Avaliação Da Concentração e Dos Tipos de Flavonoides Na

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA
Ariane Arajo ssimos
Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

Prpolis Utilizando Mtodos Quimiomtricos de Classificao e
Calibrao
Belo Horizonte, MG
2014
UFMG/ ICEx/ DQ 1012

D. 551
ARIANE ARAJO SSIMOS
Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

Prpolis Utilizando Mtodos Quimiomtricos de Classificao e
Calibrao
Dissertao apresentada ao Departamento de

Qumica do Instituto de Cincias Exatas da
Universidade Federal de Minas Gerais como
requisito parcial para obteno do grau de
Mestre em Qumica - Qumica Analtica
Belo Horizonte
2014
III
AGRADECIMENTOS
Deus por ter iluminado meu caminho e me dado foras

Ao meu orientador, Prof. Paulo Barbeira, pela oportunidade de ter desenvolvido esse trabalho
sobre sua orientao, pelos ensinamentos e apoio.
Agradeo aos meus pais, por me ajudarem a suportar os desafios, pelo carinho e amor, e por
sempre acreditarem na minha capacidade. Obrigada pela educao que me deram, por terem
transmitido os mais valorosos saberes e compartilhado comigo cada vitria.
Ao meu namorado, Leo, pela pacincia e amor, pelos conselhos valorosos e por ter estado ao
meu lado em todos os momentos. A sua presena foi essencial para que eu tivesse foras para
chegar at aqui.
minha irm, Tassiane, minha v Billa, e tia Dri e tia Graa, pelos momentos de alegria,
por sempre terem me incentivado e por entenderem os momentos de ausncia.
Agradeo a tambm a todos do laboratrio LIMA, Rosilene, Meliza e Danniel pelas conversas
e companheirismo. Agradeo tambm a Silvinha, quase membro do laboratrio LIMA, por
ter me proporcionado tantos momentos divertidos.
Cristina Bernardes, pela amizade, pelos inmeros conselhos, pelos momentos de desabafo e
por ter me ensinado tanto durante esses anos. Em vrios momentos difceis as suas palavras
foram essenciais para que eu conseguisse seguir em frente. No teria chegado at aqui sem
sua ajuda!
s estagirias Tatiane e Thlia, pelo auxlio com a parte experimental.
Mirra, por toda a ajuda e disposio nos estudos cromatogrficos.
CAPES pelo apoio financeiro
Muito Obrigada a todos!!!!
IV
RESUMO
Neste trabalho foram desenvolvidos mtodos analticos para avaliar a qualidade dos
extratos alcolicos comerciais de prpolis, baseados em mtodos quimiomtricos como a
calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais e a anlise discriminante por
mnimos quadrados parciais. Inicialmente, foram otimizadas as condies experimentais da
metodologia colorimtrica utilizada para a determinao da concentrao de flavonoides na
prpolis, que um dos parmetros de qualidade regulamentado pelo MAPA (Ministrio da
Agricultura, Pecuria e Abastecimento), para que pudesse ser aplicada aos extratos comerciais
de prpolis. Foram avaliados o volume de amostra utilizado nas anlises, a concentrao de
nitrato de alumnio e de acetato de ltio e o tipo de solvente. Espectros UV-Vis das amostras
diludas foram utilizados para a construo de um modelo PLS para a determinao da
concentrao de flavonoides nas amostras de prpolis. A metodologia quimiomtrica proposta
mostrou-se eficiente alm de ser muito menos demorada, trabalhosa, e utilizar uma
quantidade de reagente bem menor do que a metodologia colorimtrica tradicional. Na
segunda parte os espectros UV-Vis obtidos anteriormente foram utilizados para a construo
de um modelo PLS-DA para classificar as amostras de acordo com o tipo de composto
fenlico presente. O modelo construdo foi capaz de discriminar as amostras de extratos
comerciais de prpolis em quatro classes quanto ao tipo e concentrao dos compostos
fenlicos presentes e mostrou ser de grande utilidade por prever quais amostras eram
irregulares quanto concentrao de flavonoides. Anlises cromatogrficas foram feitas com
amostras representativas das classes observadas no modelo PLS-DA e foi possvel perceber
que as principais substncias responsveis pela separao nas quatro classes foram o
flavonoide pinocembrina, e os cidos fenlicos artepillin C, cido p-cumrico e cido ferlico.
Palavras chaves: prpolis, flavonoides, compostos fenlicos, quimiometria.
ABSTRACT
In this work, analytical methods were developed to assess the quality of commercial
alcoholic extracts of propolis, based on chemometric methods such as Partial Least Squares
Multivariate Calibration (PLS) and Partial Least Squares Discriminating Analysis (PLS-DA).
Initially, the experimental conditions of the spectrophotometric method used for determining
the concentration of flavonoids in propolis , which is a quality parameter regulated by MAPA
(Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento) were optimized , so it could be applied
to commercial extracts of propolis . The volume of sample used in the analysis, the
concentration of aluminum nitrate and lithium acetate, and the type of solvent were evaluated.
The UV-Vis spectra of the diluted samples were used for the construction of a PLS model for
determining the concentration of flavonoids in the samples of propolis. The chemometric
methodology proposed has shown to be very efficient in addition of be less time-consuming ,
laborious, and using a much smaller amount of reagent than the traditional spectrophotometric
method . In the second part the UV-Vis spectra obtained previously were used for the
construction of a PLS -DA model to classify the samples according to the type of phenolic
compound. The constructed model was able to discriminate samples of commercial extracts of
propolis in four classes according to the type and concentration of phenolic compounds and
proved to be very useful for predicting which samples were irregular in concentration of
flavonoids. Chromatographic analyzes were performed on representative samples of the
classes observed in the PLS DA, and it was revealed that the main substances responsible for
the separation in the four classes were the flavonoid pinocembrine and the phenolic acids
artepillinC, p-coumaric acid and ferulic acid.
Keywords: propolis, flavonoids, phenolic compounds, chemometrics.
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Apis mellifera ........................................................................................................ 1

Figura 2: Produo cientfica sobre prpolis (Chemical Abstracts). (a) Em relao dcada
de publicao (b) Em relao ao tipo de publicao............................................................... 2
Figura 3: Baccharis dracunculifolia, conhecida como alecrim-do-campo, fonte da prpolis
verde ...................................................................................................................................... 4
Figura 4: Estrutura qumica do artepillin C. .......................................................................... 4
Figura 5: Dalbergia ecastophyllum, conhecida como rabo de bugio, fonte da prpolis
vermelha. ............................................................................................................................... 5
Figura 6: Estrutura bsica dos flavonoides ............................................................................ 9
Figura 7: Flavonoides encontrados na prpolis.................................................................... 10
Figura 8: Espectro tpico de um extrato alcolico de prpolis.............................................. 11
Figura 9 : Esqueleto de uma flavona (a) ; Esqueleto de um flavonol (b) .............................. 13
Figura 10 : Esqueleto de uma isoflavona (a); Esqueleto de uma flavanona (b); Esqueleto de
uma flavanonol (c) ............................................................................................................... 13
Figura 11: Espectros UV-Vis tpico das classes de flavonoides. a) flavona (acacetina); b)
flavonol (quercetina);
c) flavanonol (taxifolina); d) isoflavona (iridina); e) flavanona
(pinocembrina). .................................................................................................................... 14
Figura 12: Dados organizados em uma matriz X ................................................................. 16
Figura 13: Distribuio de variveis em torno do eixo cartesiano. a) dados originais b) dados
centrado na mdia. ............................................................................................................... 17
Figura 14: Decomposio dos blocos de dados X e y. ......................................................... 19
Figura 15: Reao de formao do complexo entre os flavonoides e Al(III) ........................ 28
Figura 16: Solues obtidas da complexao do Al(III) com os flavonoides presentes nas
amostras de prpolis ............................................................................................................ 32
Figura 17: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual volume de amostra deveria
ser usado .............................................................................................................................. 36
Figura 18: Dependncia da absorbncia do complexo alumnio-quercetina em diferentes pH e
em diferentes nveis de fora inica...................................................................................... 37
Figura 19: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de
acetato de ltio ...................................................................................................................... 38
VII
Figura 20: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para uma
amostra de prpolis .............................................................................................................. 38
Figura 21: Espectros obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para o
padro quercetina ................................................................................................................. 39
Figura 22: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de
nitrato de alumnio ............................................................................................................... 40
Figura 23: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de nitrato de alumnio para
uma amostra de prpolis e o padro (quercetina) .................................................................. 40
Figura 24: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis obtido por outros
autores: (a) [78] (b) [79] (c) [60] (d) [59] ; cromatogrma obtido nesse trabalho: (e) . 1)
cido cafico 2) cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6)
naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12)
artepillin C. .......................................................................................................................... 46
Figura 25: Curva analtica obtida utilizando como padro a quercetina ............................... 47
Figura 26: Espectro dos complexos formados entre os flavonoides presentes nas amostras de
prpolis e o alumnio, de acordo com a concentrao de flavonoides. ................................... 49
Figura 27: Histograma com as concentraes de flavonoides para as amostras de extrato de
prpolis ................................................................................................................................ 50
Figura 28: Relao entre os parmetros teor de extrato seco e concentrao de flavonoides. (
Os valores mminos estipulados pelo MAPA encontram-se marcados com linha tracejada). . 51
Figura 29: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis. 1) cido cafico 2)
cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6) naringenina 7)
kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12) artepillin C. ............ 52
Figura 30: Espectros de absoro na regio UV-Vis das amostras diludas em etanol 95%
utilizadas na construo do modelo ...................................................................................... 57
Figura 31: Coeficientes de regresso do modelo PLS ......................................................... 59
Figura 32: Grfico de resduos versus concentrao de flavonoides determinado pelo mtodo
de referncia. () Amostras de calibrao; () Amostras de validao. ............................. 60
Figura 33: Valores da concentrao de flavonoides prevista em funo da concetrao de
flavonoides medida.
() Amostras de calibrao; () Amostras de validao. ............... 61
Figura 34: Espectros das amostras de extrato de prpolis na presena de Al(III) ................. 67
Figura 35: Escores do modelo PCA. (a) CP1 vs CP2 (b) CP1 vs CP3 ................................. 68
Figura 36: Espectros das amostras separados de acordo com as classes observadas no PCA 69
VIII
Figura 37: Grfico dos pesos em CP1, CP2 e CP3 para o modelo PCA. .............................. 70
Figura 38: Amostras classificadas pelo modelo PLS-DA. Os smbolos cheios correspondem
s amostras de validao, os smbolos vazios s de calibrao. (a) Classe 1 (b) Classe 2 (c)
Classe 3 (d) Classe 4 ............................................................................................................ 72
Figura 39: Coeficientes de regresso para o modelo PLS-DA.............................................. 73
Figura 40: Cromatograma de amostras representativas das classes observadas no PLS-DA. 1)
cido cafico 2) cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6)
naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12)
artepillin C. .......................................................................................................................... 74
IX
LISTA DE TABELAS
TABELA I: Classificao da Prpolis Brasileira de acordo com caractersticas fsico-qumicas
e origem geogrfica................................................................................................................ 3
TABELA II: Requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA para a comercializao da
prpolis bruta e dos extratos hidroalcolicos .......................................................................... 6
TABELA III: Principais cidos fenlicos derivados do cido benzoico .................................. 7
TABELA IV: Principais cidos fenlicos derivados do cido cinmico .................................. 8
TABELA V: Alguns compostos fenlicos e suas bandas de absoro no ultravioleta ........... 12
TABELA VI: Condies Cromatogrficas de estudos que utilizaram HPLC para a
quantificao dos flavonoides .............................................................................................. 25
Tabela VII: Resumo de alguns trabalhos que utilizaram CG para a quantificao dos
flavonoides .......................................................................................................................... 27
TABELA VIII: Resumos de alguns trabalhos que utilizaram a espectrofotometria para a
quantificao dos flavonoides. ............................................................................................. 30
TABELA IX: Amostras selecionadas para avaliao do volume a ser utilizado nos ensaios.. 36
TABELA X: Programao do gradiente para a separao do cido cafico, cido p-cumrico e
cido ferlico ....................................................................................................................... 42
TABELA XI: Programa de gradiente para a separao do cido trans-cinmico, quercetina,
naringenina, kaempferol e pinocembrina .............................................................................. 43
TABELA XII: Gradiente de eluio utilizado para a separao dos flavonoides, crisina,
acacetina e galangina ........................................................................................................... 44
TABELA XIII: Programao do gradiente final ................................................................... 44
TABELA XIV Deslocamentos batocrmicos observados e absoro mxima das solues dos
flavonoides na adio de Al(III) ........................................................................................... 48
TABELA XV: Estrutura e tempo de reteno (t r) dos compostos avaliados na cromatografia 53
TABELA XVI: Parmetros obtidos das curvas de calibrao por HPLC .............................. 54
TABELA XVII: Concentrao de flavonoides nas amostras pelo mtodo cromatogrfico e
espectrofotomtrico.............................................................................................................. 55
TABELA XVIII: Principais figuras de mrito para o modelo PLS ........................................ 62
TABELA XIX: Porcentagens de varincia explicada pelo modelo PLS-DA ......................... 70
TABELA XX: Sensibilidade e Especificidade do modelo PLS-DA ...................................... 71
LISTA DE ABREVIATURAS
CAS: do ingls, Chemical Abstracts Service.

CV: do ingls, Cross Validation.
DAD: do ingls, Diode Array Detector.
DNP: 2,4- dinitrofenilhidrazina.
DPR: Desvio Padro Relativo.
Er: Erro Relativo.
ESI-MS: do ingls, Electrospray Ionization Mass Spectrometry.
GC: do ingls, Gas Chromatography.
GC-MS: do ingls, Gas Chromatograph Mass Spectrometry.
HCA: do ingls, Hierarchical Cluster Analysis.
HPLC: do ingls, High Performance Liquid Chromatography.
HPLC-RP: do ingls, High Performance Liquid Chromatograph Reverse Phase
HRGC: do ingls, High-Temperature High-Resolution Gas Chromatograph.
MAPA: Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.
PAD: do ingls, Photodiode Array Detector.
PCA: do ingls, Principal Component Analysis.
PLS: do ingls, Partial Least Squares.
PLS-DA: do ingls, Partial Least Squares Discriminant Analysis.
RMSE: do ingls, Root Mean Square Error.
RMSEC: do ingls, Root Mean Square Error of Calibration.
RMSECV: do ingls, Root Mean Square Error Cross Validation.
RMSEP: do ingls, Root Mean Square Error of Prediction.
UV-Vis: Ultravioleta-visvel.
XI
VL: Varivel Latente
XII
SUMRIO
1.
Introduo..................................................................................................................... 1
1.1
Prpolis ......................................................................................................... 1
1.2 Composio Qumica ........................................................................................ 5

1.3 Compostos fenlicos ......................................................................................... 7
1.3.1 cidos Fenlicos ........................................................................................ 7
1.3.2 Flavonoides ............................................................................................. 8
1.3.3 Prpolis e Espectroscopia Eletrnica ........................................................ 10
1.4
Quimiometria .............................................................................................. 15
1.4.1 A Organizao dos Dados ...................................................................... 15

1.4.2 Pr-processamento dos Dados .................................................................. 16
1.4.3 Reconhecimento de Padres .................................................................. 17
1.4.4 Calibrao Multivariada......................................................................... 18
1.4.5 Anlise Discriminante por Mnimos Quadrados Parciais PLS-DA....... 21
2.
Objetivos .................................................................................................................... 22
3.
Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para Quantificao de
flavonoides nos extratos comerciais de prpolis ................................................................... 23

3.1
Mtodos Analticos para a Determinao de Flavonoides na Prpolis .......... 23
3.2 Materiais e Mtodos ........................................................................................ 31

3.2.1 Amostras .................................................................................................. 31
3.2.2 Reagentes ................................................................................................. 31
3.2.3 Metodologia: mtodo espectrofotomtrico ................................................ 31
3.2.4 Metodologia: mtodo cromatogrfico ....................................................... 33
3.2.5 Tratamento Estatstico dos Resultados ...................................................... 33
3.2.6 Anlise Quimiomtrica ............................................................................. 34
3.3 Resultados e Discusso ................................................................................... 35
3.3.1 Mtodo espectrofotomtrico ajuste das condies experimentais ........... 35
XIII
3.3.2 Metodologia cromatogrfica ajuste das condies experimentais ........... 41

3.3.3 Determinao da concentrao de flavonides nos extratos comerciais de
prpolis pelo mtodo espectrofotomtrico .................................................................... 47
3.3.4 Determinao da concentrao de flavonoides nos extratos comerciais de
prpolis pelo mtodo cromatogrfico ........................................................................... 52
3.3.5 Construo do modelo de calibrao multivariada .................................... 56
3.4 Concluso ....................................................................................................... 62
4.
Utilizao dos complexos de Alumnio e PLS-DA para a discriminao de extratos
comerciais de prpolis ......................................................................................................... 64

4.1 Materiais e Mtodos ........................................................................................ 64
4.1.1 Amostras .................................................................................................. 64
4.1.2 Reagentes ................................................................................................. 65
4.1.3 Metodologia espectrofotomtrica ............................................................. 65
4.1.4 Metodologia cromatogrfica ..................................................................... 65
4.1.5 Anlise Quimiomtrica ............................................................................. 66
4.2 Resultados e Discusso ................................................................................... 66
4.2.1 Construo do modelo PLS-DA ............................................................... 66
4.2.2 Concluso ................................................................................................ 76
5.
Consideraes Finais .................................................................................................. 77
6.
Referncias Bibliogrficas .......................................................................................... 79
1 - Introduo
1. INTRODUO
1.1 Prpolis
A prpolis (CAS No. 9009-62-5) uma resina de colorao e resistncia variada

produzida pelas abelhas atravs da mistura de substncias coletadas de diversas partes das
plantas (brotos, botes florais e exsudatos resinosos) com secrees produzidas por seu
organismo, cera e plen para a obteno do produto final. So conhecidas atualmente mais de
20 mil espcies de abelhas sendo que as da espcie Apis mellifera (Figura 1) so as mais
conhecidas e difundidas entre os apicultores para a produo de prpolis e mel. [1-5]
Figura 1: Apis mellifera

FONTE: www.ciencias.ies-bezmiliana.org (Acessado em 11/12/13)
O termo prpolis deriva do grego: pro em defesa de, e polis cidade. A prpolis
utilizada pelas abelhas para fechar frestas da colmeia, embalsamar insetos mortos e manter o
ambiente assptico. [3, 6-8]
O uso da prpolis na medicina popular remonta a pelo menos 300 a.C.. No Egito
antigo a prpolis era utilizada no embalsamento dos mortos. Tambm h registros da
utilizao da prpolis pelos gregos e romanos. Suas propriedades medicinais foram
reconhecidas por Aristteles, Dioscrides, Plnio e Galeno. As propriedades biolgicas da
prpolis tambm foram reconhecidas por outras civilizaes, como os Incas que a
empregavam como antipirtico. [2, 4, 6, 9;10]
1 - Introduo
A popularizao do uso da prpolis se deve as diversas propriedades biolgicas que

so atribudas a ela, como efeito hepatoprotetor, atividade antitumoral, atividade antioxidante,
atividade microbiana, atividade anti-inflamatria, efeito contra a replicao do vrus HIV-1,
atividade antifngica, imunomodulatria, entre outras. [6;7, 11-14]
O primeiro trabalho indexado no Chemical Abstract sobre prpolis foi publicado em
1903 e a primeira patente foi escrita em 1904 (USA-Composition for treating pins and piano
strings) [15]. A Figura 2 mostra o nmero de publicaes sobre prpolis ao longo das dcadas
e os tipos de documentos publicados. O interesse global a respeito da pesquisa sobre prpolis
se deve a diversidade das propriedades biolgicas e ao alto valor agregado. [2, 7, 9]
(a)
(b)
Figura 2: Produo cientfica sobre prpolis (Chemical Abstracts). (a) Em relao dcada de
publicao (b) Em relao ao tipo de publicao.
1 - Introduo
Em relao produo de prpolis, segundo Toreti et. al. [2] o Brasil exportou em
2012 cerca de 40 toneladas de prpolis, correspondendo a cerca de cinco milhes de dlares.
O mercado asitico o principal destino dessas exportaes, sendo que 92% de toda a
prpolis in natura consumida no Japo de origem brasileira e o frasco do extrato alcolico
da substncia vendido a US$ 110. Em torno de 70% da produo de prpolis do Brasil vem
de Minas Gerais, onde foram produzidas em 2012 cerca de 30 toneladas de prpolis.
importante ressaltar que o preo da prpolis varia de acordo com o tipo, pois o valor do
produto est relacionado com sua composio qumica e atividades biolgicas, que variam em
funo de sua origem botnica. [2, 16]
Recentemente, as prpolis brasileiras foram classificadas em 13 tipos de acordo com a
composio qumica e atividades biolgicas (Tabela I). Cinco tipos so provenientes da regio
sul, um proveniente do sudeste e centro-oeste, e sete do nordeste. Os tipos que apresentaram
melhor atividade antimicrobiana foram G3, G6 e G12. [2, 17]
TABELA I: Classificao da Prpolis Brasileira de acordo com caractersticas fsico-qumicas e origem

geogrfica
Tipo
Cor
Origem da Prpolis
G1 (RS5)
Amarelo
Sul
G2 (RS1)
Marrom
Sul
G3 (PR7)
Marrom Escuro
Sul
G4 (PR8)
Marrom
Sul
G5 (PR9)
Marrom Esverdeado
Sul
G6 (BA11)
Marrom Avermelhado
Nordeste
G7 (BA51)
Marrom Esverdeado
Nordeste
G8 (PE5)
Marrom Escuro
Nordeste
G9 (PE3)
Amarelo
Nordeste
G10 (CE3)
Amarelo Escuro
Nordeste
G11 (PI11)
Amarelo
Nordeste
G12 (SP12) Verde ou Marrom Esverdeado

G13 (AL)
Vermelha
Sudeste
Nordeste
Fonte: Adaptado de Toreti et. al. , 2013. [2]
1 - Introduo
A prpolis da regio sudeste do Brasil uma das mais bem cotadas no mercado
internacional por se tratar da prpolis verde, cuja origem botnica a planta Baccharis
dracunculifolia (Figura 3), conhecida popularmente como alecrim-do-campo. Os principais
componentes da prpolis verde so os fenil propanides prenilados, que so cidos fenlicos
contendo um grupo prenila. Essas substncias so formadas a partir do cido cinmico e seus
derivados, como o artepillin C (cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico) (Figura 4), marcador
qumico da prpolis verde, sendo a substncia majoritria. A cotao mdia da prpolis verde
de Minas Gerais no exterior da ordem de US$ 120 o quilo. [14, 18-21]
Figura 3: Baccharis dracunculifolia, conhecida como alecrim-do-campo, fonte da prpolis verde

FONTE: revistaplaneta.terra.com.br; www.reidaverdade.net; www.panoramio.com (Acessado em
02/01/14)
O
OH
HO
Figura 4: Estrutura qumica do artepillin C.
1 - Introduo
O 13 tipo de prpolis foi o mais recentemente classificado. Essa prpolis originria

da regio de mangue do estado do Alagoas, e sua origem botnica a leguminosa Dalbergia
ecastophyllum (Figura 5), conhecida popularmente como rabo de bugio devido sua
colorao vermelha intensa. A prpolis vermelha vem demonstrando vrias atividades
biolgicas e pode valer cinco vezes mais que a prpolis verde. O produto chega a custar
R$ 500 o quilo no mercado externo. [15, 22-23]
Figura 5: Dalbergia ecastophyllum, conhecida como rabo de bugio, fonte da prpolis vermelha.
FONTE: meliponariojandaira.blogspot.com; www.agricultura.al.gov.br; www.portaldenoticias.net
(Acessado em 02/01/14)
1.2 Composio Qumica

A composio qumica da prpolis muito complexa e depende da biodiversidade da
flora regional, mas de forma geral ela constituda de aproximadamente 30% de ceras, 50%
de resinas vegetais, 10% de leos volteis, 5% de plen e 5% de outras substncias, incluindo
compostos orgnicos e microelementos. [2, 24-25]
Mais de 300 constituintes j foram descritos em prpolis de diferentes origens. Alguns
componentes esto presentes em todas as amostras de prpolis, enquanto outros s so
encontrados em prpolis derivadas de espcies especficas de plantas. Entre os constituintes
da prpolis temos os flavonoides (como a galangina, quercetina, pinocembrina e kaempferol),
fenis, cidos aromticos e steres, aldedos e cetonas, terpenides e fenil propanides (como
1 - Introduo
os cidos cafico e clorognico), esteroides, aminocidos, polissacardeos, cidos graxos e

outros componentes em pequenas quantidades. [2, 7, 17, 26]
Dentre todos esses compostos qumicos destacam-se os compostos fenlicos, que so
os cidos fenlicos e flavonoides, pois a eles so atribudas as diversas atividades biolgicas
presentes na prpolis. Na Europa, Amrica do Norte e oeste da sia, a fonte botnica
predominante para a produo da prpolis o exsudato do boto de lamo (Populus sp.)
Estudos mostram que a prpolis de locais com clima temperado possuem composio qumica
similar, sendo que os principais compostos bioativos so os flavonoides. J as prpolis
originrias de locais com clima tropical e subtropical possuem composio qumica muito
mais complexa, sendo que os principais compostos bioativos so os cidos fenlicos, o que
confere propriedades biolgicas diferenciadas. [6-7, 17, 27-29]
No Brasil a prpolis comercializada principalmente sobre a forma de extratos
alcolicos e aquosos, e podem ser encontrados extratos da prpolis verde e vermelha e outros
sem denominao. Os produtos apcolas so registrados no Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento (MAPA) e apresentam legislaes especficas. Para assegurar a
qualidade da prpolis, tanto na forma bruta quanto na forma de extrato, utilizam-se as normas
do Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade da Prpolis. Na Tabela II podem ser
verificados alguns requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA. [30]
TABELA II: Requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA para a comercializao da prpolis bruta
e dos extratos hidroalcolicos
Parmetros
Prpolis Bruta
Extrato Hidroalcolico
Perda por dessecao
Mximo de 8% (m/m)
Cinzas
Mximo de 5% (m/m)
Cera
1% do extrato seco
Compostos fenlicos
Mnimo de 5% (m/m)
Mnimo de 0,50% (m/m)
Flavonoides
Mnimo de 0,50 (m/m)
Mnimo de 0,25% (m/m)
Atividade de Oxidao Mximo de 22 segundos
Mximo de 22 segundos
Massa Mecnica
Mximo de 40% (m/m)
Solveis em Etanol
Mnimo de 35% (m/m)
Extrato Seco
11% (m/v)
Teor alcolico
Mximo de 70 GL (v/v)
Metanol
Mximo 0,40 mg/L
1 - Introduo
Entre os parmetros preconizados pelo MAPA para os extratos alcolicos est a

concentrao de flavonoides, cujo mnimo exigido de 0,25% (m/m). Por estar diretamente
ligada atividade biolgica da prpolis, a determinao da concentrao dos flavonoides
muito importante e agrega valor econmico ao produto.
1.3 Compostos fenlicos

1.3.1 cidos Fenlicos
Os cidos fenlicos pertencem ao grupo dos compostos fenlicos e so caracterizados

por possurem um anel benznico, um grupamento carboxlico e um ou mais grupamentos
hidroxilas e/ou metoxila na molcula. Eles so divididos formalmente em derivados do cido
benzoico (Tabela III), como cido glico, e derivados do cido cinmico (Tabela IV), como o
cido p-cumrico. Os cidos fenlicos possuem atividade antioxidante que geralmente
determinada pelo nmero de hidroxilas presentes na molcula e tambm com a proximidade
do grupo CO2H com o grupo fenil. Quanto mais prximo este grupo estiver do grupo fenil,
maior ser a capacidade antioxidante do grupo hidroxila na posio meta. [31;32]
TABELA III: Principais cidos fenlicos derivados do cido benzoico
Derivados do cido Benzoico
R2
Substituintes
R1 = OH (cido Saliclico)
R1 = R4 = OH (cido Gentsico)
R1
R3 = OH (cido p- hidroxibenzoico)
R3
COOH
R4
R2 = R3 = OH (cido Protocatequnico)
R2 = OCH3 ; R3 = OH (cido Vanlico)
R2 = R3 = R4 = OH (cido Glico)
R2 = R4 = OCH3; R3 = OH (cido Sirngico)
1 - Introduo
TABELA IV: Principais cidos fenlicos derivados do cido cinmico
Derivados do cido Cinmico
Substituintes
R1 = R2 = R3 = R4 = H (cido cinmico)
R1 = OH (cido o- cumrico)
R2
R3
R1
R2 = OH (cido m- cumrico)
CH CH COOH
R3 = OH (cido p- cumrico)
R2 = R3 = OH (cido Cafico)
R4
R2 = OCH3; R3 = OH (cido Ferlico)

R2 = R4 = OCH3; R3 = OH (cido Sinpico)
Os principais cidos fenlicos presentes na prpolis so cido glico, vanlico,

ferlico, p-cumrico, cafico e sirngico. [10, 31]
1.3.2 Flavonoides
O hngaro Albert Szent-Gyrgi, descobriu os flavonoides em 1936. Baseado em

evidncias de seus experimentos ele levantou a hiptese de ter descoberto uma nova vitamina.
Apesar de sua suposio de que os flavonoides eram vitaminas estar errada, a pesquisa a
respeito dessas substncias, e seu potencial benfico, continuou e cresceu intensamente nos
anos que se passaram. [33]
A palavra flavonoide tem origem no latim flavus, que significa amarelo. No incio o
conceito de flavonoide somente inclua grupos de compostos que apresentavam a cor amarela.
Hoje, este termo inclui tambm compostos menos coloridos e incolores, bem como as
antocianinas que apresentam colorao vermelha ou azul. Esses compostos constituem uma
grande classe de substncias de origem natural, cuja sntese no ocorre na espcie humana,
mas so encontrados em vegetais, legumes, frutas, chs de ervas, mel, prpolis, entre outros
produtos de consumo cotidiano. [31, 33]
Os flavonoides absorvem radiao eletromagntica na faixa do ultravioleta (UV) e do
visvel e assim apresentam um papel de defesa das plantas perante a radiao UV da luz solar.
Eles tambm representam uma barreira qumica de defesa contra microrganismos (bactrias,
1 - Introduo
fungos e vrus), insetos e outros animais herbvoros. Alm disso, os flavonoides atuam
tambm em relacionamentos harmnicos entre plantas e insetos, sendo que uma das funes
dessas substncias conferir colorao s flores atraindo polinizadores. [31, 34;35]
Estruturalmente, os flavonoides so substncias aromticas com 15 tomos de carbono
(C15), dispostos em uma configurao C6-C3-C6, como pode ser visto na Figura 6. [33, 36]
O
A
C
O
Figura 6: Estrutura bsica dos flavonoides
Mltiplos grupos hidroxila, glicosil, oxignios ou grupos metil podem estar ligados
estrutura bsica do flavonoide. Dependendo do estado de oxidao do anel heterocclico, os
flavonoides podem ser separados em diversas classes, tais como: flavonas, flavonis,
flavanonis
flavanonas,
antocianidinas,
isoflavonoides,
auronas,
neoflavonoides,
biflavonoides, catequinas e seus precursores metablicos conhecidos como chalconas, e

podem ocorrer como agliconas, glicolsilados e como derivados metilados. J foram
identificadas mais de 4000 substncias pertencentes ao grupo dos flavonoides. [10, 33, 37]
A Figura 7 mostra estruturas de flavonoides comumente encontrados na prpolis: a
quercetina, miricetina e a galangina so flavonis; a apigenina, a crisina e o canferol so
exemplos de flavonas e a pinocembrina e a naringenina so flavanonas. [10, 33, 35;36, 38]
1 - Introduo
10
Figura 7: Flavonoides encontrados na prpolis
Vrios estudos conduzidos nos ltimos anos relatam o importante papel dos
flavonoides na sade humana. Propriedades como atividade antioxidante, antifngica,
antiprotozorios, antivirais, anti-inflamatria, antimicrobiana, anticancergena, entre outras,
tm sido relatadas na literatura. [33;34]
1.3.3 Prpolis e Espectroscopia Eletrnica
Os flavonoides e cidos fenlicos presentes na prpolis apresentam absoro na regio

do ultravioleta-visvel devidos presena do cromforo do benzeno. As transies que
resultam em absoro de radiao eletromagntica nessa regio do espectro ocorrem entre
nveis de energia eletrnicos, sendo o cromforo do benzeno do tipo *. [39;40]
O espectro eletrnico dos extratos de prpolis tambm um dos parmetros
regulamentados pelo MAPA, que estabelece que o espectro de absoro de radiaes no UVVis deve apresentar bandas caractersticas das principais classes de flavonoides entre 200 e
400 nm (Figura 8). [30]
1 - Introduo
11
Figura 8: Espectro tpico de um extrato alcolico de prpolis
O espectro ultravioleta do extrato alcolico de prpolis consiste em duas bandas de

absoro nas faixas de 280-500 nm (banda I) e entre 190-240 nm (banda II). A posio
precisa dessas bandas e as intensidades dos mximos fornecem informaes sobre a natureza
do composto fenlico e de seu padro de substituio. Na Tabela V tm-se as bandas de
absoro no UV-Vis para alguns compostos fenlicos. [40]
1 - Introduo
12
TABELA V: Alguns compostos fenlicos e suas bandas de absoro no ultravioleta
Nome do composto
cido 3,5-diprenil-p-cumrico
cido 4-hidroxi-benzoico
cido cafico
cido glico
cido p-cumrico
cido saliclico
cido sinpico
cido sirngico
cido vanilnico
Apgenina
Canferol
Crisina
Flavanona
Flavona
Galangina
Pinocembrina
Quercetina
Vanilina
II
(nm)
310
257
325
273
309
305
325
273
261
265
265
269
253
253
267
299
253
291
I
(nm)
293
337
365
313
321
295
359
369
309
Fonte: Adaptado de CHANG, 2005. [41]
Os espectros em metanol das flavonas e flavonis apresentam duas bandas de maior

absoro na regio de 240-400 nm. Esses dois picos so referidos comumente como banda I
(normalmente de 300-380 nm) e banda II (normalmente em 240-280 nm). A banda I est
associada com a absoro do anel B, e a banda II com a absoro do anel A (Figura 9).
Flavonas e flavonis oxigenados no anel A, mas no no B, tendem a ter a banda II mais
pronunciada que a I. Em molculas que tambm possuem o anel B oxigenado, o espectro
apresenta a banda I mais pronunciada, a qual aparece em comprimentos de onda no muito
distantes. A posio da banda I nos d informao sobre o tipo de flavonoide e tambm sobre
o grau de oxidao. A banda I das flavonas ocorre na faixa de 304-350 nm, enquanto que a
dos flavonis aparece em 352-385 nm. Entretanto os flavonis com o grupo 3-hidroxil
substitudo (metilado ou glicosilado) possuem a banda I em 328-357 nm, e em geral os seus
espectros so prximos aos das flavonas.[41]
1 - Introduo
13
A
OH
O
(a)
(b)
Figura 9 : Esqueleto de uma flavona (a) ; Esqueleto de um flavonol (b)
J o espectro das flavanonas, isoflavonas e flavanonis so parecidos por apresentarem

pouca ou nenhuma conjugao entre os anis A e B (Figura 10). Esses espectros apresentam
uma banda II de grande intensidade de absoro com somente um ombro ou uma banda com
baixa intensidade representando a banda I. A banda II das isoflavonas ocorre normalmente na
regio de 245-270 nm e no muito afetada pela hidroxilao do anel B. O espectro das
flavanonas e flavanonis possui a banda II na faixa de 270-295 nm. A remoo do grupo 5hidroxil de uma flavanona ou flavanonol provoca um deslocamento hipsocrmico de 10-15
nm na banda II. O aumento da oxigenao no anel B de flavanonas e flavanonis no possui
efeitos relatados no espectro UV. Na Figura 11 tem-se o espectro UV-Vis em metanol para as
principais classes de flavonoides. [41]
O
O
A
O
B
O
(b)
(a)
O
A
OH
O
(c)
Figura 10 : Esqueleto de uma isoflavona (a); Esqueleto de uma flavanona (b); Esqueleto de uma
flavanonol (c)
1 - Introduo
14
Figura 11: Espectros UV-Vis tpico das classes de flavonoides. a) flavona (acacetina); b) flavonol (quercetina);
c) flavanonol (taxifolina); d) isoflavona (iridina); e) flavanona (pinocembrina).
1 - Introduo
1.4
15
Quimiometria
A quimiometria tem como objetivo a anlise de dados qumicos de natureza

multivariada e pode ser definida como uma disciplina qumica que emprega mtodos
matemticos e estatsticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para
fornecer o mximo de informao qumica com a anlise dos dados obtidos. [42]
A utilizao de ferramentas quimiomtricas iniciou-se no Brasil na primeira metade da
dcada de 70, mas s se firmou definitivamente com a instalao de computadores nos
laboratrios qumicos. [43]
Os trabalhos que usam Quimiometria podem ser agrupados em trs reas:
planejamento e otimizao de experimentos, reconhecimento de padres (mtodos de anlise
exploratria e classificao) e calibrao multivariada. [43]
A respeito de estudos feitos com a prpolis, a quimiometria empregada
principalmente para a determinao da fonte botnica e origem geogrfica de amostras atravs
da anlise de componentes principais (PCA- do ingls, Principal Component Analysis). [28,
44-47]
1.4.1 A Organizao dos Dados
Os dados obtidos em um experimento devem ser organizados antes de serem

submetidos analise multivariada.
Quando uma determinada amostra (objeto) analisada, os resultados obtidos so as
variveis para determinado objeto. Esses resultados podem ser expressos, por exemplo, em
termos de concentrao, altura do pico, absorbncia, entre outros dados. Os dados so
dispostos em forma de uma matriz X (n x m), em que cada linha representa uma amostra (n) e
as colunas as variveis (m), como pode ser visto na Figura 12. [42, 48]
1 - Introduo
16
Figura 12: Dados organizados em uma matriz X
importante analisar se as variveis so homogneas (mesma unidade de medida), ou

heterogneas (unidades distintas), pois essa informao ajuda na deciso sobre a qual prprocessamento os dados devem ser submetidos. [48]
1.4.2 Pr-processamento dos Dados
A etapa de pr-processamento dos dados necessria quando os dados experimentais

no tm uma distribuio adequada para a anlise como, por exemplo, so obtidas medidas
em diferentes unidades e variveis com diferentes varincias. Ajustam-se ento as grandezas
de forma que elas tenham valores equivalentes para que todas tenham a mesma importncia
sobre o modelo. [42]
Os mtodos de pr-processamento mais utilizados so:
a)
Centrar na mdia: calcula-se a mdia de cada coluna de variveis e
subtrai-se dos seus respectivos valores. Com este tratamento a origem dos
eixos deslocada de forma que os dados passam a ficar distribudos em torno
da origem (Figura 13). No caso de dados espectroscpicos, recomenda-se
centrar os dados na mdia devido ao fato de as medidas apresentarem variveis
com unidades iguais. [42, 48]
1 - Introduo
17
Figura 13: Distribuio de variveis em torno do eixo cartesiano. a) dados originais b) dados centrado na mdia.
FONTE: BRERETON, 2003. [49]
b) Autoescalar: consiste em centrar os dados na mdia e dividi-los pelo respectivo

desvio padro de cada coluna/varivel. Com esse tratamento cada varivel
passa a ter mdia zero e desvio padro igual a 1. O autoescalamento dos dados
recomendado quando os dados esto em escala muito diferentes e se quer
atribuir a mesma significncia a todos. [42, 48]
1.4.3 Reconhecimento de Padres
Os mtodos de reconhecimento de padres podem ser aplicados com diferentes

finalidades, entre elas a anlise exploratria de dados. [43]
A anlise exploratria usada para tentar detectar padres de associao no conjunto
de dados, a partir dos quais se pode estabelecer relaes entre objetos e variveis. Os dois
mtodos de anlise exploratria mais usados so a Anlise de Componentes Principais (PCA)
e a Anlise de Agrupamento Hierrquica (HCA- do ingls, Hierarchical Cluster
Analysis).[42]
A PCA encontra-se entre as mais importantes ferramentas de anlise multivariada,
inclusive por constituir a base na qual se fundamentam a maioria dos outros mtodos
multivariados de anlise de dados. O principal objetivo da PCA reduzir a dimensionalidade
do conjunto de dados, preservando ao mesmo tempo o mximo de informao. Isto feito
calculando-se combinaes lineares das variveis originais. [42]
1 - Introduo
18
A primeira componente principal, PC1, a combinao linear de mxima varincia. A

segunda componente principal, PC2, tambm descreve a mxima varincia restante, porm
ortogonal a PC1. A terceira PC de mxima varincia restante e ortogonal s duas primeiras
PCs, e assim por diante. Como esses eixos so calculados em ordem decrescente de
importncia, muitas vezes a informao relevante fica concentrada nas duas ou trs primeiras
PCs, que podem ser ento examinadas procura de padres. A PCA um mtodo no
supervisionado j, que no se conhece a priori a que classes pertencem os objetos ou pelo
menos essa informao no utilizada na construo do modelo. [43, 50-51]
To importante quanto a determinao do nmero de componentes principais que
devem ser utilizadas para a construo do modelo tambm a identificao dos outliers, que
pode ser feita avaliando o leverage e os resduos de Student. O leverage uma medida da
influncia de uma amostra em comparao com o resto do conjunto de dados e os resduos de
Student uma media da informao da amostra que no foi modelada. As similaridades e
diferenas entre objetos e variveis podem ser vistos atravs de grficos, em que os Escores
ou pesos das PCs so plotados uns contra os outros. [51]
1.4.4 Calibrao Multivariada
A anlise de regresso o mtodo estatstico usado para predizer valores de uma ou

mais variveis respostas (dependentes) a partir de uma coleo de valores de variveis
preditoras (independentes). Uma das tcnicas mais utilizadas para se obter essa correlao a
calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais (PLS- do ingls, Partial Least
Squares). [52]
O modelo PLS desenvolvido a partir de um conjunto de calibrao de n amostras,
com k variveis x, representadas por xk (k=1, 2, ...., n) e m variveis y representadas por ym
(1, 2, ..., m). A partir deste conjunto de treinamento so formadas duas matrizes X e Y de
dimenses (n*k) e (n*m). A matriz X formada pelas variveis independentes, ou preditoras,
e a matriz Y formada pelas variveis dependentes. [48, 52]
Nessa tcnica de calibrao multivariada, as matrizes X e Y so decompostas em
matrizes menores de acordo com as Equaes 1.1 e 1.2. [51]
X =TP+E
(Equao 1.1)
Y=UQ+F
(Equao 1.2)
1 - Introduo
19
onde,
X e Y so as matrizes que sero decompostas

T e U so as matrizes de escores
P a matriz de pesos X,
E contm os erros (resduos) de X,
Q a matriz de pesos Y,
F contm os erros (resduos) de Y.
A Figura 14 mostra como ocorre a decomposio dos dados dos blocos X e Y, em que
p= variveis; h= variveis latentes.
Figura 14: Decomposio dos blocos de dados X e y.
Uma relao linear estabelecida aps a decomposio de X e y, entre os escores t e

u, como pode ser visto na Equao 1.3. [48]
u=bhth
(Equao 1.3)
onde,
b o vetor dos coeficientes de regresso
h o nmero de variveis latente usadas no modelo PLS
1 - Introduo
20
Os resduos dos dados, parte da varincia que no explicada no modelo, trazem

informao sobre o sistema. No caso em que se tm grandes valores de resduos em y o
modelo no est bem ajustado, e os resduos em X podem informa quais so as amostras
anmalas (outliers). [48]
O mtodo de Validao Cruzada (CV- do ingls, Cross Validation) o mais utilizado
e consiste na avaliao da magnitude dos erros de previso de um dado modelo de calibrao.
[48, 51]
A validao cruzada tambm utilizada para a escolha do nmero de variveis
latentes que iro descrever o modelo. O nmero de variveis latentes utilizado deve ser aquele
que minimiza a raiz quadrada dos erros mdios quadrados da validao cruzada (RMSECV,
do ingls, Root Mean Square Error Cross Validation), conforme Equao 1.4. [48, 51]
onde e
( Equao 1.4)
so, respectivamente, os valores previstos e os de referncia para a propriedade
de interesse, e n o nmero de amostras. Para a deteco de amostras anmalas, utilizam-se os

resduos e os valores de leverage.
Para avaliar a eficincia dos modelos de calibrao, validao e previso utiliza-se o
erro mdio quadrtico (RMSE- do ingls, Root Mean Square Error) e o erro relativo. Esses
valores expressam a veracidade do modelo, ou seja, a proximidade entre o valor calculado
pelo modelo (yprev) e o valor obtido pelo mtodo de referncia (yreal).
Para avaliar a exatido do conjunto de calibrao, utiliza-se o erro mdio quadrtico de
calibrao (RMSEC- do ingls, Root Mean Square Error of Calibration).
(Equao 1.5)
Onde n o nmero de amostras, o nmero de graus de liberdade perdidos, que igual ao

nmero de variveis latentes +1, para dados centrados na mdia. [51]
Para avaliar a exatido do conjunto de previso, utiliza-se o erro mdio quadrtico de
previso (RMSEP- do ingls , Root Mean Square Error of Prediction). [51]
1 - Introduo
21
(Equao 1.6)
1.4.5 Anlise Discriminante por Mnimos Quadrados Parciais PLS-DA
O PLS no foi originalmente designado como uma ferramenta estatstica para anlise
discriminante. Apesar disso, ele tem sido utilizado frequentemente com essa finalidade e tem
mostrado um timo desempenho nesse papel. [53]
O mtodo PLS-DA (do ingls- Partial Least Squares Discriminant Analysis) um
mtodo multivariado, supervisionado (a informao sobre a que classes pertencem os objetos
j est disponvel e usada na construo do modelo), utilizado para classificao de
amostras, no qual feita a reduo de variveis e no est claro se as diferenas entre grupos
iro dominar a variabilidade total das amostras. O vetor y em um modelo PLS-DA indica a
classe ao qual a amostra pertence. Quando se tem duas classes a serem discriminadas utilizase o mtodo PLS1. Neste caso, existe uma varivel dependente, y, que pode assumir valores 0
ou 1. [53]
Para o caso no qual trs ou mais classes esto presentes utiliza-se o mtodo PLS2. A
varivel dependente uma matriz com o nmero de colunas igual ao nmero de classes
assumindo valores iguais a 0 ou 1, que indicam se a amostra pertence ou no classe. Por
exemplo, no caso de existirem quatro classes e a amostra pertence classe 2 , o valor de y
para essa amostra ser y = {0 1 0 0}. Os valores previstos so idealmente os valores zero e
um, mas na prtica os valores aproximam-se destes. [53]
calculado um valor limite (threshold), para o qual os valores acima dele indicam que
a amostra pertence classe modelada e os abaixo que no pertencem classe modelada.
Todos os procedimentos que so usados para selecionar um melhor modelo PLS tambm so
usados para selecionar um melhor modelo PLS-DA. [53]
2 - Objetivos
22
2. OBJETIVOS
Devido importncia farmacolgica e comercial da prpolis nos mercados nacional e

internacional, h a necessidade de constante evoluo dos mtodos analticos de modo a
garantir o cumprimento das normas preconizadas pelo MAPA e, consequentemente, a
qualidade do produto.
Os flavonoides so as principais substncias responsveis pelas atividades biolgicas
da prpolis. Os extratos alcolicos de prpolis que possuem uma maior quantidade dessas
substncias possuem um maior valor econmico e muitas vezes so destinados para o
mercado exterior. Dessa forma, de grande importncia o desenvolvimento de metodologias
para a quantificao dos flavonoides.
Um dos objetivos dessa dissertao utilizar os resultados das anlises que so feitas
em laboratrios de rotina de controle de qualidade dos extratos alcolicos de prpolis para a
construo de um modelo de calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais (PLS),
para determinar a concentrao de flavonoides nas amostras. Esse modelo visa diminuir o
tempo de anlise, o custo e tambm a utilizao de reagentes.
Outro objetivo desse trabalho discriminar os extratos alcolicos comerciais de
prpolis quanto ao tipo de flavonoide, utilizando os espectros dos complexos de Al(III) que
so obtidos nas anlises de rotina para a quantificao de flavonoides. A importncia da
determinao dos tipos de flavonoides presentes nas amostras est no fato de alguns deles
apresentarem propriedades biolgicas diferenciadas. Assim, o conhecimento do tipo e
concentrao do flavonoide presente no extrato faz com que ele possa ser destinado a fins
teraputicos especficos, agregando valor ao produto.
3 - Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para quantificao de

flavonoides nos extratos comerciais de prpolis
23
3. DESENVOLVIMENTO DE UM MTODO DE CALIBRAO MULTIVARIADA

PARA QUANTIFICAO DE FLAVONOIDES NOS EXTRATOS COMERCIAIS
DE PRPOLIS
Um dos parmetros avaliados pelo MAPA para controle de qualidade do extrato

comercial de prpolis a concentrao de flavonoides, cujo mnimo exigido de 0,25%
(m/m). O mtodo espectrofotomtrico o mais utilizado para a determinao da concentrao
de flavonoides nos laboratrios de controle de qualidade por ser mais simples, rpido e de
baixo custo.
A quantificao dos flavonoides presentes na prpolis muito importante, pois a essas
substncias so atribudas as diversas propriedades biolgicas presentes na prpolis. Assim,
amostras que possuem uma maior concentrao de flavonoides, possuem maior valor
econmico.
Ultimamente, os espectros na regio do UV-Vis tm sido muito utilizados na
construo de modelos de calibrao multivariada, tanto para a determinao da concentrao
de analitos como de propriedades fsico-qumicas. A utilizao desses modelos de calibrao
multivariada surge como uma alternativa para mtodos que, em geral, so muito laboriosos,
apresentam interferentes, no possuem uma nica varivel seletiva que permita a calibrao
univariada ou que no apresentam boa resoluo do sinal analtico. [51]
Nesse trabalho foram utilizados os espectros de absoro desses extratos em conjunto
com a anlise multivariada para a construo do modelo PLS. A calibrao multivariada
capaz de prever uma determinada propriedade, como a concentrao de flavonoides, a partir
da obteno do espectro na regio do UV-Vis, que no caso da prpolis esto diretamente
relacionados com a presena dessas substncias nas amostras.
3.1 Mtodos Analticos para a Determinao de Flavonoides na Prpolis
O aumento do uso da prpolis e da sua importncia econmica fez com que surgisse a
necessidade do desenvolvimento de tcnicas adequadas para a determinao quantitativa dos
flavonoides. Vrios mtodos tm sido empregados para essa quantificao, mas as mais
utilizadas so as reaes colorimtricas, a cromatografia gasosa e a cromatografia lquida de
alta eficincia (HPLC- do ingls, High Performance Liquid Cromatography).

24
A HPLC foi utilizada pela primeira vez para a determinao de flavonoides em 1976
por Fisher e Wheaton. Como os extratos de prpolis so solveis em solues etanlicas e
hidroalcolicas, a HPLC com fase reversa se tornou a tcnica cromatogrfica mais utilizada
para a determinao qualitativa e quantitativa dos flavonoides presentes na prpolis. [27, 54]
Como os flavonoides absorvem radiao UV-Vis, o detector de arranjo de diodos
(DAD- do ingls, Diode Array Detector) a forma de deteco mais utilizada. A tcnica
HPLC-DAD tem sido aplicada para a tipificao da prpolis brasileira e tambm para a
identificao dos seus componentes principais. [27, 36]
Alm do DAD, estudos avaliam o emprego de outros tipos de detectores. Segundo
Aaby et. al. [55], detectores eletroqumicos possuem maior sensibilidade, seletividade e
fornecem mais informaes sobre a estrutura dos compostos fenlicos quando comparados
com os espectros obtidos por detectores de arranjo de diodos. Isso ocorre devido ao fato de
que diferentes substituintes ativos eletroquimicamente, em estruturas anlogas, fornecem
caractersticas diferentes no comportamento voltamtrico.
Outro detector utilizado para a quantificao dos flavonoides na prpolis o ESI-MS.
A ionizao por eletrospray (ESI- do ingls, Electrospray Ionization) permite a ionizao
direta e a transferncia das molculas para o espectrmetro de massas (MS-do ingls, Mass
Spectrometry) e tem estendido a aplicabilidade da espectrometria de massas para um maior
nmero de classes de molculas que possuem instabilidade trmica, alta polaridade e alta
massa molecular. Entretanto, a espectrometria de massas mais cara e, normalmente, no
encontrada em laboratrio de anlise de rotina. [29]
Alm de diferentes detectores, relatada na literatura a utilizao de diferentes
condies cromatogrficas para a quantificao de flavonoides, como a utilizao de
diferentes colunas e diferentes fases mveis (Tabela VI), com o objetivo de se obter uma
melhor separao, em um tempo adequado.

25
TABELA VI: Condies Cromatogrficas de estudos que utilizaram HPLC para a quantificao dos flavonoides
Compostos fenlicos
Faixa
analisados
Linear
Gradiente
DAD - 280
nm
cido cafico, cido cinmico, cido

ferlico, cido cumrico,
isosakuranetina, bacarina, drupanina,
artepillin C.
28,83
533,33
g/mL
56
Isocrtica
DAD - 280
nm
Propolins
57
Gradiente
UV -290 nm
cido cafico, cido p-cumrico, cido

ferlico, kaempferol, pinocembrina,
crisina, galangina, pinostrobina,
cafeato de feniletila, cafeato de benzila
e cafeato de isopentila
58
A: 0,1% cido frmico e gua e B:

0,08% cido frmico: acetonitrila
Gradiente
PAD 195650 nm ;
ESI-MS
59
A: 30 mM NaH2PO4 pH 3 e
acetonitrila
Gradiente
DAD- 265,
290, 360 nm
e MS
3-80
g/ml
25
60
Tcnica
Coluna
Fase Mvel
HPLC-RP
C18 CLC-ODS
(4,6 mm x 250
mm)
A:(cido actico/acetato de
amnio/metanol/gua
0.8:0.3:5.0:93.9 m/v/v/v) e 25% do
solvente B (acetonitrila), finalizando
com 100% de acetonitrila.
HPLC-RP
Thermo
C18(4,6mm x 250
mm) partculas de
5m.
Metanol e gua 80:20
HPLC-RP
Intersil 5 ODS-2
(4,6 mm x 250
mm)
HPLC-RP
Capcell Pak ACR

120 C18 ( 2 mm x
250 mm)
partculas de 5m.
HPLC-RP
C18 (4,6 mm x
220 mm)
HPLC-RP
YMC Pack ODSA
A: gua e cido actico 95:5, v/ve B:

metanol
cido actico: metanol: gua

(5:75:60 v/v)
Tipo de
Eluio
Isocrtica
Deteco
DAD- 254
nm
cido cafico, cido p-cumrico,

quercetina, apigenina, kaempferol,
pinobanksina, crisina, pinocembrina,
galangina, tectocrisina, artepillin C,
cido, 3,4-dimetoxicinmico.
cido
cafico,
pe
mcumrico,quercetina,
kaempferol,
naringenina, crisina, galangina e
pinocembrina
Quercetina, kaempferol, apigenina,
isorhamnetina, rhamnetina,
pinocembrina, sakuranetina, crisina,
acacetina, galangina, kaempferide, e
tectocrisina
Referncia

26
Apesar dos mtodos de quantificao dos flavonoides na prpolis por HPLC

mostrarem bons resultados, eles no so os mais utilizados para controle de qualidade por
requererem instrumentos avanados, padres autenticados e demandarem mais tempo de
anlise.
O desenvolvimento da cromatografia gasosa (GC- do ingls, Gas Chromatography)
precedeu o primeiro uso do moderno HPLC. A anlise de derivados de flavonoides por CG
foi reportada na dcada de 60. Isso permitiu estudos para a determinao de flavonoides em
bebidas em 1973, usando colunas de vidro recheadas com VYDAC . [38]
A anlise dos flavonoides por GC, normalmente envolve trs etapas distintas: extrao
da amostra, derivatizao e anlise GC. [29,38]
Devido ao fato da cromatografia gasosa se limitar a compostos volteis que possuem
estabilidade trmica na temperatura de operao, h uma preferncia pelos pesquisadores na
utilizao do HPLC, o que tem refletido em um crescente nmero de publicaes relatando a
investigao de flavonoides por essa tcnica. Apesar da tendncia da utilizao do HPLC para
esse fim, estudos mostram que em termos gerais h uma melhor separao dos componentes
por GC. [29,38]
Alm disso, a quantificao de flavonoides por HPLC pode ser problemtica devido a
alguns fatores como sinal de rudos muito alto devido a impurezas na amostra, alargamento
dos picos (que reduz a eficincia) tanto com a utilizao dos modos isocrtico e gradiente.
Tambm pode ser observada adsoro competitiva entre componentes, o que negligencivel
por GC. [38]
Para a determinao dos flavonoides na prpolis muito utilizada a cromatografia
gasosa acoplada com o espectrmetro de massas. A espectrometria de massas (MS) permite a
aquisio da massa molecular e tambm de informaes estruturais, sendo usada tanto pra fins
qualitativos, quanto quantitativos. Entretanto, a prpolis contm alguns componentes que no
so suficientemente volteis para anlise direta por GC-MS, e necessita da utilizao da
derivatizao ou de outras tcnicas como a cromatografia gasosa de alta resoluo (HTHRGC- do ingls, High-Temperature High-Resolution Gas Chromatography). A Tabela VII
apresenta alguns trabalhos que utilizaram a GC para a determinao dos flavonoides na
prpolis, alguns tipos de colunas e os flavonoides analisados. [29]

27
Tabela VII: Resumo de alguns trabalhos que utilizaram CG para a quantificao dos flavonoides
Coluna
Flavonoides analisados
Referncia
Pinocembrina e Galangina
61
0,25 mm x 9 m I.D. de
slica fundida com fase
estacionria SE-54
cido cinmico, pinobanksina, pinocembrina,
0,25 mm x 25 m HP-1
pinobanksina 3-acetato, cido 1,1-dimetil
capilar de metil-silicone
cafico,crisina, galangina, pinocembrina 7-metil
62
ter, crisina 7-metil ter, e galangina 7-metil ter

0,25 mm x 23 m HP5-MS
Pinostrobina, pinocembrina,benzilferulato,
coluna capilar
galangina, crisina, feniletilcafeatoekaempferol
63
0,20 mm x 17 m HP5-MS
coluna capilar 5%
Isoflavonoides
64
fenilmetilpolisiloxano
No geral, a cromatografia gasosa no utilizada para a determinao quantitativa dos

flavonoides presentes na amostra de prpolis, mas mostra-se muito eficiente na identificao
dos compostos nessa substncia to complexa.
As tcnicas espectrofotomtricas so muito utilizadas para controle de qualidade
devido sua rapidez e baixo custo. [29, 58]
Apesar dos mtodos cromatogrficos serem mais exatos e precisos na identificao e
quantificao dos flavonoides, esses mtodos exigem pessoas altamente qualificadas para a
operao, materiais e equipamentos caros. Alm disso, os mtodos cromatogrficos limitamse quantificao dos compostos majoritrios e estudos mostram que a quantificao dos
componentes ativos em grupos com a mesma estrutura qumica ou similar correlaciona-se
melhor com a atividade biolgica, o que torna os mtodos espectrofotomtricos ainda mais
vantajosos. [29, 57;58]
O mtodo espectrofotomtrico para a quantificao de flavonoides na prpolis
baseado na formao de um complexo entre o Al(III) e os grupos carbonila e hidroxila dos
flavonoides. (Figura 15). Na presena do Al(III) observado um deslocamento batocrmico
nas bandas I e II do espectro do flavonoide, e tambm um aumento da absoro. Dessa
forma, possvel quantificar os flavonoides, evitando-se a interferncia de outras substncias

28
fenlicas, principalmente os cidos fenlicos. Esse comportamento observado para todos os

flavonoides que possuem grupos 5-hidroxi-4-ceto, 3-hidroxi-4-ceto e/ou o-dihidroxi,
sugerindo que esses grupos so importantes para a formao do complexo. O deslocamento
batocrmico causado pelo aumento do efeito conjugativo quando os complexos so
formados, surgindo um novo anel. A amostra, metanol e o Al(III) so misturados e reagem
por 30 minutos. As leituras de absorbncia so feitas em torno de 425 nm. Para a construo
da curva analtica o flavonoide mais utilizado a quercetina. [29, 33, 41]
Figura 15: Reao de formao do complexo entre os flavonoides e Al(III)
Segundo Marcucci et. al. [35], o uso do cloreto de alumnio foi primeiramente
empregado para a identificao de antocianinas. Ainda segundo Marcucci, em 1954 Harbone
sugeriu o uso do cloreto de alumnio para a determinao espectrofotomtrica de certos
subgrupos dos flavonoides, o qual tambm passou a ser usado como um reagente de desvios
(shift reagent) em espectroscopia UV-Vis para a determinao estrutural de flavonoides.
Apesar de ser uma tcnica barata, rpida, de fcil execuo e precisa, ela pouco
exata. Normalmente os valores so subestimados. De acordo com Marghitas et. al. [65], isso
se deve ao fato de o cloreto de alumnio reagir melhor com os flavonoides do grupo das
flavonas e flavonis. Dessa forma, o valor medido e o valor real so tanto mais prximos
quanto maior a proporo de flavonas e flavonis nas amostras analisada. [35, 65]
Chang et. al. [66] propuseram que em conjunto com a tcnica da utilizao do cloreto
de alumnio, tambm seja empregado o mtodo espectrofotomtrico baseado na complexao
dos flavonoides com a 2-4-dinitrofenilhidrazina (DNP). As flavanonas e flavanonis
interagem com o DNP em meio cido para formar fenilhidrazonas coloridas. A absorbncia

29
medida em 486 nm. As curvas analticas so obtidas utilizando principalmente a

pinocembrina como padro. Vrios estudos mostram que a soma dos flavonoides
determinados pelo mtodo do cloreto de alumnio e o DNP representam melhor o real
contedo de flavonoides na prpolis. A Tabela VIII sumariza vrios estudos que utilizaram o
mtodo espectrofotomtrico para a determinao de flavonoides na prpolis. [57,65-67]

30
TABELA VIII: Resumos de alguns trabalhos que utilizaram a espectrofotometria para a quantificao dos flavonoides.
Substncia de
referncia
Propolina C e Propolina
D 4:1.
Complexante
Faixa de trabalho
Solvente
Tampo
Referncia
DNP
486 nm
0.4842.017 mg/mL
Metanol
57
4-40 g/ml (galangina);

0,14-1mg/ml
(pinocembrina)
Metanol
65
Etanol
Etanol 80
% (m/v)
Acetato de
potssio
11
Galangina e
Pinocembrina
AlCl3(galangina) ;
DNP
(pinocembrina)
Quercetina
AlCl3
Galangina (425
nm);
Pinocembrina
(486 nm)
425 nm
Quercetina
Al(NO3)3
415 nm
Quercetina (415
nm);
Naringenina
(495 nm)
Quercetina (415
nm);
Naringenina
(495 nm)
0-100 g/ml (quercetina);

500-2000 g/ml
(naringenina)
Etanol
95%
(m/v)
Acetato de
potssio
66
25-100 g/ml (quercetina);

500-2000 g/ml
(naringenina)
Etanol
95%
(m/v)
Acetato de
potssio
67
Metanol
58
Etanol
Metanol
Etanol
Metanol
69
70
71
72
Quercetina e
Naringenina
AlCl3(quercetina) ;
DNP (naringenina)
Quercetina e
Naringenina
AlCl3(quercetina) ;
DNP (naringenina)
Galangina e
Pinocembrina
AlCl3(galangina) ;
DNP
(pinocembrina)
Galangina (425
nm);
Pinocembrina
(486 nm)
Quercetina
Quercetina
Quercetina
Quercetina
AlCl3
AlCl3
AlCl3
AlCl3
425 nm
425 nm
425 nm
425 nm
04-12 g/ml
432 g/mL (galangina);

0.181.8 mg/mL
(pinocembrina) ; 37326
g/mL (galangina e
pinocembrina 2:1)
2-10 g/ml
5-40 g/ml
04-12 g/ml
-
68

31
3.2 Materiais e Mtodos

3.2.1 Amostras
Foram estudadas 97 amostras de extratos alcolicos de prpolis de diferentes origens,

adquiridas no comrcio ou doadas pelos produtores. As amostras foram nomeadas como
comum (C) e verde (V), de acordo com as informaes no rtulo. Aquelas que no tinham
informao sobre o tipo na embalagem foram classificadas como comum. Antes de serem
submetidas anlise, uma alquota das amostras foi centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos.
Algumas amostras apresentaram formao de corpo de fundo. Somente o sobrenadante dessas
amostras foi utilizado para a quantificao.
3.2.2 Reagentes
Para o preparo das solues da metodologia colorimtrica para a quantificao dos

flavonoides, utilizou-se metanol PA da marca Synth, Al(NO3)3.9H2O da Sigma-Aldrich e
CH3COOLi da marca VETEC.
Para a construo da curva de calibrao foi utilizada quercetina da marca SigmaAldrich.
Para o preparo das solues para obteno dos espectros eletrnicos das amostras, foi
utilizado etanol 95%(v/v) da marca Synth.
Nos estudos cromatogrficos os seguintes padres de flavonoides e cidos fenlicos
foram investigados: cido p-cumrico, quercetina, pinocembrina, crisina, cido cinmico,
cido ferlico, kaempferol, acacetina, naringenina e galangina, todos da Sigma-Aldrich e de
grau cromatogrfico. Para o preparo a diluio das amostras e preparo das solues dos
padres foi utilizado metanol de grau cromatogrfico da marca J. T. Baker. Para o preparo das
fases mveis, alm do metanol, foi utilizado 2-propanol da J. T. Baker, acetonitrila da marca
CRQ e cido actico da marca VETEC. Para diluio dos extratos de prpolis utilizou-se
etanol VETEC de grau HPLC.
3.2.3 Metodologia: mtodo espectrofotomtrico
No ensaio de quantificao de flavonoides pelo mtodo espectrofotomtrico uma

alquota de 25 L da amostra foi transferida para um balo volumtrico de 25 mL. Em

32
seguida, adicionou-se 500 L de uma soluo de acetato de ltio 0,1 mol L-1. Por ltimo,
adicionou-se 100 L de uma soluo de nitrato de alumnio 10% m/v. O volume do balo foi
completado com metanol. Na Figura 16 podem-se observar o aspecto das solues
preparadas.
Figura 16: Solues obtidas da complexao do Al(III) com os flavonoides presentes nas amostras de prpolis
Aps uma hora, realizou-se a leitura da absorbncia das solues. Os espectros UVVis foram obtidos no espectrofotmetro Hewlett-Packard, modelo 8451A, em cubetas de
quartzo de 0,5 cm de caminho tico, com varredura de 190 a 500 nm, com incrementos de
2 nm.
Os ensaios foram realizados em quintuplicata para cada amostra, e as leituras das
absorbncias foram feitas em triplicata para cada soluo.
A curva analtica foi construda utilizando soluo estoque de quercetina
500 g mL-1 em metanol.
Para a obteno dos espectros eletrnicos das amostras foram preparadas solues
contendo 20 L de amostra, completando-se o volume do balo volumtrico (25,00 mL) com

33
etanol 95% (v/v). Os espectros foram obtidos em cubeta de quartzo de 2 mm de caminho

tico, com varredura de 190 a 500 nm e incrementos de 2 nm. Os ensaios tambm foram
realizados em quintuplicata para cada amostra (replicatas independentes), e as leituras das
absorbncias de cada soluo foram tambm feitas em triplicata.
3.2.4 Metodologia: mtodo cromatogrfico
Para a anlise cromatogrfica foram separadas 40 amostras. As amostras foram

diludas 80 vezes em etanol 75% (m/v) e filtradas em filtro de seringa Milipore de 0,21 m de
poro antes da injeo no HPLC.
Para a construo das curvas analtica preparou-se solues estoque de 1000 g/mL.
Em seguida, uma mistura contendo os 11 padres foi preparada, diluindo-se adequadamente
os padres de forma a obter uma curva com 16 nveis de concentrao na faixa de 0,19 a
50,40 g mL-1. A curva foi obtida plotando-se a rea integrada do pico do composto em
funo da sua concentrao na soluo.
As solues das amostras e dos padres foram injetadas em um cromatgrafo lquido
de alta eficincia Shimadzu com detector de arranjo de diodos (SPD-M20A) e coluna
cromatogrfica Kinetex Phenomenex C18, com partculas de 2,6 m, 150 mm de
comprimento e 4,6 mm de dimetro. Foram empregadas quatro fases mveis, a Fase A
consistiu de uma soluo aquosa 5% de cido actico, a Fase B consistiu em uma soluo
30:5:70:1 de gua, 2-propanol, metanol e cido actico, na Fase C utilizou-se como eluente o
metanol e na Fase D empregou-se uma soluo 20:20:30:30:2 de gua, 2-propanol,
acetonitrila, metanol e cido actico.
3.2.5 Tratamento Estatstico dos Resultados
Determinou-se o intervalo de confiana dos resultados obtidos pela metodologia

colorimtrica para um nvel de confiana de 95%, utilizando a Equao 3.1.
em que :
(Equao 3.1)

34
= mdia dos valores obtidos pra amostra

s = desvio padro
t = valor do teste t de Student
Para a identificao de amostras anmalas foi utilizado o teste de Grubbs para
confiana de 95%, utilizando a Equao 3.2.
|
(Equao 3.2)
onde,
= mdia dos valores obtidos pra amostra
s = desvio padro
Para comparar os resultados obtidos pelo mtodo espectrofotomtrico e pelo mtodo

cromatogrfico utilizou-se o teste t pareado para 95% de confiana.
(Equao 3.3)
Onde,
(Equao 3.4)
em que,
= diferena mdia entre os mtodos A e B
n = nmero de amostras
di = diferena entre os resultados obtidos com os mtodos A e B
3.2.6 Anlise Quimiomtrica
O programa Mathlab R2009b e o pacote PLS_Toolbox-522 foram usados para o

tratamento quimiomtrico dos dados obtidos.

35
O modelo PLS foi construdo utilizando as concentraes de flavonoides nas amostras

e os espectros eletrnicos das amostras diludas em etanol 95% (v/v).
Os espectros eletrnicos tiveram a linha base corrigida utilizando a funo baseline.
As amostras foram separadas em um conjunto de calibrao e outro de validao. Para
realizar essa separao utilizou-se o algoritmo de Kennard-Stone [73], sendo que 2/3 das
amostras foram utilizadas para a calibrao (60 amostras) e 1/3 para a validao (30 amostras)
do modelo PLS. Sete amostras no foram utilizadas na construo do modelo, trs foram
separadas para os ensaios de avaliao da preciso e as outras quatro amostras apresentaram
distores em seu espectro eletrnico, o que foi verificado visualmente.
O pr-processamento utilizado foi centrar os dados na mdia, pois as variveis para a
construo do modelo quimiomtrico correspondem aos comprimentos de onda obtidos no
espectro UV-Vis e possuem, portanto, unidades equivalentes. O mtodo de validao cruzada
utilizado foi o dos blocos contnuos (do ingls, Contiguous Blocks) que o mais utilizado
quando se tem um conjunto de dados com mais de 20 amostras.
Para a verificao de possveis outliers foi utilizada uma rotina proposta por Braga em
que as amostras consideradas anmalas no foram utilizadas na construo do modelo. [74]
3.3 Resultados e Discusso

3.3.1 Mtodo espectrofotomtrico ajuste das condies experimentais
Na literatura no h condies uniformes, sendo utilizados diferentes mtodos para a

determinao dos flavonoides totais. Um grande nmero de mtodos descrito (Tabela VIII)
em que so utilizados diferentes solventes, concentrao de amostra e reagentes. Alm disso,
a maior parte dos estudos avalia a concentrao de flavonoides na prpolis bruta, em que os
extratos so preparados e tem-se conhecimento da concentrao da soluo da amostra
utilizada [75]. Dessa forma, primeiramente realizou-se um ajuste das condies experimentais
do mtodo espectrofotomtrico para adequar sua aplicao para amostras de extratos
alcolicos de prpolis comercias.
Para avaliar qual o volume de amostra deveria ser utilizado nas anlises selecionaramse 19 amostras de extrato alcolico de prpolis com teores de extrato seco variados
(Tabela IX). O teor de extrato seco o resduo obtido aps a secagem de um volume
conhecido de extrato de prpolis. Alguns estudos mostram que o teor de extrato seco pode

36
estar ligado presena de seus compostos bioativos, por isso utilizou-se esse parmetro
fsico-qumico para realizar a triagem das amostras que seriam utilizadas. [4;5, 24]
Prepararam-se solues adicionando 25 e 50 L de amostra e 100 L de nitrato de
alumnio 10% (m/v) em bales volumtricos de 25,00 mL, completando-se o volume com
etanol 95% e metanol. Aps uma hora obtiveram-se os espectros das solues. Na Figura 17
apresentado um esquema para melhor entendimento dos procedimentos realizados.
TABELA IX: Amostras selecionadas para avaliao do volume a ser utilizado nos ensaios
Teor de Extrato Seco % m/v Amostras Selecionadas

0-5
C10; C14; C48; C73
5-10
C27; C59; C64; C83
10-15
C85; C89; V20; V33
15-20
C75; V5; V6; V13
>40
V17; V24; V31
Figura 17: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual volume de amostra deveria ser usado
Algumas amostras apresentaram absorbncia maior que 1,0 quando se adicionou o

volume de 50 L. Para absorbncias maiores que 1,0 o espectro comea a apresentar
distores nas bandas, portanto optou-se pela a utilizao do volume de 25 L nos ensaios.

37
Uma controvrsia observada na literatura sobre o uso ou no do acetato de potssio.

Segundo Malesev [33], os flavonoides so cidos fracos que tendem a estar protonados.
Assim, o pH tem impacto considervel na formao dos complexos. Segundo Dowd [76], os
complexos entre os flavonoides e o alumnio se formam mais eficientemente em pH 4,0,
como pode ser observado na Figura 18.
Figura 18: Dependncia da absorbncia do complexo alumnio-quercetina em diferentes pH e em diferentes

nveis de fora inica.
FONTE: L.E. Dowd, 1959 [76]
Na maioria dos trabalhos que utilizam o tampo, o reagente o acetato de potssio,

mas observou-se que sua solubilizao muito difcil tanto em etanol quanto em metanol.
Assim, foi testado o uso do acetato de ltio, que se mostrou mais solvel nos dois solventes.
Em seguida, avaliou-se a influncia da presena ou no do acetato de ltio e sua concentrao

38
mais adequada. Para isso, fixou-se o volume de nitrato de alumnio adicionado no balo
volumtrico de 25,00 mL em 100 L e variou-se a concentrao de acetato de ltio no balo,
sendo as concentraes utilizadas 0, 2, 4, 6, 8 e 10 mmol L-1. Esse teste foi realizado com trs
amostras de extrato alcolico de prpolis (C15, C63 e C99), e com o padro quercetina. A
Figura 19 apresenta um esquema para melhor entendimento dos ensaios realizados e a
Figura 20 apresenta os espectros de uma amostra de extrato alcolico de prpolis em
diferentes concentraes de acetato de ltio.
Figura 19: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de acetato de ltio
Figura 20: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para uma amostra de prpolis

39
Na literatura a concentrao de acetato utilizada de 20 mmol L -1, mas possvel

observar na Figura 20 que medida que a concentrao do acetato de ltio aumenta, os
espectros comeam a perder definio e intensidade. Foi possvel verificar pela anlise dos
grficos que a concentrao de 2 mmol L-1 j era suficiente para que a complexao do
alumnio com os flavonoides presentes nas amostras ocorresse de forma eficiente, sendo
assim essa concentrao foi escolhida para ser utilizada nas anlises. O ensaio tambm foi
realizado com o padro quercetina. O espectro em que no foi adicionado tampo e o que foi
adicionado 2 mmol L-1 de acetato ltio se mostraram idnticos e foram os que apresentaram
maior absorbncia. Os espectros em que foram adicionados 4 e 8 mmol L-1 de acetato de ltio
tambm so idnticos (Figura 21).
Figura 21: Espectros obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para o padro quercetina
Foi possvel notar que as solues das amostras preparadas em etanol apresentavam
turvao. Alm disso, segundo Markham [77], quando o etanol usado, em vez do metanol,
os deslocamentos obtidos nos espectros dos complexos com alumnio ficam muito sensveis a
traos de gua. Assim, como relatado anteriormente, as solues em metanol apresentam um
espectro com bandas mais definidas e absorbncia maior, indicando uma maior eficincia na
complexao das substncias com o alumnio. Alm disso, o metanol permitiu uma melhor

40
solubilizao das substncias presentes na soluo. Assim, esse foi o solvente escolhido para a
realizao das anlises, apesar de vrios trabalhos da literatura terem sido realizados com o
etanol.
Para avaliar a concentrao de nitrato de alumnio variou-se a o volume adicionado no
balo, que foram 50, 100, 300 e 500 L de nitrato de alumnio 10% m/v. Os testes foram
feitos tanto com as amostras de extrato alcolico de prpolis (C15, C63 e C99), quanto com o
padro. A Figura 22 apresenta um esquema para melhor entendimento dos procedimentos e a
Figura 23 os espectros obtidos em diferentes concentraes de nitrato de alumnio.
Figura 22: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de nitrato de
alumnio
Figura 23: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de nitrato de alumnio para uma amostra de
prpolis e o padro (quercetina)

41
Foi possvel observar pela anlise da Figura 20 que tanto para o padro quando para as
amostras no h variao considervel da absorbncia com a modificao da concentrao do
nitrato de alumnio. Como a variao da concentrao do nitrato de alumnio no influenciou
no aspecto do espectro, optou-se por utilizar nas anlises o volume de 100 L de nitrato de
alumnio 10% m/v, sendo considerado suficiente para complexar os flavonoides presentes nas
amostras.
3.3.2 Metodologia cromatogrfica ajuste das condies experimentais
Como foi visto na Tabela VI, diversas condies so utilizadas para a quantificao
dos flavonoides na prpolis. Assim, inicialmente, foram testadas diferentes condies
cromatogrficas como, fase mvel, gradiente, taxa de fluxo e tempo de anlise, com o
objetivo de obter uma melhor separao dos compostos majoritrios, resoluo dos picos em
extratos alcolicos comerciais de prpolis.
A melhor separao e resoluo dos picos foi obtida no tempo de 109 minutos com
taxa de fluxo de 0,8 mL min-1. O tempo pode parecer alto, mas no extrato alcolico de
prpolis h uma grande quantidade de substncias e uma separao eficaz de todos os
componentes s possvel com tempos elevados de anlise.
Em relao escolha da fase mvel e do gradiente, como as diferenas estruturais
entre as substncias presentes na prpolis so muito pequenas empregou-se um gradiente de
eluio e eluentes preparados a partir de uma combinao de solventes que visou o aumento
da seletividade do processo de separao.
Os cidos cafico, p-cumrico e ferlico possuem estruturas muito semelhantes e so
diferenciados por meio dos grupos funcionais especficos. Esses compostos possuem massa
molar baixa e estabelecem ligaes de hidrognio com solventes prticos. Por isso, o
gradiente de eluio foi iniciado com 95 % de uma soluo aquosa de cido actico 5% (v/v)
- linha A - e com 5% de uma soluo 30:5:70:1(v/v) de gua, 2-propanol, metanol e cido
actico -linha B. O aumento gradativo da soluo contida na linha B propiciou a separao
desses cidos de forma satisfatria. Na Tabela X pode-se visualizar o programa de gradiente
que propiciou a separao dessas substncias.
O segundo grupo de similaridade constitudo pelo cido trans-cinmico, e pelos
flavonoides quercetina, naringenina, kaempferol e a pinocembrina, que possuem massas

42
molares mais elevadas e podem interagir com a fase estacionria mais eficientemente em
comparao ao primeiro grupo. Por isso, a partir de 17 minutos combinou-se a fase da linha A
com uma soluo 20:20:30:30:2 (v/v) de gua, 2-propanol, acetonitrila, metanol e cido
actico linha D. A quercetina e a naringenina so muito similares e somente uma variao
abrupta da concentrao da soluo da linha D promoveu uma separao satisfatria dessas
substncias. A Tabela XI mostra a programao usada para essa finalidade.
TABELA X: Programao do gradiente para a separao do cido cafico, cido p-cumrico e cido
ferlico
Tempo (min)
Linha
Porcentagem (%)
0,01
22
0,01
78
6,00
22
6,00
78
10,00
37
10,00
63
13,00
37
13,00
63
15,00
45
15,00
55
17,00
45

43
TABELA XI: Programa de gradiente para a separao do cido trans-cinmico, quercetina, naringenina,
kaempferol e pinocembrina
Tempo (min)
Linha
Porcentagem (%)
17,01
17,01
25
17,01
75
25,50
25
25,50
75
26,00
65
26,00
35
30,00
65
30,00
35
O terceiro grupo de compostos constitudo pelas substncias crisina, acacetina e

galangina. A anlise de usas estruturas qumicas permite classific-los como compostos
capazes de estabelecer ligaes de hidrognio com solventes prticos. Alm disso, essas
substncias estabelecem interaes mais fortes com a fase estacionria. Devido a este fato,
estabeleceu-se um gradiente linear com a soluo da linha B para favorecer o estabelecimento
das ligaes de hidrognio entre a fase mvel e as substncias, de forma a conseguir a eluio
seletiva dos componentes. Na Tabela XII encontra-se o gradiente de eluio utilizado nessa
etapa.
Por fim, empregou-se a linha C e programou-se o sistema para retornar a condio
inicial. Na Tabela XIII tem-se a programao utilizada at o final da eluio.

44
TABELA XII: Gradiente de eluio utilizado para a separao dos flavonoides, crisina, acacetina e galangina
Tempo (min)
Linha
Porcentagem (%)
30,01
30
30,01
70
35,00
30
35,00
70
44,99
55
44,99
45
47,00
55
47,00
45
52,00
60
52,00
40
62,00
60
62,00
40
TABELA XIII: Programao do gradiente final
Tempo (min)
Linha
Porcentagem (%)
68,00
50
68,00
50
75,00
80
75,00
20
85,00
80
85,00
20
85,01
50
85,01
50
86,01
86,01
22
86,01
78
109,00
78
109,00
22

45
Na Figura 24 possvel observar cromatogramas obtidos em outros estudos e o

cromatograma obtido nesse estudo utilizando as condies cromatogrficas otimizadas
[59;60,78;79]. Como possvel observar pela anlise da figura, o cromatograma obtido pelas
condies desenvolvidas nesse estudo permite a visualizao de um nmero maior de
substncias com boa resoluo dos picos identificados. possvel observar tambm que h
uma grande variabilidade na composio das amostras.
(a)
3
2
(b)
9
8
(c)

46
12
11
1 2
12
2
1
(d)
(e)
Figura 24: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis obtido por outros autores: (a) [78] (b)
[79] (c) [60] (d) [59] ; cromatogrma obtido nesse trabalho: (e) . 1) cido cafico 2) cido p-cumrico 3)
cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6) naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10)
acacetina 11) galangina 12) artepillin C.

47
3.3.3 Determinao da concentrao de flavonides nos extratos comerciais

de prpolis pelo mtodo espectrofotomtrico
A fim de determinar a concentrao de flavonoides nas amostras de extratos alcolicos

de prpolis construiu-se em triplicata curvas analticas usando como padro a quercetina. As
curvas foram obtidas em trs meses diferentes, no inicio da realizao dos ensaios, no meio e
no fim da realizao dos ensaios. Assim, tem-se uma curva vlida para todo o perodo de
medio. Alm disso, uma amostra controle foi medida em todas as anlises, apresentando
uma variao ao redor de 3%, mostrando boa reprodutibilidade das medies. Como
possvel observar na Figura 25, os nveis de concentrao da curva apresentaram baixos
desvios, mostrando que o mtodo possui boa reprodutibilidade. A faixa de trabalho utilizada
a que possui os pontos em azul.
Figura 25: Curva analtica obtida utilizando como padro a quercetina
A composio qumica de cada amostra influencia no deslocamento das bandas

observadas nos espectros dos complexos formados entre os flavonoides presentes na prpolis
e o Al(III). Segundo Denni e colaboradores [75], os diferentes substituintes presentes,

48
principalmente no anel B do ncleo dos flavonoides, provocam diferentes desvios

batocrmicos, como pode ser visto na Tabela XIV.
Em muitos trabalhos relatado que o mtodo baseado na complexao com o Al (III)
pouco exato e que muitas vezes a concentrao de flavonoides fica subestimada. Isso se
deve ao fato de o comprimento de onda selecionado para as anlises ser em torno de 425 nm.
Como pode ser observado na Tabela XIV, somente trs flavonoides (kaempferol, luteolina e
orientina) apresentam mximo de absorbncia prximo a 425 nm, o que acaba fazendo com
que os valores da concentrao de flavonoides obtidos fiquem subestimadas. Na Figura 26
tem-se os espectros dos complexos formados entre os flavonoides presentes nas amostras de
prpolis e o alumnio. Como possvel perceber algumas amostras apresentam desvios na
banda I. [35;66]
TABELA XIV Deslocamentos batocrmicos observados e absoro mxima das solues dos flavonoides na
adio de Al(III)
Composto
Absoro mxima em
Absoro mxima com
etanol (nm)
adio de AlCl3 (nm)
Flavonis
Kaempferol
265, 368
269, 424
Quercetina
255, 371
271, 445
Miricetina
255, 375
270, 444
Gossipetina
260, 380
268, 443
Flavonas
Apigenina
266, 335
283, 346
Luteolina
255, 348
269, 425
Orientina
255, 347
267, 426
Acacetina
270, 326
277, 336
Tricina
245, 350
278, 392
FONTE: Adaptado de Denni, Mammen; 2012. [75]

49
Figura 26: Espectro dos complexos formados entre os flavonoides presentes nas amostras de prpolis e o
alumnio, de acordo com a concentrao de flavonoides.
Para evitar erros na determinao da absorbncia optou-se por obter os espectros das
solues das amostras varrendo de 190 a 500 nm. Em seguida, determinou-se o mximo de
absoro da banda I dos espectros obtidos para 97 amostras de extrato alcolico de prpolis,
ao invs de obter-se a absorbncia em 425 nm. Esse valor foi interpolado na curva analtica,
obtendo-se assim a concentrao de flavonoides em equivalentes de quercetina. Na Figura 27
apresentado um histograma com a distribuio da concentrao de flavonoides nas amostras
analisadas.

50
Figura 27: Histograma com as concentraes de flavonoides para as amostras de extrato de prpolis
Avaliando os resultados obtidos nesse estudo tem-se que a concentrao de flavonoide

mxima obtida foi de 1,74% (m/m) e a mnima foi de 0,06% (m/m). O DPR mdio do mtodo
espectrofotomtrico foi de 3,4%.
Chang e colaboradores [66] determinaram a concentrao de flavonoides de 12
amostras comerciais de prpolis, sendo nove do Brasil, uma da Inglaterra e uma da Nova
Zelndia. As concentraes de flavonoides encontradas variaram de 0,55 a 1,82% (m/m),
valores semelhantes aos encontrados nesse estudo.
O total de amostras irregulares, ou seja, que possuem concentrao de flavonoides
menor que 0,25% (m/m), recomendado pelo MAPA, foi de 27%. Para um parmetro que est
ligado diretamente s propriedades biolgicas da prpolis esse valor muito alto, o que
mostra a necessidade de um monitoramento mais eficiente dos extratos alcolicos de prpolis.
Esse produto utilizado para fins farmacolgicos pela populao e a garantia de que o valor
da concentrao de flavonoides est de acordo com o preconizado pelo MAPA assegura que a
prpolis ser eficiente na sua atividade biolgica, agregando assim valor ao produto
brasileiro.

51
Como j foi citado anteriormente, alguns estudos mostram que o teor de extrato seco
pode estar ligado presena de seus compostos bioativos e, devido a isso, deveria haver uma
correlao entre o teor de extrato seco e a concentrao de flavonoides nas amostras. Para
verificar se h correlao entre esses parmetros fsico-qumicos, construiu-se o grfico que
pode ser observado na Figura 28.
Figura 28: Relao entre os parmetros teor de extrato seco e concentrao de flavonoides. ( Os valores mminos
estipulados pelo MAPA encontram-se marcados com linha tracejada).
Em geral, quanto maior o teor de extrato seco, maior a concentrao de flavonoides,

mas para algumas amostras esse comportamento no seguido. Essas amostras foram
circuladas no grfico. Elas possuem alto teor de extrato seco, mas concentrao de
flavonoides baixa. O teor de extrato seco dessas amostras com comportamento anmalo pode
estar levando em considerao substncias que no possuem propriedades biolgicas e assim
elas devem ser consideradas irregulares, ou outros compostos bioativos, que no se
complexam eficientemente com o alumnio, esto presentes nessas amostras e elas realmente
possuem atividades biolgicas. Isso mostra que nem sempre um teor de extrato seco alto
significa que a amostra apresenta propriedades teraputicas.

52
3.3.4 Determinao da concentrao de flavonoides nos extratos comerciais

de prpolis pelo mtodo cromatogrfico
Os cromatogramas das amostras e dos padres foram processados utilizando um

software especfico. A identificao dos compostos foi realizada pela comparao dos tempos
de reteno e dos espectros de absoro UV-Vis das amostras e dos padres. Na Figura 29
apresentado o cromatograma de uma amostra analisada nesse estudo. Na Tabela XI tem-se os
comprimentos de onda (UV-Vis) utilizados na integrao dos cromatogramas de cada padro,
assim como os tempos de reteno e a estrutura qumica de cada composto.
Figura 29: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis. 1) cido cafico 2) cido p-cumrico 3)
cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6) naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10)
acacetina 11) galangina 12) artepillin C.

53
TABELA XV: Estrutura e tempo de reteno (tr) dos compostos avaliados na cromatografia
Grupos
Composto
cido cafico
cido p-cumrico
substituintes
Estrutura
OH
R1
OH
cido ferlico
cido cinmico
tr
(min)
R1
R2
R3
OH
OH
321
6,11
OH
305
11,21
OCH3 OH
320
13,44
R2
278
28,88
OH
OH
OH
370
31,89
OH
265
62,03
OH
OH
368
33,27
267
58,78
OCH3
337
60,48
OH
287
32,19
290
35,65
316
81,72
Quercetina
R2
Galangina
Kaempferol
(cm)
R3
HO
Crisina
R1
OH
Acacetina
R1
Naringenina
HO
Pinocembrina
OH
O
OH
Artepillin C
HO
Como possvel observar na Tabela XV, os cido fenlicos (com execeo da

artepillin C que possui grupos prenil) tiveram tempo de reteno menor que os flavonoides.
Isso deve ao fato dos flavonoides possurem maior cadeia carbnica do que os cidos
fenlicos, e assim ficaram mais tempo retidos na coluna C18 (apolar). Tambm possvel
observar na tabela que, dependendo do grau de hidroxilao e metilao, h modificao no
tempo de reteno. O aumento da hidroxilao reduz o tempo de reteno na coluna, enquanto

54
o aumento da metilao aumenta a reteno dos compostos na coluna cromatogrfica. Alm

disso, flavanonas (ex. pinocembrina) e flavonas (ex. crisina) eluem mais cedo do que os
flavonis (ex. galangina). [79]
Aps a identificao dos compostos presentes na prpolis, realizou-se a quantificao
dessas substncias. As curvas foram construdas utilizando 16 nveis de concentrao de
0,22-50,40 g mL-1 de forma a abranger as faixas de concentrao da maioria dos compostos
presentes nos extratos alcolicos de prpolis. Na Tabela XVI tem-se alguns parmetros das
curvas analticas dos padres. Como pode ser observado, para todos os analitos estudados
obteve-se um bom ajuste, com todos os coeficiente de correlao acima de 0,9975.
TABELA XVI: Parmetros obtidos das curvas de calibrao por HPLC
Composto
Coeficiente de correlao Faixa de trabalho (g/mL)
cido cafico
0,9987
0,24 - 44,10
cido p-cumrico
0,9998
0,26 40,80
cido ferlico
0,9992
0,25 10,00
cido trans-cinmico
0,9997
0,28 50,40
Quercetina
0,9992
0,24 38,40
Naringenina
0,9975
0,22 26,40
Kaempferol
0,9983
0,25 29,40
Pinocembrina
0,9980
0,25 30,00
Crisina
0,9994
0,25 44,10
Acacetina
0,9997
0,19 33,30
Galangina
0,9989
0,28 49,50
Os resultados obtidos pelo mtodo cromatogrfico e pelo mtodo espectrofotomtrico

foram comparados utilizando teste t pareado . Os resultado obtidos pelos dois mtodos
encontram-se na Tabela XVII.

55
TABELA XVII: Concentrao de flavonoides nas amostras pelo mtodo cromatogrfico e espectrofotomtrico
Amostra
C3
C5
C10
C15
C16
C17
C21
C28
C30
C31
C32
C34
C35
C38
C47
C49
C52
C53
C57
C60
C63
C68
C76
C77
C81
C86
C90
C91
C93
C97
V2
V6
V10
V25
V26
V29
V33
V37
V39
V42
Concentrao de flavonoides
pelo mtodo cromatogrfico
(mg/mL)
2,56
0,88
5,25
0,82
4,33
0,70
3,01
7,33
2,39
1,95
2,22
11,55
4,91
2,52
9,13
1,90
1,14
12,23
2,79
6,25
3,83
7,04
1,83
0,25
1,60
7,84
4,78
0,77
1,27
6,86
7,82
4,89
3,41
8,38
7,78
9,62
2,44
3,12
9,20
1,72
Concentrao de flavonoides
pelo mtodo
espectrofotomtrico (mg/mL)
3,29 0,14
6,26 0,15
3,25 0,10
1,36 0,13
3,76 0,05
0,38 0,02
4,69 0,17
7,35 0,27
2,90 0,15
0,92 0,03
2,76 0,23
13,42 0,51
2,47 0,20
3,47 0,13
13,72 0,46
1,74 0,05
8,41 0,66
12,7 1,5
2,34 0,21
5,31 0,56
4,39 0,62
6,77 0,27
1,82 0,09
0,29 0,09
1,87 0,09
7,30 0,47
5,44 0,71
0,65 0,08
1,20 0,26
7,95 0,58
7,35 0,73
14,3 2,7
4,87 0,29
8,61 0,16
3,95 0,16
10,75 0,91
2,81 0,10
3,28 0,05
10,3 1,3
1,81 0,14

56
O valor de t encontrado foi 1,923. O valor de t tabelado para 39 graus de liberdade

2,022 para 95% de confiana. Sendo assim, os valores encontrados pelos dois mtodos so
estatisticamente iguais para a maioria das amostras. Nos estudos de Popova e colaboradores
[58], os resultados obtidos pelo mtodo espectrofotomtrico e por HPLC-DAD tambm foram
comparados chegando-se tambm concluso de que os resultados so estatisticamente
iguais.
Cerca de 20% das amostras analisadas (amostras destacadas em vermelho na
Tabela XVII) apresentaram concentrao de flavonoides diferentes pelos dois mtodos.
Alguns desses resultados so menores no mtodo cromatogrfico. Isso pode ser devido ao fato
de alguns compostos que aparecem no cromatograma de vrias amostras no terem sido
quantificados, apesar de terem sido selecionados para essa quantificao os compostos
descritos pela literatura como majoritrios. Por exemplo, h uma grande quantidade de
compostos na regio prxima do tempo de reteno do artepillin C. Esses compostos so
derivados prenilados do cido p-cumrico. [80;82]
J os resultados do mtodo espectrofotomtrico que foram muito menores que os
obtidos pelo HPLC podem ser devido ao fato das diferentes classes de flavonoides
interagirem de forma diferente com o Al(III), e assim, alguns compostos podem no terem
sido quantificados por no terem formado o complexo com o alumnio. Um exemplo disso
so os flavonoides do grupo flavanonas e flavanonis que no complexam eficientemente
com o Al(III). [58]
Como somente uma replicata foi obtida, um possvel erro no mtodo cromatogrfico
ser avaliado em estudos futuros em que sero obtidos um maior nmero de replicatas da
concentrao de flavonoides para se ter maior confiabilidade dos resultados.
3.3.5 Construo do modelo de calibrao multiv ariada
A concentrao de flavonoides obtida pelo mtodo espectrofotomtrico para 90

amostras, na faixa de 0,06 a 1,74% (m/m) (vetor y), juntamente com os espectros de absoro
na regio UV-Vis das amostras diludas em etanol 95% (v/v) (matriz X) foram usados para a
construo de um modelo de calibrao multivariada. Na Figura 30 podem-se visualizar os
espectros de absoro dos extratos de prpolis analisados.

57
Figura 30: Espectros de absoro na regio UV-Vis das amostras diludas em etanol 95% utilizadas na
construo do modelo
Segundo Pavia, pesquisadores notaram que as bandas primrias e secundrias nos

espectros de compostos aromticos polinucleares sofrem deslocamento batocrmico. Dessa
forma, a banda primria que ocorre em 184 nm, e no observada em condies
experimentais normais, deslocada para um comprimento de onda dentro do alcance da maior
parte dos espectrofotmetros UV-Vis. [39]
Substituintes com eltrons no ligantes tambm podem causar deslocamentos nas
bandas, devido ao fato desses eltrons aumentarem o comprimento de sistema . Assim,
quanto mais disponveis esses eltrons estiverem para interagir com o sistema , maiores
sero os deslocamentos.
Devido ao fato dos compostos fenlicos serem hidrocarbonetos aromticos
polinucleares, com substituintes que possuem eltrons no ligantes, ocorre deslocamento
batocrmico das bandas primrias e secundrias.
Observando os espectros da Figura 30 percebe-se que a segunda banda primria que
deveria ocorrer em 184 nm deslocada para comprimentos da ordem de 206 nm. A banda que
deveria ocorrer em 202 nm sofre um deslocamento batocrmico e observada em torno de
240 nm. Outro comprimnento de onda em que a banda observada em todas amostras o que

58
ocorre por volta de 310 nm, que corresponde ao deslocamento batocrmico da banda
secundria de compostos aromticos, que deveria ser visualizada em 255 nm.
Segundo o MAPA, os extratos alcolicos de prpolis devem apresentar bandas
caractersticas entre 200 e 400 nm devido presena dos compostos fenlicos. Todas as
amostras analisadas esto de acordo com a legislao.
Na construo do modelo PLS quatro variveis latentes foram escolhidas por
apresentarem menor RMSECV. Essas quatro variveis latentes explicaram 99,77% da
varincia em X e 97,28% da varincia em y. Para a verificao dos outliers foi utilizada uma
rotina proposta por Braga [74] e um total de 12 amostras foram consideradas outliers. Essa
rotina considera como outlier amostras com alto leverage, que uma medida da influncia de
uma amostra no modelo em comparao com o resto do conjunto de dados, e alto resduo, que
uma medida da parte da informao da amostra que no foi modelada. Dessas 12 amostras
uma foi retirada por apresentar alto leverage, duas por resduo espectral e 9 por alto resduo
em y, todas do conjunto de calibrao. Segundo Botelho et. al. [83], o fato da maioria dos
outliers ter sido detectada com base nos altos resduos em y um indicativo de problemas nos
valores obtidos pelo mtodo de referncia. Uma possvel causa desse problema o pequeno
volume de extrato (20 L) que utilizado nas anlises. As amostras apresentam diferentes
viscosidades e a transferncia da alquota das amostras mais viscosas dificultada. Entretanto,
verificou-se que volumes maiores que esse fazem com que a absorbncia dos espectros seja
muito maior que 1, provocando disores. Outra possibilidade a diferente composio das
amostras. Como j foi falado anteriormente, o mtodo do Al(III) mais eficiente na
complexao dos flavonoides do grupo das flavonas e flavonis.
Assim, podem estar
presentes em algumas amostras flavonoides que no complexam to eficientemente com o

alumnio e para essas amostras os valores podem estar subestimados.
Os outliers que possuem alto leverage indicam amostras com composio muito
diferentes, um problema que est relacionado com as diversas origens das amostras obtidas
[83]. Como pode ser observado na Figura 26, algumas amostras apresentaram espectro bem
diferentes das demais, o que indica que essas amostras realmente apresentam uma composio
diferenciada. A diversidade botnica a que a abelha est exposta para a produo da prpolis
influencia na sua composio. Amostras com composio muito diferente das demais, acabam
ento sendo consideradas como outliers.
Na Figura 31 possvel analisar a contribuio de cada varivel (comprimento de
onda) na construo do modelo PLS atravs dos coeficientes de regresso. Os coeficientes de

59
regresso calculadas a paritr de todos os pesos em todas as variveis latentes utilizadas no

modelo. possvel observar que os comprimentos de onda que mais contribuiram para o
modelo foram 210, 240 e 330 nm que correspondem aos comprimentos de onda que so
observados nas bandas dos espectros das amostras de prpolis.
0,15
Coeficiente de Regresso
0,10
0,05
-0,05
-0,10
-0,15
-0,20
200
250
300
350
Comprimento de onda (nm)
400
450
Figura 31: Coeficientes de regresso do modelo PLS
Para avaliar a linearidade do modelo plotou-se os resduos em funo da concentrao

de flavonoides prevista pelo modelo (Figura 32). Como pode ser observado, a distribuio dos
resduos das amostras de calibrao e validao apresentam comportamento aleatrio,
demostrando que o modelo linear.

60
0.15
0.1
Resduos (%)
0.05
-0.05
-0.1
-0.15
-0.2
0.5
1
Valores previstos (%m/m)
1.5
Figura 32: Grfico de resduos versus concentrao de flavonoides determinado pelo mtodo de referncia.
() Amostras de calibrao; () Amostras de validao.
Construiu-se ento o grfico da concentrao de flavonoides prevista pelo modelo PLS

versus concentrao de flavonoides determinada pelo mtodo espectrofotomtrico
(Figura 33). Obteve-se para o modelo construdo erro quadrtico mdio para o conjunto de
calibrao (RMSEC) igual a 0,067% (m/m) e para o conjunto de validao (RMSEP) um erro
igual a 0,054% (m/m). Para avaliar o modelo tambm foi determiado o valor do coeficiente de
determinao da curva que igual a R = 0,9703, demostrando um bom ajuste.

61
Figura 33: Valores da concentrao de flavonoides prevista em funo da concetrao de flavonoides medida.
() Amostras de calibrao; () Amostras de validao.
O erro relativo mdio do modelo em relao s amostras de validao foi de 11,0% e

das amostras de calibrao foi de 10,0%. A preciso do modelo foi avaliada em termos da
repetitividade com Desvio Padro Relativo (DPR) entre 1,38 e 2,25% e entre 2,40 e 3,72%
para a preciso intermediria. Os valores esto de acordo com a legislao que estabelece
limites mximos de 2,5% para a repetitividade e 3,7% para a preciso intermediria,
considerando o nvel de concentrao do analito utilizado (1 g/kg c < 10 g/kg). [84]
Atravs dos resultados obtidos na avaliao da linearidade, da preciso e exatido do
modelo,
estabeleceu-se
faixa
de
trabalho
de
0,03
1,47%
(m/m).
Na
Tabela XVIII encontram-se as principais figuras de mrito calculadas para o modelo PLS
construdo nesse trabalho.

62
TABELA XVIII: Principais figuras de mrito para o modelo PLS
Figuras de mrito
Exatido
Parmetro
Valor
RMSECV
0,086% (m/m)
RMSEC
0,067% (m/m)
RMSEP
0,054% (m/m)
2,25%
DPR Repetitividade
1,38%
1,44%
Preciso
DPR preciso intermediria
3,72%
2,40%
Regresso
Coeficiente de Determinao
0,9703
Faixa de Trabalho
0,03-1,47% (m/m)
Em estudo recente, Cai et. al. utilizaram espectroscopia no infravermelho prximo

para obter o espectro de 180 amostras de prpolis bruta originrias da China, e a concentrao
de flavonoides nas amostras obtida por HPLC, para a construo de um modelo PLS. Para o
modelo construdo usando a quercetina como padro o autor obteve um erro mdio de 11,4%
para o conjunto de validao. Os erros neste trabalho e no de Cai, foram bem prximos,
entretanto o mtodo espectrofotomtrico muito mais rpido e simples que o mtodo
cromatogrfico utilizado pelo autor. [85]
3.4 Concluso
As condies cromatogrficas utilizadas para a obteno dos cromatogramas dos

extratos alcolicos de prpolis se mostraram muito eficazes, sendo possvel obter uma maior
separao e resoluo dos picos.
O modelo PLS proposto para a determinao da concentrao de flavonoides nas
amostras de extratos comerciais de prpolis mostrou ser uma alternativa eficaz em relao ao

63
mtodo espectrofotomtrico. Alm de o mtodo espectrofotomtrico ser trabalhoso e utilizar

uma grande quantidade de reagentes, somente aps uma hora pode ser feita a leitura da
absorbncia das solues. No modelo quimiomtrico, somente necessrio a obteno do
espectro da amostra diluda em etanol, sendo um mtodo muito mais rpido, alm de no ser
necessrio o uso de diversos reagentes e solventes, principalmente o metanol que txico.
Assim, o modelo construdo nesse trabalho pode ser utilizado em laboratrios de anlise de
rotina como um mtodo simples para a quantificao da concentrao de flavonoides nas
amostras de prpolis.
4 - Utilizao dos complexos de alumnio e PLS-DA para a discriminao de

extratos comerciais de prpolis
64
4. UTILIZAO DOS COMPLEXOS DE ALUMNIO E PLS-DA PARA A

DISCRIMINAO DE EXTRATOS COMERCIAIS DE PRPOLIS
Devido diversidade da flora regional, a prpolis brasileira possui uma composio

qumica bem complexa, o que reflete em suas propriedades biolgicas diferenciadas. A alta
concentrao de compostos fenlicos (cidos fenlicos e flavonoides) faz com que ela seja de
grande interesse para o mercado internacional, principalmente o asitico.
Amostras de prpolis com diferentes origens geogrficas possuem diferentes tipos de
compostos fenlicos e em diferentes concentraes. Muitos dessas substncias possuem
propriedades farmacolgicas diferenciadas, como o artepillin C, e a presena dessas
substncias na prpolis agrega valor econmico ao produto. [22, 86;87]
Alm disso, a variabilidade qumica da prpolis torna-se um problema para sua
padronizao. Trabalhar com materiais padronizados importante, pois permite que os
pesquisadores consigam conectar uma determinada composio qumica da prpolis com um
tipo especfico de propriedade biolgica e assim formular recomendaes do uso do produto,
o que iria ajudar o pblico em geral a fazer um uso mais eficiente das propriedades benficas
da prpolis. [88]
Dessa forma, a discriminao da prpolis quanto ao contedo em compostos fenlicos
e, consequentemente, quanto origem geogrfica, de grande importncia para a previso de
suas propriedades biolgicas. Neste trabalho aproveitam-se os espectros UV-Vis dos
complexos formados entre os flavonoides e o Al(III), que so obtidos na anlise de rotina de
determinao da concentrao de flavonoides nas amostras comerciais de prpolis, para a
construo de um modelo de classificao supervisionada para discriminar as amostras de
acordo com os tipos de flavonoides, utilizando o PLS-DA.
4.1 Materiais e Mtodos

4.1.1 Amostras
Foram estudadas 78 amostras de extratos alcolicos de prpolis de diferentes estados

do pas, adquiridas no comrcio ou doadas pelos produtores. As amostras foram nomeadas
como comum (C) e verde (V) de acordo com as informaes no rtulo. Aquelas que no
tinham informao sobre o tipo na embalagem foram classificadas como comum. Antes de

65
serem submetidas a anlise, uma alquota da amostras foi centrifugada a 3000 rpm por cinco
minutos. Algumas amostras apresentaram formao de corpo de fundo. Somente o
sobrenadante dessas amostras foi utilizado para a quantificao.
4.1.2 Reagentes
Para o preparo das solues da metodologia colorimtrica para a quantificao dos

flavonoides, utilizou-se metanol PA da marca Synth, Al(NO3)3.9H2O da Sigma-Aldrich e
CH3COOLi da marca VETEC.
Nos estudos cromatogrficos os seguintes padres de flavonoides e cidos fenlicos
foram investigados: cido p-cumrico, quercetina, pinocembrina, crisina, cido cinmico,
cido ferlico, kaempferol, acacetina, naringenina e galangina, todos da Sigma-Aldrich e de
grau cromatogrfico. Para o preparo a diluio das amostras e preparo das solues dos
padres foi utilizado metanol de grau cromatogrfico da marca J. T. Baker. Para o preparo das
fases mveis, alm do metanol, foi utilizado 2-propanol da J. T. Baker, acetonitrila da marca
CRQ e cido actico da marca VETEC. Para diluio dos extratos de prpolis utilizou-se
etanol VETEC de grau HPLC.
4.1.3 Metodologia espectrofotomtrica
Nesse trabalho foram utilizados os espectros eletrnicos dos complexos de Al(III)

obtidos para a determinao da concentrao de flavonoides nas amostras pelo mtodo
espectrofotomtrico, conforme descrito no item 3.1.3.
4.1.4 Metodologia cromatogrfica
Para a anlise cromatogrfica foram separadas 40 amostras representativas dos grupos

observados no PLS-DA. As amostras foram diludas 80 vezes em etanol 75% (m/v) e filtradas
em filtro de seringa Milipore de 0,21 m de poro antes da injeo no HPLC.
Para o preparo das solues dos padres, obteve-se inicialmente solues estoque dos
padres de 200 g mL-1. Para isso, foram pesados 1 mg de cada padro que foi transferido
para um balo volumtrico de 5 mL. O volume dos bales foi completado com metanol. A

66
partir das solues estoque foram preparadas solues de 10 g mL-1. Para o preparo dessas
solues transferiu-se 250 L da soluo estoque para um balo de 5 mL e completou-se o
volume com metanol. Tambm foi preparado um pool adicionando-se 250 L de todos os
padres em uma balo volumtrico de 5 mL e completando-se o volume do balo com
metanol.
4.1.5 Anlise Quimiomtrica
O programa Mathlab R2009b e o pacote PLS_Toolbox-522 foram usados para o

tratamento quimiomtrico dos dados obtidos.
Com os espectros construiu-se a matriz de dados e realizou-se, primeiramente, uma
Anlise de Componentes Principais (PCA). Os espectros tiveram a linha base corrigida
utilizando o algoritmo baseline do PLS_Toolbox. Os dados foram centrados na mdia e
utilizou-se o alisamento para reduzir o rudo nos espectros. A partir anlise do PCA as
amostras foram separadas em quatro grupos e essa informao foi utilizada para a construo
do vetor y do PLS-DA.
Para a construo do PLS-DA as amostras foram separadas em um conjunto de
calibrao e outro de validao, utilizando o algoritmo de Kennard-Stone [73], sendo que 2/3
das amostras (52 amostras) foram utilizadas para a calibrao e 1/3 (26 amostras) para a
validao do modelo.
O pr-processamento utilizado foi centrar os dados na mdia e alisamento (SavitskyGolay) [89]. O mtodo de validao cruzada foi o dos blocos contnuos (do ingls,
Contiguous Blocks).
Para a verificao de possveis outliers utilizou-se o grfico de QxT2 de Hotelling,
sendo que as amostras consideradas anmalas foram retiradas do modelo.
4.2 Resultados e Discusso

4.2.1 Construo do modelo PLS-DA
Os espectros de absoro na regio UV-Vis obtidos para as amostras pelo mtodo

espectrofotomtrico podem ser visualizados na Figura 34.

67
Figura 34: Espectros das amostras de extrato de prpolis na presena de Al(III)
O ction alumnio forma complexos estveis com os flavonoides em metanol,

ocorrendo desvio para maiores comprimentos de onda e uma intensificao da absoro em
relao ao espectro do flavonoide sem a presena do alumnio. Dessa forma, possvel
determinar a concentrao de flavonoides, evitando-se a interferncia de outros compostos
fenlicos, como os cidos fenlicos. Os cidos fenlicos que formam complexos absorvem
em comprimentos de onda muito inferiores.
Inicialmente, foi realizada com esses espectros uma anlise por componentes
principais com o objetivo de visualizar uma possvel seperao entre as amostras. Essa PCA
foi construida com 78 amostras. Foi possvel observar que havia a separao das amostras em
quatro grupos. Atravs da anlise do grfico de QxT de Hotelling para 95% de confiana,
amostras com alto resduos e altos valores de T (alta influncia no modelo) foram
consideradas outliers. Assim, foram removidas trs amostras e construiu-se uma nova PCA.
Na nova PCA foram utilizadas trs componentes principais que explicaram 98,62% da
varincia. Na Figura 35 possvel visualizar os quatro grupos em que as amostras se
separaram.

68
1,0
C40
Escores em CP2 (16.43%)
0,5
C59C56
C36
C87V26
V36
C57
C10
V37
C75C18
C41
C84
C70
C64
C17
C83 V42 C32
C38
C31
C30
C77
C78
V33
C92C14
C7C15
C63
C93 C81
C35
C102
C101
C27
C3
V10
C37
C21
C91
V14
C50V35
C60
C79V30 C86
C68
C95
C33
V4
C94
C28
C90
V13 V25
C97
V28
C72 V38
C45
-0,5
V39
C71
-1,0
C34
C5
-1,5
V1
-2,0
-2,5
-2,0
-1,5
C47 C58
V29V23
C53
V6
C52
-1,0
-0,5
0
0,5
1,0
1,5
2,0
(a)
1,5
V1
1,0
C52
C5
V6
0,5
-0,5
C84
C40 C21
C63
V33
C3
V10
C37
C36
V36 C64 C59V26
C30
C27
C57
C32
C56
V42
V37 C87
C10
C18
C41
C83
C75
C7C31
C38
C14
C15 C35
C17
C70
C77
C91
C102
C92 C78
C81
C93
C101
C45
-1,0
-1,5
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0
0,5
C95 C60
C94
C79
V30 V13
C68
C90
C72
V14
C50
C28 V25
V35 C86
C97 V4 V28
C33 V38
V23
C58
V39
C53
V29
C34
C71
1,0
C47
1,5
(b)
Figura 35: Escores do modelo PCA. (a) CP1 vs CP2 (b) CP1 vs CP3
2,0

69
Na Figura 36 pode-se obervar os espectros das amostras separadas de acordo com os

grupos observados na PCA e a Figura 37 mostra o grfico dos pesos das componentes
principais que foram utilizadas no modelo, demonstrando a influncia de cada varivel
(comprimento de onda) na separao das amostras.
possvel perceber que os pesos na primeira componente principal se assemelham aos
espectros das classes 1, 3 e 4. Os comprimentos de onda importantes na separao foram os
por volta de 330 e 430 nm. Os pesos em CP2 se assemelham aos espectros da classe 2, e o
comprimento de onda que mais influencia nessa separao o por volta de 370 nm. Tambm
possvel perceber pela anlise da Figura 36 que os espectros das amostras pertencentes a
classe 4 apresentam um desvio hipsocrmico da banda II. O comprimento de onda mximo
dessa banda, em torno de 310 nm, contribui negativamente para a separao em CP2.
Observando os pesos em CP3 pode-se perceber a contribuio dos comprimentos de onda em
310 e 370 nm que influenciam positivamente, enquanto que em 430 nm influencia
negativamente.
Figura 36: Espectros das amostras separados de acordo com as classes observadas no PCA

70
Figura 37: Grfico dos pesos em CP1, CP2 e CP3 para o modelo PCA.
As informaes obtidas dessa PCA foram utilizadas para a construo do vetor y do

PLS-DA. As amostras do conjunto de calibrao (52) e validao (26) foram escolhidas
utilizando o algoritmo de Kennard-Stone [73]. O melhor modelo foi construdo com 3
variveis latentes, que explicaram 98,47% em X e 79,39% em Y. O nmero de variveis
latentes foi escolhido baseado no menor valor para o RMSECV. A Tabela XIX apresenta a
varincia acumulada para as 3 variveis latentes.
TABELA XIX: Porcentagens de varincia explicada pelo modelo PLS-DA
Bloco X
Varivel
Bloco Y
Latente
VL
Varincia Acumulada
VL
Varincia Acumulada
(VL)
(%)
(%)
(%)
(%)
72,87
72,87
27,50
27,50
16,03
88,91
28,61
56,11
9,57
98,47
23,27
79,39

71
Foram calculadas ento a sensibilidade e a especificidade do modelo. A sensibilidade

corresponde ao nmero de amostras previstas como sendo da classe, dividido pelo nmero de
amostras presentes de fato na classe. J a especificidade calculada dividindo o nmero de
amostras corretamente previstas como no pertencentes classe pelo nmero de amostras que
realmente no pertencem. Na Tabela XX podem ser vistos os parmetros de qualidade para o
modelo, sendo que houve 100% de acerto na previso das amostras das classes 1, 2 e 3. Para a
classe 4 houve um acerto de 96%.
TABELA XX: Sensibilidade e Especificidade do modelo PLS-DA
Parmetro
Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
Sensibilidade (calibrao)
1,000
1,000
1,000
0,966
Especificidade (calibrao)
1,000
1,000
1,000
1,000
Sensibilidade (previso)
1,000
1,000
1,000
0,956
Especificidade (previso)
1,000
1,000
1,000
1,000
Na Figura 38 tem-se as amostras previstas para as quatro classes. As amostras com

smbolos cheios correspondem as amostras de validao, enquanto que as amostras com
smbolo vazio so as amostras de validao.

72
Figura 38: Amostras classificadas pelo modelo PLS-DA. Os smbolos cheios correspondem s amostras de
validao, os smbolos vazios s de calibrao. (a) Classe 1 (b) Classe 2 (c) Classe 3 (d) Classe 4
A Figura 39 mostras os grfico dos coeficientes de regresso para cada classe do

modelo. Pela anlise deste grfico possvel verificar que os comprimentos de onda
responsveis pelas separaes foram os mesmos verificados no PCA, que so 310, 330, 370 e
430 nm.

73
Figura 39: Coeficientes de regresso para o modelo PLS-DA.
Para explicar melhor a separao das amostras nessas classses, amostras

representativas de cada classe foram analisadas por HPLC. Na Figura 40 pode-se observar o
cromatograma de quatro amostras que foram selecionadas de cada classe.

74
Figura 40: Cromatograma de amostras representativas das classes observadas no PLS-DA. 1) cido cafico 2)
cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6) naringenina 7) kaempferol 8)
pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12) artepillin C.

75
Como pode ser observado na Figura 37, as amostras que pertencem classe 1 so as
que apresentam uma maior quantidade e concentrao dos compostos fenlicos. Essas
amostras possuem uma concentrao bem alta de artepillin C, que relatado na literatura
como o composto fenlico majoritrio da prpolis verde. Na literatura existem vrios estudos
sobre o artepillin C, mostrando que ele possui diversas propriedades biolgicas como ao
antitumoral, antioxidante, antiinflamatria, antibacteriana, prevenindo assim vrias doenas.
[22, 80, 86;87, 90 ]
As amostras pertencentes classe 2, alm de possuirem um espectro bem diferenciado
dos demais, com uma nica banda em torno de 370 nm, possuem uma concentrao de cidos
fenlicos maior do que as amostras pertencentes s demais classes. As amostras pertencentes
a essa classe praticamente no possuem derivados prenilados do cido p-cumrico e o
artepillin C. Alm disso, elas no possuem em sua composio a acacetina e galangina.
J as amostras pertencentes classe 3 mostraram no possuir concentraes
considerveis de compostos fenlicos. Ao analisar as amostras pertencentes a esse grupo
notou-se que 61% dessas amostras pertencem regio sul. Diante desse resultado, verificouse os resultados obtidos na determinao da concentrao de flavonoides das amostras de
prpolis e foi possvel perceber que das 16 amostras do sul que foram utilizadas nesses
trabalho, 11 foram consideradas irregulares quanto concentrao de flavonoides, cujo
mnimo exigido por lei 0,25% (m/m). Alm disso, foi possvel notar que somente uma
amostra pertencente classe 3 no irregular, mesmo assim sendo essa amostra da regio sul
e possuindo uma concentrao de flavonoides baixa (0,29% m/m).
A composio qumica da prpolis dependente da localizao geogrfica, estando
assim a atividade biolgica intimamente relacionada com a a ecologia vegetal da regio
visitada pelas abelhas. A prpolis brasileira se destaca por possuir diversas propriedades
biolgicas, e essa caracterstica atribuida diversidade botnica do pas . Entreatanto, no sul
do pas as abelhas utilizam principalmente as plantas da espcie Populus alba para a produo
da prpolis, o que faz com que sua composio se assemelhe mais s prpolis da Europa,
Amrica do Norte e sia Ocidental. Devido a isso, essas amostras apresentaram baixa
composio de compostos fenlicos e o emprego dessas amostras com prpositos
farmacolgicos deve ser melhor avaliado. [1;2,17]

76
As amostras pertencentes classe 4 possuem todos os compostos fenlicos que esto

presentes nas amostras da classe 1, mas em concentraes muito mais baixas, principalmente
dos cidos fenlicos, que so praticamente ausentes.
4.2.2 Concluso
O modelo proposto foi capaz de classificar as amostras de acordo com o tipo e

concentrao de compostos fenlicos com um acerto de 100% para as classes 1, 2 e 3, e com
um acerto de 96% para a classe 4.
Os comprimentos de onda responsveis pelas separaes nas classes foram 310, 330 e
430 nm, comprimentos de onda tpicos dos espectros dos complexos formados entre os
flavonoides e o Al(III), e 370 nm, que o comprimento de onda dos complexos formados
entre os cidos fenlicos e o Al(III).
A determinao de quais so os compostos fenlicos presentes nas amostras de extrato
alcolico de prpolis e quais dessas amostras possuem maior concentrao dessas substncias
de grande importncia, pois a presena e concentrao delas esto ligadas s propriedades
biolgicas conferidas prpolis. Dessa forma, o modelo PLS-DA pode ser utilizado como
uma ferramenta rpida para a identificao de amostras com maior valor agregado. Alm
disso, o modelo foi capaz de prever quais amostras eram irregulares quanto a concentrao de
flavonoides e pode ser utilizado na rotina como uma ferramenta de screening para identificar
quais so essas amostras.
5 - Consideraes Finais
77
5. CONSIDERAES FINAIS
A importncia econmica da prpolis no Brasil tem crescido significativamente,

devido a isso surge a necessidade de um controle mais rgido que garanta a qualidade do
produto e do desenvolvimento de metodologias mais adequadas para o controle de qualidade.
Neste trabalho,
metodologias quimiomtricas
juntamente com metodologias
espectrofotomtricas foram desenvolvidas para a avaliao de parmetros de qualidade dos

extratos comerciais de prpolis.
A concentrao de flavonoides nas amostras de extrato alcolico de prpolis foi
determinada atravs do mtodo espectrofotomtrico, que baseado na formao de
complexos entre os flavonoides e o alumnio, e por cromatografia. O grande diferencial desse
trabalho que as condies foram ajustadas para a quantificao dos flavonoides nos extratos
comercias, enquanto que na maioria dos outros estudos so analisados extratos preparados a
partir da prpolis bruta e, portanto, de concentrao conhecida.
As condies cromatogrficas desenvolvidas nesse trabalho se mostraram muito
eficazes, obtendo-se uma boa separao e resoluo dos compostos. As concentraes de
flavonoides obtidas pelo mtodo espectrofotomtrico e por HPLC foram comparadas
utilizando o teste t pareado e chegou-se a concluso de que os resultados obtidos pelas duas
metodologias, para a maioria das amostras, so estatisticamente iguais. Cerca de 20% das
amostras apresentaram resultados diferentes pelos dois mtodos. Um maior nmero de
replicatas ser obtido futuramente para ter-se maior confiabilidade nos resultados.
Das 97 amostras analisadas pelo mtodo espectrofotomtrico, 27% foram consideradas
irregulares por terem menos que 0,25% (m/m) de flavonoides, que o mnimo recomendado
pelo MAPA. Como a concentrao de flavonoides est diretamente ligada s propriedades
biolgicas da prpolis, esse um valor muito alto, mostrando assim a necessidade de um
controle de qualidade mais rigoroso em relao aos extratos alcolicos comerciais de prpolis.
A garantia de que a concentrao de flavonoides est de acordo com o estabelecido pelo
MAPA muito importante, pois o produto utilizado para fins teraputicos pela populao,
assim possvel assegurar que a prpolis ser eficiente para combater diversas doenas,
agregando valor ao produto brasileiro.
A composio qumica da prpolis est diretamente ligada diversidade da flora
regional. A prpolis brasileira reconhecida internacionalmente, principalmente a prpolis
proveniente da regio sudeste, por possuir alta concentrao de compostos fenlicos.
5 - Consideraes Finais
78
Entretanto, a prpolis proveniente da regio sul mostrou possuir caractersticas diferentes das
demais. Das 16 amostras de prpolis proveniente da regio sul, 11 foram consideradas
irregulares por possuirem concentrao de flavonoides abaixo do limite estipulado pela
legislao, mostrando assim que h a necessidade de um melhor controle dos extratos
comercias de prpolis provenientes dessa regio.
O mtodo de calibrao multivariada PLS que foi desenvolvido para a determinao
da concentrao de flavonoides nas amostras comerciais de extrato alcolico de prpolis se
mostrou muito eficaz. O modelo PLS apresentou bom valor de coeficiente de correlao. A
metodologia proposta nesse estudo tem a vantagem de ser mais rpida do que a metodologia
colorimtrica, menos laboriosa e envolver menos reagentes. Sendo assim, ela pode ser
executada em anlises de rotina para o controle de qualidade desses produtos.
O modelo PLS-DA proposto conseguiu classificar as amostras de acordo com a
composio fenlica com um acerto de 100% para as classes 1, 2 e 3, e 96% para a classe 4. A
determinao da composio fenlica dessas amostras importante tanto do ponto de vista
econmico quanto biolgico. Aquelas que possuem maior concentrao e quantidade dessas
substncias so mais valorizadas no mercado nacional, e principalmente internacional, pois
possuem propriedades biolgicas diferenciadas. Um exemplo so as amostras que foram
classificadas na classe 1, que alm de possuir no geral uma alta quantidade e concentrao de
compostos fenlicos, se destacam pela concentrao elevada de artepillin C que mostrou em
vrios estudos possuir diversas atividades biolgicas. Alm de classificar as amostras quanto
composio e concentrao dos compostos fenlicos, uma das classes observadas no modelo
constituda de amostras consideradas irregulares quanto concentrao de flavonoides.
Assim, esse modelo til no somente para determinar quais so os principais compostos
fenlicos presentes nas amostras (o que normalmente feito atravs de mtodos
cromatogrficos, que so caros e demandam muito tempo), mas tambm para identificar quais
amostras so irregulares.
6 - Referncias Bibliogrficas
79
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citotxica de amostras de prpolis de alecrim. 2008. 110f. Dissertao (Mestrado em
Botnica) Universidade de So Paulo, Instituto de Biocincias, Departamento de Botnica,
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Qumica Nova, vol. 25,p.321-326, 2002.
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Avaliação Da Concentração e Dos Tipos de Flavonoides Na

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

Ariane Arajo ssimos

Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

UFMG/ ICEx/ DQ 1012

Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

Dissertao apresentada ao Departamento de

Deus por ter iluminado meu caminho e me dado foras

Palavras chaves: prpolis, flavonoides, compostos fenlicos, quimiometria.

Keywords: propolis, flavonoids, phenolic compounds, chemometrics.

Figura 1: Apis mellifera ........................................................................................................ 1

c) flavanonol (taxifolina); d) isoflavona (iridina); e) flavanona

() Amostras de calibrao; () Amostras de validao. ............... 61

CAS: do ingls, Chemical Abstracts Service.

VL: Varivel Latente

1.2 Composio Qumica ........................................................................................ 5

1.4.1 A Organizao dos Dados ...................................................................... 15

Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para Quantificao de

flavonoides nos extratos comerciais de prpolis ................................................................... 23

Mtodos Analticos para a Determinao de Flavonoides na Prpolis .......... 23

3.2 Materiais e Mtodos ........................................................................................ 31

3.3.2 Metodologia cromatogrfica ajuste das condies experimentais ........... 41

Utilizao dos complexos de Alumnio e PLS-DA para a discriminao de extratos

comerciais de prpolis ......................................................................................................... 64

Consideraes Finais .................................................................................................. 77

Referncias Bibliogrficas .......................................................................................... 79

A prpolis (CAS No. 9009-62-5) uma resina de colorao e resistncia variada

Figura 1: Apis mellifera

A popularizao do uso da prpolis se deve as diversas propriedades biolgicas que

TABELA I: Classificao da Prpolis Brasileira de acordo com caractersticas fsico-qumicas e origem

G12 (SP12) Verde ou Marrom Esverdeado

Fonte: Adaptado de Toreti et. al. , 2013. [2]

Figura 3: Baccharis dracunculifolia, conhecida como alecrim-do-campo, fonte da prpolis verde

Figura 4: Estrutura qumica do artepillin C.

O 13 tipo de prpolis foi o mais recentemente classificado. Essa prpolis originria

1.2 Composio Qumica

os cidos cafico e clorognico), esteroides, aminocidos, polissacardeos, cidos graxos e

Perda por dessecao

Mnimo de 0,50% (m/m)

Mnimo de 0,50 (m/m)

Mnimo de 0,25% (m/m)

Atividade de Oxidao Mximo de 22 segundos

Mximo de 40% (m/m)

Mnimo de 35% (m/m)

Mximo 0,40 mg/L

Entre os parmetros preconizados pelo MAPA para os extratos alcolicos est a

1.3 Compostos fenlicos

Os cidos fenlicos pertencem ao grupo dos compostos fenlicos e so caracterizados

Derivados do cido Benzoico

TABELA IV: Principais cidos fenlicos derivados do cido cinmico

Derivados do cido Cinmico

R2 = OCH3; R3 = OH (cido Ferlico)

Os principais cidos fenlicos presentes na prpolis so cido glico, vanlico,

O hngaro Albert Szent-Gyrgi, descobriu os flavonoides em 1936. Baseado em

Figura 6: Estrutura bsica dos flavonoides

biflavonoides, catequinas e seus precursores metablicos conhecidos como chalconas, e

Figura 7: Flavonoides encontrados na prpolis

1.3.3 Prpolis e Espectroscopia Eletrnica

Os flavonoides e cidos fenlicos presentes na prpolis apresentam absoro na regio

Figura 8: Espectro tpico de um extrato alcolico de prpolis

O espectro ultravioleta do extrato alcolico de prpolis consiste em duas bandas de

TABELA V: Alguns compostos fenlicos e suas bandas de absoro no ultravioleta

Fonte: Adaptado de CHANG, 2005. [41]

Os espectros em metanol das flavonas e flavonis apresentam duas bandas de maior