Comportamentul mioglobinei n diferite

medii de pH prin spectroscopie UV-vis

Plcean (Muntean) Ioana Mirela

IMPM II

1.Introducere
Mioglobina este o protein globular format dintr-un singur lan de 154 de
aminoacizi coninnd o grupare hem nfasurat de o apoprotein. Este format din opt alfahelixuri i un miez hidrofob.
Hemoglobina (care conine fier) este transportorul de oxigen n sngele animalelor,
iar mioglobina asigur stocarea oxigenului.
Printre proteinele transportoare de oxigen se numr: hemoglobina (Hb),
mioglobina (Mb), citoglobina (Cgb), neuroglobina (Ngb).
Partea responsabil de legarea oxigenului n globine este un centru de fier coordinat
de porfirin i care este denumit hem (Figura 1).

Fig. 1 Hemul
Structura tridimensional a hemului. Ionul de Fe++ este reprezentat de sfera gri
central; N albastru O rou, C bleu H alb
n procesele respiratorii, oxigenul este legat de ctre hemoglobin n plmni,
transportat prin snge pn la muchi, unde este cedat mioglobinei, pentru a fi depozitat i
utilizat.

2. Materiale i metode
Pentru a determina comportamentul mioglobinei n diferite medii, s-a ales ca
metod de investigare spectrometria UV-vis. Aceast metod este aplicabil deoarece
mioglobina absoarbe n acest domeniu, datorit posibilitii tranziiilor electronice - *, din
nveliul proteic, respectiv din hem (datorit legturilor duble conjugate), i a tranziiilor
electronice metal-ligand.
Domeniul util de colectare a spectrelor UV-vis este 260-800 nm, observndu-se un
maxim n jur de 280 nm, datorat materialului proteic, mai exact aminoacizilor aromatici.
De asemenea mioglobina prezenta un maxim de absorbie la aproximativ 407-409 nm
band numit Soret sau i n domeniul Vis dou benzi datorate tranziiilor metal-ligand.
Colectarea spectrelor se face n soluii diluate, pentru a se ncadra n condiiile de
liniaritate a legii Lambert-Beer, ns concentraia trebuie s fie suficient de mare pentru a
obine un spectru clar, cu absorbanele cuprinse n intervalul 0.1-1 uniti.
Etapele sunt:
Se prepar soluii tampon pentru valorile de pH 2-13.
Se pregtete o soluie stoc de mioglobin
Se nregistreaz spectrele UV-vis ale mioglobinei ferice n domeniul de pH
2-13
Se explic diferenele (sau lipsa lor) ntre spectrele de mai jos, i se
calculeaz valoarea pKa
Prepararea soluiilor tampon
n cadrul experimentelor efectuate n decursul laboratorului, s-a utilizat mioglobin
feric din inim de cal i urmtorii reactivi: acetat de sodiu, fosfat de potasiu, citrat de
sodiu CAPS.
S-au preparat soluii tampon de concentraie 0.2 M (200 mM) i pH=2-13.
Soluiile tampon se prepar n ap de cea mai nalt puritate posibil.
Soluiile astfel obinute, se eticheteaz i se pstreaz n sticle, de preferin nchise
la culoare i la rece. nainte de a fi folosite, trebuie aduse la temperatura camerei.

Prepararea soluiei de mioglobin

Pentru metaloproteinele din clasa mioglobinei se recomand pstrarea n stocuri de
1-5 mM, dac sunt n soluie.
ntr-un tub Eppendorf s-a preparat aproximativ 1,5 ml soluie stoc de mioglobin,
dizolvnd proteina n ap ntr-un volum egal de ap. Agitarea soluiei s-a realizat cu grij
pentru a evita denaturarea proteinei. Soluia de mioglobin se pastreaza la rece.
nregistrarea spectrelor UV-vis ale mioglobinei ferice
Pentru nregistrarea spectrelor, a fost nevoie de un spectru UV-vis, o cuv de 1 ml,
pipete de tip Eppendorf cu volum reglabil i soluiile tampon preparate la pH-uri de: 2-13.
nainte de colectarea spectrelor, aparatul a fost calibrat cu etalonul de soluie
tampon de pH corespunztor fiecrei probe. Dup calibrarea aparatului au fost adugai n
cuv 10 l de mioglobin. Concentraia mioglobinei n cazul fiecrei probe a fost aceeai.
Colectarea spectrelor s-a fcut n soluii diluate, pentru a se ncadra n condiiile de
liniaritate a legii Lambert-Beer. La lungimea de und maxim , s-a citit absorbana
soluiei; aplicndu-se legea lui Lambert-Beer:
A=*l*c,
nainte de a nregistra orice spectru, trebuie s facem linia de zero a aparatului cu o
soluie tampon sau ap, aceasta fiind soluia blanck. Astfel, injectm n cuv soluia tampon
pentru pH=6, pe care o aezm n spectrometru i nregistrm spectrul. Extragerea probelor
din soluiile stoc s-a fcut de fiecare dat cu un vrf de pipet nou de tip Eppendorf.
Rezultatele au fost prelucrate n Excel.

3. Rezultate i discuii
Influena pH-ului
La pH-uri mici se observ o scdere brusc a absorbanelor, ceea ce ne indic
denaturarea proteinei. n cazul acestor probe, concentraiile relativ mari de protoni 10 -1
10-4 M, afecteaz legturile de hidrogen intramoleculare care se rup, distrugnd structura
teriar a proteinei. Odat cu creterea pH-ului i implicit scderea excesului de protoni din
soluie, legturile dintre lanurile de aminoacizi nu mai sunt afectate de prezena H +. n
acest caz, intensitatea benzii Soret nregistrat este in jurul valorii de 400nm . In (figura 2)

Fig. 2 Spectre UV-vis ale mioglobinei ferice

n domeniul 600-650 nm spectrele se intersecteaz ntr-un punct, numit punct

isosbestic, care indic prezena n probe a dou specii aflate n echilibru (Figura 3).

Fig.3 Punctul isosbestic

Pentru determinarea pKa, s-a reprezentat grafic absorbana corectat soluiei n
funcie de pH, valoarea acesteia fiind determinat din grafic. Absorbana corectat s-a
calculat folosind formula:
Ac = Ai - Amin
Ac absorbana corectat, Ai absorbana la pHi, Amin absorbana minim n
intervalul de pH 5-12, la aceeai lungime de und. Este de preferat alegerea lungimii de
und la care se calculeaz pKa s fie aleas din zona n care benzile nu se suprapun, i
diferenele de absorban sunt sesizabile, cum ar fi banda Soret.

Lungimea de und aleas a fost 408 nm.

Figura 4 .Determinarea pKa-ului mioglobinei

Modificrile care apar la spectrele din domeniul de pH 5-13, sunt datorate tipului de
ligand al Fe2+ i strii de spin a acestui centru metalic.
Pe domeniul de pH n care proteina este n stare nativ, pH>4, se poate defini o
constant pKa similar constantei de aciditate din chimia analitic, care ns indic punctul
de echivalen dintre Fe n stare de spin nalt sau jos. Graficul din Figura 4 arat
dependena echilibrului [Fe-OH2] [Fe-OH] n funcie de pH, iar pKa determinat este 13.
4. Concluzii
Din datele obinute s-a observat c matricea proteic a fost distrus doar la pH-uri
mici, n experimentul nostru la pH<5, ns prezena excesiv sau absena protonilor, n
soluiile apoase, poate influena tria ligandului, prin deprotonarea apei legat la fier.
Capacitatea de coordinare a metalului este influenat de starea sa de oxidare, n
cazurile prezentate Fe n starea superioar de oxidare este hexacoordinat, iar n starea
inferioar fiind pentacoordinat.
La pH acid are loc denaturarea mioglobinei, n schimb la pH bazic nu se
denatureaz .