando se utiliza para la separacin de biomolculas, se habla de centrifugacin preparativa.
Cuando se utiliza con fines analticos estudiar biomolculas puras para obtener
informacin sobre sus caractersticas, tales como sus masas moleculares, pureza,
forma, densidad, etc., se habla de centrifugacin analtica. La instrumentacin
utilizada en ambos tipos es similar, aunque los fines sean distintos.
Centrifugacin preparativa
Como ya se ha comentado, la finalidad de este tipo de centrifugacin es la separacin de grupos de biomolculas, aunque tambin puede utilizarse en la separacin de los diferentes componentes de la clula para su posterior anlisis. Por
ello la centrifugacin preparativa suele utilizarse para aislar clulas enteras, orgnulos celulares, macromolculas, etc. Normalmente, en este tipo de tcnicas se
dispone de grandes cantidades de muestra.
Dentro de las tcnicas de centrifugacin preparativa, se han ido desarrollado
diferentes tipos de aplicaciones dependiendo de la finalidad del estudio. As
pues, puede hablarse de tcnicas de centrifugacin diferencial, de sedimentacin en zona, isopcnicas o isopcnicas de equilibrio.
Centrifugacin diferencial
El principio de separacin se basa en la diferente velocidad de sedimentacin de
las partculas en funcin de su tamao y densidad. En un tubo, los diferentes tipos de partculas se encuentran distribuidos uniformemente, pero, al someterlas
a un campo centrfugo, las molculas sedimentarn a distintas velocidades, por
lo que se irn separando a lo largo del proceso de centrifugacin (Figura 17.7).
Un ejemplo de aplicacin de este tipo de centrifugacin lo constituye la separacin de los diferentes orgnulos de una clula. A partir de un homogeneizado de tejido, utilizando diferentes etapas con campos centrfugos crecientes,
pueden separarse de manera diferencial los distintos orgnulos de las clulas.
El valor del campo centrfugo a aplicar en cada una de las etapas se determina de tal manera que en cada etapa se consiga la sedimentacin, en forma
de pellet o precipitado, de un componente especifico de la clula. Cada precipitado obtenido de esta manera puede separarse del sobrenadante y ser lavado varias veces para eliminar los posibles restos que hayan podido quedar en
dicho precipitado correspondientes a componentes menos pesados, obtenin-
Figura 17.7. Representacin de tres

tiempos del proceso de separacin por
centrifugacin diferencial de tres tipos
distintos de partculas. Inicialmente, los
tres tipos de partculas se encuentran
distribuidos uniformemente. A medida
que transcurre el proceso de
centrifugacin, las partculas ms pesadas
sedimentan ms rpidamente
(representadas en la figura como esferas
grandes), mientras que las ms pequeas
(esferas pequeas) no sedimentan en este
caso. Las partculas de tamao intermedio
requieren ms tiempo para sedimentar
(cubos) que las grandes.
255
Captulo 17
Figura 17.8. A partir de un

homogeneizado de tejido, utilizando
diferentes etapas con campos centrfugos
crecientes, pueden separarse de manera
diferencial los distintos orgnulos de las
clulas.
dose una fraccin de componente relativamente pura (Figura 17.8). Debe recordarse que el pellet recuperado durante la primera precipitacin por este
tipo de centrifugacin no es puro, ya que todas las partculas inicialmente se
encuentran distribuidas de forma homognea en el tubo, incluida la parte inferior, por lo que siempre los componentes ms pequeos quedarn contaminando el pellet, pudindose purificar por la realizacin de repetidas
resuspensiones y centrifugaciones del mismo (con 2 3 procesos de lavado
suele ser suficiente).
Centrifugacin de sedimentacin zonal
En este tipo de centrifugacin, la muestra se deposita en forma de capa en la
parte superior del medio en que se va a realizar la separacin, el cual presenta un gradiente de densidad continuo. Una vez depositada la muestra, se procede a la centrifugacin de los tubos. De esta manera, los diferentes
elementos de la muestra se separan formando bandas (Figura 17.9). Se centrifugan las muestras hasta conseguir separar las molculas de inters. En este
caso, no debe terminar la centrifugacin hasta que las distintas partculas de
la mezcla hayan quedado sedimentadas en diferentes zonas del gradiente
segn su velocidad de sedimentacin, para poder conseguir as una buena separacin.
Centrifugacin isopcnica (igual densidad)
Figura 17.9. Representacin de tres

tiempos de la separacin por
centrifugacin zonal de tres tipos distintos
de partculas. Inicialmente, los tres tipos
de partculas se encuentran juntos,
depositados en la parte superior del tubo.
A medida que transcurre la separacin, las
partculas ms pesadas (esferas grandes)
sedimentan ms rpidamente, quedando
en zonas inferiores; las de peso
intermedio (cubos) quedan en una zona
intermedia, mientras que las ms ligeras
(esferas pequeas) quedan situadas en
zonas superiores.
La velocidad de sedimentacin de las partculas depende no slo de su tamao,

sino tambin de su densidad y de la densidad del medio (o fluido) donde se realiza la separacin, de la siguiente forma:
v
( rp rf )
Kuh
uV ug
De manera que, cuando una partcula alcanza una zona del fluido que presenta su misma densidad, el valor de la velocidad pasa a ser cero, con lo que la
partcula detendr su migracin. La centrifugacin isopcnica consiste en aislar
las partculas en medios que presenten su misma densidad.
Este tipo de separacin puede realizarse de varias maneras, utilizando o no
un gradiente de densidad. Por ejemplo, puede realizarse inicialmente una centrifugacin diferencial de la muestra, para que sedimenten las partculas ms pesadas y no las que se pretende aislar. Una vez desechadas las partculas ms
pesadas, el sobrenadante se resuspende en un medio que presente la misma
densidad que la correspondiente a la fraccin de inters en la muestra y se centrifuga, de manera que las partculas que quieren aislarse sedimenten, mientras
que las menos densas quedarn flotando sobre el medio.
Otra posibilidad es depositar la muestra en forma de capa sobre un gradiente de densidad continuo, el cual debe incluir la densidad de las partculas
de inters. Se centrifuga la muestra y las partculas se separan en funcin de
su densidad, formando bandas o zonas en sus correspondientes regiones de
densidad.
256
Preparacin de gradientes de densidad

Como ya se ha podido ver, un aspecto importante en determinados procesos de
centrifugacin es la preparacin de gradientes de densidad, para la realizacin
de centrifugaciones zonales o isopcnicas. Los rangos de densidad que tienen
que utilizarse son diferentes segn el tipo de centrifugacin (Figura 17.10). Debe
tenerse en cuenta que, mientras en las separaciones zonales la funcin del gradiente de densidad es estabilizar la sedimentacin, en la centrifugacin isopcnica su funcin es generar un gradiente que incluya la densidad de las partculas
que se pretende aislar.
Los gradientes pueden prepararse con diferentes compuestos, siendo uno de
los ms utilizados la sacarosa. En la figura 17.11 pueden verse las caractersticas
de densidad y viscosidad a 20 C de diferentes disoluciones de sacarosa. Se han
utilizado tambin diferentes materiales sintticos para la formacin de gradientes
de densidad, tales como los que aparecen en la figura 17.12.
Los gradientes pueden prepararse de forma que sean discontinuos o continuos. Los gradientes discontinuos se preparan depositando en un tubo de centrfuga, cuidadosamente y de forma secuencial, disoluciones de densidades
decrecientes. La muestra se deposita en la parte superior, de manera que forme
una estrecha capa (ha de presentar una densidad menor a la de la ltima disolucin depositada del gradiente). A partir de este punto, existen dos posibilidades.
Una es proceder inmediatamente a realizar la centrifugacin. Otra posibilidad es
dejar pasar un tiempo para que, debido al movimiento browniano, se produzca
un gradiente lineal continuo, pudindose acelerar esta formacin de un gradiente lineal mediante una ligera agitacin de los tubos.
Para formar gradientes de densidad continuos se utiliza, en muchos casos, un
aparato denominado formador de gradientes. Dicho aparato consiste en dos cmaras cilndricas de igual dimetro, conectadas en su base con un tubo que comunica las dos cmaras, presentando este tubo, adems, una llave que permite
la mezcla de las disoluciones que haya en ambas cmaras. En una de las cmaras
se aade una disolucin cuya densidad sea la ms elevada del gradiente, mientras que en la otra se coloca una disolucin con una densidad correspondiente a
la menor. La cmara con la disolucin menos concentrada contiene un sistema
de agitacin que permite en todo momento mezclar su contenido; esta cmara
de mezclado tambin presenta una salida para poder llenar tubos de centrfuga
(Figura 17.13). Inicialmente, las dos cmaras presentan una altura tal que permita igualar las presiones hidrostticas de ambas cmaras. Los tubos de centrfuga
se van llenando con el contenido de la cmara de mezclado (la que inicialmente
contiene la disolucin menos densa); a medida que el contenido de esta cmara
se va vaciando, al estar conectada por el tubo con llave de paso con la cmara de disolucin ms densa, se produce un flujo de sta ltima a la primera; y,
adems, al contener la primera cmara un sistema de mezclado (el sistema de
agitacin), va aumentando gradualmente la densidad de la disolucin que la
ocupa a medida que entra el lquido ms denso. De esta forma, al llenarse los
tubos de centrfuga desde el fondo, en ellos se forma un gradiente de densidad
continuo.
Despus de finalizar el proceso de centrifugacin, y realizada la separacin
de las partculas, debe extraerse cada banda de inters evitando que los diferentes materiales se mezclen otra vez. La extraccin de los materiales puede realizarse de varias maneras. Un mtodo consiste en perforar el tubo de centrfuga
por la parte inferior e ir introduciendo una disolucin ms densa, de manera
Figura 17.10. Diferentes orgnulos

celulares y macromolculas, y su
correspondiente densidad.
Figura 17.11. Caractersticas de densidad

y viscosidad de diferentes disoluciones de
sacarosa a 20 C.
Figura 17.12. Diferentes materiales para la

formacin de gradientes de densidad.
257
Captulo 17
formacin de gradientes de densidad
continuos.
que las bandas se desplazan hacia arriba, pudindose extraer las diferentes fracciones con una jeringuilla o con una pipeta. En otros casos, los tubos pueden
cortarse, recuperando las diferentes bandas. Otra posibilidad es perforar el tubo
en su base y recoger con un colector las fracciones correspondientes a las diferentes bandas.
Centrifugacin analtica
La finalidad de la centrifugacin analtica es obtener informacin sobre determinadas caractersticas de macromolculas o partculas: pureza, peso molecular,
forma del material, etc. Normalmente, en este tipo de tcnica se dispone de pequeas cantidades de muestra y suelen utilizarse elevadas velocidades de giro.
La instrumentacin que se utiliza no difiere mucho de la empleada para las separaciones preparativas, pero requiere que se utilicen sistemas de deteccin y
observacin de los resultados (Figura 17.14).
Figura 17.14. Esquema representativo del
diseo de una centrfuga analtica.
258
Mtodos de determinacin de lpidos individuales

INTRODUCCIN
FRACCIONAMIENTO DE MEZCLAS DE LPIDOS
Extraccin con disolventes
Extraccin en columna
Cromatografa en capa fina
DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS
Determinacin de cidos grasos por cromatografa de gases
Determinacin simultnea de cidos grasos libres y esterificados en plasma
DETERMINACIN DE LAS LIPOPROTENAS PLASMTICAS
Separacin de lipoprotenas por ultracentrifugacin
Separacin de lipoprotenas por electroforesis
Determinacin de lipoprotenas por mtodos inmunolgicos
DETERMINACIN DE FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA
260
18
INTRODUCCIN
Como ya se ha comentado, los lpidos son mezclas complejas de un grupo muy
heterogneo de compuestos que tienen como nica caracterstica comn su solubilidad en disolventes orgnicos y su insolubilidad en disolventes polares. La gran
heterogeneidad de estos compuestos provoca que la metodologa que puede aplicarse para la separacin de mezclas de lpidos sea realmente muy extensa.
En la figura 18.1 se puede observar una lista de lpidos ordenados en funcin
de su polaridad.
Al ser los lpidos un conjunto tan heterogneo de compuestos, no existe un
mtodo que permita determinarlos todos al mismo tiempo. Lo ms normal es
hacer un fraccionamiento previo de los mismos, separando los diferentes grupos
de lpidos utilizando algn tipo de tcnica separativa (normalmente basada en la
polaridad) y, despus, una vez fraccionada la mezcla de lpidos, aplicar otra tcnica separativa y cuantitativa de la fraccin lipdica que quiera estudiarse.
En este captulo se muestra cmo pueden cuantificarse los diferentes cidos
grasos individuales, tanto libres como esterificados, las lipoprotenas y los fosfolpidos.
FRACCIONAMIENTO DE MEZCLAS DE LPIDOS

Entre las tcnicas utilizadas habitualmente para el aislamiento de lpidos se encuentran la extraccin con disolventes orgnicos, la cromatografa de adsorcin,
la cromatografa en capa fina y la cromatografa de gases.
Figura 18.1. Lista de lpidos ordenados en

funcin de su polaridad. Se muestran en
orden decreciente de apolaridad de arriba
a abajo.
Extraccin con disolventes

A pesar de ser compuestos bsicamente apolares, los lpidos presentan polaridades variables, que permiten llevar a cabo separaciones de mezclas de lpidos con
diferentes disolventes, simplemente cambiando la proporcin de estos ltimos,
261
Captulo 18
de forma que dos grupos de lpidos con polaridad muy diferente se pueden separar con estas tcnicas. Un ejemplo lo constituye la separacin de los fosfolpidos del resto de los lpidos por su precipitacin con acetona fra. Otro ejemplo
es la extraccin de los cidos grasos con ter o con heptano a pH cido, ya que,
a dicho pH, los cidos grasos estn protonados y son los ms apolares. As, la extraccin con disolventes orgnicos permite la separacin de determinados grupos de lpidos con propiedades de solubilidad muy diferentes.
Extraccin en columna
La cromatografa de adsorcin en columna puede utilizarse para separar los diferentes lpidos. Adsorbentes como el gel de slice (adsorbente polar), el Florisil
(silicato de Mg) y el carbn activo (adsorbente apolar) son los ms utilizados y
permiten realizar separaciones diferenciales de los distintos grupos de lpidos,
eluyendo los lpidos retenidos por el adsorbente con disolventes adecuados.
Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina, especialmente en placas de gel de slice, permite
la separacin de los diferentes lpidos que se pueden encontrar en mezclas
biolgicas. Se puede utilizar para separar los diferentes grupos de lpidos (Figura
18.2) o para separar lpidos dentro de un mismo grupo (Figura 18.3); la separacin por cromatografa en capa fina puede ser en una direccin o en dos direcciones (Figura 18.4).
Figura 18.2. Separacin de lpidos del
plasma por cromatografa en capa
fina (TLC) con gel de slice como
soporte, utilizando el siguiente
eluyente: petrleo ligero (b.p. 40-60
C):dietil ter (85:1, V:V). El revelado
se ha realizado con vapores de iodo.
Este mtodo permite separar el
colesterol esterificado del libre y
obtener los triacilgliceroles
purificados. CE: colesterol
esterificado; TG: trialcilgliceroles;
AGL: cidos grasos libres; C:
colesterol libre; DG: diacilgliceroles;
PL: fosfolpidos (ms
monoacilgliceroles).
262
Figura 18.3. Separacin de diferentes

fosfolpidos en placas de gel de slice
G, utilizando como eluyente
cloroformo:metanol:agua (65:35:5,
V:V:V). LN: lpidos neutros; PE:
fosfatidiletanolamina; PS:
fosfatidilserina; PC: fosfatidilcolina;
SM: esfingomielina; LC: lisolecitina.

Figura 18.4. Separacin de los lpidos de
la membrana eritrocitaria por
cromatografa bidimensional en placa de
gel de slice.
En las figuras 18.2, 18.3 y 18.4 se muestra la separacin por cromatografa en

capa fina de diferentes mezclas complejas de lpidos, o de fosfolpidos. La polaridad de los diferentes lpidos determina su adsorcin sobre la placa de gel de slice, de forma que los menos apolares se unen ms fuertemente. La polaridad del
eluyente determina que un tipo de lpido se adsorba ms o menos sobre la placa
y presente diferentes Rf.
Para la visualizacin y cuantificacin de los lpidos se utilizan diferentes reactivos (Figura 18.5). Algunos son generales y otros son especficos de un grupo (de
fosfolpidos, glucolpidos, colesterol, etc.).
Figura 18.5. Reactivos empleados para la
visualizacin de lpidos tras su separacin
por TLC.
Una vez separados los diferentes grupos de lpidos por cualquiera de las tcnicas que hemos visto, se pueden someter a otras tcnicas separativas para de263
Captulo 18
terminar la composicin de los diferentes elementos de una clase de lpidos;

como, por ejemplo, los cidos grasos libres, los cidos grasos esterificados, los
fosfolpidos, los cidos grasos de los fosfolpidos, etc.
DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS

Determinacin de cidos grasos por cromatografa de gases
Los cidos grasos libres se diferencian entre s en el nmero de carbonos y en el
nmero de dobles enlaces y su posicin, lo que determina, adems, que presenten
diferentes puntos de ebullicin. La cromatografa de gases (ver captulo 9) es un sistema que permite separar molculas voltiles con puntos de ebullicin diferentes
y, por lo tanto, resulta de gran utilidad para la separacin de cidos grasos. Los cidos grasos que forman parte de los triacilgliceroles o fosfolpidos se pueden obtener saponificando estos compuestos, para realizar posteriormente una
determinacin por cromatografa de gases de los cidos grasos presentes.
La determinacin de cidos grasos por cromatografa de gases, en cuanto a su
fundamento, no difiere de la separacin de aminocidos por TLC o por HPLC. Los
cidos grasos como tales, es decir, intactos, al igual que otras muchas sustancias, no
pueden separarse por cromatografa de gases ya que presentan un punto de ebullicin muy elevado y quedan retenidos en la columna. Esto es debido a la polaridad
del grupo cido (COOH). La solucin a este problema radica en modificar qumicamente los cidos grasos de manera que sean ms voltiles, lo que puede conseguirse formando los correspondientes steres metlicos (COOCH 3); al
desaparecer el enlace OH del cido graso, se incrementa su volatilidad. No obstante, los cidos grasos libres de cadena corta (de 2 a 8 tomos de carbono) pueden analizarse por cromatografa de gases sin ser metilados previamente, ya que
en su forma original son ms voltiles que los cidos grasos de cadena ms larga.
Una vez separados los cidos grasos se procede a su deteccin, normalmente con
un detector de ionizacin a la llama. Dadas unas determinadas condiciones de
temperatura, flujo de gas portador, etc., los cidos grasos presentan un determinado tiempo de retencin en la columna de la cromatografa de gases, que permite
su separacin del resto de cidos grasos, as como su identificacin.
Los anlisis de cidos grasos por cromatografa de gases pueden efectuarse a
una temperatura constante, en cuyo caso se habla de anlisis isotrmicos. Sin
embargo, es muy frecuente realizar el anlisis utilizando un gradiente de temperatura. Est tcnica es til cuando los compuestos que quieren separarse tienen
una volatilidad similar; en general, el anlisis empieza a baja temperatura (por
ejemplo 70 C), pero pasado un tiempo desde la inyeccin de la muestra (30 segundos), la temperatura empieza a incrementarse a una velocidad constante. De
esta manera, se acelera la elucin de los componentes ms voltiles.
En el Anexo de Mtodos del CD puede encontrarse un mtodo para la determinacin de los cidos grasos libres individuales del plasma por cromatografa de
gases. En el mtodo se utilizan patrones internos y externos, que ayudarn a la
identificacin y cuantificacin de los cidos grasos. La identificacin de los diferentes cidos grasos es ms precisa si se trabaja con tiempos de retencin relativos al
patrn interno. Adems, el patrn interno permite controlar las prdidas del proceso de tratamiento de las muestras al aadirse en una cantidad conocida al inicio de
dicho tratamiento. La cantidad de seal obtenida en el detector (de ionizacin a la
llama) es caracterstica de cada cido graso, por lo que deben utilizarse patrones
264
externos para determinar la respuesta de cada cido graso con el detector y,

adems, normalmente se corrige este valor con referencia al patrn interno. Se
asigna al patrn interno un factor de respuesta de 1. Si se realiza una relacin entre la respuesta de un determinado cido graso, de concentracin conocida, y el
estndar interno, del que tambin se conoce la concentracin, se puede determinar cmo responde el cido graso al detector de ionizacin de llama (Figura 18.6).
Este factor de respuesta (FR) controla la seal que da el detector para cada
cido graso y se calcula a partir de mezclas de patrones externos con un patrn
interno que se pasan por la columna de cromatografa.
La utilizacin del patrn interno tiene tres funciones:
Figura 18.6. Clculo del factor de

respuesta (FR) de un cido graso x (AGx ).
rea indica el rea bajo la curva que
forma el pico de deteccin
correspondiente.
Controlar las alteraciones que puede sufrir la muestra

Permitir la identificacin de cada componente en el cromatograma y de su
tiempo de retencin relativo
Controlar el factor de respuesta del detector para cada componente
La cuantificacin de cada componente por separado en una muestra se realiza a partir del rea del pico correspondiente a dicho componente en el cromatograma que se obtiene al final del proceso, la concentracin del patrn interno,
el rea del pico correspondiente al patrn interno y el FR determinado mediante
los patrones externos (Figura 18.7).
Figura 18.7. Clculo de la concentracin
en una muestra de cada cido graso tras la
realizacin de una cromatografa de gases.
Los cidos grasos que se utilizan como patrones internos en la determinacin

de los cidos grasos por cromatografa de gases son cidos grasos de un nmero
impar de carbonos, dado que todos los cidos grasos que pueden encontrarse en
una muestra biolgica presentan un nmero par de tomos de carbono. Los patrones internos ms utilizados son el cido heptadecanoico (17:0) y el cido pentadecanoico (15:0). Estos cidos grasos de nmero impar de tomos de carbono se
comportan en la cromatografa de forma similar respecto a los dems cidos grasos
naturales y son fcilmente identificables en un cromatograma tpico (Figura 18.8).
Figura 18.8. Cromatograma tpico del
contenido de cidos grasos de una
muestra de plasma tratada con lipasa.
265
Captulo 18
Determinacin simultnea de cidos

grasos libres y esterificados en plasma
El mtodo que aqu se describe (ver tambin Anexo de Mtodos en el CD) combina tcnicas de cromatografa en columna, cromatografa de gases y mtodos
enzimticos. Este mtodo permite determinar simultneamente los cidos grasos
circulantes tanto libres como esterificados (triacilgliceroles, diacilgliceroles, monoacilgliceroles y fosfolpidos).
A continuacin se detalla cada uno de los pasos de este ejemplo, para comprender el diseo de este tipo de mtodos.
Los lpidos de las muestras de plasma se fraccionan utilizando una columna
de carbn activo para separar los cidos grasos libres del resto de lpidos. Esta separacin permite eluir de manera diferencial los cidos grasos libres respecto de
los triacilgliceroles.
Se procesan dos muestras en paralelo; una tratada con lipasa, la cual hidroliza los triacilgliceroles a cidos grasos libres y glicerol, y otra sin tratar. De esta
manera, en la muestra tratada con enzima, se recuperan los cidos grasos libres
y los procedentes de la hidrlisis de la lipasa en la fraccin de cidos grasos,
mientras que en la muestra sin tratar se recuperan slo los cidos grasos libres
del plasma en la fraccin de cidos grasos (Figura 18.9).
Figura 18.9. Esquema del mtodo
simultneo de determinacin de cidos
grasos libres, esterificados y totales en el
plasma. cidos grasos esterificados =
cidos grasos totales cidos grasos
libres.
Las distintas fracciones de lpidos son separadas por elucin diferencial en

una columna de carbn activo. Las muestras tratadas se pasan a travs de la columna, que retiene los compuestos apolares (los lpidos). La columna se lava con
HCl para eluir los compuestos polares que puedan contaminar la columna. Los
lpidos ms polares son eluidos con metanol, mientras que para eluir los cidos
266
grasos libres se pasa una mezcla de cloroformo:metanol por la columna. Los lpidos ms apolares se eluyen con cloroformo (Figura 18.10).
La fraccin de cidos grasos libres separada de esta manera se puede utilizar
para la determinacin de los diferentes cidos grasos individuales.
DETERMINACIN DE LAS LIPOPROTENAS PLASMTICAS

Las distintas lipoprotenas plasmticas pueden separarse utilizando diversos mtodos en funcin de sus propiedades fsicas y qumicas. Las lipoprotenas difieren
en su tamao, densidad, relacin carga/tamao, composicin de protenas, etc.
Los mtodos para separarlas se basan en estas diferencias. As pues, las lipoprotenas pueden separarse por tcnicas de ultracentrifugacin (debido a que difieren en su densidad), por tcnicas electrforeticas (al tener diferentes relaciones
tamao/carga) y tambin pueden determinarse por mtodos inmunolgicos (al
presentar protenas especficas en su estructura).
Separacin de lipoprotenas por ultracentrifugacin

Las diferencias de densidad entre las distintas lipoprotenas permiten su separacin por centrifugacin diferencial con disolventes que presenten tambin distintas densidades. En el Anexo de Mtodos del CD se explica un procedimiento
por ultracentrifugacin diferencial para las distintas lipoprotenas, el cual se esquematiza en la figura 8.11. La muestra de plasma se ultracentrifuga varias veces
aumentando la densidad del medio. Tras la primera centrifugacin, las VLDL
Figura 18.10. Esquema de proceso de

cromatografa en columna para el
fraccionamiento de lpidos del plasma.

separacin de lipoprotenas por
ultracentrifugacin diferencial.
267
Captulo 18
(densidad inferior a 1,006 g/mL) se recuperan en la fraccin flotante y se separan

del resto. Se ajusta la densidad del infranadante y se vuelve a ultracentrifugar la
mezcla, tras lo cual las IDL (densidad 1,006-1,019 g/mL) flotan y pueden aislarse
del resto de compuestos. La ltima centrifugacin contiene en la fraccin flotante las LDL (densidad 1,063 g/mL). De esta forma, se continan realizando centrifugaciones diferenciales y ajustando la densidad del medio de manera creciente
hasta separar las distintas fracciones de lipoprotenas.
Con este mtodo es posible separar y recuperar cuantitativamente las fracciones de lipoprotenas aisladas y reconstituir el volumen original de la alcuota
de plasma. La cuantificacin de las fracciones lipoproteicas se puede llevar a
cabo determinando su contenido en colesterol, triacilgliceroles, fosfolpidos o
protenas.
Esta tcnica requiere una instrumentacin muy cara y adems los protocolos
son muy largos y laboriosos, de manera que se suele aplicar sobre todo en investigacin, no siendo habitual en un laboratorio clnico.
Separacin de lipoprotenas por electroforesis

Las lipoprotenas, al presentar distinta relacin carga/tamao, pueden separarse
unas de otras por electroforesis. Las electroforesis en papel y en gel de agarosa
producen separaciones similares, aunque el gel de agarosa aumenta la resolucin de la separacin y en ocasiones se utiliza para separar subclases de lipoprotenas. Un soporte de acetato de celulosa no permite diferenciar los
quilomicrones, que migran con las VLDL.
La movilidad relativa de las lipoprotenas tras una electroforesis en gel de
agarosa se especifica en la figura 18.12.
Figura 18.12. Separacin electrofortica
de lipoprotenas en un gel de agarosa.
En las separaciones en geles de agarosa, los quilomicrones, si estn presentes,

permanecen prcticamente en el origen. Las dems lipoprotenas migran hacia
el polo positivo, ya que al pH al que se realiza la separacin (8,6), tienen carga
negativa. Los tipos de lipoprotenas separadas por electroforesis se clasifican de
acuerdo con las bandas de protenas sricas de movilidad similar. Las HDL se
268
asocian a la regin de las D1-globulinas, las VLDL a la regin de las D2-globulinas, y las LDL a la regin de la J-globulinas. Las lipoprotenas se visualizan utilizando un colorante adecuado, por ejemplo oil red. En el Anexo de Mtodos del
CD se puede ver un protocolo para la determinacin de lipoprotenas por electroforesis.
Determinacin de lipoprotenas por mtodos inmunolgicos

Las distintas lipoprotenas presentan apoprotenas caractersticas, que pueden
actuar como antgenos. Esto hace posible su determinacin por mtodos inmunolgicos (ver captulo 14).
DETERMINACIN DE FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA

Los fosfolpidos se diferencian entre s por la distinta polaridad que presentan,
por lo que las tcnicas basadas en diferencias de polaridad, tales como TLC y
HPLC, permiten determinar los distintos fosfolpidos. Los fosfolpidos pueden separarse a partir del extracto de Folch lpidos totales, precipitndolos con acetona, realizando posteriormente una separacin de stos por HPLC y
detectndolos espectrofotomtricamente. Los fosfolpidos, al ser polares, tienen
que separarse en columnas de fase normal (slice) y utilizando disolventes apolares (por ejemplo, acetonitrilo:metanol:cido fsfrico 99:3:1) (Figura 18.13). La
deteccin puede realizarse a 200 nm. Se puede lograr una completa separacin
de los diferentes fosfolpidos en 15 min (ver Anexo de Mtodos en el CD).
Figura 18.13. Cromatograma obtenido
tras una separacin de fosfolpidos de
membranas eritrocitarias por HPLC en
fase normal y posterior deteccin a
200 nm.
269
Mtodos de determinacin de carbohidratos

INTRODUCCIN
Estructura de los carbohidratos
Monosacridos
Disacridos
Polisacridos
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS

Preparacin de las muestras
Mtodos qumicos para la determinacin de carbohidratos
Mtodo de reduccin del cobre
Reacciones con cidos fuertes y fenoles
Mtodos enzimticos para la determinacin de carbohidratos

SEPARACIN DE MEZCLAS DE CARBOHIDRATOS E IDENTIFICACIN
Cromatografa en papel y en capa fina
Cromatografa de gases y HPLC
270
19
INTRODUCCIN
Los carbohidratos, tambin denominados glcidos, hidratos de carbono, sacridos o azcares, pueden definirse como polialcoholes que presentan, adems, un
grupo cetona o un grupo aldehdo. Cumplen funciones tanto estructurales como
de reserva energtica en el organismo.
Los carbohidratos, al igual que el resto de biomolculas, se determinan y
cuantifican por mtodos que se fundamentan en sus propiedades diferenciales
respecto del resto de biomolculas, en su caso la presencia del grupo carbonilo
(adems de ser polialcoholes). En presencia de cidos fuertes, los carbohidratos
pueden hidrolizarse; los polisacridos, por ejemplo, se descomponen en sus unidades bsicas. Las pentosas y las hexosas se deshidratan produciendo un furfural
y derivados hidroximetilfurfural, que pueden condensarse con compuestos fenlicos, dando lugar a productos coloreados que pueden utilizarse para la determinacin de los carbohidratos originales.
Cuando el objetivo es el estudio de carbohidratos individuales, debe tenerse en
cuenta que el anlisis cualitativo y cuantitativo de una mezcla de carbohidratos presenta considerables dificultades, debido a la similitud de la estructura y naturaleza
qumica de los diferentes glcidos. Por ello, muchos mtodos de anlisis son incapaces de distinguir entre los diferentes carbohidratos. La especificidad de la determinacin puede mejorarse separando previamente los componentes de la mezcla
mediante una tcnica cromatogrfica adecuada; las ms utilizadas son la cromatografa de gases y la cromatografa lquida. Sin embargo, la disponibilidad de preparaciones puras de muchas enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos
ha dado lugar al desarrollo de mtodos enzimticos de anlisis relativamente sencillos, que no slo son especficos, sino que tienen altos niveles de sensibilidad.
Estructura de los carbohidratos

Los carbohidratos, cuyo nombre viene de la frmula emprica de estos compuestos (CH2O)n, son aldehdos y cetonas de polialcoholes. Se clasifican en
271
Captulo 19
funcin del tipo y nmero de productos que se forman al hidrolizarse en medio cido:
Monosacridos: carbohidratos que no pueden hidrolizarse
Disacridos: al hidrolizarse producen dos monosacridos (iguales o diferentes)
Oligosacridos: al hidrolizarse dan de tres a diez molculas de monosacridos
Polisacridos: al hidrolizarse producen ms de diez molculas de monosacridos
Monosacridos
En forma slida son de color blanco, cristalinos, muy solubles en agua e insolubles en disolventes no polares. La mayora tienen sabor dulce y no pueden
ser hidrolizados en molculas ms sencillas. Son, por lo tanto, los azcares
ms sencillos, aldehdos (aldosas) o cetonas (cetosas) con dos o ms grupos
hidroxilo.
Los monosacridos pueden subdividirse en grupos segn el nmero de tomos de carbono que poseen:
Triosas (CH2O)3
Tetrosas (CH2O)4
Pentosas (CH2O)5
Hexosas (CH2O)6
Heptosas (CH2O)7
Octosas (CH2O)8
Pueden subdividirse, adems, en aldosas y cetosas segn tengan un grupo aldehdo o ceto (Figuras 19.1 y 19.2). Las aldosas y cetosas se consideran, estructuralmente, derivados del D-gliceraldehdo o de la D-dihidroxiacetona,
respectivamente.
Los azcares presentan estructura cclica. El grupo carbonilo es un grupo
muy reactivo y forma hemiacetales al reaccionar con un grupo OH propio o
Figura 19.1. Configuracin de las aldosas
de serie D.
272

Figura 19.2. Configuracin de las cetosas
de serie D.
bien de otra molcula. En el caso de que la cadena del azcar sea lo suficientemente larga (4-6 tomos de carbono), uno de los grupos hidroxilo de la misma
molcula puede reaccionar con el grupo carbonilo para formar un hemiacetal
cclico, que se halla en equilibrio con la forma de aldehdo o de cetona libre
(Figura 19.3). Los teres de hidroxilo hemiacetlico reciben el nombre de
glucsidos.
Figura 19.3. Proceso por el que una
molcula lineal de D-Glucosa forma una
estructura cclica por reaccin del grupo
hidroxilo con el grupo carbonilo, para
formar un glucsido. Ntese que todas las
reacciones se encuentran en equilibrio.
De esta forma, por ejemplo, la glucosa (el monosacrido ms comn) se puede representar de tres maneras: cadena lineal, proyeccin de Haworth y silla (Figuras 19.4 y 19.5).
Figura 19.4. Distintas formas en que se
puede representar la D-glucosa: cadena
lineal, proyeccin de Haworth y silla.
273
Captulo 19
Las estructuras cclicas de estos monosacridos pueden ser de tipo piranosa

(anillo de 6 elementos) o de tipo furanosa (anillo de 5 elementos) (Figura 19.6).
La nomenclatura se debe a que son similares a las estructuras de los compuestos
conocidos como pirano y furano.
La configuracin espacial no es plana y, en general, se habla de la adopcin
de una forma de tipo silla o de tipo nave (Figura 19.7).

estructura molecular de la D-glucosa
(representacin en forma de varillas
derecha y radios de Van der Waals
izquierda), en forma de cadena lineal
(arriba) y de silla (abajo).
Figura 19.6. Estructura de los anillos de

piranosa y de furanosa en comparacin
con las estructuras de la
a-D-glucopiranosa, la b-D-glucopiranosa,
la a-D-fructofuranosa y la
b-D-fructofuranosa.
Figura 19.7. Cuando la a-D-glucopiranosa

adopta forma de nave o de silla, los
grupos OH pasan a encontrarse en forma
ecuatorial (E) respecto al anillo, y no en
forma axial (A), con lo que se encuentran
ms separados entre ellos y, de esta
manera, la molcula es ms estable en
trminos termodinmicos.
Disacridos
Los disacridos son azcares compuestos por dos residuos de monosacridos
unidos por un enlace glucosdico (ter), con prdida de una molcula de agua
al realizarse dicha unin. El enlace glucosdico es la formacin de un acetal
entre el OH anomrico de un monosacrido y un OH de otro monosacrido. Es estable frente a la accin de las bases, sin embargo se hidroliza frente a
los cidos.
274
Podemos hablar de dos grandes grupos de disacridos dependiendo de la

existencia o no de un OH anomrico libre (es decir, si entra o no a formar parte del enlace glucosdico):
Reductores: presentan un OH anomrico libre.
No reductores: no presentan ningn OH anomrico libre.
Los disacridos se nombran indicando el lugar de formacin del enlace glucosdico, el tipo de configuracin cclica y el nombre de los azcares que intervienen. Por ejemplo, la lactosa es la 1-E-D-galactopiranosil-4-E-D-glucopiranosa
(Figura 19.8).
Los disacridos ms importantes se detallan en la figura 19.9.
Figura 19.8. Estructura de la lactosa: 1-bD-galactopiranosil-4-b-D-glucopiranosa.
Figura 19.9. Estructura de algunos

disacridos importantes.
275
Captulo 19
Polisacridos
Los polisacridos, tambin llamados polisidos o glucanos, estn formados por
ms de 10 residuos de monosacridos. A continuacin, se resumen las caractersticas ms importantes de los principales tipos de polisacridos.
Almidn. Est formado por una cadena D-glucosdica, que es un polmero de
glucosas unidas a travs de enlaces D (1 o 4), con enlaces D (1 o 6) en los puntos de ramificacin. Constituye la fuente ms importante de carbohidratos de los
alimentos y se encuentra en cereales, patatas, legumbres y otros vegetales. Los
dos constituyentes principales del almidn son la amilosa y la amilopectina. La
amilosa constituye de un 15 a un 20% del almidn y tiene estructura helicoidal
no ramificada (Figura 19.10). La amilopectina constituye un 80-85% del almidn
y consiste en cadenas muy ramificadas, de 24 30 residuos de glucosa unidos
por enlaces D (1 o 4) en las cadenas y por enlaces D (1 o 6) en los puntos de
ramificacin (Figura 19.11).
Figura 19.10. Estructura de la amilosa,
mostrndose su estructura helicoidal.

amilopectina, mostrndose un punto de
ramificacin a (1 o 6) y un esquema de
la estructura ramificada que posee.
Glucgeno. Es el polisacrido que se almacena en el organismo animal, por lo

que a veces se designa como almidn animal. El glucgeno posee una estructura mucho ms ramificada que la amilopectina, con cadenas de 11 a 18 residuos de D-glucopiranosa unidos por enlaces glucosdicos D (1 o 4) y
ramificaciones unidas a las cadenas por medio de enlaces glucosdicos
D (1 o 6) (Figura 19.12).
Celulosa. Es un constituyente importante del armazn de los vegetales. Consiste
en unidades de E-D-glucopiranosa unidas por enlaces E (1 o 4) formando cadenas rectas y largas, reforzadas por enlaces cruzados de puentes de hidrgeno (Figura 19.13). La celulosa no puede ser digerida por muchos mamferos,
276

Figura 19.12. Molcula de glucgeno. Se
muestra la estructura general y una
ampliacin de la estructura de un punto
de ramificacin.
incluyendo el hombre debido a la carencia de una hidrolasa que ataque el enlace E (1 o 4). En el intestino de los rumiantes y otros herbvoros existen microorganismos capaces de hidrolizar estos enlaces E, haciendo disponible la celulosa
como fuente calrica importante para tales animales.
Quitina. Es un tipo de polisacrido de gran importancia estructural en los invertebrados. Se puede encontrar en los exoesqueletos de crustceos e insectos. Las
unidades bsicas son N-acetil-D-glucosaminas unidas por enlaces E (1 o 4) glucosdicos (Figura 19.14).
Figura 19.13. Uniones que se dan entre

molculas de b-D-glucopiranosa para
formar molculas de celulosa.
Figura 19.14. Representacin de las

unidades bsicas que forman una cadena
de quitina.
Glucosaminoglucanos. Los glucosaminoglucanos (mucopolisacridos) estn

constituidos por cadenas de carbohidratos complejos, caracterizndose por contener aminoazcares y cidos urnicos. Cuando estas cadenas se unen a una
molcula de protena, el compuesto se conoce como un pptidoglucano. Se encuentran relacionados con elementos estructurales de los tejidos animales, como
la elastina y el colgeno o como el propio tejido seo. Presentan la propiedad de
retener grandes cantidades de agua y de adoptar una conformacin extendida
en disolucin, por lo que son tiles a la hora de amortiguar o lubricar; en la manifestacin de estas propiedades es importante el gran nmero de grupos OH y
de cargas negativas de estas molculas, lo que permite, por el establecimiento
de fuerzas de repulsin, que se conserven relativamente separadas entre s las
cadenas de carbohidratos. Ejemplos de este tipo de polisacridos son: el cido
hialurnico, el sulfato de condroitina y la heparina (Figura 19.15).
Glucoprotenas (mucoprotenas). Las glucoprotenas existen en muchas condiciones diferentes en los lquidos corporales y en los tejidos, incluso en las membranas celulares. Son protenas que contienen carbohidratos en diversas
proporciones, adheridos a ellas en forma de cadenas cortas o largas (ms de 15
unidades), ramificadas o no. Dichas cadenas se denominan cadenas oligosacridas (Figura 19.16).
277
Captulo 19
Figura 19.15. Estructura del cido
hialurnico, de la heparina y del sulfato
de condroitina.
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS

Preparacin de las muestras
Figura 19.16. Estructura de una
glucoprotena.
La preparacin y tratamiento previos de una muestra para el posterior anlisis

de los carbohidratos presentes depender de su naturaleza, pero tambin del
mtodo analtico elegido. La preparacin de la muestra generalmente implica
la homogeneizacin y ruptura celular, as como la extraccin y la eliminacin
de las protenas (desproteinizacin) y de las sustancias que puedan interferir
en los anlisis posteriores. Es necesario evitar la descomposicin y degradacin
de los carbohidratos en estos tratamientos o en su almacenamiento, lo que se
consigue aadiendo agentes antibacterianos como el timol, o sustancias que
inhiban la transformacin enzimtica de los carbohidratos, como los iones
fluoruro.
Mtodos qumicos para la determinacin de carbohidratos

Los mtodos qumicos desarrollados para determinar los carbohidratos se basan
en la capacidad de estas molculas para reaccionar con determinados reactivos,
dando lugar a productos coloreados. Al estar fundamentados estos mtodos en
reacciones sobre determinados grupos funcionales, resultan poco especficos, tal
y como ocurre en general con el anlisis por mtodos qumicos de otros tipos de
sustancias, debido a que los diferentes carbohidratos presentan los mismos grupos funcionales. De esta forma, los mtodos qumicos no son viables, por ejemplo, para la determinacin de un monosacrido determinado en presencia de
otros; en tales casos, es conveniente recurrir al uso de mtodos enzimticos, que
son ms especficos, o a la realizacin de una separacin de los componentes de
la muestra, con una posterior cuantificacin de la sustancia de inters mediante
un mtodo qumico.
La mayora de mtodos qumicos para la determinacin de carbohidratos
se basan en el poder reductor de stos. Los carbohidratos se determinan y
278
cuantifican por mtodos que se fundamentan en la presencia del grupo carbonilo, aunque algunos mtodos tienen en cuenta el hecho de que son polialcoholes.
Como ya se ha comentado, los carbohidratos se hidrolizan en presencia de
cidos fuertes. Los monmeros se deshidratan produciendo un furfural y derivados hidroximetilfurfural que pueden condensarse con compuestos fenlicos,
dando lugar a productos coloreados.
Mtodo de reduccin del cobre

Los azcares que presentan algn OH anomrico libre son reductores y, por
tanto, capaces de reducir los iones cpricos (Cu2+) a iones cuprosos (Cu+). Estos ltimos, en solucin alcalina, producen hidrxido cuproso, de color amarillo, que se convierte, por calentamiento, en xido cuproso, de color rojo
(Figura 19.17).
Figura 19.17. Reduccin de Cu2+ por
azcares reductores y produccin de
xido cuproso y de hidrxido cuproso en
medio alcalino y en caliente.
Entre los mtodos basados en este principio, los ms utilizados son el mtodo de Benedict y el de Fehling. El primero permite la deteccin de los azcares reductores totales en una muestra y se emplea todava como base en las
pruebas semicuantitativas para la determinacin de azcares reductores totales
en orina.
Reacciones con cidos fuertes y fenoles

Al calentar pentosas y hexosas en presencia de un cido fuerte, se deshidratan
produciendo un furfural y derivados de hidroximetilfurfural, respectivamente; los
grupos aldehdo pueden condensarse con un compuesto fenlico, dando lugar a
un producto coloreado (Figura 19.18). Por ejemplo, la reaccin de Molish utiliza
cido sulfrico concentrado y D-naftol que, con los carbohidratos, produce un
compuesto de color rojo-violeta. En el mtodo de la antrona, que es cuantitativo, se produce una reaccin similar y se obtiene un compuesto de color azulverdoso (ver Anexo de Mtodos en el CD).
Figura 19.18. Formacin de furfural y de
5-hidroximetilfurfural a partir de una
pentosa o de una hexosa
respectivamente, y condensacin con el
reactivo de la antrona para producir un
cromforo.
279
Captulo 19
Si se escogen cuidadosamente las condiciones de reaccin y el compuesto

fenlico, se pueden obtener colores caractersticos de un carbohidrato particular
o de un grupo de carbohidratos relacionados, pudindose disear as mtodos
relativamente especficos.
El mtodo de determinacin de glucgeno (ver Anexo de Mtodos del CD,
mtodo de la antrona) es un mtodo que combina la purificacin de esta macromolcula (basada en su precipitacin con etanol) con un mtodo qumico, que
se fundamenta en la formacin de un derivado coloreado que permite su cuantificacin.
Mtodos enzimticos para la determinacin de carbohidratos

Los carbohidratos pueden determinarse tambin enzimticamente. Existe un
gran nmero de enzimas que catalizan reacciones sobre los carbohidratos y sus
derivados y algunas de ellas se utilizan en mtodos analticos para la determinacin de glcidos. Por ejemplo, se puede utilizar la E-galactosidasa, que cataliza
la hidrlisis de enlaces glucosdicos E (1 o 4) (enlace que, por ejemplo, se da en
la lactosa), la D-glucosidasa, que cataliza la hidrlisis de enlaces glucosdicos
D (1 o 4) (enlace de la maltosa), o la amiloglucosidasa, que cataliza la hidrlisis
de los enlaces glucosdicos del glucogeno, D (1 o 4) y D (1 o 6). Estas enzimas
se utilizan para estudiar tanto la estructura de los disacridos y polisacridos
como para realizar su cuantificacin. Las enzimas hidrolizan los enlaces glucosdicos y liberan los monosacridos individuales, que se analizan posteriormente
con mtodos qumicos o con otros mtodos enzimticos.
Los mtodos enzimticos para la cuantificacin de monosacridos presentan
una elevada especificidad, superior a la de los mtodos qumicos. No obstante,
algunas enzimas pueden reaccionar con ms de un monosacrido, como ocurre
con la enzima hexoquinasa, que se utiliza generalmente para medir la glucosa
de una muestra, pero que no es especfica para la determinacin de dicha glucosa, ya que puede catalizar la fosforilacin de otras hexosas. Adems, aunque
muchas enzimas estn comercializadas en estado casi puro, existe la posibilidad
de que en el purificado de la enzima utilizado se d tambin la presencia de pequeas cantidades de otras enzimas, cuyo sustrato podra encontrarse en el medio de reaccin.
Ya hemos comentado una serie de estos mtodos, al hablar de las enzimas
como reactivos, como son el de la glucosa oxidasa, el de la glucosa deshidrogenasa y el de la hexoquinasa (ver captulo 14 y protocolo en el Anexo de Mtodos del CD, donde se presentan ejemplos de mtodos enzimticos para la
determinacin de carbohidratos).
En la figura 19.19 se muestra la determinacin de glucosa utilizando glucosa
oxidasa, y en la figura 19.20 utilizando hexoquinasa.
En ambos mtodos se acopla una segunda reaccin que acta como indicadora de la primera; en el caso del mtodo que utiliza la glucosa oxidasa se utiliza la aparicin de un cromforo, mientras que en el de la hexoquinasa se
aprovecha el hecho de que se produce una reduccin del NADP+.
Otras hexosas pueden ser analizadas por mtodos similares. As, por ejemplo,
la D-galactosa puede ser determinada utilizando la galactosa deshidrogenasa,
que la oxida a D-galacto-1,4-lactona, producindose NADH en la reaccin que
se muestra en la figura 19.21.
280

Figura 19.19. Determinacin de glucosa
por el mtodo de la glucosa oxidasa.
Figura 19.20. Determinacin de glucosa

por el mtodo de la hexoquinasa.
Figura 19.21. Determinacin de Dgalactosa utilizando galactosa

deshidrogenasa.
La fructosa puede determinarse acoplando tres reacciones enzimticas: las

catalizadas por la hexoquinasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa. De manera que las reacciones se acoplaran como se muestra
en la figura 19.22.
281
Captulo 19
Figura 19.22. Determinacin de fructosa
acoplando tres reacciones enzimticas, las
catalizadas por la hexoquinasa, la
fosfoglucosa isomerasa y la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, de forma que al
final puede medirse la reduccin de
NADP+.
Por lo tanto, la glucosa y la fructosa pueden determinarse en una misma

muestra realizando un mtodo en tres etapas (Figura 19.23).
Primera etapa. Adicin de un reactivo con hexoquinasa. Lectura de la absorbancia de la muestra a 340 nm.
Figura 19.23. Reacciones enzimticas que
se suceden en el proceso de
determinacin de glucosa y fructosa en
una misma muestra.
282
Segunda etapa. Adicin de un reactivo con glucosa-6-P deshidrogenasa,

para la identificacin de la glucosa. Lectura de la absorbancia a 340 nm
una vez transcurrida la reaccin (unos 20 minutos); el incremento entre la
lectura de la primera y la segunda etapa es atribuible a la cantidad de glucosa presente en la muestra.
Tercera etapa. Adicin de un reactivo con fosfoglucosa isomerasa, que
convertir la fructosa-6-P formada en la primera etapa en glucosa-6-P; rpidamente transformndose en 6-fosfoglucono-1,5-lactona, por la presencia en el medio de glucosa-6-P deshidrogenasa. De esta manera se puede
determinar tambin la fructosa presente en la muestra.
Lectura de la absorbancia a 340 nm una vez transcurrida la reaccin (unos
20 minutos). El incremento entre la lectura de la segunda y la tercera etapa es atribuible a la cantidad de fructosa presente en la muestra.
La manosa puede determinarse de una manera similar a la fructosa, acoplando 4 reacciones enzimticas. Se utiliza hexoquinasa, fosfomanosa isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucosa-6-P deshidrogenasa. Esquemticamente, la
secuencia de reacciones se muestra en la figura 19.24.
Figura 19.24. Determinacin de manosa
acoplando 4 reacciones enzimticas. Se
utiliza hexoquinasa, fosfomanosa
isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y
glucosa-6-P deshidrogenasa.
La lactosa (disacrido) puede determinarse enzimticamente acoplando dos

reacciones (ver Anexo de Mtodos en el CD), siendo una catalizada por la E-galactosidasa y la otra por la galactosa deshidrogenasa, tal y como se observa en la
figura 19.25.
En la figura 19.26 se muestra cmo puede determinarse el almidn (polisacrido) mediante hidrlisis enzimtica, por accin de la amiloglucosidasa, seguida de la determinacin enzimtica de la glucosa formada (ver Anexo de
Mtodos del CD).
La cantidad de fibra presente en una muestra tambin puede determinarse
enzimticamente, despus de eliminar las protenas y carbohidratos que no forman parte de la fibra por la accin de distintas enzimas (amilasa, proteasa y
aminoglucosidasa). La amilasa gelatiniza la muestra, la proteasa hidroliza los enlaces peptdicos de las protenas, liberando aminocidos, y la aminoglucosidasa
hidroliza los enlaces glucosdicos de los carbohidratos complejos, como el almidn, liberando azcares sencillos. La fibra se precipita con etanol y, a continuacin, se filtra la solucin en crisoles de 40-60 Pm de poro (dos crisoles por
cada muestra); de esta manera se eliminan los compuestos solubles que han
aparecido tras la accin de los enzimas. Los crisoles se pesan; uno se utiliza
283
Captulo 19
Figura 19.25. Determinacin de lactosa
acoplando los reacciones de la
b-galactosidasa y la galactosa
deshidrogenasa.
para calcular las cenizas y el otro para determinar el contenido residual de protenas por el mtodo Kjeldahl (ver captulo 11). La determinacin de fibra se
corresponde con la diferencia de pesos entre la muestra original y el filtrado,
del que se descuentan el contenido de protenas residuales y de cenizas (ver
Anexo de Mtodos en el CD).
Figura 19.26. Determinacin enzimtica
de almidn acoplando las reacciones de
la amiloglucosidasa, la hexoquinasa y la
glucosa-6-P-deshidrogenasa.
284
SEPARACIN DE MEZCLAS DE
CARBOHIDRATOS E IDENTIFICACIN
La separacin de mezclas de carbohidratos y la identificacin de los distintos carbohidratos de una muestra se puede realizar utilizando tcnicas de cromatografa.
Cromatografa en papel y en capa fina

La cromatografa en papel o la cromatografa en capa fina se utilizan en las separaciones rutinarias de los componentes de una mezcla de carbohidratos, siendo
estas tcnicas utilizadas tambin para su determinacin semicuantitativa. Los
carbohidratos pueden separarse tanto realizando una cromatografa en una nica direccin como realizando separaciones bidimensionales. La eleccin de los
eluyentes se efecta en funcin de los carbohidratos que se pretendan separar.
Una vez separados los carbohidratos, pueden localizarse los distintos tipos por la
accin de diferentes reactivos (cido sulfrico, orcinol, naftoresorcinol, fosfato de
difenilamina anilina, cido 4-aminobenzoico, etc.); alguno de estos reactivos
provoca la aparicin de colores diferentes sobre la superficie cromatogrfica al
reaccionar con los distintos carbohidratos (Figura 19.27).
Figura 19.27. Reacciones de coloracin
para diferentes mono- y disacridos.
(1) Indica que el reactivo es poco sensible
para ese carbohidrato en concreto.
Se sabe que las molculas ms pequeas tienen, en general, una mayor movilidad durante el proceso de cromatografa. En el caso de los oligosacridos, la
distancia recorrida depender del nmero de unidades de monosacridos que
los componen. En general, la distancia recorrida por los carbohidratos suele ser
corta y las diferencias relativas entre los distintos componentes glucdicos de una
muestra son pequeas, por lo que a veces es necesario dejar salir del soporte el
frente del solvente. Otra posibilidad para mejorar la resolucin de la tcnica es
repetir varias veces el proceso, secando la placa de cromatografa al finalizar
cada desarrollo. Cabe comentar que, cuando se determinan diferentes carbohidratos utilizando estas tcnicas, la distancia recorrida por la glucosa es la que se
utiliza como referencia.
Un ejemplo de anlisis de carbohidratos por tcnicas cromatogrficas es
la separacin de los mono-, di-, y trisacridos de una mezcla, que puede
realizarse en placas de gel de slice, desarrollando el proceso cromatogrfico
tres veces con acetonitrilo:agua (85:15), secando entre desarrollo y desarrollo, y visualizando los carbohidratos con fosfato de difenilamina-anilina (Figura 19.28).
Figura 19.28. Resultado de la separacin

cromatogrfica de mono-, di-, y
trisacridos de una mezcla en placa de gel
de slice, por desarrollo de la
cromatografa tres veces con
acetonitrilo:agua (85:15). La visualizacin
se ha realizado por reaccin con fosfato
de difenilamina-anilina.
285
Captulo 19
Por otra parte, los polisacridos pueden separarse en placas de gel de slice y
desarrollando la cromatografa con butanol:metanol:agua (50:25:20); los carbohidratos se visualizan con fosfato de difenilamina-anilina (Figura 19.29).
La glucosa y la fructosa se pueden separar con acetonitrilo:cido brico 0,5%
en agua (76:24) (Figura 19.30).
Figura 19.29. Resultado de una
separacin de polisacridos en placa de
gel de slice por cromatografa con
butanol:metanol:agua (50:25:20). La
visualizacin se ha realizado con fosfato
de difenilamina-anilina.
Figura 19.30. Separacin de azcares

con acetonitrilo:cido brico 0,5% en
agua (76:24). Este tipo de separacin
permite diferenciar la glucosa de la
fructosa.
Cromatografa de gases y HPLC

La cromatografa de gases (Figura 19.31) y la tcnica de HPLC (Figura 19.32) se
utilizan tambin para la separacin de muestras muy complejas de carbohidratos
y para su determinacin cuantitativa.
La cromatografa de gases es un mtodo til cuando hace falta identificar o
cuantificar uno o ms carbohidratos, especialmente cuando se encuentran en
muy pequeas cantidades y/o en muestras muy complejas.
Esta cromatografa de gases tiene que llevarse a cabo utilizando derivados
voltiles de los carbohidratos. Los ms utilizados son los derivados de O-trimetilsilil. Las condiciones de la derivatizacin deben ser suaves para evitar las isomerizaciones al azar.
Por el contrario, la utilizacin de la tcnica de HPLC para la separacin de
mezclas de carbohidratos y la determinacin de stos no requiere la formacin
de derivados voltiles, a diferencia de la cromatografa de gases.
Figura 19.31. Separacin de
una mezcla de carbohidratos
por cromatografa de gases.
El anlisis se ha realizado en
una columna de 3% SP-2340
100/120
SUPELCOPORT6c u 2mm ID
glass. Temperatura del horno:
225 C; gas transportador:
nitrgeno; 20mL/min;
detector: FID.
286
Figura 19.32. Separacin de

azcares por HPLC.
Columna: 250 u 4,6 D.I.
POLYGOSIL 60-5 NH2 ;
solvente: acetonitrilo-agua
(75:25); flujo: 2,0 mL/min;
deteccin: UV 188 nm.
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos

INTRODUCCIN
Estructura de los cidos nucleicos
MTODOS DE AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS
Mtodos de aislamiento y purificacin de ADN
Mtodos de aislamiento y purificacin de ARN
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS
Determinacin por espectrofotometra
Mtodo de tincin con bromuro de etidio
Mtodo del cido diamino benzoico (DABA) para la determinacin de ADN
288
20
INTRODUCCIN
Los cidos nucleicos juegan un papel clave en la transmisin de la informacin
gentica. En los ltimos aos se ha hecho necesario el estudio de los cidos nucleicos desde diferentes puntos de vista, debido a su implicacin en las enfermedades hereditarias, en los procesos de diferenciacin y proliferacin celular
(con especial hincapi en los procesos neoplsicos), y en la determinacin de
los mecanismos patolgicos de organismos infecciosos. El resultado de todos estos estudios ha sido el desarrollo, durante las ltimas tres dcadas, de un nmero importante de tcnicas nuevas que han permitido el estudio de los cidos
nucleicos.
Los mtodos generales para el estudio de los cidos nucleicos se basan en la
separacin de estas molculas del resto de las biomolculas; tal y como ya se ha
descrito a lo largo del libro, es necesario recurrir a las propiedades diferenciales
del ADN y del ARN respecto del resto de biomolculas. Su cuantificacin general se fundamenta en que presentan una capacidad importante de absorcin de
radiacin electromagntica a 260 nm, debido a la presencia de las bases nitrogenadas.
El ADN y el ARN se pueden separar por su diferente polaridad. As, al ser el
ARN ms polar, puede separarse de manera diferencial del ADN, controlando
por ejemplo, el pH de la disolucin en que se encuentren ambos tipos de cidos
nucleicos.
Las distintas especies de ARNm se diferencian entre s por su tamao, por lo
que pueden utilizarse tcnicas electroforticas para separarlas, ya que presentan
carga y su tamao es relativamente grande. No obstante, al igual que ocurra en
el caso de las protenas, las tcnicas electroforticas no son lo suficientemente finas para separar y diferenciar completamente las distintas especies de ARNm.
Por lo tanto, debe buscarse la total resolucin basndose en otra diferencia ms
especfica entre dichas especies: la secuencia de bases que forman el cido nucleico en cuestin. De forma anloga a los procedimientos utilizados en las tcnicas inmunolgicas, en este caso se utilizan sondas (secuencias de ADN o de
289
Captulo 20
Figura 20.1. Modelo esquemtico del

ADN en la forma comn B. La estructura
bsica se repite a intervalos de 34 , que
corresponde a diez residuos nucleotdicos
en cada cadena. Las dos cadenas
polinucleotdicas que forman la doble
hlice de ADN corren en sentido
5c-3c antiparalelo.
Figura 20.2. Diagrama de una de las

hebras de una doble hlice de ADN vista
desde arriba. Las bases (en este esquema
son todas pirimidinas) se sitan en el
interior, mientras que el esqueleto del
azcares y grupos fosfatos se sita en el
exterior.
290
ARN complementarias a la secuencia a estudiar) que, marcadas adecuadamente

(con radiactividad, con fluorescencia o con enzimas), pueden servir para determinar de manera semicuantitativa la cantidad de una especie de ARNm presente o simplemente para detectar determinadas especies.
La presencia de un gen determinado o de una mutacin sobre el ADN puede
determinarse utilizando tcnicas enzimticas. En este sentido, el descubrimiento
de las llamadas enzimas de restriccin ha sido esencial. Estas enzimas son capaces de cortar el ADN en regiones especficas gracias a la presencia de una determinada secuencia de bases, lo que provoca la aparicin de fragmentos de ADN
de diferentes tamaos que pueden utilizarse para determinar la presencia o no
de la mutacin a estudiar.
Uno de los problemas ms importantes que se plantea en el estudio de los
cidos nucleicos es el hecho de disponer de una pequea cantidad de muestra,
problema que se soluciona, al igual que en otras circunstancias relacionadas con
los mtodos en Bioqumica, acudiendo a los propios conocimientos bioqumicos. En este caso se recurre al conocimiento del proceso de replicacin del ADN
por accin de la ADN polimerasa, realizando in vitro lo que se conoce como reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, del ingls Polymerase Chain Reaction).
La reaccin en cadena consiste en repetir n veces el proceso de replicacin del
ADN, obteniendo de esta manera ms copias del ADN para que sea ms fcil su
estudio. En el caso del ARN, se puede recurrir a transformar el ARN en ADN por
accin de una transcriptasa inversa, amplificando despus por PCR la molcula
de ADN obtenida, para su posterior estudio.
Como la mayora de tcnicas, los mtodos para el estudio de los cidos nucleicos se fundamentan en la estructura de estos compuestos.
Estructura de los cidos nucleicos

La estructura del ADN consiste en una doble hebra helicoidal de polmeros de desoxirribonucletidos de adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G), de manera que los sucesivos nucletidos estn unidos entre s por enlaces covalentes: el
grupo 5c-hidroxilo de la pentosa de un nucletido est unido al grupo 3c-hidroxilo
del nucletido siguiente por un enlace fosfodister. De este modo, el esqueleto covalente de los cidos nucleicos est constituido por grupos alternantes de fosfato y
de pentosa, mientras que las bases nitrogenadas caractersticas aparecen como
grupos laterales unidos al esqueleto a intervalos regulares (Figura 20.1). Hay que
indicar, adems, que el ADN constituye una molcula muy polar, ya que los grupos fosfato son cidos y, a pH fisiolgico, se encuentran cargados negativamente.
Las bases pricas y pirimidnicas se sitan en el interior de la doble hlice de
ADN, mientras que las unidades de fosfato y desoxirribosa estn en el exterior
(Figura 20.2). Los planos que contienen las bases son perpendiculares al eje de la
hlice. Los planos que contienen los azcares estn formando ngulos casi rectos
con los de las bases.
Las dos hebras no son iguales ni en su secuencia de bases ni en su composicin, sino que son complementarias. Las dos cadenas permanecen unidas entre
s por puentes de hidrgeno que se establecen entre los pares de bases, siguiendo las reglas de Watson y Crick. De esta forma, la adenina se empareja con la timina por el establecimiento de determinados puentes de hidrgeno, mientras
que la guanina se empareja con la citosina (Figura 20.3).

Figura 20.3. Modelos de los pares de
bases de timina-adenina y citosinaguanina, estableciendo puentes de
hidrgeno, tal y como hacen cuando se
forma la doble hlice.
Los cidos ribonucleicos (ARN) son polmeros lineales de ribonucletidos de

cadena sencilla. Por lo tanto, constituyen, en general, polmeros de pesos moleculares menores que las cadenas de ADN de la misma longitud. Adems, suelen
constituir polmeros mucho ms cortos que los de ADN, aunque son mucho ms
abundantes. El esqueleto covalente del ARN consiste en un polmero lineal de
unidades de ribonucletidos unidos mediante enlaces fosfodister 5c-3c. En este
ltimo aspecto es idntico al ADN, pero el ARN se diferencia estructuralmente
del ADN en tres puntos importantes:
1. El grupo azcar del ARN es la ribosa y no la 2c-desoxirribosa (Figura 20.4).
2. En lo referente a las bases nitrogenadas, la timina se sustituye por uracilo.
La timina posee un grupo metilo en el C-5, mientras que en el uracilo se
sustituye dicho grupo por un H. Las otras bases son comunes con las del
ADN: adenina, guanina y citosina (Figura 20.5).
Figura 20.4. Estructura de la ribosa y la 2cdesoxirribosa.
Figura 20.5. Estructura de las distintas

bases nitrogenadas.
3. Las molculas de ARN son generalmente monocatenarias. Sin embargo, el

apareamiento de bases de tipo Watson-Crick se puede dar entre la adenina
y el uracilo, y entre la guanina y la citosina de una misma molcula. Al ser el
ARN una molcula de cadena nica se producen toda clase de estructuras
secundarias, entre las que cabe citar las estructuras en bucle y en horquilla
que participan en el reconocimiento del ARN por protenas (Figura 20.6).
La sustitucin de 2c-desoxirribosa en el ADN por la ribosa en el ARN puede
parecer insignificante y, sin embargo, afecta en gran medida a las propiedades
del ARN, ya que el grupo 2c-hidroxilo:
1. Impide a las molculas de ARN la adopcin de la conformacin de tipo B
Figura 20.6. Las molculas de ARN

monocatenario pueden contener zonas
bicatenarias. En la figura se representa la
estructura molecular de una cadena de
ARNt formando una estructura en horquilla.
291
Captulo 20
2. Permite que en las molculas de ARN se produzca un nmero mayor de

interacciones terciarias
3. Promueve la reactividad qumica
Son estas caractersticas las que se explotan para la separacin de ambos tipos de cidos nucleicos.
MTODOS DE AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

La aplicacin de las tcnicas de Biologa Molecular al anlisis de genomas complejos depende de la capacidad de aislar fragmentos puros de ADN y ARN y, en
el caso de los primeros, tambin de poder aislar molculas de un elevado peso
molecular.
Para purificar cidos nucleicos hay que partir de una disolucin acuosa. La
preparacin de la disolucin acuosa depende de la procedencia de la muestra,
ya sea, por ejemplo, de tejido o de sangre.
Mtodos de aislamiento y purificacin de ADN

Las muestras de tejido se recogen y se congelan en nitrgeno lquido. A continuacin, se procede a la digestin y lisis del tejido con reactivos adecuados (por
ejemplo, empleando proteinasa K).
La purificacin de ADN de muestras de sangre es difcil porque la sangre es
una mezcla compleja que contiene clulas, protenas, metabolitos, etc. Ms
del 99% de las clulas de la sangre son eritrocitos, que no tienen ncleo y, por
lo tanto, carecen de ADN. El ADN de la sangre debe aislarse de los leucocitos
(0,3% del total de las clulas sanguneas) y debe estar libre de contaminantes
que interfieran en mtodos posteriores; as, por ejemplo, la presencia del grupo hemo provoca una fuerte inhibicin de la Taq ADN polimerasa durante el
proceso de PCR. Las muestras de sangre se recogen en tubos con EDTA como
anticoagulante y, generalmente, deben procesarse inmediatamente (aunque en
algunos casos pueden almacenarse a 4 C). La separacin de los eritrocitos respecto de los leucocitos se realiza va lisis preferencial de los eritrocitos. Despus se lisan los glbulos blancos con un detergente aninico fuerte, para
proseguir con un proceso general de aislamiento de ADN (ver Anexo de Mtodos en el CD).
El gran tamao del ADN procedente de clulas de mamferos dificulta su
aislamiento y purificacin. La eleccin del mtodo de extraccin de ADN
debe estar determinada por el uso que se har de la muestra, ya que el tamao final del material purificado diferir segn el mtodo. De esta forma,
los mtodos muy drsticos tienden a romper el ADN en molculas de bajo
peso molecular (<50 kpb) y, si bien pueden ser tiles para realizar la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y, en algunos casos, para su aplicacin en la tcnica de Southern blot, no son tiles para otros propsitos,
como la construccin de libreras genmicas. Se utilizarn mtodos ms suaves para obtener fragmentos de ADN superiores a 200 kpb, que son apropiados para otros propsitos, en general, para la purificacin del ADN de
clulas de mamferos.
Los mtodos generales de purificacin de ADN pueden dividirse en dos fases:
292
Un procedimiento suave de lisis de las clulas y de solubilizacin del ADN.

Una segunda fase con uno o varios mtodos enzimticos o qumicos de
eliminacin de contaminantes (protenas, ARN y otras macromolculas).
El proceso de extraccin con fenol:cloroformo se basa en la capacidad que
tienen los disolventes orgnicos de desnaturalizar y precipitar las protenas en disolucin, mientras que no afectan en este sentido a los cidos nucleicos. Se ha
desarrollado un gran nmero de procesos basados en la utilizacin de fenol, as
como varios aditivos que aumentan la inhibicin de la actividad nucleasa o sirven para reforzar una desproteinizacin ms eficaz por parte del fenol (por
ejemplo, el cloroformo). La mayora de mtodos lleva acoplado un proceso de lisis celular utilizando un detergente, que adems permite la disociacin de los
complejos protena-nucletidos (Figura 20.7).
Figura 20.7. Esquema de aislamiento de
ADN total utilizando un mtodo de
extraccin con fenol:cloroformo.
El aislamiento y la concentracin de ADN y ARN en disoluciones acuosas

se realiza primero eliminando los lpidos de la muestra mediante una extraccin con fenol:cloroformo (50:50), seguida de la precipitacin con etanol de
los cidos nucleicos, que se encuentran en la fase acuosa. En el proceso de extraccin con disolventes orgnicos, las protenas son desnaturalizadas y se re293
Captulo 20
parten en la fase orgnica o entre la interfase orgnica/acuosa. Durante la precipitacin con etanol, en presencia de sales, el fenol y el cloroformo residual
se mantienen en disolucin, mientras que los cidos nucleicos, en forma de
sal, forman un precipitado blanco que puede recogerse fcilmente por centrifugacin.
Con este procedimiento se pueden precipitar eficazmente fragmentos de cidos nucleicos y oligonucletidos mayores de 15 nucletidos. La concentracin
de cidos nucleicos debe ser al menos de 10 g/mL; pueden precipitarse concentraciones ms bajas, pero el proceso en tal caso no es cuantitativo. Para precipitar bajas concentraciones de cidos nucleicos deben incubarse las muestras,
una vez aadido el etanol (u otro alcohol usado para la precipitacin), a 20 C
(o en hielo seco) durante 4 horas o durante toda la noche y centrifugar a continuacin durante 30 minutos para recoger el precipitado. En la figura 20.7 puede
observarse un ejemplo tpico de extraccin de cidos nucleicos despus de mantenerlos en disolucin acuosa. Para separar el ADN del ARN contaminante, se
trata con ARNasas, enzimas que degradan especficamente el ARN, obtenindose as una muestra pura de ADN.
Mtodos de aislamiento y purificacin de ARN

El aislamiento de ARN no difiere en gran medida del aislamiento del ADN, aunque presenta un problema importante: la posible contaminacin de las muestras
con ribonucleasas, que son enzimas muy estables, y que por tanto pueden degradar el ARN de la muestra. Las disoluciones acuosas que se utilizan en el proceso deben estar tratadas con DEPC (dietilpirocarbonato), que inactiva a las
ARNasas. En la figura 20.8 puede verse un protocolo con elementos tpicos para
el aislamiento de ARN. Los protocolos de purificacin y aislamiento de ARN suelen involucrar la lisis celular en un entorno qumico que provoque la desnaturalizacin de las ARNasas; para ello se utilizan normalmente detergentes fuertes,
soluciones caotrpicas y otros agentes desnaturalizantes de protenas. El ARN es
entonces separado del resto de componentes celulares. El tipo de clula y el uso
posterior que se pretenda dar al ARN determinan el proceso de aislamiento
apropiado.
La lisis de las clulas se puede realizar por diferentes mtodos, entre los que
se puede mencionar:
la utilizacin de detergentes,
la lisis celular utilizando tiocianato de guanidinio, que es el mtodo ms
utilizado para la extraccin de ARN de tejidos.
Normalmente, pueden utilizarse determinados sistemas para favorecer la lisis
de las clulas, manuales o mecnicos, como el sistema Potter-Elvejhem o como
el homogeneizador mecnico de palas. Adems, los procesos de extraccin pueden ser de ARN total o ARN especficos (citoplasmtico, nuclear u organular). La
extraccin de ARN total no requiere una separacin de un orgnulo celular especfico antes de la lisis u homogeneizacin, pudindose realizar el proceso de
extraccin sin un fraccionamiento previo de las clulas.
Los mtodos de aislamiento de ARN explotan sus diferencias qumicas con el
ADN. Controlando el pH se puede forzar a que el ADN tenga afinidad por una
fase fenlica y el ARN por una fase acuosa, ya que el ARN es ms soluble en di294

Figura 20.8. Esquema de aislamiento de
ARN total utilizando un mtodo de
extraccin en el que se incluye tiocianato
de guanidinio. El reactivo bsico es el
TriPure (desarrollado por la empresa
Roche), que contiene fenol y tiocianato de
guanidinio.
soluciones acuosas al poseer un grupo hidroxilo ms, en posicin 2c, y al estar

constituido nicamente por una hebra.
Las extracciones clsicas con fenol:cloroformo han sido reemplazadas por los
mtodos en que, adems de fenol y cloroformo, se incluye tiocianato de guanidinio. ste es un agente caotrpico en el que tanto el catin como el anin que
forma son fuertes agentes caotrpicos, lo que permite una rpida inactivacin
celular de las ARNasas durante la lisis celular.
Un ejemplo de este mtodo se muestra en el Anexo de Mtodos del CD y en
la figura 20.8.
El resultado del aislamiento y purificacin de ARN es una mezcla compleja de
ARNs (ARNm, ARNt, ARNr). La utilizacin de cromatografas de resinas-oligo(dT)
permite purificar los ARNm, debido a que stos presentas colas de poli(A).
El fraccionamiento de ARN utilizando oligo(dT) celulosa es una tcnica de
aislamiento que aplica mtodos de afinidad. Se utiliza una columna de celulosa
295
Captulo 20
que presenta unidas cadenas de oligo(dT), las cuales podrn interaccionar con
las colas de poli(A) de los ARNm (Figura 20.9). El ARN en disolucin acuosa se
carga en la parte superior de la columna de celulosa oligo(dT) con un tampn
que posee una elevada concentracin de sal (por ejemplo un tampn TrisEDTA-SDS con NaCl). Los ARNm maduros son retenidos en la columna y pueden eluirse con un tampn adecuado (por ejemplo, mediante un tampn
Tris-EDTA).
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN

DE CIDOS NUCLEICOS
Figura 20.9. Unin de ARNm maduros a
una columna de oligo(dT) para su
purificacin.
Determinacin por espectrofotometra

El ADN o el ARN se pueden cuantificar midiendo su absorcin de luz ultravioleta a 260 nm en un espectrofotmetro. Deben usarse cubetas de cuarzo, ya que
las cubetas de plstico, normalmente empleadas en cuantificaciones espectrofotomtricas, absorben luz en la regin UV del espectro a la que se realiza la medicin de absorbancia de cidos nucleicos.
Para realizar este tipo de medidas se toma una alcuota de unos 5 PL de disolucin purificada de ADN o de ARN, y se diluye con agua hasta completar la
capacidad del volumen de la cubeta de cuarzo (entre 0,5 y 1 mL). A continuacin se procede a leer la absorbancia a 260 nm. Para comprobar la posible contaminacin con protenas, se lee tambin la absorbancia (A) a 280 nm y se
mide la relacin de A260/A280. Si esta relacin es prxima a 1,8 es probable que
la absorcin se deba mayoritariamente a la presencia de cidos nucleicos; si la
relacin es inferior a 1,6, es probable que exista una importante cantidad de
otros compuestos que acten como contaminantes, como protenas (debido a
los aminocidos aromticos), fenol residual u otros compuestos orgnicos; y si
la relacin es superior a 2,0 indica una probable degradacin de los cidos nucleicos purificados o una posible contaminacin con determinadas sustancias,
segn la procedencia de la muestra. Para calcular la concentracin se multiplica
la absorbancia medida a 260 nm por diferentes factores segn se trate de ADN,
de ARN o de un oligonucletido:
ADN: A260 u 50 Pg/mL
ARN: A260 u 40 Pg/mL
Oligonucletido: A260 u 30 Pg/mL
Mtodo de tincin con bromuro de etidio
Figura 20.10. Se muestra la estructura de

la molcula de bromuro de etidio y cmo
se intercala entre las bases nitrogenadas
del ADN.
296
El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente que se intercala entre las bases del ADN (Figura 20.10). Al producirse dicha unin, cambian las propiedades
de fluorescencia del bromuro de etidio, incrementndose de forma muy importante su emisin fluorescente en presencia de ADN (Figura 20.11). La fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de ADN presente. No obstante, es
un mtodo poco sensible y, adems, no es especfico del ADN, ya que el ARN
tambin interacciona con el bromuro de etidio; la interferencia del ARN puede
eliminarse tratando las muestras con ARNasa.

Figura 20.11. Espectro de emisin
fluorescente del bromuro de etidio en
ausencia (negro) y en presencia (gris) de
ADN, tras absorcin de radiacin
electromagntica. El bromuro de etidio
puede absorber luz dentro de la regin
del visible (con un mximo de absorcin
sobre los 515 nm); no obstante, presenta
tambin una intensa banda de absorcin
en la zona del ultravioleta prximo,
siendo muy frecuente su excitacin, para
su uso en experimentacin, por absorcin
de radiacin electromagntica a 280 nm.
Mtodo del cido diamino benzoico (DABA)

para la determinacin de ADN
En el mtodo del cido diamino benzoico (DABA) se provoca la hidrlisis de los
desoxirribonucletidos, y las desoxirribosas libres reaccionan con el DABA dando un compuesto fluorescente (Figura 20.12), de manera que la fluorescencia
producida es proporcional a la concentracin de ADN presente en la muestra
(ver Anexo de Mtodos en el CD).
Figura 20.12. Reaccin del cido diamino
benzoico con el ADN para la formacin
de un fluorforo.
297
Tcnicas de hibridacin y PCR

INTRODUCCIN
PROCESO DE HIBRIDACIN
Formacin y separacin de la doble hebra de ADN
Medio de hibridacin
DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN
Preparacin de las sondas: produccin y marcaje
Produccin de sondas
Tipos de marcaje
Inmovilizacin de la muestra
Hibridacin y lavados
Cuantificacin
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
Fundamento de la PCR
Diseo de las tcnicas de PCR
Medio de reaccin
Etapas de la PCR
Visualizacin de los productos
RT-PCR
298
21
INTRODUCCIN
Los cidos nucleicos difieren entre s, principalmente, en la secuencia de nucletidos, por lo que se han desarrollado tcnicas capaces de determinar dicha secuencia o parte de ella. El principio de estas tcnicas se fundamenta en el
proceso de formacin de la doble hlice del ADN, ya que las dos hebras de
ADN se unen por el establecimiento de puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas (ver captulo 20). La complementariedad de bases entre dos secuencias de ADN permite que se forme la doble hlice (Figura 21.1). Si se consigue
sintetizar en el laboratorio un fragmento de ADN con una secuencia de bases
complementaria a un segmento determinado de un cido nucleico, puede utilizarse este fragmento (conocido con el nombre de sonda) para realizar un reconocimiento especfico del ADN que quiere estudiarse. Este proceso de
reconocimiento requiere un sistema que posteriormente permita la visualizacin
o cuantificacin de la unin entre el cido nucleico a estudiar y la sonda. El proceso de reconocimiento y unin de un cido nucleico y un fragmento complementario se conoce con el nombre de hibridacin.
Uno de los problemas ms importantes en el estudio de los cidos nucleicos
suele ser el hecho de no disponer de cantidad suficiente de muestra de cidos
nucleicos como para ser detectada. En este sentido, la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), que combina tcnicas enzimticas con tcnicas de hibridacin, permite amplificar la cantidad de ADN muestra y as facilita el estudio de
los cidos nucleicos cuando se dispone de muy poca muestra de partida.
Figura 21.1. Estructura de la doble hebra

de ADN. Se estabiliza por el
establecimiento de puentes de hidrgeno
entre las bases nitrogenadas del interior
de la doble hebra.
PROCESO DE HIBRIDACIN
Como ya se ha comentado, el fundamento de las tcnicas de hibridacin se encuentra en la complementariedad de las bases nitrogenadas, al establecerse
puentes de hidrgeno entre la adenina y la timina (dos puentes de hidrgeno) y
la citosina y la guanina (tres puentes).
299
Captulo 21
Formacin y separacin de la doble hebra de ADN

Tanto la formacin de la doble hlice de ADN, como la separacin de las dos
hebras (su desnaturalizacin), se encuentran influenciadas por la temperatura. En
la figura 21.2 se puede ver cmo se produce el proceso de desnaturalizacin del
ADN en funcin de la temperatura, representando la absorcin de luz U.V. a
260 nm (mximo de absorcin de los cidos nucleicos). Esta absorbancia es un
indicador del estado de desnaturalizacin del ADN, puesto que tiene mayor capacidad de absorbancia si est desnaturalizado (formando hebras simples) que si
est en estado bicatenario. El proceso de formacin de la doble hebra de ADN
por el establecimiento de los enlaces de hidrgeno es cooperativo. La forma sigmoidea de la curva indica que las interacciones entre los pares de bases unidas
mediante puentes de hidrgeno y apiladas son interacciones cooperativas. Estas
interacciones cooperativas se distorsionan progresivamente durante la desnaturalizacin (fusin) hasta que las dos hebras se separan completamente y, a partir
de ese momento, no se observa ningn cambio posterior en la absorcin. La
temperatura a la cual el ADN se encuentra semidesenrollado (es decir, la mitad
del ADN total de la muestra se encuentra en forma de doble hlice y la otra mitad en forma de cadenas separadas) se conoce con el nombre de temperatura de
fusin o Tm (T melting) del ADN.
Figura 21.2. Curva de desnaturalizacin
del ADN. A la temperatura Tm, la mitad
del ADN se encuentra en forma de doble
hebra y la otra mitad en forma de
cadenas separadas.
La temperatura de fusin se encuentra determinada por la composicin de

las bases del ADN, ya que los apareamientos AT requieren menor cantidad de
energa para su separacin que los apareamientos GC (debido a que stos se establecen mediante tres puentes de hidrgeno), de manera que cuanto mayor sea
el numero de bases G y C, mayor ser la temperatura de fusin (Figura 21.3).
Una vez separadas, las dos hebras se pueden renaturalizar, es decir, volver a
unirse en una doble cadena. Si una muestra de ADN fundido o desnaturalizado
(con las hebras separadas) se enfra lentamente, la absorcin de luz ultravioleta
por la disolucin en que se encuentra dicho ADN disminuye, indicando que las
hebras complementarias de ADN se han apareado de nuevo. La renaturalizacin
tiene lugar a cualquier temperatura por debajo de la temperatura de fusin, Tm,
pero es caractersticamente ms rpida a 20 C por debajo de dicha Tm (Figura
21.4). El proceso de renaturalizacin requiere que la muestra de ADN fundida
sea enfriada lentamente; si se enfra rpidamente, las cadenas polinucleotdicas
forman masas enmaraadas y la renaturalizacin es mucho ms lenta.
300

Figura 21.3. Curva de desnaturalizacin
trmica del ADN. Diferencias segn la
composicin en bases nitrogenadas.
La renaturalizacin ser ms rpida cuanto mayor sea el nmero de pares de

bases que persistan unidas entre las dos cadenas. An en el caso de una separacin total de las dos hebras, puede producirse la renaturalizacin, pero de forma
mucho ms lenta, ya que las hebras debern alinearse previamente de forma
adecuada; teniendo en cuenta que slo una de las alineaciones es la correcta, la
velocidad inicial de renaturalizacin ser lenta.
Medio de hibridacin
El proceso de hibridacin se encuentra influenciado por la composicin del medio donde tiene lugar la reaccin. El medio de hibridacin es un punto clave, ya
que determina el entorno en el que se da la reaccin fsica de interaccin entre
los cidos nucleicos a estudiar y sus sondas (Figura 21.5). La composicin del
medio y la temperatura de la hibridacin determinan el rigor (condiciones estrictas de apareamiento de las bases). Aunque la unin por complementariedad de
cada par de bases est termodinmicamente favorecida, pueden darse uniones
errneas entre las dos hebras durante el proceso de hibridacin. Los hbridos
con errores de apareamiento en las bases son termodinmicamente menos estables que los hbridos con un perfecto acoplamiento; por lo tanto los primeros
pueden desnaturalizarse (separarse) a ms bajas temperaturas que los segundos.
Las condiciones de la reaccin de hibridacin definen el nmero de errores
en el apareamiento de bases que pueden tolerarse en la estructura doble, es decir, el rigor de la reaccin de hibridacin. Un elevado rigor permite pocos errores
de apareamiento, mientras que en condiciones de bajo rigor se permite un mayor nmero de errores en el apareamiento de las bases. Las condiciones de rigor
tienen influencia en la sensibilidad del mtodo, de manera que un elevado rigor
puede provocar una disminucin de la sensibilidad. Por el contrario, condiciones
de bajo rigor aumentan la sensibilidad y disminuyen la especificidad. As pues,
un punto clave en una tcnica de hibridacin es determinar las condiciones de
rigor que permiten buena especificidad con el mximo de sensibilidad; estas
condiciones se consiguen modificando la composicin del medio de hibridacin
y los procesos de lavado para eliminar la sonda no unida.
En el proceso de hibridacin hay una primera fase de nucleacin, en la que
se da la formacin de un pequeo nmero de uniones entre las bases de las dos
hebras, siendo sta la etapa limitante de la reaccin; esta fase va seguida de una
Figura 21.4. Proceso de desnaturalizacin

y renaturalizacin del ADN.
Figura 21.5. Tpico horno para la

hibridacin de cidos nucleicos, con un
tubo de hibridacin en su interior que
contiene una membrana con cidos
nucleicos fijados y una solucin de
hibridacin.
301
Captulo 21
rpida formacin de la doble hebra por complementariedad de las secuencias.

Muchos factores influyen en la velocidad de la reaccin. Un incremento de la
concentracin de sonda generalmente incrementa la velocidad de reaccin. Sin
embargo, en sondas de doble hebra, las elevadas concentraciones de stas provocan una autohibridacin (uniones sonda-sonda complementaria), lo que eventualmente limitara la velocidad de hibridacin con la secuencia diana. La
composicin en bases tiene un pequeo efecto en la velocidad de hibridacin:
las molculas con un alto contenido de G y C tienden a una hibridacin ms rpida con sus secuencias complementarias. La temperatura tambin influye en la
velocidad de reaccin: por encima de la Tm, la tendencia a que la hibridacin
tenga lugar es baja; en cambio, a temperaturas por debajo de este punto, la velocidad de hibridacin se incrementa y alcanza el mximo a (20-25) C por debajo de la Tm. La presencia de polmeros de elevado peso molecular en el
medio, como el sulfato de dextrano, provoca un incremento de la velocidad de
hibridacin, posiblemente incrementando la concentracin efectiva de la sonda
en la mezcla.
La composicin del medio de hibridacin se determina de manera emprica.
Los ingredientes de este medio se establecen de manera que modulen el rigor
de la reaccin y favorezcan la interaccin especfica de los cidos nucleicos mediante puentes de hidrgeno ms que por interacciones entre cargas. Los componentes pueden ser muy variados, pero incluyen:
tampones
sales
agentes desnaturalizantes del ADN y del ARN, como la formamida
polmeros de elevado peso molecular
portadores de ADN o de ARN
ingredientes mgicos diseados para reducir el ruido de fondo (background), como albmina y ficoll
La composicin exacta vara dependiendo de la aplicacin, y se encuentran
disponibles muchas mezclas comerciales, en las que simplemente se debe aadir
una sonda especfica.
Las condiciones de elevado rigor (como una baja concentracin de sales, una
alta concentracin de formamida y alta temperatura) requieren que se d una
alta complementariedad entre las bases para que tenga lugar una hibridacin
efectiva. Cuando el rigor del ensayo de hibridacin es bajo (incrementando la
concentracin de sales, con bajos niveles de formamida y a temperaturas bajas)
se incrementa el nmero de errores en el acoplamiento de bases que puede tolerarse en la estructura de doble hlice.
Una vez establecidos los hbridos, las muestras se lavan para eliminar las interacciones no deseadas. Estos lavados se realizan con disoluciones de sales en las
que se modula la concentracin; en este sentido, es muy frecuente modular la
concentracin del tampn que se conoce como tampn de citrato sdico y cloruro sdico (SSC, compuesto por NaCl 0,15 M y citrato trisdico 0,015 M a
pH = 7). El control de estas condiciones se refiere a la fuerza del tampn de SSC
(por ejemplo, 2 u SSC; 0,1 u SSC). Tambin se aade SDS, en la hibridacin y
los lavados.
En la prctica, los ensayos de hibridacin se disean de forma ms o menos
emprica. El tiempo de hibridacin, la temperatura de hibridacin y la concentra302
cin de la sonda son las variables ms frecuentemente ajustadas en el ensayo. Otro

aspecto que tambin debe calcularse son las condiciones de lavado, una vez realizado el proceso de hibridacin. En general, las condiciones se ajustan para establecer el punto de mxima hibridacin especfica con el mnimo de hibridacin no
especfica, y la sensibilidad suficiente para poder determinar el cido nucleico.
DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN

La unin de la sonda con el cido nucleico aporta la especificidad del mtodo
pero, al igual que ocurre con otros mtodos, es necesario acoplar un sistema
para su deteccin, lo que se consigue marcando la sonda (con radiactividad, con
fluorescencia, con un antgeno como la digoxigenina o la biotina, etc.) (Figura
21.6). De la misma manera que ocurre con los mtodos inmunolgicos, se debe
conseguir distinguir, adems, entre la sonda unida y la sonda libre, lo que se logra inmovilizando el cido nucleico a estudiar, de manera que la sonda no unida
pueda eliminarse por lavados. Los puntos clave de cualquier mtodo de este
tipo son la preparacin, procedencia y tipo de marcaje de la sonda, el sistema
de inmovilizacin de la muestra, el proceso de hibridacin, los lavados que se
realizan a continuacin y la cuantificacin de la cantidad de sonda hibridada.
Figura 21.6. Diferentes sistemas de
marcaje de sondas.
303
Captulo 21
Preparacin de las sondas: produccin y marcaje

Las sondas son fragmentos de ADN o de ARN de secuencia conocida (complementaria a parte del ADN o del ARN que quiere estudiarse), marcados en uno o
ms de sus grupos. Estos fragmentos de ADN o de ARN pueden obtenerse digiriendo fragmentos de ADN (sonda genmica), por clonacin (recombinantes), o
por sntesis (sntesis de oligonucletidos). El marcaje puede ser radiactivo o no
radiactivo.
Produccin de sondas
Las sondas genmicas fueron las primeras en ser utilizadas en las tcnicas de hibridacin; consisten en fragmentos de cidos nucleicos extrados de organismos
y purificados. La naturaleza qumica de la sonda (ADN o ARN, de hebra doble o
simple) depende de la estructura del genoma del organismo a partir del cual se
purifica dicha sonda.
Las sondas recombinantes, en cambio, se obtienen por clonacin: se insertan segmentos de ADN de secuencia conocida en un vector plasmdico, construido de forma que puede crecer y amplificarse en una bacteria. Los pequeos
ADNs plasmdicos se pueden separar fcilmente del genoma bacteriano basndose en su tamao.
Existen vectores que contienen una regin promotora de ARN adyacente a la
secuencia de ADN insertada, lo que permite la generacin de transcritos de ARN
a partir del ADN insertado. En este proceso de sntesis de ARN se copia una nica hebra. Controlando la orientacin de la regin insertada en relacin con la regin promotora, se permite la produccin de transcritos en sentido sense (es
decir, como el ARNm) o antisentido antisense (es decir, secuencia complementaria al ARNm).
Este tipo de sondas tiene varias ventajas. Entre ellas, se puede destacar que es
imposible la autohibridacin, debido a que no se generan dos sondas complementarias sino una nica sonda, de manera que se favorece al mximo la interaccin con la secuencia diana. Otra ventaja es que la fraccin de sondas no
unidas a su diana, en caso de las sondas de ARN, puede ser eliminada a travs
de digestin con ARNasas, que degradan las hebras simples pero no las hbridas.
No obstante, son sondas ms difciles de obtener y el ARN es mucho ms lbil
que el ADN.
La reaccin en cadena de la polimerasa permite tambin obtener sondas,
diseando condiciones de amplificacin de una zona determinada del ADN del
organismo de inters (que se puede conocer utilizando las bases de datos de los
bancos genmicos). El proceso de amplificacin puede utilizarse tambin para
marcar la sonda. En este caso, se obtienen sondas de ADN doble, con las limitaciones que ello supone, ya que puede producirse una autohibridacin.
Los sondas cortas, segmentos cortos (14-45 bases) de desoxirribonucletidos
de ADN oligonucletidos se pueden sintetizar qumicamente con una secuencia de bases determinada. La secuencia para la construccin de estas sondas puede conocerse a partir de bases de datos de uso pblico, y de programas
informticos que permiten encontrar secuencias con un mximo de homologa
con el cido nucleico a estudiar y un mnimo de homologa con otros cidos nucleicos. Estas sondas pueden ser sense o antisense. Un gran nmero de casas comerciales ofrece servicios para la sntesis de estos segmentos.
304
Tipos de marcaje
Las sondas pueden marcarse por diferentes procedimientos, dependiendo del
tipo de sonda. En las figuras 21.7 y 21.8 se presentan diferentes tipos de procesos por los que se puede realizar el marcaje segn el tipo de sonda (ADN, ARN u
oligonucletido).
Figura 21.7. Distintos sistemas de sntesis
de sondas marcadas.
Figura 21.8. Distintos mecanismos

utilizados para incorporar un marcaje a
las sondas, segn los diferentes tipos de
sondas.
Inmovilizacin de la muestra
Un aspecto importante de las tcnicas de hibridacin es la posibilidad de poder distinguir entre la sonda unida y la no unida. Se consigue por diferentes procedimientos, y uno de los ms utilizados consiste en inmovilizar la muestra de cido nucleico
sobre una membrana de nitrato de celulosa o de niln. Estas membranas, cargadas
positivamente, presentan una importante capacidad de unin de cidos nucleicos,
al encontrarse stos cargados negativamente; adems, las uniones pueden darse co305
Captulo 21
valentemente si las membranas se mantienen durante 30 minutos a 110 C o se exponen a radiacin ultravioleta. Al estar las molculas de ADN o de ARN diana inmovilizadas sobre una membrana, puede someterse dicha membrana a sucesivos
lavados, de forma que la fraccin de sonda unida no podr eliminarse por los lavados (se encontrar unida por puentes de hidrgeno a las molculas de cidos nucleicos que, a su vez, se encontrarn unidas fuertemente a la membrana), mientras
que la sonda no unida s se eliminar en estos lavados.
Hibridacin y lavados
La siguiente etapa consiste en proceder a la hibridacin de las membranas con la
sonda diseada para tal efecto. Para tal fin, la membrana es incubada en las condiciones adecuadas de tiempo, temperatura y cantidad de sonda que permitan una
buena sensibilidad en la determinacin del cido nucleico diana, con un mximo
de especificidad. Antes de la incubacin de la membrana con la sonda, se suele incubar la membrana con el medio de hibridacin (que contiene, entre otros, compuestos como la albmina y el ficoll, as como algn tipo de ADN por ejemplo, de
esperma de salmn, que se unen a los diferentes cidos nucleicos de manera inespecfica) y sin la sonda. De esta manera se bloquea la posibilidad de que puedan
darse uniones inespecficas de la sonda (que se aadir en el siguiente paso) sobre
la membrana, disminuyendo el ruido de fondo de la determinacin. Una vez realizada la incubacin con la sonda, la membrana se lava con tampones de distintas
concentraciones; la finalidad de los primeros lavados es eliminar la sonda no unida,
mientras que los lavados finales se ajustan para eliminar la sonda unida de manera
inespecfica a la membrana. Tanto las condiciones de hibridacin como las de lavado se determinan empricamente para cada cido nucleico diana y tipo de sonda.
Cuantificacin
Una vez hibridada la membrana, se procede a la cuantificacin de la sonda unida. El
procedimiento va a depender del tipo de marcaje de la sonda. sta puede haberse
marcado con los sistemas de cuantificacin tradicionales: capacidad de formacin de
color, radiactividad, fluorescencia o marcaje con antgenos para que, acoplando tcnicas inmunoqumicas, se pueda cuantificar la cantidad de sonda unida.
El marcaje radiactivo de las sondas est ampliamente difundido al ser el sistema ms sensible. El istopo ms utilizado es el 32P, pero tambin pueden usarse
el 125I, el 35S, el 14C y el 3H. El marcaje radiactivo de la sonda se realiza a travs
de la incorporacin enzimtica de nucletidos radiactivos a sta.
Cuando se utiliza un marcaje radiactivo, una vez producida la hibridacin y lavada
la membrana de niln, es suficiente con exponer la membrana a un film de rayos X en
la oscuridad, para impresionar la placa fotogrfica. Tambin pueden utilizarse sistemas
de captacin de radiactividad. La cantidad de radiactividad emitida es proporcional a
la cantidad de cido nucleico diana presente en la membrana (Figura 21.9).
Hay diferentes sistemas de marcaje no radiactivos que permiten la determinacin de cidos nucleicos. Entre ellos, se puede destacar la utilizacin de marcaje con fluorescencia y el uso de antgenos, que han sustituido, en muchos
casos, la utilizacin de sondas radiactivas. Uno de los mtodos ms usados es el
de la digoxigenina. La digoxigenina es una molcula de origen vegetal que pue306

Figura 21.9. Sistema de documentacin y
anlisis de geles comercializado por BioRad para la deteccin de muestras en
geles de agarosa y de acrilamida. Se
muestra, adems, un ejemplo del tipo de
imgenes que se pueden obtener.
de ser detectada por el uso de anticuerpos especficos anti-digoxigenina. Puede

incorporarse a la sonda, por ejemplo, introduciendo durante la sntesis de sta
nucletidos de uracilo (UTP) unidos a esta molcula (Figura 21.10).
Figura 21.10. Estructura de la dUTPdigoxigenina, la UTP-digoxigenina y la
ddUTP-digoxigenina.
307
Captulo 21
Una vez hibridada la membrana con la sonda marcada con UTP-digoxigenina, se procede al revelado inmunolgico con un anticuerpo anti-digoxigenina
marcado con fosfatasa alcalina, que se unir a la sonda (Figura 21.11). La seal
se puede detectar mediante mtodos similares a los empleados en la tcnica de
Western blot, utilizando sustratos de la fosfatasa alcalina capaces de producir color o luminiscencia a ser transformados por la enzima (ver captulo 15). En el
caso de que el sustrato d color, ste se desarrolla directamente sobre la membrana; mientras que si el sustrato es quimioluminiscente, la seal puede ser detectada con pelculas de rayos X o detectores de quimioluminiscencia.
deteccin de una sonda marcada con
digoxigenina. desarrollado por Boehringer
Mannheim (Roche). A: el anticuerpo antidigoxigenina ha sido marcado
directamente con una molcula que
presenta color, o fluorescencia o
luminiscencia. B: el anticuerpo antidigoxigenina ha sido marcado con una
enzima, cuya accin sobre un sustrato
produce una reaccin luminiscente.
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR

Fundamento de la PCR
Uno de los problemas ms serios que presenta el estudio de los cidos nucleicos
es la poca disponibilidad de muestra y la baja concentracin a la que a veces se
encuentra, lo que complica en muchos casos su estudio. Este problema ha podido solventarse, como en otras ocasiones, a travs de la aplicacin en el laboratorio de conocimientos en bioqumica y del uso de enzimas. Para poder dividirse,
la clula necesita duplicar todo su material gentico, de forma que cada una de
las dos clulas hijas recibe una copia exacta del ADN de la clula progenitora. In
vivo, la incorporacin de nucletidos a cada una de las cadenas que forman el
ADN genmico, se cataliza por la ADN polimerasa. El conocimiento de este proceso de replicacin sirvi de punto de partida para el desarrollo de tcnicas in
vitro que han permitido sintetizar cadenas de ADN complementarias a un ADN
molde.
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction)
es un mtodo que permite la amplificacin in vitro de fragmentos de ADN a partir de una cadena de ADN molde. La PCR utiliza la capacidad de un oligonucletido para hibridar con una zona especfica de ADN monocatenario, lo que
permite la posterior extensin de la cadena de oligonucletido a partir de su extremo 3c-hidroxilo, en una reaccin catalizada por una ADN polimerasa. Cuando se seleccionan oligonucletidos complementarios a determinadas secuencias
de las dos hebras del ADN a estudiar, de tal forma que delimiten una regin de
inters, se puede obtener de manera exponencial una amplificacin del nmero
de copias de esa regin (Figura 21.12).
Se eligen dos primers o cebadores distintos, de forma que se siten en cada
uno de los dos extremos 3c que delimitan la regin del ADN a amplificar. Uno
308

Figura 21.12. Representacin del principio
de ampliacin del nmero de copias de
una regin de ADN de inters por el
mtodo de la PCR. Mediante la
realizacin de sucesivos ciclos de
replicacin de la regin, se consigue
incrementar el nmero de copias de esa
regin de forma exponencial.
de los primers hibrida con una de las dos cadenas de la doble hlice de la molcula de ADN, y el otro primer con la otra cadena. A partir de ah, tras la unin
de los primers, una ADN polimerasa puede ya realizar la sntesis de ADN (en direccin 5c o 3c), amplificndose el nmero de copias de la regin del ADN delimitada por los primers.
Diseo de las tcnicas de PCR

El medio de reaccin para proceder a la replicacin del ADN en un tubo de ensayo requiere que se aadan los cosustratos de la ADN polimerasa, el molde de
ADN, los desoxirribonucletidos (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), los cebadores o primers (que permiten que la ADN polimerasa pueda iniciar la sntesis de ADN enlazando los diferentes desoxirribonucletidos, y que adems delimitan la regin
o las regiones de inters), y por ltimo la enzima ADN polimerasa. De esta manera, la enzima podr realizar la replicacin de la doble hebra de ADN. Una
cuestin esencial para iniciar la replicacin es que la doble hebra se encuentre
separada y los primers se hayan unido a los sitios donde son complementarios.
La separacin de la doble hebra de ADN puede conseguirse aumentando la
temperatura del medio hasta unos valores de (90-95) C, lo que conlleva la fusin o desnaturalizacin del ADN. Sin embargo, la unin de los primers a las secuencias complementarias de ADN molde requiere una bajada de la
temperatura. Adems, se ha de considerar que las enzimas son muy sensibles a
temperaturas elevadas, lo que provoca su desnaturalizacin y perdida de actividad. Considerando todo lo dicho anteriormente, el mtodo podra desarrollarse
en varias etapas (Figura 21.13):
309
Captulo 21
Figura 21.13. Ejemplo de un proceso
tpico de PCR, con sus distintas etapas.
Introducir la muestra en el tubo de reaccin y proceder a la separacin de

las dos hebras del ADN por aumento de la temperatura (95 C) (Desnaturalizacin).
Enfriar la muestra y aadir al medio de incubacin el tampn adecuado
para la enzima, los sustratos de la reaccin (desoxirribonucletidos, primers, etc.) y la enzima. Dejar que se produzca la hibridacin o annealing
de los primers sobre las dos hebras molde (Annealing).
Dejar que la ADN polimerasa proceda a ir aadiendo los desoxirribonucletidos siguiendo la secuencia especificada por el molde (Elongacin o
extensin).
Volver a aumentar la temperatura para separar las dos hebras de ADN
(Desnaturalizacin).
Enfriar y aadir la enzima de nuevo para poder realizar otro ciclo de duplicacin, debido a que dicha enzima se habr desnaturalizado por accin
de la temperatura.
Figura 21.14. Un termociclador tpico.
310
Si se repiten n veces los ciclos, se consigue amplificar la cantidad de ADN.

Sin embargo, un problema importante lo constituye tener que ir aadiendo la
enzima en cada ciclo de amplificacin, lo que, aparte de grandes problemas tcnicos, supone tambin un gasto importante.
Los problemas tcnicos se solucionan con la utilizacin de ADN polimerasas
que son estables a elevadas temperaturas y mediante el diseo de equipos que
permiten el control automtico de la subida y bajada de la temperatura (termocicladores) (Figura 21.14), pudindose realizar reacciones de PCR con una mxima precisin y en un tiempo mnimo. De esta manera se ha desarrollado un
sistema que permite la amplificacin del ADN a travs de tres etapas (desnaturalizacin, annealing y elongacin), que se repiten n veces.
Medio de reaccin
En el tubo de reaccin deben encontrarse presentes todos los elementos que permitan la reaccin en cadena de la polimerasa: tampn adecuado, primers, la polimerasa, desoxirribonucletidos, etc. El medio debe tamponarse al pH ptimo de
la enzima y normalmente contiene Mg2+, necesario para la actividad enzimtica.
Primers. Son necesarios debido a que la ADN polimerasa no es capaz de incorporar de novo nucletidos a una cadena sencilla de ADN, sino que requiere de
una regin de doble cadena precedente para poder iniciar la sntesis. Los primers son secuencias de ADN monocatenario de pequeo tamao, de entre 15 y
30 bases aproximadamente, y que presentan complementariedad de bases con
regiones del ADN molde prximas a cada uno de los extremos del fragmento
que interesa amplificar.
Los primers se disean a partir del conocimiento de la secuencia que se quiere
amplificar. Se eligen de manera que se evite la complementariedad de bases entre
los propios primers, o entre stos y secuencias del ADN de regiones distintas a la que
se quiere estudiar, ya que provocara la aparicin de productos distintos al deseado.
Otro aspecto importante en el diseo de primers es el valor de su temperatura de fusin (Tm), ya que sirve de referencia a la hora de fijar una temperatura
de hibridacin o annealing. Siempre que sea posible, debe escogerse una pareja
de primers cuyas Tm sean similares entre s, con lo que se asegura la eficacia y
especificidad del perfil de temperaturas empleado en el ciclo. Existen varios programas de ordenador en el mercado que facilitan el diseo de primers, comparando secuencias y calculando valores de Tm.
La concentracin de los primers en el medio no debe ser limitante. Normalmente para un medio de reaccin que contenga 1 Pg de ADN genmico, la relacin entre primers y secuencia diana debe ser de 108 a 1. nicamente de esta
forma puede asegurarse que cuando las dos cadenas de ADN de la muestra se
separan, se unan antes a los primers que entre s. Sin embargo, si esta relacin es
demasiado alta (un exceso de primers), existe una mayor probabilidad de amplificaciones inespecficas y de que se formen dmeros entre los primers. En caso de
que la relacin sea demasiado baja, la cantidad final de producto obtenido puede disminuir considerablemente.
ADN polimerasa. En el mercado hay diferentes ADN polimerasas que pueden
actuar a elevadas temperaturas. Una de ellas es la Taq polimerasa, que se
aisl del microorganismo termfilo Thermus aquaticus. Esta enzima es capaz
de soportar las temperaturas de desnaturalizacin del ADN aplicadas en la
PCR (95 qC), aunque a esta temperatura su vida media es de 40 minutos. El
uso de polimerasas termoestables en la PCR hace posible que se pueda llevar
a cabo la reaccin completa en un nico tubo que contenga todos los reactivos necesarios.
La fidelidad de la Taq polimerasa, es decir, la frecuencia de error en la incorporacin de nucletidos, depende de la concentracin de Mg2+ y de dNTPs, as
como del equilibrio de concentraciones entre ellos. En la velocidad de sntesis
de la Taq polimerasa intervienen una serie de factores entre los que destacan la
temperatura, la concentracin de Mg2+ y de detergentes, la estructura secundaria del molde y la concentracin de dNTPs. Cuando la temperatura est entre
72 qC y 80 qC, la Taq es capaz de incorporar 150 nucletidos por segundo, encontrndose en el mximo de su actividad. La velocidad disminuye al descender
311
Captulo 21
la temperatura, de forma que a 55 qC son incorporados 24 nucletidos/segundo

y nicamente 1,5 nucletidos/segundo a 37 qC.
La cantidad ptima de enzima oscila entre 0,5 y 2,5 unidades de enzima
para un volumen de reaccin de 50 L.
dNTPs. Los dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) deben aadirse en cantidad suficiente para que puedan darse todas las reacciones de extensin durante todos
los ciclos de amplificacin, de manera que en ningn momento estos sustratos
sean limitantes en el proceso de amplificacin.
Etapas de la PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa presenta varias etapas, que cumplen
funciones diferentes en el proceso; algunas etapas se dan una sola vez, mientras
que otras se repiten n veces, dando lugar a los ciclos de amplificacin.
1) La primera etapa es la de desnaturalizacin de la muestra por aumento
de la temperatura y se realiza una sola vez. La muestra de ADN se desnaturaliza para dar lugar a hebras simples. El calentamiento inicial a unos
95 qC durante un perodo de 3 a 5 minutos es suficiente para desnaturalizar por completo el ADN genmico, el cual, en las condiciones en las que
tiene lugar la reaccin, ya no vuelve a renaturalizarse por completo.
2) En la siguiente etapa, fase de hibridacin o annealing, se disminuye la
temperatura del medio para que pueda darse la unin de los primers a
sus dianas en el ADN. La temperatura de esta fase se determina empricamente, segn las caractersticas de los primers, y suele oscilar entre
(5060) C. La temperatura se selecciona de manera que el procedimiento tenga el mximo de especificidad y sensibilidad. Las temperaturas bajas aumentan la sensibilidad del proceso (se favorece la unin de
los primers al ADN), al tiempo que la especificidad disminuye (pueden
darse ms uniones errneas); las temperaturas elevadas disminuyen la
sensibilidad (menor unin primers-ADN) y aumentan la especificidad. El
xito de la unin de los primers va a depender del nmero de copias del
ADN diana y de si hay tiempo suficiente para que stos se unan a su secuencia complementaria. El tiempo de hibridacin de los primers suele
ser de entre 20 y 40 segundos, aunque depende del tipo de termociclador que se utilice.
3) Fase de extensin. La temperatura del medio se incrementa hasta alcanzar la temperatura optima de funcionamiento de la ADN polimerasa; en el caso de Taq polimerasa, esta temperatura se encuentra
alrededor de los 72 C. Normalmente suele dar buen resultado la utilizacin de tiempos de elongacin que van desde 20 segundos, para fragmentos de 500 pares de bases, hasta 40 segundos, para fragmentos por
encima de 1,2 kilobases.
4) Fase de desnaturalizacin. Las hlices de ADN formadas se separan por
aumento de la temperatura a (90-95) C. Esta fase de desnaturalizacin
suele ser ms corta que la primera y depende del diseo de cada PCR.
Las etapas 2), 3) y 4) se repiten n veces, hasta alcanzar la amplificacin deseada. A la hora de disear el programa de ciclos en el termociclador hay que
312
tener en cuenta la vida media de la polimerasa a (90-95) qC (que es, por ejemplo, de 40 minutos para la Taq polimerasa) y que una exposicin excesiva al calor puede provocarle daos que incrementen la incorporacin errnea de
nucletidos. Adems, un nmero excesivo de ciclos puede ocasionar que en los
ltimos ciclos falte alguno de los sustratos de la reaccin en el medio, como primers y dNTPs. En algunos casos, los productos de amplificacin pueden comenzar a actuar como primers en los ciclos sucesivos dando lugar a productos de
mayor peso molecular.
5) Fase de extensin final. Normalmente tras el ltimo ciclo se aade un
perodo de incubacin a 72 C de 5-12 minutos, para permitir que se
complete la elongacin de los productos que hayan quedado parcialmente sintetizados.
Visualizacin de los productos

Los productos de la amplificacin por PCR pueden detectarse como una nica
banda, si las condiciones han sido las apropiadas, en un gel de agarosa teido
con bromuro de etidio (Figura 21.15), aunque a veces se observan tambin otras
bandas secundarias, correspondientes a amplificaciones inespecficas.
Figura 21.15. Visualizacin del resultado
de una PCR en un gel de agarosa teido
con bromuro de etidio.
RT-PCR
La RT-PCR permite la amplificacin de ARN mediante una modificacin del
mtodo que requiere la inclusin de una etapa previa de retrotranscripcin del
ARN a su ADN complementario (ADNc) y que est catalizada por una transcriptasa inversa. Los diferentes ARNs presentes en la muestra son desnaturalizados
a 90 C, destruyendo de esta manera las estructuras secundarias, tanto intracatenarias como intercatenarias y favoreciendo que todo el ARN pueda ser retrotranscrito a ADNc. La retrotranscripcin tiene lugar por la accin de una
retrotranscriptasa viral en un medio de reaccin que contiene primers, una
mezcla de dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) e inhibidores de ARNasas. Se pueden utilizar diferentes enzimas para la reaccin de transcripcin inversa. Los
tres tipos de primers que se emplean para la retrotranscripcin son los
oligo(dT)12-18, los hexanucletidos al azar (mezcla de hexmeros de nucletidos que se unen al azar a distintas zonas del ARN) y secuencias especficas de
oligonucletidos.
El ADNc sirve como molde de la posterior reaccin en cadena de la polimerasa (Figura 21.16).
313
Captulo 21
Figura 21.16. Ejemplo de un proceso
tpico de RT-PCR.
314
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos Individuales

INTRODUCCIN
SEPARACIN ELECTROFORTICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS
ESTUDIO DEL ADN
Uso de enzimas de restriccin y Fingerprinting
Southern blot
Anlisis de RFLPs
Reaccin en cadena de la ligasa (LCR, Ligase Chain Reaction)
Secuenciacin del ADN
Mtodos de fragmentacin qumica
Mtodo del terminador de cadena
ESTUDIO DEL ARN

Dot blot y Slot blot
Northern blot
RT-PCR
316
22
INTRODUCCIN
Los mtodos de aislamiento y purificacin de cidos nucleicos se basan en el tamao de estas biomolculas y su solubilidad en distintos disolventes. Por otra
parte, la necesidad de determinar un cido nucleico especfico ha provocado el
desarrollo de tcnicas basadas en las diferencias de los cidos nucleicos entre s.
Estas diferencias se basan en el tamao (en el caso de las diferentes especies de
ARN) y, sobre todo, en la secuencia (en el caso tanto del ADN como del ARN).
Las diferencias de tamao y el hecho de que adems estas molculas presenten
carga, posibilitan su separacin por tcnicas electroforticas. Sin embargo, no
permiten una plena identificacin de los cidos nucleicos, lo que ha llevado a
desarrollar nuevas tcnicas basadas en su secuencia de bases que utilizan enzimas de restriccin o tcnicas que explotan la capacidad de hibridacin.
SEPARACIN ELECTROFORTICA
DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Una vez aislados los cidos nucleicos del resto de biomolculas que los acompaan en las muestras biolgicas, debe determinarse cada uno en particular. Al
ser molculas cargadas y con tamaos significativos pueden separarse por electroforesis. En el caso de las largas molculas de ADN, es necesario realizar previamente una ruptura en fragmentos. Esta ruptura se puede realizar por mtodos
qumicos, aunque el conocimiento del funcionamiento de las enzimas de restriccin (nucleasas que digieren el ADN tras reconocer secuencias especficas de
nucletidos) ha provocado una sustitucin del uso de los reactivos qumicos por
el uso de estos mtodos enzimticos.
El tamao de los fragmentos de ADN y de los ARNs es grande, por lo que
normalmente se utiliza como soporte de electroforesis de cidos nucleicos la
agarosa, que permite la separacin de estas molculas por cribado molecular, ya
que mantienen una relacin carga/masa constante. Se consiguen buenas separa317
Captulo 22
Figura 22.1. Diferentes concentraciones

de agarosa en relacin con el rango de
tamao de cidos nucleicos para
conseguir una separacin ptima de stos
por electroforesis.
Figura 22.2. Gel de agarosa en el que se

ha realizado una electroforesis de ARN
total eucariota, visualizado por adicin de
bromuro de etidio. Las bandas ms
gruesas corresponden a los ARN
ribosmicos 28S (arriba) y 18S (abajo). En
el carril de la izquierda se observan las
bandas correspondientes a un marcador
de peso molecular.
ciones en geles de agarosa debido a que este tipo de geles presenta un rango de
tamaos de poro que permite la discriminacin de cidos nucleicos por tamao
molecular; los geles de poliacrilamida, en cambio, al tener tamaos de poro ms
pequeo no permiten una buena separacin de los fragmentos grandes, aunque
son utilizados en determinados casos para separar cidos nucleicos de pequeo
tamao, como ocurre durante los procesos de secuenciacin.
En la figura 22.1 se muestra la concentracin adecuada de agarosa a emplear
segn el rango de tamaos de los cidos nucleicos a separar.
Los cidos nucleicos pueden visualizarse tiendo los geles con diferentes colorantes: bromuro de etidio, Sybr Green, Sybr Gold, etc. (Figura 22.2).
ESTUDIO DEL ADN

Los mtodos de estudio del ADN generalmente estn encaminados a determinar diferencias en las secuencias del ADN. Muchas veces se centran en analizar
la presencia de mutaciones en un gen determinado o en estudiar las similitudes
entre el ADN de distintos individuos. Se han utilizado diferentes estrategias
para el estudio de los cidos nucleicos, de las que veremos algunas las ms destacadas.
Uso de enzimas de restriccin y Fingerprinting

El ADN puede fragmentarse por la accin de productos qumicos o por la accin
de las enzimas de restriccin. Estas enzimas se encuentran en una gran variedad
de especies bacterianas y se caracterizan por reconocer secuencias especficas
de nucletidos y producir cortes caractersticos en ellas (Figura 22.3).
Figura 22.3. Ejemplos de enzimas de

restriccin de tipo II, procedentes de
distintas bacterias, y que cortan el ADN
en secuencias especficas. Las zonas
oscuras y claras delimitan en dnde se
produce la ruptura de la doble hlice.
El ADN purificado de una muestra puede incubarse con diferentes enzimas

de restriccin, que producirn cortes especficos sobre l, provocando la formacin de fragmentos de ADN de diferentes tamaos que pueden ser separados
por electroforesis en geles de agarosa. Si se est partiendo de muestras de ADN
de distintos individuos, en los geles de agarosa se podrn observar bandas correspondientes a fragmentos de tamao caracterstico. El anlisis de estas bandas, exclusivas para cada individuo, por este tipo de tcnica se conoce como
Fingerprinting y tiene una importante aplicacin en pruebas de paternidad y en
318
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
medicina forense, as como en el estudio de la presencia de polimorfismos, etc.

(Figura 22.4).
Southern blot
La especificidad de los mtodos de hibridacin puede incrementarse procediendo a una separacin previa de los diferentes cidos nucleicos. En el caso del
ADN, la tcnica de Southern blot permite detectar la presencia de una secuencia
o regin especfica y, en algunos casos, la deteccin de mutaciones. La tcnica
de Sourthern blot se basa en transferir a una membrana el ADN separado por
electroforesis, para su posterior anlisis.
Estos tipos de ensayos requieren una purificacin y fragmentacin previa del
ADN. El ADN purificado por alguno de los mtodos vistos en el captulo 20 es fragmentado por la accin de una o varias enzimas de restriccin, que reconocen secuencias especficas de nucletidos (ver figura 22.3). Una vez fragmentado el ADN,
los diferentes segmentos son separados por electroforesis en geles de agarosa.
Los fragmentos de ADN son transferidos a membranas de nitrocelulosa o de
niln cargadas positivamente para inmovilizarlos, de manera que pueda procederse despus a la hibridacin de las membranas con sondas especficas (Figura
22.5 y ver captulo 21). De esta forma, se consigue no slo una mayor sensibilidad en la tcnica, sino que adems se puede estudiar, por ejemplo, la presencia
de secuencias caractersticas de los individuos estudiados (Figura 22.6).
Figura 22.4. Fingerprinting de ADN de

semillas de soja. Se muestra el anlisis
realizado sobre el ADN de 5 muestras de
la generacin F2 procedentes del cruce
entre semillas de soja (A y B). Las flechas
indican polimorfismos entre dos
progenitores (A y B) que se segregan a la
generacin F2.
Figura 22.5. Esquema general de cmo se

realiza un Southern blot, utilizando una
sonda marcada radiactivamente.
Cuando se realiza el proceso de hibridacin de los fragmentos de ADN con

una sonda en concreto, se puede detectar y analizar de forma especfica una secuencia o regin del ADN de inters, mientras que si solamente se realiza una
separacin electrofortica de los fragmentos, no podran diferenciarse fragmentos con tamaos parecidos, que quedaran superpuestos tras la separacin.
Anlisis de RFLPs
La presencia de una determinada mutacin en un gen o en el promotor del mismo puede determinarse mediante el anlisis de los Restriction Fragment Length
Figura 22.6. Resultado de una prueba

forense por anlisis de Fingerprinting,
posterior transferencia de los fragmentos
de ADN a una membrana y revelado. Las
bandas obtenidas para el sospechoso 2
coinciden con las de una prueba obtenida
en la escena del crimen.
319
Captulo 22
Polymorphisms (RFLPs), es decir, por la formacin de fragmentos de ADN de distinto tamao cuando son tratados con una endonucleasa especfica. La endonucleasa se elige segn la mutacin a estudiar origine o elimine dianas para ella.
Una vez tratadas las muestras con la enzima, si por ejemplo, se crean nuevas
dianas para la endonucleasa debido a la mutacin, las muestras que presenten la
mutacin darn lugar a fragmentos ms pequeos que las que no la presenten.
As, una separacin electrofortica de los fragmentos producidos permitir identificar la presencia de la mutacin o no en los individuos estudiados (Figura
22.7). Uno de los problemas que suelen darse a la hora de aplicar este tipo de
tcnicas es la escasa disponibilidad de muestra, lo que puede solventarse realizando una PCR previa para amplificar el nmero de copias de la zona del ADN
que quiera estudiarse.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo para estudiar determinados polimorfismos del gen de la UCP1.
Figura 22.7. Visualizacin en gel de
agarosa (teido con bromuro de etidio) de
los resultados de diferentes muestras
estudiadas por un anlisis de RFLPs para
el estudio de un polimorfismo concreto
del gen de la UCP1. El ADN no mutado
tiene una diana para BclI, as, los
homocigotos de alelo A presentan dos
fragmentos, mientras que la mutacin en
los homocigotos con el alelo G slo
presentarn un fragmento. En estos
individuos, la presencia de la sustitucin
de una A por una G provoca la
desaparicin de la diana de la
endonucleasa. En los heterocigotos
(presentan la mutacin en uno de los
alelos del gen) aparecen tres fragmentos:
dos fragmentos para el alelo A y uno para
el alelo G.
320
Reaccin en cadena de la ligasa

(LCR, Ligase Chain Reaction)
El desarrollo de la tcnica conocida como reaccin en cadena de la ligasa (LCR o
Ligase Chain Reaction) no slo posibilita la amplificacin del nmero de copias
de un fragmento de ADN, sino que tambin permite determinar la presencia de
mutaciones puntuales. El fundamento de esta tcnica es la utilizacin de la reaccin catalizada por la enzima ligasa, que une fragmentos de ADN adyacentes
complementarios a una secuencia diana, cuando los nucletidos adyacentes a
unir forman un emparejamiento de bases perfecto con la secuencia diana. As
pues, en esta tcnica se utilizan oligonucletidos que presentan complementariedad de bases con dos zonas adyacentes de la secuencia diana. Si los oligonucletidos se hibridan correctamente con el ADN diana, la ligasa puede unirlos.
La ligasa utilizada ha de ser termoestable.
El proceso de amplificacin/deteccin por LCR consta de distintas fases. En
primer lugar, el ADN diana se desnaturaliza por calor y, a continuacin, se disminuye la temperatura para que cuatro oligonucletidos complementarios a la
regin de inters (dos por cada cadena), y que se siten en posiciones adyacentes, hibriden con dicha regin. En el siguiente paso, la ligasa termoestable nicamente ligar nucletidos adyacentes si stos forman una unin perfectamente
complementaria con la diana. Los productos de un ciclo de hibridacin y accin de la ligasa se convierten en dianas del siguiente ciclo, de forma que el encadenamiento sucesivo de ciclos de desnaturalizacin, hibridacin y unin por
la ligasa provoca el incremento exponencial del nmero de fragmentos del cido nucleico de inters (Figura 22.8). Resulta evidente que el tamao de la regin del ADN a amplificar vendr limitado por el tamao de los
oligonucletidos que se utilicen.
Basta la presencia de una nica base que provoque que la hibridacin no sea
correcta en el punto de unin de los oligonucletidos, para que la ligasa no pueda actuar de forma eficiente (Figura 22.9), y por lo tanto no se producir la amplificacin. Esto permite detectar la presencia de una mutacin puntual.
Normalmente se disea el mtodo para que el extremo 3c de los oligonucletidos upstream coincida con la posicin de la base alterada.

de la LCR para la amplificacin de ADN y
la deteccin de mutaciones puntuales.
Tras la desnaturalizacin del ADN diana
por calor, cuatro oligonucletidos
complementarios hibridan con sus dianas.
La ligasa termoestable unir de forma
covalente nicamente nucletidos
adyacentes que sean perfectamente
complementarios a su diana. De esta
manera, por la repeticin de sucesivos
ciclos de desnaturalizacin, hibridacin y
accin de la ligasa, la regin de inters se
amplificar de forma exponencial.

de la LCR para la amplificacin de ADN y
la deteccin de mutaciones puntuales.
Tras la desnaturalizacin del ADN diana
por calor, cuatro oligonucletidos
complementarios hibridan con sus dianas.
En el caso de la presencia de una
mutacin, esta hibridacin no es perfecta
y la ligasa termoestable no unir
covalentemente nucletidos adyacentes.
De esta manera, a diferencia de lo que se
muestra en la figura 22.8, por la
repeticin de sucesivos ciclos de
desnaturalizacin, hibridacin y accin de
la ligasa, la regin de inters no se
amplificar.
321
Captulo 22
Secuenciacin del ADN

El estudio de las diferencias entre las secuencias de los cidos nucleicos puede
realizarse por secuenciacin. La secuenciacin de los cidos nucleicos requiere
la fragmentacin y el aislamiento de la zona del ADN que se quiere estudiar, y la
posterior ordenacin de los fragmentos individuales.
En la ruptura en fragmentos del ADN se utilizan enzimas de restriccin que
producen cortes en secuencias concretas.
La secuenciacin del ADN puede realizarse por mtodos qumicos o por
mtodos enzimticos. Los primeros se fundamentan en la ruptura caracterstica
de los fragmentos al someterlos a determinados tratamientos qumicos, mientras que los segundos se basan en sintetizar fragmentos de todos los tamaos
posibles.
Mtodos de fragmentacin qumica

En el mtodo de Maxam y Gilbert, el fragmento de ADN que quiere estudiarse
se marca (por ejemplo, con radiactividad 32P o con digoxigenina), normalmente en el extremo 5c.
Una vez marcado, el ADN es fragmentado con diferentes compuestos qumicos que reconocen la presencia de un nucletido con una base nitrogenada determinada. Por ejemplo, si se secuencia el siguiente fragmento marcado en el
extremo 5c con 32P:
32
P AATTCCGGCCAATACG, un reactivo que conduzca a la ruptura de los

desoxirribonucletidos antes de C, provocara la formacin, aparte de fragmentos no marcados, de los siguientes fragmentos marcados:
32
P AATTCCGGCCAATA
32
P AATTCCGGC
32
P AATTCCGG
32
P AATTC
32
P AATT
Estos fragmentos pueden separarse en geles de poliacrilamida, que admiten
la separacin de ADN en fragmentos pequeos al tener un tamao de poro menor que los geles de agarosa, pudindose llegar a discriminar fragmentos que se
diferencien en tan slo una base en su longitud. Al estar marcados, puede realizarse una visualizacin de los resultados, lo que permitir determinar las posiciones de la base C en la secuencia del fragmento de ADN.
Hay diferentes compuestos qumicos que cortan el ADN por los distintos desoxirribonucletidos, tal y como se detalla a continuacin:
Corte por delante de dATP y dGTP. Si los residuos de purina son previamente metilados por dimetilsulfato A en N(3) y G en N(7), y en
medio cido, un tratamiento posterior con piperidina producir la ruptura de la hebra de ADN tanto antes de un desoxirribonucletido con A
como con G.
Corte por delante de dGTP. El tratamiento con dimetilsulfato y piperidina, pero no en medio cido, provoca la ruptura de la hebra tan slo delante de un residuo con G.
322
Corte por delante de dCTP y dTTP. El tratamiento con hidracina, seguido

con el de piperidina, provoca el corte de las cadenas de ADN por delante
de los residuos con C y con T.
Corte por delante de dCTP. Si se trata el ADN con hidracina en NaCl
1,5 M, nicamente los residuos con C reaccionan de manera apreciable, de
manera que la piperidina tan slo corta por delante de los residuos con C.
As pues, para llevar a cabo el proceso de secuenciacin, cada muestra se
distribuye en cuatro tubos, y en cada uno de ellos se trata con uno de los reactivos que originan los cuatro diferentes cortes. Estos reactivos se aaden de forma
limitada, para que no se produzca la ruptura total de la cadena, de manera que
es posible obtener residuos de todos los tamaos. Al estar marcadas las molculas en el extremo 5c con 32P, una autorradiografa despus de la separacin electrofortica de los resultados de cada tubo en geles de poliacrilamida permite
visualizar bandas de todos los tamaos y la identificacin de cada uno de los residuos (Figura 22.10).
Figura 22.10. Esquema del proceso que se
lleva a cabo para la secuenciacin
qumica de un fragmento de ADN y
resultado tras electroforesis en gel de
poliacrilamida de los fragmentos
obtenidos. En este tipo de electroforesis
se pueden discriminar tamaos de
fragmentos de ADN que se diferencien en
longitud en un nico nucletido, de forma
que se puede establecer la secuencia, a
partir de la movilidad en el gel de los
fragmentos obtenidos con cada
tratamiento.
Comparando los resultados obtenidos en cada uno de los cuatro carriles se

puede determinar la secuencia del fragmento de ADN, ya que segn donde aparezca la banda (dependiendo del tratamiento), se puede determinar cul es el
nucletido que ha sido atacado y, a partir del orden de movilidad, se puede establecer el orden secuencial de las bases.
Cuando la cadena de ADN se rompe en dCTP, aparece banda en los carriles
correspondientes a los tratamientos destinados a cortar por delante de dCTP y
de dCTP + dTTP. As pues, indica C. Del mismo modo:
323
Captulo 22
Indica T: banda nicamente en el tratamiento para dCTP + dTTP

Indica G: banda en el tratamiento para dGTP y dATP + dGTP
Indica A: banda nicamente en el tratamiento para dATP + dGTP
Mtodo del terminador de cadena
Figura 22.11. Sntesis de una cadena de

ADN y utilizacin de anlogos de
nucletidos de tipo
didesoxirribonucletidos (ddNTP).
324
Este mtodo consiste en sintetizar fragmentos de ADN de distintos tamaos utilizando como molde el ADN que se pretende secuenciar. La ADN polimerasa requiere un primer para realizar la sntesis de los fragmentos y, a partir del grupo 3c
del primer, coloca el desoxirribonucletido (dNTP) correspondiente para ir sintetizando la cadena de ADN complementaria al molde. La clave del mtodo radica en que la adicin de dNTP puede detenerse si en vez de dNTP se aade un
anlogo del tipo didesoxirribonucletido (ddNTP) que, al no tener grupo OH
en 3c, no permite la adicin posterior de un nuevo desoxirribonucletido, interrumpindose de esta manera la elongacin de la cadena (Figura 22.11). Este
proceso se conoce con el nombre del procedimiento de Sanger.
De esta forma, para llevar a cabo el proceso de secuenciacin, se preparan
cuatro tubos y, en cada uno de los tubos, se aade una mezcla de los cuatro
dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y un ddNTP diferente. Por ejemplo, en el primero se aade ddATP, en el segundo ddCTP, en el tercero ddGTP y en el cuarto
ddTTP. El didesoxirribonucletido se aade en pequea proporcin para permitir que, durante la sntesis de cadenas de ADN, se incorpore la mayora de las
veces el dNTP y no el terminador de la reaccin (ddNTP), aunque de vez en
cuando se aadir el terminador, lo que permite que se generen fragmentos de
todos los tamaos posibles. Una vez finalizada la reaccin, los productos de
cada uno de los cuatro tubos se separan por electroforesis en geles de poliacrilamida. Las molculas del primer pueden estar marcadas, o bien se pueden marcar los ddNTPs, pudindose visualizar los resultados; este marcaje puede ser por
radiactividad, fluorescencia o con antgenos como la digoxigenina (ver captulo
21). Las bandas obtenidas en cada uno de los cuatro carriles de la electroforesis
permiten determinar la secuencia del fragmento estudiado (Figura 22.12).
Una modificacin del mtodo de secuenciacin consiste en marcar los primers
con una molcula fluorescente, de un color caracterstico y diferente para cada uno
de los cuatro tubos de reaccin, de manera que el color se asocie a la presencia de
un didesoxirribonucletido. De esta forma, es posible identificar, por el color de la
seal fluorescente emitida, el desoxirribonucletido correspondiente al final de cada
hebra. En esta versin del mtodo, los productos de cada uno de los cuatro tubos se
mezclan y se separan por electroforesis capilar con un sistema lser de deteccin,
que separa los distintos fragmentos, detectando diferencias en un nico desoxirribonucletido en la longitud de sus cadenas. Como cada ddNTP se asocia a un color, se
puede identificar de forma automtica el desoxirribonucletido correspondiente al final de la cadena de cada fragmento y, segn el orden de salida de la columna capilar
de los fragmentos, se puede establecer la secuencia. El sistema se encuentra conectado a un ordenador para facilitar la determinacin de la secuencia.
Otra posibilidad es que sean los ddNTPs los que estn marcados con un
cromforo diferente, de manera que pueden realizarse los cuatro tipos de adiciones en un mismo tubo y posteriormente realizar la electroforesis capilar identificando el ddNTP al final de cada cadena de salida por su color de emisin
fluorescente. En la figura 22.13 pueden observarse las diferentes etapas del mtodo diseado de esta manera.

secuenciacin de ADN por el mtodo del
terminador de cadena.
Figura 22.13. Sistema de secuenciacin de

ADN por el mtodo del terminador
incorporando un marcaje fluorescente
diferente a cada uno de los ddNTPs.
325
Captulo 22
ESTUDIO DEL ARN

El estudio del ARN est encaminado, muchas veces, a determinar su expresin, es decir, la cantidad de mensajero que se produce en una situacin determinada.
Dot blot y Slot blot
Figura 22.14. Resultados de un Dot blot y

un Slot blot.
Estas tcnicas permiten estudiar la cantidad de ARNm que hay en un momento

determinado inmovilizando las muestras sobre una membrana de nitrato de celulosa o de niln cargada positivamente. Los cidos nucleicos se unen por interacciones electrostticas, pudiendo formar enlaces covalentes con la membrana
por exposicin al calor o a radiacin ultravioleta.
El nombre de la tcnica viene dado por la forma que adquieren las muestras
sobre la membrana. En un principio, las muestras se aplicaban directamente sobre la membrana, adquiriendo formas aleatorias. Con el tiempo, se han ido desarrollando sistemas que aplican las muestras de forma regular, bien sea
redondeada (dot punto) o alargada (slot ranura) (Figura 22.14).
La matriz slida sobre la que se transfieren las especies de ARN permite que
se procesen al mismo tiempo mltiples muestras, permitiendo as tambin que
todas las etapas del proceso se produzcan de forma simultnea sobre las diferentes muestras y, por tanto, minimizando la variabilidad en el tratamiento de stas
(Figura 22.15). El hecho de que las muestras a estudiar y las muestras control
estn expuestas a los mismos reactivos y condiciones en todo momento, incrementa la consistencia interna del ensayo y permite la comparacin de los resultados entre las diferentes muestras.
Figura 22.15. Esquema de montaje para

realizar la transferencia de ARN a una
membrana en un proceso de Slot blot.
Las muestras de ARN desnaturalizado se depositan en los pocillos y, mediante un sistema de generacin de vaco, son succionadas, de forma que el ARN
queda depositado sobre la membrana (cargada positivamente), todo ello con
ayuda del sistema de Slot (o Dot) blotting. A continuacin, se fijan covalentemente las muestras de ARN a la membrana por calor o por exposicin a radiacin ultravioleta.
La membrana, con las muestras de ARN inmovilizadas, se incuba con una solucin de prehibridacin con la finalidad de bloquear las posibles uniones posteriores inespecficas de la sonda sobre la membrana. Una vez bloqueada la
membrana, se incuba con solucin de hibridacin, que contiene la sonda disuelta. Las condiciones en que se desarrollan los siguientes pasos del procedimiento
son claves en el establecimiento del rigor del mismo: temperatura de hibridacin
326
(cuanto mayor temperatura, mayor grado de rigor y menor sensibilidad), concentracin de la sonda (el rigor disminuye a medida que aumenta la concentracin
de sonda, mientras que la sensibilidad aumenta) y tiempo de hibridacin.
El rigor no slo se controla durante el proceso de hibridacin, sino tambin
durante los lavados posteriores con una solucin de lavado de fuerza inica relativamente elevada y a temperatura ambiente, para eliminar los restos de sonda
no unida. A continuacin, se realizan lavados a mayor temperatura y utilizando
una solucin de fuerza inica menor, con el fin de eliminar la sonda unida de
forma inespecfica. En general, cuanto menor sea la fuerza inica de este medio
de lavado y mayor la temperatura a la que se lleva a cabo, mayor ser el grado
de rigor aplicado, aunque tambin supone una disminucin de la sensibilidad;
de forma que la temperatura y fuerza inica del medio se suelen establecer de
manera emprica para conseguir una sensibilidad y especificidad adecuada a
cada sonda y mensajero que quiera determinarse.
Dependiendo del marcaje de la sonda, se proceder a su deteccin. En el
Anexo de Mtodos del CD se presenta un procedimiento por slot blot para la
determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm de UCP1. En este
ejemplo, se utiliza una sonda marcada con dUTP-digoxigenina, por lo que la
deteccin del marcaje ha de ser de tipo inmunolgico. Para detectar visualmente los resultados, se aade, en este caso, el sustrato de la enzima conjugada al
anticuerpo (fosfatasa alcalina) (Figura 22.16). Mediante la reaccin catalizada
por la enzima sobre este sustrato, se produce luz. Gracias a este proceso de luminiscencia, que suele manifestarse durante una serie de horas, puede recogerse la seal emitida por impresin de sta sobre un film fotogrfico. La impresin
dejada por cada seal se cuantifica posteriormente con ayuda de un fotodensitmetro.
catalizada por la fosfatasa alcalina a partir
del sustrato CDP-Star (Roche).
Northern blot
Del mismo modo que la tcnica de transferencia Southern blot proporciona
una herramienta til para el estudio del ADN, la tcnica de Northern blot permite realizar estudios, de forma similar, sobre molculas de ARN, teniendo interesantes aplicaciones en el estudio de la expresin de genes. Los ensayos de
Southern blot y de Northern blot no slo aportan informacin del peso molecular de productos hibridados, sino que permiten, adems, determinar la cantidad de stos, al menos de forma semicuantitativa, siendo muy til su uso. La
tcnica Northern blot resulta de gran utilidad en experimentos en los que se
comparan diferencias de expresin en el nivel del ARN mensajero de un determinado gen entre distintas muestras, presentando una ventaja adicional sobre la tcnica de Dot blot (o de Slot blot): una mayor especificidad, al
producirse una separacin previa de las diferentes molculas de ARN por su
tamao molecular antes de proceder a la hibridacin con la sonda marcada.
327
Captulo 22
Figura 22.17. Esquema representativo del

tipo de agrupaciones que pueden
producirse entre molculas de ARN:
intramoleculares e intermoleculares.
Figura 22.18. Imgenes obtenidas en un

experimento de Northern blot. Se observa
la imagen (izquierda) del ARN total teido
inespecficamente con un agente con
capacidad de intercalacin en los cidos
nucleicos y fluorescente (el bromuro de
etidio). Ntese que las bandas
mayoritarias son las constituidas por los
ARN ribosmicos, 28 S y 18 S. En la
imagen derecha se observan las tpicas
bandas que aparecen tras la deteccin de
una especie de ARN concreta, el ARNm
de la UCP1 (de un peso molecular
determinado), detectada con una sonda
especfica marcada y habindose
empleado el sistema de visualizacin
correspondiente al marcaje. Tambin se
muestra la imagen de deteccin del ARNr
18S, que puede utilizarse como control
de carga y transferencia.
328
As, la tcnica de Southern blot fue modificada de forma que pudiera adaptarse al estudio de las diferentes molculas de ARN, introduciendo la separacin
por electroforesis en geles de agarosa, y desarrollndose la tcnica denominada Northern blot.
Una caracterstica diferencial importante a tener en cuenta es que el
ARN presenta estructura monocatenaria y el ADN bicatenaria. Evidentemente, el hecho de que el ARN sea monocatenario no quiere decir que carezca de enlaces por puentes de hidrgeno entre bases complementarias en
su estructura, ya que determinadas secuencias de una molculas de ARN
pueden hibridar con fragmentos de la misma molcula, o con otras molculas de ARN (Figura 22.17). Estas asociaciones entre molculas de ARN dificultaran su estudio por tcnicas de hibridacin, ya que, si hay molculas
de ARN hibridando entre s, se reducen las posibilidades de hibridacin con
las sondas marcadas. Por otro lado, estas agrupaciones interferiran en la separacin de molculas de ARN en los geles de agarosa, provocando una migracin ms rpida o ms lenta, con lo que los resultados no seran
fcilmente interpretables ni comparables entre distintas muestras y experimentos. As pues, al disear la tcnica del Northern blot, uno de los objetivos fue eliminar estas interacciones entre las molculas de ARN, de forma
que las molculas se presentaran de forma totalmente lineal antes de realizar la electroforesis. Para ello, se hace uso de agentes desnaturalizantes,
que interfieren en la formacin de enlaces por puentes de hidrgeno, evitando las agrupaciones. Pueden utilizarse agentes como el formaldehdo y
la formamida. En estas condiciones los diferentes ARN se separan por su tamao y no por su forma.
Otro problema que se manifiesta durante la realizacin de la tcnica de
Northern blot es la presencia de ARNasas, por lo que determinadas disoluciones
que se emplean durante el procesamiento de las muestras deben tratarse con
agentes inhibidores de stas, como el DEPC (dietilpirocarbonato), y adems es
conveniente mantener determinadas medidas de precaucin, tales como el uso
de material estril, guantes y pinzas.
Los ARN, una vez separados por electroforesis, deben ser inmovilizados
para proceder a realizar una hibridacin y una posterior deteccin de las especies de inters. As, el ARN se transfiere por capilaridad a membranas de niln
cargadas positivamente. Una vez realizada la transferencia, las especies de
ARN son fijadas sobre la membrana por la formacin de enlaces covalentes
con sta (inducidos por calor o por radiacin UV). El proceso de hibridacin y
de deteccin es el mismo que el descrito en el ejemplo utilizado para explicar
la tcnica de Slot blot. En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo
de Northern blot para la determinacin semicuantitativa de los niveles de
ARNm de UCP1 (Figura 22.18).
RT-PCR
En algunos casos, la determinacin de un ARNm por Northern blot resulta poco
sensible, por lo que puede utilizarse el proceso de amplificacin por PCR (ver
captulo 21), realizando previamente una retrotranscripcin. La RT-PCR es una
tcnica ms sensible, que se puede convertir en una tcnica semicuantitativa e,
incluso, cuantitativa. Uno de los problemas de utilizar la RT-PCR con fines cuantitativos es que resulta difcil controlar las condiciones de amplificacin, por lo
que se recurre a utilizar patrones internos durante el proceso, pudindose tambin utilizar patrones internos y externos en otros casos.
Hay diferentes mtodos que permiten la utilizacin de la RT-PCR con fines
cuantitativos. Se comentarn brevemente dos mtodos que permiten la cuantificacin de los niveles de ARNm de la UCP1; uno es semicuantitativo, mientras
que el otro es de tipo cuantitativo.
En la determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm por RT-PCR se
realiza, en primer lugar, una retrotranscripcin del ARN aislado de la muestra o
muestras de inters por accin de una enzima con actividad retrotranscriptasa
(RT). Se obtiene as el ADN complementario (ADNc), que puede utilizarse como
molde en la posterior reaccin en cadena de la polimerasa. Para controlar las diferencias en el proceso de amplificacin dado entre los distintos tubos de anlisis
(que, como se ha comentado en el captulo 21, vienen determinadas por un
gran nmero de factores), se coamplifica en cada tubo otro ADNc correspondiente a un gen constitutivo (gen que se expresa constantemente debido a la eficiencia de su promotor) que se utiliza como patrn interno del proceso. Para
este segundo gen se utilizan primers que provocan la amplificacin de un fragmento de este gen de una longitud diferente a la longitud del fragmento del gen
que quiere estudiarse, de manera que los productos amplificados en el mismo
tubo puedan separarse y diferenciarse posteriormente mediante electroforesis en
geles de agarosa.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta el procedimiento de forma detallada de la determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm de la UCP1
por RT-PCR, utilizando actina como patrn interno. Los productos de amplificacin son separados por electroforesis en geles de agarosa y visualizados con bromuro de etidio, observndose dos bandas por tubo de amplificacin (Figura
22.19). Los geles son analizados por un sistema de captura de imagen, y la intensidad de cada banda se determina con ayuda de un programa informtico de
cuantificacin.
La determinacin cuantitativa de los niveles de ARNm por RT-PCR se fundamenta en la retrotranscripcin del ARNm salvaje y en la amplificacin de un
fragmento de este gen, junto con la coamplificacin de un patrn interno que se
aade a la muestra. Se utiliza como patrn interno un ARNm mutante para el
mensajero a cuantificar, en el que se ha sustituido una sola base, de manera que
presenta una diana de restriccin que no aparece en la secuencia salvaje. Esto
permite diferenciar el producto del ARNm mutante del ARNm salvaje, tras incubar los productos de la RT-PCR con la enzima de restriccin.
Figura 22.19. Imagen obtenida tras la

separacin electrofortica de productos
de RT-PCR correspondientes a la
coamplificacin de un fragmento del
ADNc del mensajero de la protena UCP1
y un fragmento del ADNc del mensajero
de la actina en diferentes muestras.
329
Captulo 22
Al igual que en otras tcnicas cuantitativas, se utilizan tambin patrones externos, que proporcionan una curva patrn para poder determinar los niveles de
mensajero presentes en la muestra. Los productos amplificados son separados
por electroforesis y se realiza posteriormente un Southern blot y una hibridacin
con una sonda especfica, seguida de un revelado inmunolgico.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta el procedimiento de forma detallada de la determinacin cuantitativa de los niveles de ARNm UCP1, utilizando
un ARNm mutante que presenta una diana de restriccin para HindI, como
patrn interno (Figura 22.20).
Figura 22.20. Imagen obtenida tras la

separacin electrofortica de productos
de RT-PCR correspondientes a la
coamplificacin de un fragmento del
ADNc del mensajero de la UCP1 y un
patrn interno en diferentes muestras.
330
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336
ndice analtico
a
absorbancia, 82
A260/A280, 296
Ac. Vase anticuerpo
aceleracin de la gravedad, 252
acetal, 274
acetato de celulosa, 120, 165, 250
acetilacetona, 239, 241. Fig. 16.20.
acetileno. Fig. 7.1.
acetoacetato, 245. Fig. 16.27.
acetona, 65, 141, 269. Fig. 5.21, 8.5.
fra, 262
cido
4-aminobenzoico, 285. Fig. 19.27.
1-amino-2-naftol-4-sulfnico. Vase
ANS
actico, 68, 168, 171, 220. Fig.
16.1.
araqudico. Fig. 16.1.
araquidnico. Fig. 16.1.
ascrbico, 66
asprtico. Fig. 8.4.
behnico. Fig. 16.1.
benzoico. Fig. 5.22.
bicinconnico. Vase BCA
biliar, 235
butrico. Fig. 16.1.
cprico. Fig. 16.1.
caprlico. Fig. 16.1.
caproico. Fig. 16.1.
clorhdrico, 68
clupanodnico. Vase DPA
decanoico. Fig. 16.1.
desoxirribonucleico. Vase ADN
diamino benzoico. Vase DABA
1-dimetilaminonaftaleno-5sulfnico. Vase DNS
dococenoico. Fig. 16.1.
docosahexanoico. Fig. 16.1.
docosanoico. Fig. 16.1.
docosapentaenoico. Fig. 16.1.
dodecanoico. Fig. 16.1.
eicosanoico. Fig. 16.1.
eicosapentaenoico. Fig. 16.1.

eicosatetraenoico. Fig. 16.1.
eladico. Fig. 16.1.
ercico. Fig. 16.1.
esterico, 237. Fig. 16.1.
etanoico. Fig. 3.5, 16.1.
frmico. Fig. 16.1, 16.23
fosfatdico. Fig. 16.13.
fosfrico, 236
glutmico. Fig. 8.4.
heptadecanoico, 265
hexadecanoico. Fig. 16.1.
hexadecenoico. Fig. 16.1.
hialurnico, 277. Fig. 19.15.
lurico. Fig. 16.1.
lignocrico. Fig. 16.1.
linoleico. Fig. 16.1.
linolnico. Fig. 16.1.
metanoico. Fig. 16.1.
mirstico. Fig. 16.1.
nervnico. Fig. 16.1.
ntrico, 100
nucleico, 289
octadecadienoico. Fig. 16.1.
octadecanoico. Fig. 16.1.
octadecatrienoico. Fig. 16.1.
octadecenoico. Fig. 16.1.
octanoico. Fig. 16.1.
oleico. Fig. 1.10, 16.1.
palmtico, 237. Fig. 16.1.
palmitoleico. Fig. 16.1.
pentadecanoico, 265
pentanoico. Fig. 16.1.
perclrico, 65, 100. Fig. 8.5.
perydico, 242
pcrico. Fig. 8.5.
propanoico. Fig. 16.1.
propinico. Fig. 16.1.
retinoico, 25. Fig. 1.8
ribonucleico. Vase ARN
salicilsulfnico. Fig. 8.5.
silico, 238. Fig. 16.18.
sulfosaliclico, 171
sulfrico, 244, 279

caliente, 123
tetracosanoico. Fig. 16.1.
tetracosenoico. Fig. 16.1.
timnodnico. Vase EPA
tricloroactico. Vase TCA
tngstico, 65
rico, 66
valrico. Fig. 16.1.
cido graso, 232
cromatografa de gases, 264
esterificado, 266. Fig. 18.9.
libre, 266. Fig. 16.24, 18.1, 18.9,
18.10.
metilacin, 264
mtodos enzimticos, 243
monoinsaturado. Vase MUFA
patrn interno, 265
poliinsaturado. Vase PUFA
saturado, 232. Vase SFA
acil-CoA
-oxidasa, 243. Fig. 16.24.
-sintasa, 243. Fig. 16.24.
acilglicerol, 234. Fig. 16.3, 18.1.
acrilamida, 169, 173, 221. Fig. 12.6,
12.7, 12.15.
actividad termognica, 24
adenina, 290. Fig. 3.3, 20.5.
adenosina. Fig. 3.3.
adipocito, 23. Fig. 1.4
ADN, 289, 290. Fig. 3.3, 20.1, 20.2.
complementario. Vase ADNc
conformacin tipo B. Fig. 20.1.
cuantificacin, 296
electroforesis, 317
extraccin con fenol:cloroformo,
293. Fig. 20.7.
hibridacin, 300
molde, 308
mutante. Fig. 22.9.
PCR, 308
polimerasa, 290, 308
purificacin, 292
recombinante, 38
337
ndice analtico
secuenciacin, 322
sonda, 304
tincin, 296
ADNc, 313
adsorbente, 116, 119, 120
adsorcin, 116, 165
aerosol, 37
Ag-Ac
afinidad, 202
avidez, 202
complejo, 203, 205. Fig. 14.5,
14.10.
mltiple, 201
tipo sandwich, 210
especificidad de unin, 201
precipitacin, 202, 203
agarosa, 133, 317. Fig. 9.23, 22.1.
agente
caotrpico, 154. Vase caotrpico y
tambin desnaturalizante
desnaturalizante. Vase
desnaturalizante
etiolgico. Vase etiolgico
infeccioso. Vase infeccioso
oxidante. Vase oxidante
precipitante. Vase precipitante
quelante. Vase quelante
agua, 114. Fig. 9.1, 9.2.
agua total,determinacin, 100
aguja, 61. Fig. 2.5, 4.1.
alanina. Fig. 8.1.
-transaminasa. Vase ALT
albmina, 302, 306. Fig. 15.6.
determinacin, 159
alcanfor, 234
alcaptonuria, 138
alcohol isoproplico, 244
aldolasa. Fig. 15.13.
aldosa, 272
aldosterona. Fig. 16.10.
alergia. Fig. 15.7.
almidn, 120, 276
determinacin, 283. Fig. 19.26.
alosa. Fig. 19.1.
ALT, 225. Fig. 15.13, 15.14.
altrosa. Fig. 19.1.
almina, 120
amida, 150
amilasa, 283. Fig. 15.13.
amiloglucosidasa, 280
amilopectina, 168, 276. Fig. 19.11.
amilosa, 168, 276. Fig. 19.10.
amino, 105, 150
aminocido, 105. Fig. 8.1, 8.2, 8.3, 8.4.
analizador automtico de, 136, 146.
Fig. 10.15.
cadena lateral, 106
dansil derivado, 139. Fig. 10.10.
determinacin por mtodos
qumicos, 107
dinitrofenil derivado. Vase DNPderivado
estructura, 105
feniltiocarbamil derivado, 110, 144.
Fig. 10.13.
HPLC, 143
mezcla de. Fig. 10.1.
PITC, 144
propiedades. Fig. 10.2.
338
TLC, 136
4-aminoantipirina, 243
1,2,4-aminonaftol. Fig. 3.5.
aminopterina, 200
amonaco, 66, 156, 239. Fig. 16.20,
16.23.
amonio, 64
ampermetro, 77
amperio. Fig. 3.16.
amplitud de onda. Fig. 5.2.
anlisis
continuo, 189
cualitativo, 123
cuantitativo, 124
de punto final, 189
isotrmico, 264
sistmico, 66
analizador automtico de aminocidos,
136, 146. Fig. 10.15
anfiptico, 234, 236
anfolito, 172
anhdrido actico, 244
anilina. Fig. 5.22.
anillo esterano, 235. Fig. 16.9.
annealing, 310. Fig. 21.13, 21.16, 22.8,
22.9.
nodo, 162
ANS, 102. Fig. 14.24.
anticoagulante, 61, 63. Fig. 4.5, 4.8.
anticuerpo, 197, 199. Fig. 3.8.
bivalente, 201
forma libre, 203
monoclonal, 200, 201. Fig. 14.3.
policlonal, 199. Fig. 14.2.
antgeno, 199. Fig. 3.8.
marcado, 206
multivalente, 201
antisense. Vase antisentido
antisentido, transcrito en, 304
antisuero, 199, 204
antitripsina. Fig. 15.6.
antrona. Fig. 3.5.
mtodo de, 279. Fig. 19.18.
apoprotena, 269
arabinosa. Fig. 19.1.
arco de precipitacin, 204. Fig. 14.8.
arginasa, 185. Fig. 15.13.
arginina. Fig. 8.3.
armario. Fig. 2.2.
ARN, 289, 291. Fig. 3.3.
aislamiento. Fig. 20.8.
conformacin de tipo B, 291
cuantificacin, 296
determinacin
cuantitativa, 329
semicuantitativa, 329
electroforesis, 317
mensajero. Vase ARNm
purificacin, 294
ribosmico. Fig. 22.2, 22.18.
sonda, 304
transferente. Vase ARNt
ARNasa, 294, 328
inhibidor de, 313
ARNm, 296
mutante, 329
ARNt. Fig. 20.6.
arsenazo, 101. Fig. 7.2.
arsenomolibdato. Fig. 3.5.
arteria
aorta, 25
femoral, 62
heptica, 25. Fig. 1.7
mesentrica. Fig. 1.7
radial, 62
artritis reumatoide. Fig. 15.7, 15.8.
asma. Fig. 15.7.
asparagina. Fig. 8.2.
L-aspartato-2-cetoglutarato
aminotransferasa. Vase AST
aspartato transaminasa, 225. Fig.
15.13.
actividad, 191
AST, 225. Fig. 13.16
atomizador, 76
autohibridacin, 302
autorradiografa, 97, 323
avidina, 212. Fig. 14.23.
azcar. Vase carbohidrato
azul
brillante de coomassie. Vase
coomassie
de bromofenol. Fig. 12.10, 15.9.
de metileno. Fig. 12.10.
azulnitro de tetrazolio. Vase TNBT
b
banda, 171
de absorcin, 78
de centrifugacin, 256
de electroforesis, 166, 171
espectros de, 75
bao termostatizado, 36
base nitrogenada, 49, 289, 290
pirimidnica. Vase pirimidina
prica. Vase purina
bases de datos de secuencias, 304
bata, 34
batofenantrolina, 103. Fig. 7.4.
BCA, 154, 157. Fig. 3.5, 11.17.
mtodo del, 154
becquerel (Bq), 93
benceno. Fig. 5.21, 5.22.
Benedict,
mtodo de, 279
BHA, 238
BHT, 238
bial. Fig. 3.5.
bilirrubina, 66, 67
bioelemento, 99. Fig. 5.15.
bio-gel. Fig. 15.2.
bioseguridad, 40
biotina, 303. Fig. 14.23.
-avidina, 212
-estreptavidina, 212
bis[N,Nbis(carboximetil)aminometil]fluoresc
ena. Vase calcena
bisacrilamida, 169, 173, 221. Fig. 12.6,
12.7, 12.15.
biuret. Fig. 3.5.
mtodo del, 156. Fig. 11.14, 11.15,
11.16
blanco, 84
bomba impulsora, 129. Fig. 9.17,
10.14.
Bradford, mtodo de, 154, 158. Fig.
11.18.
ndice analtico
bromuro de etidio, 296, 318. Fig. 3.5,
12.10, 20.10, 20.11, 21.15.
bucle, 291
Bunsen, mechero, 46
butanol, 128
c
12
C, 90
C, 25, 140, 207, 306. Fig. 6.3.
cadena
lateral (grupo R), 106
ligera, 198. Fig. 14.1.
pesada, 198. Fig. 14.1.
calcena, 102. Fig. 7.3.
calcio. Fig. 7.1.
determinacin, 101
calorimetra, 24. Fig. 1.5.
campana
de proteccin biolgica. Fig. 2.6.
extractora de gases, 34. Fig. 2.7.
campo
centrfugo, 253
creciente, 255
relativo. Vase CCR
elctrico, 161, 164
gravitatorio, 251, 253
terrestre, 253
magntico, 72. Fig. 5.2.
candela. Fig. 3.16.
cantidad
de funcin, 48, 215
de sustancia. Fig. 3.16.
caotrpico, 65, 136, 294. Fig. 8.5.
captura electrnica (CE), 91. Fig. 6.3,
6.7.
carbazole. Fig. 3.5.
carbohidrato, 271
cromatografa de gases, 286. Fig.
19.31.
cromatografa en papel, 285
derivatizacin, 286
determinacin, 278
estructura, 271
HPLC, 286. Fig. 19.32.
O-trimetilsilil derivado. Vase
derivado de O-trimetilsilil
carbn activo, 120, 262, 266. Fig. 18.9.
carbonilo, 272. Fig. 11.8.
carbono. Fig. 6.1.
12
12. Vase C
14
14. Vase C
D, 106, 151
Z, 232
carboxilo, 105, 150
carboximetil celulosa, 193
carcinomatosis. Fig. 15.7.
cardiolipina. Fig. 16.14.
carga, 116, 161
de la molcula, 162
elctrica, 162
naturaleza, 164
caroteno, 80
E-caroteno, 235. Fig. 5.19, 16.8
carotenoide, 235
cascos de proteccin auditiva, 34
ctodo, 162
CCR, 253
cebador, 308, 311. Fig. 21.16.
14
celobiosa. Fig. 19.9.

celofn. Vase acetato de celulosa
clula
fotoelctrica. Fig. 5.10.
fotovoltaica, 77. Fig. 5.11.
celulosa, 120, 276. Fig. 19.13.
centelleante, 95
centrfuga, 251, 254
analtica. Fig. 17.14.
de mesa, 254
centrifugacin. Fig. 17.5.
analtica, 255, 258
diferencial, 255. Fig. 17.7.
isopcnica, 256
preparativa, 255
zonal, 256, 257. Fig. 17.9.
centro de catlisis, 181
cera, 233. Fig. 18.1.
ceramida, 237. Fig. 16.15.
cerebrogalactsido, 237
cerebrsido, 237. Fig. 18.1.
ceruloplasmina. Fig. 15.6.
cesio, 103
cetohexosa, 47
cetosa, 272
CGP-12177, 27. Fig. 1.9.
cianohemoglobina, 159
cianuro
nitroprusiato, 139
sdico, 111
ciclo
de PCR, 310
ciclopentano-perhidrofenantreno, 235.
Fig. 16.9.
cintica
de orden cambiante, 182
de orden cero, 182
de primer orden, 182
de saturacin, 182. Fig. 13.5, 13.6.
enzimtica, 182
cirrosis heptica, 226. Fig. 15.7.
cis, configuracin, 232. Fig. 16.2.
cistena, 153. Fig. 3.3, 3.5, 8.1.
determinacin, 111
cistinuria, 138
citidina. Fig. 3.3
citocromo c oxidasa, 23. Vase Cox
citosina, 290. Fig. 3.3, 20.5
citrato, 64, 225. Fig. 4.5, 4.8.
clorobenceno. Fig. 5.22.
cloroetano. Fig. 5.21.
clorofila, 71. Fig. 5.1.
cloroformo, 128, 239, 244. Fig. 8.5
N-clorosuccinimida, 111
cloruro
de dansilo, 140, 144. Fig. 3.5, 8.12,
10.9.
reaccin, 111
de guanidinio, 154
de lantano, 101
sdico, 66, 239
coagulacin. Fig. 4.5.
de la sangre, 63
cobaya, 25
cobre. Fig. 7.1.
coeficiente
de extincin molar, 82, 109
de regresin (r), 84. Fig. 5.26.
de reparto, 118
de variacin, 51
colecalciferol. Vase vitamina D
4-colesten-3-ona, 244
colesterasa. Fig. 16.26.
colesterol, 235. Fig. 16.10.
determinacin, 243
enzimtica, 244. Fig. 16.26.
qumica, 244. Fig. 16.25.
esterificado. Vase ster de
colesterol
-oxidasa. Fig. 16.26.
colesterol oxidasa, 244
colidin, 250
colina. Fig. 16.14.
columna
de afinidad, 217. Fig. 15.4.
de analizador automtico de aa.
Fig. 10.14.
de celulosa, 296
de cromatgrafo de gases, 125
de HPLC, 129. Fig. 9.18, 9.19.
de intercambio inico, 216. Fig.
15.1.
de un cromatgrafo de gases. Fig.
9.13.
de vidrio, 119, 124
comisin de enzimas, 186
complejo
Ag-Ac, 201
calcio-anin, 101
calcio-calcena, 101
citrato-calcio, 64
de coordinacin, 157
del Cu, 157
dicetohidrindilideno, 109
enzima-producto (EP), 182
enzima-sustrato (ES), 182. Fig.
13.7.
fsforo-sales de molibadto, 102
hierro-batofenantrolina, 103
hierro-ferrozina, 103
hierro-glutamil hidroxamato. Fig.
13.15.
oxalato-calcio, 64
oxalato-fosfomolibdeno, 102
protena-detergente, 154
complementariedad de bases, 299
conejo, 25, 199
de indias, 25
conservante. Vase anticoagulante
orina, 68
sangre, 64
constante
de desintegracin, 92
de Michaelis-Menten. Vase Km
de Planck, 72
dielctrica, 121. Fig. 9.9.
gravitatoria terrestre, 253
contador
de centelleo lquido, 96. Fig. 6.12.
de centelleo slido, 95. Fig. 6.11.
Geiger-Mller, 94. Fig. 6.10.
contaminacin bacteriana, 67
control de calidad, 53. Fig. 3.14.
programas, 39
coomassie, azul de, 158. Fig. 3.5,
11.18, 12.10, 15.9.
coplanaridad, 151
corazn, 26
339
ndice analtico
cortisol. Fig. 16.10.
Cox, 28. Fig. 1.4, 1.10, 1.11.
creatina quinasa. Fig. 15.13.
creatinina, 66
cribado molecular, 133, 161, 166, 215
crisol, 283
cromatografa, 119
bidimensional, 123. Fig. 9.11.
en TLC, 142
de adsorcin, 120
en columna, 121, 262. Fig. 9.10.
de cribado molecular, 216
de gases, 124
de cidos grasos, 264
de cidos grasos del plasma, 264
de carbohidratos, 286. Fig. 19.31.
de intercambio inico, 131, 216.
Fig. 9.22.
de permeabilidad, 133. Fig. 9.23.
de polaridad. Fig. 9.8.
en capa fina. Vase TLC
en papel, 47, 128
de carbohidratos, 285
de protenas, 167
gas-lquido, 124
lquida alta precisin. Vase HPLC
lquido-lquido, 120
cromatgrafo de gases, 124. Fig. 9.12.
cromatograma, 125, 127, 131, 145,
265. Fig. 9.13,9.14, 9.15, 18.8.
de cidos grasos. Fig. 18.8.
cromforo, 84, 101
cromosoma, 20
cuantificacin, 45
cuanto de luz, 72
cubeta
de cromatografa, 122
de cuarzo, 83, 296
de electroforesis, 163. Fig. 12.1.
de plstico, 83
de referencia. Vase blanco
de vidrio, 83
cuerpo cetnico, 245
cultivo
de clulas, 27
de rganos, 27
explantes primarios, 27
lnea celular, 27
curio (curie, Ci), 93
curva
de calibrado, 203
de desintegracin radiactiva, 92.
Fig. 6.9.
de saturacin enzimtica, 182. Fig.
13.5, 13.6.
patrn, 330
sigmoidea, 300
tangente en un punto, 188. Fig.
13.10.
d
DABA, 297. Fig. 3.5, 20.12.
dansilacin, 111
ddNTP, 324. Fig. 22.11.
ddUTP-digoxigenina. Fig. 21.10.
DEPC, 294
derivado de O-trimetilsilil, 286. Fig.
19.32.
340
derivatizacin, 137, 139. Fig. 9.16.

pre-columna, 143
deshidro-3-retinol. Vase vitamina A2
desintegracin
por minuto. Vase dpm
por segundo. Vase dps
radiactiva, 92
velocidad de, 90
desnaturalizacin
de ADN, 300, 310, 312. Fig. 21.2,
21.3, 21.4.
de ARN, 302, 326, 328
de ARNasa, 294
de protenas, 153. Fig. 11.12.
desnaturalizante, 65, 154
desorden metablico, 138
desoxirribonucletido. Vase dNTP
desoxirribosa, 290, 291. Fig. 20.4.
desproteinizacin, 65, 103, 136, 145,
238, 251, 278
desviacin
estndar, 50. Fig. 3.10
tipo, 50
detector, 125
de captura electrnica, 126. Fig.
9.15.
de conductividad trmica, 125. Fig.
9.13.
de cromatgrafo de gases. Fig.
9.13.
de HPLC, 130. Fig. 9.17.
de ionizacin a la llama, 126, 264.
Fig. 9.14.
electroqumico, 131. Fig. 9.21.
espectrofotomtrico, 83. Fig. 5.8,
5.24
espectrofotomtrico, 77
fluorimtrico, 130
fotomtrico, 130
radioqumico, 131
detergente, 173
determinante antignico, 199. Fig.
14.2, 14.3.
2
deuterio. Vase H
lmpara de, 83
dextrano, 133. Fig. 9.23, 14.6.
diabetes mellitus. Fig. 15.7.
diaforasa, 240. Fig. 16.22.
dilisis, 249. Fig. 17.2.
2,7-dicloro-fluorescena. Fig. 18.5.
didesoxirribonucletido. Vase ddNTP
dieta de cafetera, 23
dietilaminoetil celulosa, 193
dietilpirocarbonato. Vase DEPC
1,3-di-[2-(5-feniloxazol)]-benceno.
Vase POPOP
2,5-difeniloxazol. Vase PPO
digitonina, 243
digoxigenina, 303, 306, 322
D-dihidroxiacetona, 272. Fig. 19.2.
dilucin
en gradiente, 129
isocrtica, 129
isotpica, de bioelementos, 99
dimetilsulfato, 322
dinitrofenil derivado. Vase DNPderivado
dinitrofenilfluorobenceno. Fig. 3.5.
dinitrofenilhidrazina. Fig. 3.5.
dinitrosalicilato. Fig. 3.5.
dnodo, 77. Fig. 5.13.

dinucletido de nicotinamida y adenina,
190
diodo array, 130. Fig. 9.20.
dixido de carbono, 60
presin de, 62
dipolo temporal, 153
disacrido, 272, 274
no reductor, 275
reductor, 275
disolvente orgnico, 48, 119, 122, 238
dispersor, 239
distrofia muscular, 226
2,6-di-ter-butil-p-cresolhidroxitolueno
butilado, 2,6di-tert-butil-p-cresol.
Vase BHT
diterpeno, 234
DNP-derivado. Fig. 10.8.
DNS, 213. Fig. 14.24.
dNTP, 297, 309
doble hlice, 299. Fig. 20.1, 20.2, 21.1,
21.4.
dodecil sulfato sdico. Vase SDS
dot blot, 326. Fig. 22.14.
DPA. Fig. 16.1.
dpm, 93
dps, 93
dUTP-digoxigenina, 327. Fig. 21.10.
e
ecuacin
de Michaelis-Menten, 184. Fig.
13.8.
Edman. Vase PITC
EDTA, 64, 101, 225, 292. Fig. 4.5, 4.8,
7.3.
EGTA, 102. Fig. 7.3.
Ehrlich. Vase reactivo de Ehrlich
EIA, 208
elastina, 277
electroendsmosis, 166. Fig. 12.3.
electrfilo, 127. Fig. 9.15.
electroforesis, 161
bidimensional, 174. Fig. 12.16.
capilar, 161, 324. Fig. 12.17.
automatizada, 175
de cidos nucleicos, 317
de alto voltaje, 173
de lipoprotenas, 268. Fig. 18.12.
de protenas, 217
discontinua, 221. Fig. 15.12.
en acetato de celulosa, 168, 220
en gel
de agarosa, 169, 317. Fig. 12.5,
21.15, 22.2, 22.4, 22.5, 22.27.
de almidn, 168
de poliacrilamida, 170, 220. Fig.
15.10.
en papel de filtro, 167, 220. Fig.
12.4.
electrolisis del agua, 163
electrn de valencia, 80
electronegatividad, 114
electrn-voltio (eV), 92
ELISA, 209
competitivo, 210. Fig. 14.19, 15.21.
en sndwich, 210, 227. Fig. 14.18,
14.20, 15.20.
ndice analtico
elongacin, 310. Fig. 21.13, 21.16.
elucin en gradiente, 122
eluyente, 119, 121
EMIAT, 211. Fig. 14.22.
endonucleasa, 320
energa
cintica. Fig. 17.1.
de activacin, 180. Fig. 13.2.
de onda de luz, 72
libre estndar de Gibbs, 180. Fig.
13.1.
libre media, 154
enlace
forma resonante, 150
fosfodister, 290, 291
glucosdico, 274
peptdico, 150. Fig. 3.5, 11.1, 11.3,
11.4.
ensayo
competitivo
secuencial, 207
simultneo, 207
inmunorradiomtrico. Vase IRMA
enzima, 180. Fig. 13.9.
catlisis, 181
centro activo, 181
como reactivo. Fig. 13.17.
de restriccin, 290, 318, 322. Fig.
22.3.
ligasa. Vase ligasa
plasmtica, 223
enzimologa, 179
enzyme multiplied immunoassay
technique. Vase EMIAT
enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay.
Vase ELISA
EPA. Fig. 16.1.
EPA (U.S. Environmental Protection
Agency), 38
eptopo, 199. Fig. 14.5.
eritrocito, 66, 67
eritrosa. Fig. 19.1.
eritrulosa. Fig. 19.2.
error
accidental, 51. Fig. 3.11.
estndar de la media. Vase S.E.M
sistemtico, 51. Fig. 3.12.
esfingenina, 237
esfingomielina, 236, 237. Fig. 16.16.
esfingosina, 236, 237. Fig. 16.15.
especificidad
antignica, 198
de accin, 181
de sustrato, 181
de unin Ag-Ac, 201
inmunolgica, 199
espectro
de absorcin, 80. Fig. 5.17.
de bandas, 75
de lneas, 75
electromagntico, 74. Fig. 5.5.
visible, 71
espectrofotometra
de absorcin atmica a la llama, 78
de emisin a la llama, 75
espectrofotmetro, 82. Fig. 5.24.
de absorcin a la llama, 78. Fig.
5.14.
de doble haz, 83. Fig. 5.25.
de emisin a la llama, 76. Fig. 5.8.

espectroscopa, 71
esperma de salmn, 306
espn. Fig. 5.5.
estado
fundamental, 73. Fig. 5.4.
transitorio, 180. Fig. 13.1.
ster
colesterol hidrolasa, 244
de cido graso, 233
de colesterol, 235. Fig. 16.11.
de esteroide. Fig. 18.1.
de fosfato. Fig. 16.13, 16.14.
sulfrico, 237
esteroide, 235
esterol. Fig. 18.1.
estradiol. Fig. 16.10.
estreptavidina. Fig. 14.23.
estrona. Fig. 16.10.
estructura proteica
cuaternaria, 151. Fig. 11.6.
dominio estructural, 151. Fig. 11.6.
primaria, 150, 151, 197. Fig. 11.6.
secundaria, 151. Fig. 11.6.
supersecundaria, 151. Fig. 11.6.
terciaria, 151, 197. Fig. 11.6.
etano. Fig. 5.21.
etanol. Fig. 8.5, 5.21.
etanolamina. Fig. 16.14.
eteno. Fig. 5.21.
ter, 65, 262
de petrleo, 244
etiolgico, 38
exactitud. Fig. 3.13
experimento
in situ, 22
in vitro, 22
in vivo, 22
extensin
del ADN, 312
f
factor de respuesta (FR), 143, 265
para un cido graso. Fig. 18.6.
fase
estacionaria, 117. Fig. 9.5.
mvil, 117. Fig. 9.5.
FDA (U.S. Food and Drug
Administration), 38
Fehling, mtodo de, 279
fenilalanina. Fig. 3.3, 8.1.
determinacin, 111
fenilcetonuria, 138
fenilisotiocianato. Vase PITC
4-fenilspiro-(furan-2-(3H)-1-ftaln)-3,3diona. Vase Fluoram
feniltiocarbamil aminocido, 110, 144.
Fig. 10.13.
fenol, 293. Fig. 3.5, 5.22.
ferrozina, 103. Fig. 7.4.
fibra
determinacin, 283
ficoll, 302, 306. Fig. 17.12.
fiebre reumtica. Fig. 15.7.
film fotogrfico, 97, 306. Fig. 6.14,
15.23.
filoquinona. Fig. 16.7.
filtracin, 250. Fig. 17.3. 17.4.
en gel, 133. Fig. 15.2.

filtro, 251
fingerprinting, 318. Fig. 22.4, 22.6
FITC. Fig. 14.24.
fitol, 234
flavoprotena. Fig. 11.2.
flor-2,4-dinitrofenol, 144
flor-2,4-dinitrobenceno. Vase
reactivo de Sanger
fluoram, 213. Fig. 14.24.
fluorescamina. Fig. 8.11.
reaccin, 110
fluorescencia, 85. Fig. 5.27, 14.21.
fluormetro, 85. Fig. 5.27.
fluorforo
primario, 96. Fig. 6.13.
secundario, 96. Fig. 6.13.
fluoroinmunoensayo, 213
heterogneo, 213
homogneo, 213
fluoruro, 61, 64. Fig. 4.5.
Folch
extracto de, 239, 269
mtodo de, 239
Folin-Ciocalteu. Vase reactivo de
Folin-Ciocalteu
forma resonante, 150
formador de gradientes, 257. Fig.
17.13.
formaldehdo, 171, 328. Fig. 16.26.
formamida, 302, 328
formazn. Vase INTH
fosa cubital, 60
fosfatasa
cida. Fig. 15.13.
alcalina, 224, 228, 308, 327. Fig.
14.14, 14.16, 14.17, 22.16.
fosfatidilcolina. Fig. 16.14.
fosfatidiletanolamina. Fig. 16.14.
fosfatidilglicerol. Fig. 16.14.
fosfatidilinositol, 237. Fig. 16.14.
fosfatidilserina. Fig. 16.14.
fosfato, 68, 236, 290
de difenilamina anilina, 285. Fig.
19.27, 19.28, 19.29, 19.30.
fosfoacilglicrido.Vase
fosfoacilglicerol
fosfoacilglicerol, 236
fosfolpido, 236. Fig. 16.14
determinacin, 269
fosfoprotena. Fig. 11.2.
fsforo. Fig. 7.1.
32
P, 306, 322. Fig. 6.3.
determinacin, 102
fotoctodo, 77. Fig. 5.13.
fotodensitometra, 168
fotodensitmetro. Fig. 21.9.
fotomultiplicador, 77, 95. Fig. 5.13.
fotn, 72
fototubo, 77. Fig. 5.12.
fragmento
Fab. Fig. 14.1.
Fc. Fig. 14.1.
frecuencia, 72
fructosa. Fig. 19.2.
fuente
de energa radiante, 83. Fig. 5.24.
electrofortica, 163. Fig. 12.1.
341
ndice analtico
radiactiva
encapsulada, 36
no encapsulada, 36
fuerza
de friccin, 162
de retardo, 250
de Van der Waals, 153. Fig. 11.10
electrosttica, 152. Fig. 11.7.
hidrofbica, 153. Fig. 11.9.
impulsora, 117, 161, 162, 250. Fig.
9.4, 9.5.
no covalente, 151
retardadora, 117, 161, 162. Fig. 9.4,
9.5.
furano, 274. Fig. 19.6.
furfural, 271
fusin. Vase desnaturalizacin del
ADN
g
gafas, 34. Fig. 2.4.
galactocerebrsido, 237. Fig. 16.17.
D-galactosa. Fig. 19.1.
E-galactosidasa, 280. Fig. 14.14.
ganglisido, 238
gas
butano, 36
portador, 125. Fig. 9.12, 9.13, 9.14.
gato, 25
gel
concentrador, 221
de agarosa, 169
de almidn, 169
de poliacrialamida, 169, 322
gradiente de acrilamida, 174
gradiente de pH, 170
gradiente de tamao de poro,
170
de slice, 120, 262
en columna, 170. Fig. 12.8.
en lmina vertical, 170. Fig. 12.9.
separador, 221
gelificacin, 169
gentibiosa. Fig. 19.9.
GLC, 124
gliceraldehdo, 272. Fig. 19.1.
glicerol, 236. Fig. 16.14.
-fosfato deshidrogenasa, 240, 242.
Fig. 16.22.
-quinasa, 240. Fig. 16.21, 16.22.
glicina. Fig. 8.1, 15.11.
glicoprotena. Fig. 11.2.
glucanos. Vase polisacrido
glcido. Vase carbohidrato
glucocerebrsido, 237. Fig. 16.17.
glucocorticoide, 235
glucgeno, 276. Fig. 19.12.
determinacin, 280
glucolpido, 237
gluclisis de hemates, 61
glucopiranosa, 276. Fig. 19.3, 19.6,
19.7.
glucoprotena, 277. Fig. 19.16.
glucosa, 67, 273. Fig. 4.5, 19.1, 19.4,
19.5, 19.6, 19.7.
-6-P deshidrogenasa, 193, 211,
283. Fig. 14.14.
342
cadena lineal, 273. Fig. 19.4, 19.5.

determinacin
por glucosa oxidasa, 192. Fig.
19.19.
por hexoquinasa, 193. Fig. 19.20,
19.23.
nave. 274. Fig. 19.7.
proyeccin de Haworth. 273. Fig.
19.4.
silla, 273. Fig. 19.4,19.5, 19.7.
glucosaminoglucano, 277
D-glucosidasa, 280
glutamato
-oxalacetato transaminasa. Vase
GOT
-piruvato transaminasa. Vase GPT
glutamil transferasa. Fig. 15.13.
glutamina. Fig. 8.2, 13.15
-sintasa. Fig. 13.15.
gorro, 34
GOT, 225
GPT, 225
gradiente
de densidad, 256
continuo, 257
discontinuo, 257
de pH, 172
de temperatura, 264
grfica
de Levey-Jennings, 53
de sumas acumuladas, 54
gravimetra, 239
grupo
cido, 161, 264
amida. Vase amida
D-amino. Vase amino
bsico, 161
carbonilo. Vase carbonilo
carboxilo. Vase carboxilo
fosfato. Vase fosfato
funcional, 192
hemo, 292
hidroxilo. Vase hidroxilo
prosttico. Vase prosttico
guanina, 290. Fig. 3.3, 20.5
guanosina. Fig. 3.3.
guantes, 34
gulosa. Fig. 19.1.
h
2
H, 100
H, 25, 100, 126, 207, 306. Fig. 6.3.
hapteno, 199
haptoglobina. Fig. 15.6.
HDL. Fig. 16.19.
hematocrito, 60
hematoma, 62
hemiacetal, 272
hemoglobina, 66, 103, 220
determinacin, 159
hemolisis, 61, 62
hemopexina. Fig. 15.6.
hemoprotena. Fig. 11.2.
heparina, 61, 62, 63, 225, 277. Fig. 4.5,
4.8, 19.15.
hepatitis, 226
viral, 225. Fig. 15.7.
heptano, 262
3
heptosa, 272
hexanucletido, 313
hexoquinasa, 280
hexosa, 47, 271, 272
hexosamina, 47
hibridacin, 299, 301. Fig. 3.9
del ADN, 312
rigor de, 301, 327
hibridoma, 200. Fig. 14.3, 14.4.
hidracina, 323
hidrato de hidracina, 246
hidrazona, 246. Fig. 16.28.
hidrgeno. Fig. 7.1.
hidrolasa, 277. Fig. 13.9.
E-hidroxibutirato, 245. Fig. 16.27,
16.28.
-deshidrogenasa, 245. Fig. 16.27,
16.28.
3-hidroxi-5,6-colesteno. Vase
colesterol
hidrxido de zinc. Fig. 8.5
hidroxilo, 235, 290
hidroximetilfurfural, 271. Fig. 19.18.
hidroxiprolina, 108. Fig. 8.6.
hierro. Fig. 7.1.
determinacin, 103
hgado, 25, 26. Fig. 1.7
Hind I, 330
hiperfagia, 24
hiptesis, 21
hipoxantina guanina fosforribosil
transferasa, 200
histidina, 139. Fig. 3.3, 8.3.
histidinuria, 138
homeostasis cido-bsica, 66
homocistinuria, 138
homogeneizacin, 28
homogeneizador, 239
mecnico de palas, 294
hormona esteroidea. Fig. 3.5.
horno, 125
de hibridacin. Fig. 21.5.
mufla, 100
horquilla, 291
HPLC, 128
componentes. Fig. 9.17.
de aminocidos, 143
individuales libres, 144
de carbohidratos, 286. Fig. 19.32.
de fosfolpidos, 269. Fig. 18.13.
lquida
en fase normal, 129
en fase reversa, 129
i
125
I, 207, 306. Fig. 6.3.

IDL, 268
idosa. Fig. 19.1.
imidazol, 139
iminocido, 108. Fig. 8.6.
ndice
de polaridad de Snyder, 121. Fig.
9.9.
de refraccin, 158
idioptico, 135
infarto de miocardio, 225, 226. Fig.
15.13.
infeccin crnica. Fig. 15.7.
infeccioso, 38
ndice analtico
inflamacin aguda. Fig. 15.7, 15.8.
ingesta, 24
inhalacin, 33
inmunoblot. Vase Western blot
inmunodifusin, 204
inmunoelectroforesis, 204. Fig. 14.8.
inmunoensayo
enzimtico. Vase EIA
heterogneo, 209
homogneo, 208
inmungeno, 199
inmunoglobulina
A, 198
cadena ligera, 198. Fig. 14.1.
cadena pesada, 198. Fig. 14.1.
D, 198
E, 198
G, 198. Fig. 14.1.
M, 198
inmunoprecipitacin, 204
inositol. Fig. 16.14.
insulina. Fig. 15.20.
INT, 240
intensidad
de color, 45, 46
de luz, 77. Fig. 3.16.
del campo elctrico, 162. Fig. 3.16.
intercambiador
de aniones, 132
de cationes, 131
ionizado, 131
intestino, 277. Fig. 1.7
INTH, 240, 242. Fig. 16.22.
inyector
de analizador automtico de aa.
Fig. 10.14.
de cromatgrafo de gases, 125.
Fig. 9.12.
de HPLC, 129. Fig. 9.17
iodo. Vase yodo
p-iodonitrotetrazolio, 242. Vase INT
in
cloruro, 222
de cobre, 279
fluoruro, 278
glicinato, 222. Fig. 15.11, 15.12.
IRMA, 207. Fig. 14.9, 14.13.
isatina. Vase reactivo de isatina
isoelectroenfoque, 170, 171. Fig.
12.11, 12.12.
isogel, 172
isoleucina. Fig. 8.1.
isomerasa. Fig. 13.9.
isopentenilpirofosfato, 235
isopreno, 234. Fig. 16.4.
isotiocianato
de fluorescena. Vase FITC
de rodamina-B. Vase RBITC
istopo, 89. Fig. 6.2, 6.3.
j
jabn, 173
jeringa, 35
de plstico, 62
de vidrio, 62
joya, 34
k
katal, 189
kelvin. Fig. 3.16.
kilogramo. Fig. 3.16.
Kjeldahl
aparato de. Fig. 11.13
mtodo de, 154, 155, 284
Km, 184, 185. Fig. 13.8.
l
laboratorio, 32
lactato. Fig. 3.7.
-deshidrogenasa. Vase LDH
lactosa, 275. Fig. 19.8, 19.9.
lantano. Fig. 7.1.
LCR, 320. Fig. 22.8, 22.9.
LDH, 190, 220, 225, 240. Fig. 3.7,
13.14, 15.13, 15.14, 15.16, 15.17,
15.18, 15.19, 16.21.
isoenzimas, 226
LDL, 268. Fig. 16.19.
lecitn colesterol acil transferasa, 224
leucemia mieloide. Fig. 15.7.
leucina. Fig. 8.1.
leucocito, 66, 67, 292
ley
de Beer-Lambert, 82
de Ohm, 165. Fig. 12.2.
de Stoke, 162, 252
liasa. Fig. 13.9.
Liebermann-Burchard
reaccin de, 244. Fig. 3.5, 16.25.
ligando, 217
ligasa, 320. Fig. 13.9, 22.8, 22.9.
limoneno, 234. Fig. 16.5.
lnea
de transicin D, 75
inmortal, 200
linfocito B, 198
lipasa, 234, 266. Fig. 15.13.
microbiana, 242
lpido, 231, 261
complejo, 231, 236
de poliprenilo, 234
determinacin, 238
estructura, 231
fraccionamiento, 261
isoprenoide, 234
simple, 231, 232
lipoprotena, 20, 238. Fig. 16.19.. Fig.
11.2, 15.6, 18.11.
aclaramiento plasmtico, 224
determinacin, 267
lisina. Fig. 8.3.
lisosoma. Fig. 17.8, 17.10.
lisozima, 211. Fig. 13.4.
litio, 103. Fig. 7.1.
lixosa. Fig. 19.1.
llama, 75, 76
longitud. Fig. 3.16.
de onda, 46, 72. Fig. 5.2.
Lowry, mtodo de, 154, 157
lupus eritematoso. Fig. 15.7, 15.8.
m
macroglobulina. Fig. 15.6.
magnesio. Fig. 7.1.

24
24. Vase Mg
malato deshidrogenasa. Vase MDH
maltosa. Fig. 19.9.
manosa. Fig. 19.1.
marcador molecular, 173
masa. Fig. 3.16.
molecular, 133, 173, 216. Fig. 9.25,
12.14.
mscara, 34. Fig. 2.4.
Maxam y Gilbert,
mtodo de, 322
MDH, 211. Fig. 13.16.
media aritmtica, 50. Fig. 3.10.
medicina forense, 319
medio
de reaccin enzimtica, 187
HAT, 200, Fig. 14.3.
mega-electrn-voltio (MeV), 92
MEHA, 243
melibiosa. Fig. 19.9.
membrana
biolgica, 20
celular, 224. Fig. 17.10.
de acetato de celulosa, 168, 250
de celulosa, 202
de steres de celulosa, 250
de niln, 305, 319, 326, 328
de nitrocelulosa, 228, 305, 319,
326. Fig. 22.15
de polmeros de polivinilo, 250
mucosa, 33
semipermeable, 249. Fig. 17.2.
E-mercaptoetanol, 174
mercurio. Fig. 7.1.
metabolopata, 138
metahemoglobina, 159
metaloprotena. Fig. 11.2.
metano, 115. Fig. 9.2, 9.3.
metanol, 220, 239. Fig. 8.5
metasulfato de fenazina. Vase PMS
3-metil-N-etil-N-(E-hidroxietil)-anilina.
Vase MEHA
metionina. Fig. 8.1.
mtodo
cientfico, 20
de Benedict. Vase Benedict
de Bradford. Vase Bradford
de Fehling. Vase Fehling
de Folch. Vase Folch
de Kjeldahl. Vase Kjeldahl
de la antrona. Vase antrona
de la ninhidrina. Vase ninhidrina
de Lowry. Vase Lowry
de Maxam y Gilbert, 322
de obtencin de sangre, 60
de reduccin del cobre, 279. Fig.
19.17.
de Sanger, 324
del cido diamino benzoico. Vase
DABA
del BCA. Vase BCA
del biuret, 154
del o-ftaldehdo. Vase o-ftaldehdo
del terminador de cadena. Vase
terminador de cadena
especificidad, 52
NEFA C. Vase NEFA C
343
ndice analtico
seleccin, 55
sensibilidad, 52
metrizamida. Fig. 17.12.
metro. Fig. 3.16.
24
Mg, 91. Fig. 6.8.
2+
Mg , 311
Michaelis-Menten
ecuacin de, 184
modelo de, 183
microcalormetro, 27
microondas, 74. Fig. 5.5.
microsoma. Fig. 17.8, 17.10.
mieloma. Fig. 14.3, 15.7, 15.8.
de ratn, 200
mineralocorticoide, 235
mioglobina, 103
mitocondria, 20. Fig. 1.4, 17.8, 17.10.
modelo de Michaelis-Menten, 183
mol. Fig. 3.16.
molcula anfiptica, 173
molibdato
amnico, 123. Fig. 3.5, 18.5.
Molish
reaccin de, 279.Fig. 19.18.
mono, 25
monocromador, 77, 83. Fig. 5.8, 5.24.
primario, 86. Fig. 5.28.
secundario, 86. Fig. 5.28.
monosacrido, 272
monoterpeno, 234
morfina, 199
movilidad electrofortica, 162
movimiento browniano, 249, 251. Fig.
17.1.
mucopolisacrido. Vase
glucosaminoglucano
mucoprotena. Vase glucoprotena
MUFA, 232
mutacin, 290, 320, 329
n
14
N. Fig. 6.5.
N,N-metiln-bis-acrilamida. Vase
bisacrilamida
N-acetilneuramnico. Vase cido
silico
NAD+, 190, 225, 226, 242, 245. Fig.
13.13, 15.15.
NADH, 190, 225, 226, 240, 242, 245.
Fig. 13.13, 15.15, 16.21.
NADP+, 190, 280. Fig. 13.13.
NADPH, 193
naftaleno. Fig. 5.21.
D-naftol, 279. Fig. 18.5.
naftoresorcinol, 285
nave. Fig. 19.7.
nebulizador, 76
NEFA C,
mtodo, 243
nefelometra, 154, 158
nefelmetro, 158. Fig. 11.19.
negro
amido. Fig. 12.10, 15.9.
sudn. Fig. 12.10, 15.9.
neoplasia, 289
63
Ni, 126
nick translation. Fig. 21.8.
ninhidrina, 111, 123, 143, 147. Fig. 3.5.
344
mtodo de, 108. Fig. 8.7.

nitrato de plata, 219. Fig. 12.10.
nitrobenceno. Fig. 5.22.
nitrocelulosa, 250
nitrgeno, 124
14
14. Vase N
atmsfera de, 238
determinacin, 155
lquido, 34
nitroprusiato sdico, 111
1-nitroso-2-naftol, 111
nitrotirosina, 141
nivel energtico, 46, 79. Fig. 5.3.
norleucina, 141
normas GLP, 38
Northern blot, 327. Fig. 22.18.
norvalina, 141
nucleacin, fase de, 301
nmero
atmico (Z), 89
de recambio, 185
msico (A), 89
nycodenz. Fig. 17.12.
o
18
O, 100
o-cresolftalena, 101. Fig. 7.2.
octosa, 272
o-ftaldehdo, 144. Fig. 3.5, 8.10.
mtodo del, 110
OH anomrico, 279
oil red, 269. Fig. 12.10.
oligo(dT), 295. Fig. 20.9.
12-18, 313
-celulosa, 295
oligonucletido, 304
oligosacrido, 272
orbital
antienlazante, 81
enlazante, 80
n, 80. Fig. 5.20.
S, 85
V, 80. Fig. 5.20.
orcinol, 285. Fig. 18.5.
orina, 65
recogida de muestras. Fig. 4.9.
oxalato, 64, 225. Fig. 4.5, 4.8
oxidante, 100
xido nitroso. Fig. 7.1.
xidorreductasa. Fig. 13.9.
oxgeno, 80
18
18. Vase O
consumo de, 27
electrodo de, 245
presin de, 62
p
32
P, 306, 322. Fig. 6.3.

PAGE, 170. Vase tambin
electroforesis en gel de
poliacrilamida
papel de filtro, 250
partculas
D, 90. Fig. 6.4.
E, 90. Fig. 6.3, 6.5.
paso de la luz, 82
patgeno, 38
patrn
externo, 127, 131, 140, 141
interno, 100, 131, 140, 143, 265.
Fig. 22.20.
recta, 84, 217. Fig. 5.26.
tubos, 84
Pauly. Vase reactivo de Pauly
204
Pb, 92
PCR, 290, 304, 308. Fig. 21.12, 21.13.
pellet, 254, 255
pentosa, 47, 271
pptidoglucano, 277
percoll. Fig. 17.12.
perlas de vidrio, 125
peroxidasa, 243. Fig. 14.15.
de rbano, 227. Fig. 14.14, 15.24.
perxido de hidrgeno, 243
perro, 25
persulfato amnico, 169. Fig. 12.6.
peso, 24
evolucin. Fig. 1.5.
peco, 34
pI, 164, 171
Pico-Tag, 144. Fig. 10.12.
cromatograma. Fig. 10.13.
piperidina, 322
pipeta, 35
pirano, 274. Fig. 19.6.
pirimidina, 290. Fig. 20.2.
piruvato. Fig. 3.7.
-quinasa, 240. Fig. 16.21.
PITC, 110, 144. Fig. 3.5, 8.9, 10.11.
pK, 132. Fig. 15.11.
placa
de gel de slice, 262, 285
de Petri, 35
plasma, 61. Fig. 3.2, 4.5, 4.6.
plastoquinona, 234
plato terico, 119
PMS, 226
212
Po, 92
polaridad, 114
poliacrilamida. Fig. 9.23.
poliamidas, 120
poliestireno, 147. Fig. 9.23.
polietiln glicol, 200, 202. Fig. 14.6.
polmeros porosos, 125
polisido. Vase polisacrido
polisacrido, 272, 276
polivinil pirrolidona. Fig. 14.6.
Ponceau S. Fig. 12.10, 15.9.
POPOP, 96. Fig. 6.13.
positrn (E, 91. Fig. 6.3, 6.6.
potasio. Fig. 7.1.
determinacin, 103
Potter-Elvejhem, 294
PPO, 96. Fig. 6.13
precipitacin del complejo Ag-Ac,
202. Fig. 14.7.
precipitante, 108. Fig. 8.5.
precisin. Fig. 3.13
primer. Vase cebador
principio
de Arqumedes, 252
fotoelctrico, 77
producto, 180. Fig. 13.1, 13.2, 13.11,
13.12.
qumico
etiquetado, 33
ndice analtico
radiactivo, 36
progesterona. Fig. 16.10.
prolina, 108. Fig. 8.1, 8.6.
prosttico, 150
proteasa, 181
protena, 149
conjugada, 150. Fig. 11.2.
cromatografa, 216
cuantificacin, 154
desacoplante 1. Vase UCP1
desacoplante 3. Vase UCP3
electroforesis, 217
enrollada al azar, 154
estructura, 150
nativa, 154
srica, 218. Fig. 15.5, 15.6, 15.10.
proteinasa K, 292
protrombina. Fig. 15.6.
prueba de paternidad, 318
psicosa. Fig. 19.2.
puente
de hidrgeno, 152, 154, 299, 300,
328. Fig. 11.8, 21.1, 22.17.
disulfuro, 151, 153, 174. Fig. 11.11.
salino, 152, 201. Fig. 11.7.
PUFA, 232
puncin
arterial, 62
cutnea, 63. Fig. 4.7.
venosa, 60
punto
de ebullicin, 115. Fig. 9.3.
de fusin, 33, 115. Fig. 9.3.
de inflamacin, 33
isoelctrico. Vase pI
purificacin, 45
purina, 290
prpura de bromocresol. Fig. 3.5.
q
quelante, 101
D-queratinas, 153
quilomicrn, 268. Fig. 16.19.
quimotripsina. Fig. 11.7, 11.8, 11.9,
11.10, 11.11.
quinona. Fig. 18.1.
quitina, 277. Fig. 19.14.
226
Ra. Fig. 6.4.

radiacin
incidente, 82. Fig. 5.23.
infrarroja, 74
trasmitida, 82. Fig. 5.23.
ultravioleta, 74
visible, 74
radiactividad, 90. Fig. 6.2.
especfica, 93
radin, 253
radical libre, 169
radio
de giro, 253
de hidratacin, 202
de la molcula, 162
de Van der Waals, 151
inico, 202
medio de rotacin, 253, 254
radioinmunoensayo. Vase RIA

radioproteccin, 36
Ramachandran, 151
representacin de, 151
random priming. Fig. 21.8.
rata, 25
ratn, 25
rayos
J, 91. Fig. 5.5, 6.3, 6.8.
X, 74. Fig. 5.5.
RBITC, 213. Fig. 14.24.
reaccin
de Liebermann-Burchard, 244
de Molish, 279. Fig. 19.18.
en cadena de la ligasa. Vase LCR
en cadena de la polimerasa. Vase
PCR
reactivo, 45
de Edman. Vase PITC
de Ehrlich, 139. Fig. 3.5.
de Folin-Ciocalteu, 157. Fig. 3.5.
de isatina, 139. Fig. 10.7.
de Pauly, 139
de Sanger, 109. Fig. 8.8.
ninhidrina-colidina, 137, 139, 146.
Fig. 10.4, 10.5, 10.6, 10.14.
recta patrn, 84. Fig. 5.26.
regin
constante, 198
variable, 198
registrador-integrador
de un cromatgrafo de gases, 127.
Fig. 9.12
de un HPLC, 131
relacin carga/masa, 173, 267, 317.
Fig. 12.14.
renaturalizacin
de protenas, 153
del ADN, 300. Fig. 21.4.
reparto
en columna, 119. Fig. 9.6, 9.7.
resina, 131
de intercambio catinico fuerte, 146
de intercambio inico, 132, 146
XAD, 120
resistencia elctrica, 165
resolving. Vase gel separador
resorcinol, 47
Restriction Fragment Length
Polymorphisms. Vase RFLPs
retinol, 234
retrotranscripcin
del ARN, 313
retrotranscriptasa. Vase transcriptasa
inversa
revoluciones por minuto. Vase rpm
Rf, 123, 263
RFLPs, 320. Fig. 22.7.
RIA, 206. Fig. 14.9, 14.11, 14.12.
ribonucleasa, 294
ribonucletido, 291
ribosa, 291. Fig. 19.1, 20.4.
ribulosa. Fig. 19.2.
rigor de hibridacin, 301, 327
rin, 26, 66
222
Rn. Fig. 6.4.
rodamina. Fig. 18.5.
rojo
aceite O. Fig. 15.9.
Ponceau S. Vase Ponceau S

rotacin
de los tomos, 74
de una centrfuga, 251
eje de, 253
radio medio, 253
rotor, 251. Fig. 17.6, 17.14
angular, 254
basculante, 254
vertical, 255
rpm, 253
RT-PCR, 313, 329. Fig. 21.16, 22.19,
22.20.
ruido, 34
de fondo, 96, 192, 302, 306
s
35
S, 306. Fig. 6.3.

sacarosa, 257. Fig. 17.11, 19.9.
sales de molibdato, 102
salto electrnico, 74
Sanger
mtodo de. Vase mtodo de
Sanger
reactivo de. Vase reactivo de
Sanger
sangre, 59. Fig. 4.5.
arterial, 60
capilar, 60
extraccin de, 59. Fig. 4.1, 4.2.
velocidad de sedimentacin. Fig.
4.5.
venosa, 60. Fig. 4.2.
saponificacin, 241
SDS, 154, 173, 221, 302. Fig. 12.13.
-PAGE, 173
secuencia de bases, 289
secuenciacin
del ADN, 322. Fig. 22.10
segundo, 48
seguridad, 31
almacenamiento, 33
biolgica, 38
bioseguridad, 40
cabinas de, 36
contenedor. Fig. 2.9.
medidas bsicas, 31
normas, 33
personal, 34
programas, 32
selenio, 77
S.E.M, 51
semiconductor, 77
sense, 304. Vase sentido
sentido, transcrito en, 304
separacin, 45
de molculas
en dos fases, 117
en una sola fase, 117
de orgnulos celulares, 255
Sephadex, 133. Fig. 9.23, 9.24, 15.2.
sepharose. Fig. 15.2.
serina. Fig. 8.2, 16.14.
sesquiterpeno, 234
SFA, 232. Fig. 16.2.
S.I., 56
slice porosa. Fig. 9.23.
silla. Fig. 19.7.
345
ndice analtico
Sistema Internacional de unidades.
Vase S.I.
slot blot, 326. Fig. 22.14, 22.15.
sobrenadante, 255
sobrepeso, 24
sodio. Fig. 5.3, 7.1.
determinacin, 103
solubilidad, 115
sonda, 289, 299, 304. Fig. 3.9, 21.6.
cuantificacin, 306
de ADN. Fig. 21.7, 21.8.
de ARN. Fig. 21.1.7, 21.8.
de oligonucletidos. Fig. 21.7, 21.8.
genmica, 304
libre, 303
recombinante, 304
unida, 303
unin inespecfica, 306
sonicador, 239
soporte
de electroforesis, 165. Fig. 12.1.
sorbitol. Fig. 17.12.
-deshidrogenasa. Fig. 15.13.
sorbosa. Fig. 19.2.
Southern blot, 319. Fig. 22.5.
SSC, 302
staking. Vase gel concentrador
subnivel energtico, 79. Fig. 5.16.
suero, 61, 199. Fig. 4.5.
hemolizado, 225
sulftido, 237. Fig. 16.17.
sulfato
clcico, 122
de condroitina, 277. Fig. 19.15.
de dextrano, 302
de metil-p-aminofenol, 102
sdico. Fig. 8.5
sulfolpido. Fig. 18.1.
sustrato, 180. Fig. 13.1, 13.2, 13.11,
13.12.
activado, 180. Fig. 13.1.
t
tagatosa. Fig. 19.2.
talosa. Fig. 19.1.
tamao
de poro, 169, 216, 250
de una molcula, 116, 249
tampn
de citrato sdico y cloruro sdico.
Vase SSC
de electroforesis, 163, 165
tartrato alcalino. Fig. 3.5.
Tris-EDTA, 296
tapn, 61. Fig. 4.5.
Taq polimerasa, 292, 311. Fig. 21.16.
tartrato de cobre alcalino, 111
TCA, 65, 103, 158, 171. Fig. 8.5.
tejido adiposo
blanco, 27
marrn, 25, 26, 27, 211, 228. Fig.
1.4
TEMED, 170
temperatura. Fig. 3.16.
de fusin. Vase Tm del ADN
de hibridacin, 311
teora del estado estacionario, 183
346
ter-butil-4-hidroxianisolhidroxianisole
butilado, 2,3-t-butil-4-hidroxianisole. Vase BHA
terminador de cadena, 324. Fig. 22.11,
22.12, 22.13.
termociclador, 310. Fig. 21.14.
termognesis, 24
testosterona. Fig. 16.10.
tetrametilbenzidina. Fig. 15.20.
tetrametilndiamina. Vase TEMED
tetraterpeno, 235
tetrosa, 272
Thermus aquaticus, 311
tiempo
de retencin, 128, 264
inicial de la reaccin enzimtica,
187
tierra de diatomeas, 125
timidina, 200. Fig. 3.3.
timina, 290. Fig. 3.3, 20.5.
tiocianato de guanidinio, 294, 295
tiourea. Fig. 3.5.
tirosina, 139, 155. Fig. 3.2, 3.3, 8.2
determinacin, 111
tirosinuria, 138
TLC, 122
de aminocidos, 136. Fig. 10.3.
bidimensional, 137. Fig. 10.5, 10.6
unidimensional, 137
de carbohidratos, 285. Fig. 19.28,
19.29, 19.30.
de fosfolpidos, 269. Fig. 18.3.
bidimensional. Fig. 18.4.
de lpidos, 262. Fig. 18.2.
Tm del ADN, 311. Fig. 21.2, 21.3, 21.4.
TNBT, 226
D-tocoferol, 234. Fig. 16.7.
tolueno, 68. Fig. 5.22.
torniquete, 60
trans, configuracin, 232. Fig. 16.2.
transaminasa, 225
transcobalamina. Fig. 15.6.
transcriptasa inversa, 290, 313, 329.
Fig. 21.16.
transferasa. Fig. 13.9.
transferrina. Fig. 15.6.
transicin nuclear, 74. Fig. 5.5.
transmitancia (T), 82
trauma muscular, 226
trealosa. Fig. 19.9.
treonina. Fig. 8.2.
treosa. Fig. 19.1.
triacilglicerol, 234. Fig. 16.3.
triglicrido. Vase triacilglicerol
triosa, 272
tripsina. Fig. 15.13.
triptfano, 155. Fig. 3.3, 8.1.
espectro de absorcin. Fig. 5.18.
3
tritio. Vase H
trombina. Fig. 4.5, 4.8.
tubos de vaco. Vase vacutainer
turbidez, 203
turbidometra, 158
turbidmetro, 159
u
ubiquinona, 234
UCP1, 28, 211, 228, 320, 327, 328.

Fig. 9.25, 15.3, 15.21, 15.22, 15.24,
22.7, 22.18, 22.19.
UCP3, 27
ultracentrfuga, 254
ultracentrifugacin diferencial, 267. Fig.
18.11.
ultrafiltracin, 251
unidad de actividad enzimtica, 188
uracilo, 291. Fig. 3.3, 20.5.
urea, 66, 154
ureasa, 185
uridina. Fig. 3.3.
urobilingeno, 67
UTP-digoxigenina, 308. Fig. 21.10,
21.11.
v
vaco, 250
vacutainer, 61. Fig. 4.3.
valina. Fig. 8.1.
vapores de yodo, 123, 263. Fig. 18.2,
18.5.
vaso de precipitado, 35
vector, 38
plasmdico, 304
vrico, 38
velocidad
angular, 253
de desintegracin radiactiva, 90, 92
de la luz, 72
de migracin, 117, 161
de reaccin enzimtica, 187. Fig.
13.5.
inicial de reaccin enzimtica, 189.
Fig. 13.10, 13.11, 13.12
mxima de reaccin enzimtica.
Vase Vmx
vena
baslica. Fig. 4.1.
cava. Fig. 1.7
ceflica. Fig. 4.1.
cubital media. Fig. 4.1.
heptica, 25. Fig. 1.7
porta, 25. Fig. 1.7
veneno, 33
verde de bromocresol, 159. Fig. 3.5.
vibracin de los tomos, 74
vida media (T1/2), 92
vidrio poroso. Fig. 9.23.
virus
oncognico, 38
vector, 38
viscosidad
del fluido, 252
del medio, 162
vitamina
A1, 234. Fig. 16.6.
A2, 234
D, 235
D3, 235. Fig. 16.12.
E, 234. Fig. 16.7.
K, 234. Fig. 16.7.
VLDL, 268. Fig. 16.19.
Vmx, 182, 185, 187. Fig. 13.8.
volatilidad, 115, 124, 264
volumen
de elucin, 128. Fig. 15.3.
muerto, 125
ndice analtico
w
Watson y Crick, reglas de, 290. Fig.
20.3.
Western blot, 213, 228. Fig. 15.23.
wolframato de cobre. Fig. 8.5
wolframio, lmpara de, 83
xantina, 68
xilosa. Fig. 19.1.
xilulosa. Fig. 19.2.
z
zinc. Fig. 7.1.
zwitterin, 222
y
x
XAD, resina, 120
yodo. Fig. 12.10.

125
125. Vase
I
vapores de, 123, 263. Fig. 18.2, 18.5.
347

Bioquimica - Tecnicas y Metodos - Jordi Oliver y Ana Ma Rodriguez (Coautor

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04. OBTENCIN DE MUESTRAS .............................................................

05. TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS Y FLUORIMTRICAS ...........

06. TCNICAS RADIOQUMICAS ............................................................

07. MTODOS DE DETERMINACIN DE BIOELEMENTOS ....................

08. MTODOS DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS .................... 104

09. TCNICAS DE SEPARACIN: CROMATOGRAFA ............................. 112

10. MTODOS DE DETERMINACIN DE AMINOCIDOS

11. MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS ........................... 148

12. TCNICAS DE SEPARACIN: ELECTROFORESIS ............................... 160

13. TCNICAS ENZIMTICAS .................................................................. 178

14. TCNICAS INMUNOQUMICAS ........................................................ 196

15. MTODOS DE DETERMINACIN DE PROTENAS INDIVIDUALES .. 214

16. MTODOS GENERALES DE DETERMINACIN DE LPIDOS ............ 230

17. TCNICAS DE SEPARACIN: DILISIS, FILTRACIN Y

18. MTODOS DE DETERMINACIN DE LPIDOS INDIVIDUALES ....... 260

19. MTODOS DE DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS ................ 270

20. MTODOS DE DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS ............ 288

21. TCNICAS DE HIBRIDACIN Y PCR ................................................. 298

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