CO U UPT LABORATORIUM PUSAT MIPA UNIVERSITAS SEBELAS MARET eokumen No | Halaman 1 dan 6 SURAKARTA ANK-5. en as Tanggal Terbit : 2 Agustus 2014 TOTAL COLIFORM No. revisi : 0 SWI 06-4158-1996 4, Ruang Lingkup Metade pengujian ini : 8) Membahas ketentuan-ketentuan, cara ujidan leporan ui; b}Dapat digunekan unluk semua jenis air termacuk air dengan kadar suspensitingg ; ©) Dititung menggunakan Tabel Jumiah Perkiraan Terdekat (JPT) atau rumus. 2 Cara Uji Prinsip Uji penduga cilakukan dengan menginkubasi contoh zir didalam tabung durham yang diisi dengan media Lactose Broth pada suhy 35°C selema 24 — 48 jam. Dengan adanya bakteri golongan Keli didalam contoh, maka lektosa akan difermentasi dan membentuk gas dan asam, Oleh arena laktosa juga dapat dfermentasi oleh bakteri lain maka uji penduga yang positf perlu dilanjutkan dengan yi Penguat Alat a) Neraca analik dengan keteltian 0,1 mg; b) Peralaten gelas yang terdi atas ; (1) Botol conioh ui berukuran minimel 120 mi dan disterikan sebelum digunekan ; (2) Bolo alau erlemeyer bertutup 250 ml; ‘Tabungreaksi 20 ri ; (4) Tebung Durham 2 ml; (6) Pipet ukur 4,5, dan 40. ; (6) Pipet seukuran 10 dan 50 mi ; (7) Lebu takar 100 dan 1000 mi; 8 Golas piela 500 dan 1000 mi; Golas ukur 100 dan 1000 ml; tt Batang pengaduk ; ©) pH meter: 4) Otokiaf dengan kepasitas 10 atau 20liter den dapat mencapai subu 121°C serta tekenan 1,3, kgom? ; Incubator dengan suhu inkubasi (35 + 0,5)°C atau (37 + 05)°C : Jerum inokulasi dengan diameter lingkaran pada ujung jarum berkisar 2—4 mm ; 4 Pembaker Bunsen atau lampu spirtus yang mempunyai nyala oksidasi. Bahan a) Airsuling yang mempunyai daya hanteristikkurang dari2. 4x mhos/am dan pH §\5—7 ; b) Tryptose ; 6) Lactose ; a) K:HPO. )KHPO,UPT LABORATORIUM PUSAT MIPA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA, Dokumen No. . 2.1.4nk-s.omo11 | Melaman 2dan 5 ING TRUS: Ristdh Tanggal Terbit : 2 Agustus 2014 Bagian 2.1.4 delat TOTAL COLIFORM h f) NaCl; @) Natium Lauryl Sulfa; h) Brom Cresol Purple (BCP) ; ’) Buon i) Peptone Ky Oxgall; 1) Briliant Green ; m)_ Nad ni) MgCb.6H0 ; 0) NaSAs; pp) Dinatrium EDTA ; 4) Kapas beriemak; ) HCL Langkah Kerja ‘Contoh Uji ‘Contoh uji harus memenuhi ketentuan, sebagai berikut : @) Diambil sesuai dengan SNt 06-2412-1991 b) Untuk contoh uii yang diketahui mengandung klor atau senyawa halogen lainnya, ditambahken 0,41 mi larutan NaS:0; 10 % ke dalam botol contoh uji sebelum botal disterilkan. ¢) Untuk contoh uj yang mengandung Cu dan Zn fingg atau sir buangan dengan kadar logam berat tinggi tambahkan 0,3 mi larutan dinatrium EDTA ke dalam botol contoh uj sebelum botol disterikan, Benda Uji Benda yj herus memenuhi ketentuan, sebagai berikut @)Disiapkan dari contoh uj b) Untuk contoh uji yang dperlukan pengenceran, diencerkan minimal 3 seri pengenoeran masing- masing sebesar kelipaten sepuluh sehingga volume contoh uj setelah diencerkan menjadi 0,1 mi, 0,01 mi dan 0,001 mn dan seterusnya ) Benda yj siap dij Pereaksi Pereaksi-pereaksi yang digunakan dalam metode penguiian ini terdin aas: a) Medium lauryl tryptose broth atau lactose broth. b) Medium bailiant green lactose bile broth. Airpengencer 4 4) Lerutan dinairium EDTA e) Larutan NaOH 1 N f) Lerutan HCI1N Pembuatan Pereaksi a) Medium laury| tryptose broth, unituk contoh ji lebih besar dari 1 mi. Lautan ini dibuat dengan cara : (1) Melarutken 40 q typlose, 10 9 lactose, 5.5 g K:HPO.,5,5 g KH:PO., 10 g NaCl, 0,2.gnatrium lauryl sutfat, 0,02 9 brom cresol purple ke dalam 1 liter air suling dan atur pH 6,8 + 0,2 dengen penambahan asam atau basa : (2) Medium tersebut dimasukkan sebanyek 10 mi ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham dalam keadaan terbatikUPT LABORATORIUM PUSAT MIPA re ae UNIVERSITAS SEBELAS MARET pokumen No. | Halaman 3 dani 6 SURAKARTA sulla lee Tanggal Terbit : 2 Agustus 2011 TOTAL COLIFORM Nereis? (@)_Disterikan dalam ctoklaf celama 15 menit pada suhu 121 *C dan tekanan 1,3 kgior b) Medium lauryl tryptose broth, untuk contoh yj kurang atau sama dengan 1 mi. Larutan ini dibuat dengan cara mengencerkan medium lauryi tryptose broth tersebut diates sebenyak 2 kali ) Medium Lactose broth, untuk contoh uj lebih besar deri 1 rm Larutan ini dibuat dengan cara : (1) Melarutkan 6 g bulion, 10 g peptone, 10 g lactose, 0,02 g bram cresol purple ke dalam 1 iter air suling dan atur pH 6,9 +0,2 dengan penambehan asam atau basa, (2) Medium tersebut dimasukkan sebanyak 10 mi ke dalam tabung reaksi yang beris! tabung durham dalam keadeen terbalik. (3)_Disterikan dalam oioklef setama 15 menit pada suhu 124 °C dan tekanan 1,3 kgom? ) Mecium lactose broth, untuk contoh uj kurang atau sama dengan 4 ml Lerutan ini dibuat dengan cara mengencerkan medium lactose broth tersebut di atas sebanyak 2 kel. ) Medium brliant green lactose bile broth (BGLB broth). ‘Larutan ini dibuat dengan cara: (1) Molarutkan 10 g peptone, 10 g lactose, 20 g oxgall, 0.0133 g brillant green ke dalam 1 liter air ssuling dan atur pH 7,2 +0,2 dengan penambahan asam atau basa. (2) Medium tersebut dimasukkan sebanyak 10 mi ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham dalam keadaan terbalik.. (8)_ Disterikan dalam ctokiaf selama 16 menit pada suhu 121 °C dan tekanan 1,3 kafor?, Air Pengencer. Air pengencor ini cibuat dengan cara (1) Menyiapkan larutan induk buffer fosfat dengan cara melarutkan 34 g KH:PO, ke dalam 500 mi air suling, distur pH 7,2 +0,5 dengen NaOH 1 N diencerkan hingga 1 liter dalam labu uur. (2) Menyiapken larutan MgClz dengan cara melarutken 81,1 q MgCl.6H.O dengan air suling ssampai {liter dalam labu ukur, (3) Mencampurkan 1,25 ml laruten induk buffer fostat dan 5 mi larutan MgCl ke dalam 1 titer air sling. Dituangkan larutan di atas sebanyak (29 + 0,2) mi ke dalam botoll/erienmeyer berulup dan (940,2) ml ke dalam tabung reaksi, disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit. 9) Laruten Na,S,03 10 %. LLarutan ini dibuat dengan cara melerutken 15,6962 g Na,S,0;5H0 dengan air suing sarmpai 100 imi dalam labu ukur, hy) Larutan dinatrium EDTA Lanutan ini dibuat dengan cara malarutken 372 mg dinatrium EDTA dengan air suling sampel 1000 mi dalam labu ukur, pH diatur 6,5 dengan penambahan asam, dipipet 15 ml lanutan ini dan cdiencerkan dengan air suing sampai 100 mi dalam labu ukur. i) Laruten NeQH 1N Larutan ini dibuat dengan cara melerutkan 40 g NaOH dengan air suling 1000 ml dalam labu ukur. i) Laruten HCI Larutan ini dibuat dengan cara mengencerkan 83,33 ml HCI pekat dengan air suing sampei 1000 rl dalam labu ukur. = «) Tahap Pendugaan a) Siapkan 3 atau § tabung reaksi berisi medium Laur Tryptose Broth atau Lactose Broth untuk setiap seri pengenceran (minimal 3 seri pengenceran) ; b) Masukkan benda uj 10 mi, 1 mi dan 0,1 mi untuk contoh uii yang tidak dienoerkan ke dalam tabung reaksi tersebut menggunakan pipet ster, takukan dekat pembakar Bunsen atau lampu spirius ;UPT LABORATORIUM PUSAT MIPA UNIVERSITAS SEBELAS MARET gnokumen NO. | | Halaman 4 dans SURAKARTA sla! ea Tanggal Tefit: 2 Agustus 2011 L TOTAL COLIFORM Te Ce ) ‘Atau masukkan 1 mi benda uji dari masing-masing pengenceran untuk contoh uj yang diencerkan (seri pengenceran 10' ; 102; 10 dan seterusnya) ke dalam tabung reaksi tersebut menggunaken pipet ste, lakukan dekat pembekar Bunsen atau lempu spiritus ; 4) Inkubasi tabung reaksi berisi medium dan benda ufi pada suhu (35 + 0,5) *C atau (37 + 0:5) °C selama (24 + 2} jam ; e) Pertksa gas yang tertangkap dalam tabung Durham dan hasil asam yang ditendai dengan erubahan warna medium deri ungu menjadi Kuning ; f)Lanjutkan penguian ke tehap penegasan untuk benda yj yang menghaslkan gas alau asa, jk tidak dihasilkan lanjutkan inkubasi 24 jam lagi ; )Lanjutkan pengujan ke tahap penogesan jika dihasikan ges atau asam sesudah 24 jam inkubasi, jika tidak dihasikan maka benda uj tidak mengandung total bakteri golongen kali Tahap Penegasan 8) Koook perlahantahan tabung reaksi yang menghasikan gas atau asam pada tahap pendugaan ; b) Pindahkan sebenyak 1 atau 2 mata jarum inokulas! cairan dari masing.masing tabung reaks! ke dalam tabung reaksi yang berisi BGLB broth, lakukan dekat pembakar Bunsen atau lampu spiritus ; ©) Inkubasi tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu (35 +0,5)° C atau (37 +0,5}° C selama (48 +3) jam; d) Apabila menghasikan gas dalam waktu 48 jam menunjukkan kehadiran total bakteri qolongan Koti dalam benda uji e) Hitung iimiah tabung yeng renghasikan gas pada seliap seri pengenceran sebagai kombinasi tabung posiif; f)_Hitung jumfah total bakteri golongan kali sebagai JPT/100 ml menggunakan Tabel JPT atau rumus. Rumus Perhitungan ) Untuk volume benda uj yang diambil 10 mi, 1 ml, dan 0,1 mi serta kombinasi tabung positif sesuai ‘kolom 1 tabel JPT maka jumiah total bakteri koli langsung dibaca sesuai table tersebut. b) Untuk volume benda uj yang diambil dak sama dengan ketentuan dalam tabel JPT tetapi has kombinasi tabung positf sesuai dengan kolom 4 tabel JPT maka jumiah total bakteri kali dititung dengan men ggunakan rumus sebagai bericut : Jumiah total bakterikoli (JPT/100 ml) = Indeks JPT*) x ° Keterengan: Indeks JPT*) Y iperoleh dari kolom 1 tabel JPT volume benda uj terbesar Untuk hasil tabung yang positf tetapi tidak terdapat pada Kombinasi tabung posiff sesuai kolom 1 {abel JPT maka jumieh total bakteri kol dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : °) Ax100 Jura otal bake ko SPTA00 ih = = jumiah tabung yang ome (i bade da tung yong regnt = volume (mi) bends ui dalam semua tabung "yC L UPT LABORATORIUM PUSAT MIPA Dokumen No. UNIVERSITAS SEBELAS MARET | Halaman § dan S ween 2.4.4K-5.072011 Seed ‘Tanggal Terbit : 2 Agustus 2011 TOTAL COLIFORM Nonna i TABEL INDEKS JUMLAH PERKIRAAN TERDEKAT (JPT) UNTUK BERMACAN-MACAM HASIL. DENGAN KOMBINAS! 3 TABUNG DARI 10 ML, 3 TABUNG DARI 1 ML DAN 3 TABUNG DARI 0,1 ML CONTOH WI. 0 0 0 <3 0 0 1 3 <05 9 0 1 0 3 <05 3 o | 2 | 0 - : 1 0 0 4 <05 2 1 o 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 1" 3 36 1 2 0 1 3 26 2 0 0 9 1 36 2 0 1 4 3 37 2 1 0 ci 3 4 2 1 1 20 7 89 2 2 0 a 4 a 2 2 1 B 10 150 2 3 9 - = - 3 0 0 a a 120 3 Q 1 9 7 130 3 0 2 64 6 380 3 1 0 8 7 210 3 1 1 75 4 230 3 4 2 120 0 360 3 2 0 93 15 360 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 6 470 3 3 0 240 6 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 4100 150 4800