Laboratorio de Qumica Orgnica Aplicada.

Prctica 2. Cromatografa en columna.

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LABORATORIO DE QUMICA ORGNICA APLICADA

PRCTICA # 2
SEPARACIN POR CROMATOGRAFA EN COLUMNA DE
PIGMENTOS VEGETALES
Y SUS ESPECTROS DE ABSORCIN

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:

1. Preparar una columna para cromatografa.
2. Preparar un extracto de pigmentos de plantas.
3. Separar por cromatografa en columna la mezcla de pigmentos extrados.
4. Obtener el espectro de absorcin en la zona del visible de los pigmentos extrados.
5. Explicar los conceptos fundamentales en los que se basa la cromatografa.

INFORMACION GENERAL

Pigmentos de las plantas

Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre llevan a cabo un
proceso llamado fotosntesis, por el cual, mediante la energa solar, transforman el bixido de carbono en
carbohidratos como la glucosa y su polmero el almidn, que son compuestos con alto contenido en energa
qumica y, por ello, estos seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es
utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiracin, en el cual se oxida hasta
CO2 y H2O, obteniendo as la energa necesaria para llevar a cabo sus diversas funciones.

Para atrapar la energa solar e iniciar el proceso de transformacin de energa luminosa a energa qumica, las
plantas superiores contienen en sus clulas un organelo llamado cloroplasto, en donde se encuentran los
llamados centros de reaccin, formados por protenas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las
clorofilas a y b se encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias
fotosintticas. Adems de estas molculas, los organismos fotosintticos tienen otros pigmentos con
capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por ejemplo a los carotenos, xantofilas,
antocianinas y otras molculas con colores caractersticos.

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La estructura de estas sustancias se muestra en la fig. 1.

Fig. 1. Estructura de algunos pigmentos de plantas

Estas sustancias son coloridas por el nmero elevado de dobles ligaduras conjugadas que poseen, lo que
permite que las excite la radiacin con longitud de onda en la regin del visible. La clorofila absorbe bien en
la regin del rojo y el azul y muy poco en la zona del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes
porque la luz verde se refleja, no se absorbe.
Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con solventes orgnicos cuando las clulas
que los contienen se rompen. Los extractos tienen, adems de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos
incoloros. Entre los tipos de pigmentos ms solubles en solventes orgnicos, se encuentran las clorofilas
(azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las plantas (por ejemplo
en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a xantocianinas, las cuales si son solubles en
agua y no se extraen con solventes orgnicos.

Mtodos cromatogrficos

Los mtodos cromatogrficos son mtodos de separacin que involucran la transferencia reversible de un
compuesto que est adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase mvil (solvente) que fluye a
travs de la fase estacionaria.

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La separacin surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, solvente y adsorbente. El
adsorbente est presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir
reversiblemente pequeas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrosttico. El
solvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unin. Estos componentes son
desplazados reversible y continuamente en la direccin del flujo del solvente. El proceso descrito puede
escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una particin de los componentes entre la fase
estacionaria y la fase mvil:
componentes-adsorbente

solvente-adsorbente

componente-solvente

Entre ms polar sea un compuesto, ms fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su
migracin a lo largo de ella es menor, siendo eludo (arrastrado) ms lentamente por la fase mvil, que los
compuestos menos polares. De este modo, la separacin selectiva de los componentes de una muestra, por
cromatografa, se debe a las diferencias en la migracin de los componentes individuales a lo largo de la fase
estacionaria.
En la cromatografa en fase lquida se usa una fase mvil (lquida) y una fase estacionaria (slida), siendo los
adsorbentes ms comunes la slica gel (SiO2.H2O), almina (A2O3) y celulosa.
La distribucin de los componentes entre la fase slida y lquida es determinada, adems de por la polaridad
propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado
de hidratacin y de la polaridad del solvente).
El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la
polaridad del solvente. Una lista de los solventes ms usados en los diferentes tipos de cromatografa, en
orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre ms polar sea un solvente, ms rpido es el
movimiento de los compuestos y menos efectiva la separacin.
Menos polar

Ms polar

Hexano
Tolueno
Cloruro de metileno
Cloroformo
ter
Acetato de etilo
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
cido actico

Tabla 1. Disolventes comunes para cromatografa de lquidos

Cromatografa en columna

La cromatografa en una columna de adsorbente proporciona un medio para la separacin y aislamiento de

los componentes de una mezcla. La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se deja pasar
solvente a travs del adsorbente. Este proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los
compuestos individuales; estas bandas pueden ser eludas (arrastradas) en secuencia por adicin de ms
solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla usando el solvente menos

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polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad prctica.
Generalmente es necesario ir cambiando a solventes ms polares para efectuar la elusin de los compuestos,
dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eludo
ms rpidamente, depender de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2.
El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del
solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas
(separadas).
Las sustancias demasiado polares, como azcares o aminocidos, no pueden separarse de sus mezclas por
cromatografa en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua
o cido actico porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se
desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ah al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los
componentes de la mezcla se eluyen simultneamente.
VELOCIDAD
menos polar

RAPIDEZ DE ELUSIN
ms rpido

ms polar

ms lento

GRUPO FUNCIONAL
alcanos
halogenuros de alquilo
alquenos
dienos
hidrocarburos aromticos
halogenuros aromticos
teres
steres
cetonas
aldehdos
aminas
alcoholes
fenoles
cidos carboxlicos
cidos sulfnicos

Tabla 2. Velocidades relativas de elucin para diferentes grupos funcionales

En la prctica, los pasos de desarrollo y elusin frecuentemente son distinguibles, ya que la banda que se
mueva ms rpido puede empezar a emerger de la columna antes de que se complete la separacin de las
bandas que se mueven ms lentamente.
Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse las bandas.
En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeo. se evapora el solvente y los residuos se comparan
por cromatografa en placa delgada para determinar cules fracciones tienen igual composicin y pueden ser
reunidas.
La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede
utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapn de algodn o lana de
vidrio cubierto con una capa de arena para retener partculas finas. La relacin usual de dimetro de la
columna a altura del adsorbente es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la
columna para permitir que haya solvente arriba del adsorbente. Si el tubo tiene un dimetro de 1 cm o mayor,
se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se aade el adsorbente, ya
sea seco, dejndolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendindolo en un vaso de precipitados con el
mismo solvente y aadiendo la suspensin a la columna. Mientras se aade el adsorbente, debe mantenerse
entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un
dimetro menor a 1 cm (como las usadas en tcnicas de microescala, en las que se puede usar una pipeta

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Pasteur como columna)) no se pone solvente y el adsorbente se aade en seco. En cualquiera de los casos, la
columna debe ser compacta y uniforme; una columna no uniforme, en la que haya capas disparejas de
adsorbente, cuarteaduras o burbujas, no es utilizable. Arriba del adsorbente se coloca una pequea capa de
arena para prevenir que la parte superior del adsorbente sea alternada. El exceso de solvente es drenado de la
columna, justo hasta arriba del adsorbente y entonces se aade, usando una pipeta Pasteur, la muestra disuelta
en un volumen mnimo de solvente. La muestra debe adsorberse en la zona ms angosta posible, ya que las
bandas se vuelven ms difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo un cromatograma es
importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente para prevenir la
formacin de cuarteaduras en el adsorbente.
Las mezclas complejas de pigmentos de plantas presentan un gran problema de separacin. Generalmente la
separacin completa de todos los pigmentos de un extracto no se logra en un solo cromatograma; por
ejemplo, las diferentes clorofilas pueden separarse utilizando azcar pulverizada como adsorbente pero la
separacin de carotenos, menos polares, requieren de un adsorbente ms activo. Esta separacin fina no se
llevar a cabo en esta prctica.
En las condiciones de separacin usadas en esta prctica ocurren algunos cambios en los pigmentos ms
sensibles durante la extraccin y cromatografa, logrndose nicamente una separacin parcial; adems, los
compuestos incoloros se detectaran en el residuo si se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizar
la pureza de las fracciones para comprobar que la separacin fue completa; sin embargo, los principios del
mtodo si podrn ser observados.
Los resultados de esta cromatografa dependern de variables como la fuente de los pigmentos, la eficiencia
de la extraccin, la actividad de la almina utilizada como adsorbente, las dimensiones de la columna, los
volmenes de cada solvente y las mezclas de cada solvente utilizadas en el desarrollo. Cambios muy
pequeos en algunos de estos factores pueden afectar la separacin e incluso causar cambios en las posiciones
individuales de los pigmentos en el cromatograma.
Ya que es imposible especificar todas estas variables, no importa que tan detallado sea el procedimiento
indicado para llevar a cabo el cromatograma, no en todos los casos se obtendrn resultados ptimos. En el
procedimiento dado en la parte experimental, se sugiere una secuencia general de cambio de solventes y
recoleccin de fracciones pero los detalles dependern del cromatograma individual. El principal objetivo es
obtener tantos pigmentos individuales como sea posible en tubos de ensaye separados.

Espectroscopa de absorcin

La espectroscopa de absorcin es la medicin de la cantidad de radiacin que absorbe un compuesto como

funcin de la longitud de onda de la radiacin que incide sobre ella. En general, se irradia una muestra con
una fuente de radiacin y se mide con un detector la cantidad de radiacin transmitida a diversas longitudes
de onda.
Las principales tcnicas espectroscpicas (y otras relacionadas), que constituyen herramientas poderosas para
la elucidacin de estructuras en qumica orgnica son las siguientes:
- Espectroscopa de infrarrojo, que observa las vibraciones de los enlaces y da evidencia acerca de los grupos
funcionales presentes en una molcula.
- Espectroscopa de ultravioleta-visible, que observa las transiciones electrnicas y da informacin acerca de
los electrones, especialmente de los no compartidos y de los sistemas de enlaces mltiples en la muestra.

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- Espectroscopa de resonancia magntica nuclear, que da informacin sobre el entorno de todos los tomos
de hidrgeno de la molcula en estudio y, por lo tanto, sobre la estructura de la cadena aliftica y/o aromtica
y sobre los grupos funcionales cercanos a los hidrgenos.
- Espectrometra de masas, tcnica en la que se bombardean las molculas con electrones para romperlas. El
anlisis de las masas de los fragmentos obtenidos da informacin sobre el peso molecular, los heterotomos y
los grupos funcionales presentes en la molcula original.
El espectro electromagntico incluye todas las posibles frecuencias, desde cero hasta infinito. En la prctica,
el espectro abarca desde frecuencias muy bajas, como las de radio utilizadas para la comunicacin con
submarinos, hasta frecuencias muy altas, como las de los rayos gama. La Tabla 3 muestra la frecuencia, la
longitud de onda y las relaciones de energa de las diversas zonas del espectro electromagntico.

mayor frecuencia
menor longitud de onda
longitud de
onda
10-10 m

regin del
espectro
rayos gama

energa por
mol
106 kcal

efectos
moleculares

10-8 m

rayos X

104 kcal

ionizacin

102 kcal

10-6 m

Ultravioleta
lejano
Ultravioleta
cercano
Visible

10-4 m

Infrarrojo

1 kcal

10-2 m

Microondas

10-4 kcal

10 0 m

Radio

10-6 kcal

102 m

transiciones
electrnicas
color

10 kcal

vibraciones
moleculares
movimiento
rotacional
transiciones en
el spin del
electrn

Tabla 3. Espectro electromagntico

El espectro electromagntico es continuo y la posicin exacta de la divisin entre cada regin es ms o menos
arbitraria. En la parte superior se encuentran las frecuencias ms altas y, por lo tanto, longitudes de onda ms
cortas y mayor energa. En la parte inferior se encuentran las frecuencias menores y, por lo tanto, longitudes
de onda mayores y menor energa.
Las molculas orgnicas sufren diferentes efectos de acuerdo a la energa de la radiacin que incide sobre
ellas: Si se utilizan ondas de radio de baja frecuencia, se puede modificar el spin de los electrones, en especial
el del hidrgeno, lo que aprovecha la tcnica de NMR. La energa en la regin de las microondas permite la
rotacin de las molculas. En la regin del infrarrojo hay vibracin de los enlaces entre los tomos de una
molcula. En el ultravioleta los electrones se excitan y pasan a niveles de energa ms altos dentro de las
molculas. Los rayos X tienen tanta energa que excitan los electrones por encima de los niveles de energa
del enlace y permiten la ionizacin de la molcula.

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En la prctica # 1 se puede utilizar la espectroscopa de infrarrojo para determinar la presencia de los grupos
funcionales en una muestra problema. En esta ocasin, utilizaremos la espectroscopa de ultravioleta-visible,
nicamente en la regin de visible, para determinar las longitudes de onda de absorcin de algunos de los
pigmentos de plantas, que fueron separados por cromatografa en columna. Posteriormente se verificarn los
resultados con los datos reportados en la literatura.

Espectroscopa en la regin del ultravioleta-visible

La excitacin de los electrones de una molcula orgnica puede requerir desde 40 a 300 kcal/mol. Las
longitudes de onda correspondientes a estas energas abarcan la regin del visible (400-800 nm), el
ultravioleta cercano (200-400 nm) y el ultravioleta lejano (100-200nm). La informacin ms til se obtiene
de los electrones y los pares de electrones no compartidos, pues estos enlaces son ms dbiles y requieren
menos energa (y mayor longitud de onda) para pasar del estado basal al estado excitado.
En especial en los alquenos, el fotn absorbido corresponde a la energa requerida para la transicin *.
A estos grupos que facilitan la absorcin de energa para la transicin electrnica se les llama cromforos. Si
el alqueno est conjugado, y entre mayor sea el nmero de dobles enlaces conjugados, la energa requerida
para llevar a cabo esta transicin disminuye (y la longitud de onda aumenta), como puede observarse en la
siguiente tabla:
nombre
etileno
1,3-butadieno
1,3,5-hexatrieno
1,3,5,7-octatetraeno

estructura
CH2=CH2
CH2=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH2

(nm)
165
217
268
290

Si el cromforo se sigue extendiendo, la longitud de onda de la transicin * se desplaza a la zona del

visible, en donde se da el mximo de absorcin (max). En esa situacin, la sustancia tendr color. Ya que la
longitud de onda absorbida estar en la zona azul del espectro, el compuesto se ver amarillo. El color
cambiar a rojo cuando la energa del fotn requerido para excitar a la molcula sea todava menor.
La transicin * se observa abajo de 190 nm. En el caso de los compuestos que tienen el cromforo
carbonilo: >C=O, ste tambin absorbe radiacin en la regin del ultravioleta., Sin embargo, el carbonilo
contiene un tomo de oxgeno con pares de electrones no compartidos que se encuentran en el estado basal n
y que pueden ser excitados al orbital *. La energa necesaria para esta transicin n * es menor que la
del alqueno y la absorcin se encuentra en la regin del UV cercano (270 nm para la acetona).
La max que presenta un cromforo en particular es muy sensible a los cambios estructurales en el sistema ,
es decir, al grado de sustitucin que tengan las dobles ligaduras, a la presencia de anillos aromticos, de
heterotomos, etc. Es posible calcular la max de un compuesto en especial siguiendo las reglas de
Woodward-Fieser.
Refirindonos especficamente al caso de esta prctica, si se observa la estructura de los carotenos (de color
naranja) se ver que son polienos conjugados. En las clorofilas (de color verde o azul-verde), el cromforo es
ms complejo, pero bsicamente tambin corresponde a un sistema polinico altamente conjugado, con pares
de electrones no compartidos en los tomos de nitrgeno (ver la Fig. 1).
A continuacin se incluyen los espectros de visible-UV de los pigmentos aislados en dos cromatografas de
extractos de espinaca. Los espectros de la primera cromatografa se reunieron en tres fracciones: 1) de
polaridad baja, 2) de polaridad intermedia y 3) de polaridad alta. Los espectros de la segunda cromatografa
en cuatro fracciones.

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ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA DE LAS FRACCIONES DE LA CROMATOGRAFA EN

COLUMNA DE PIGMENTOS DE PLANTAS

Tubo 2. Fraccin de menor polaridad, de color amarillo, eluda con hexano.

Tubo 3. Fraccin de polaridad baja, de color verde, eluda con cloruro de metileno.

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Tubo 4. Fraccin de polaridad media, de color amarillo, eluda con acetato de etilo.

Tubo 5. Fraccin de polaridad alta, de color verde, eluda con metanol.

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Nombres:

Equipo:

TCNICA EN MICROESCALA:

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Grupo:

PREGUNTAS PARALELAS:

a) Preparacin de la muestra de pigmentos:

Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas
pequeas y colcalas en un mortero con media
cucharadita de arena y 3 mL de metanol.

Para qu sirve la arena en la molienda?

Muele con la mano del mortero hasta obtener una

papilla, aade 6 mL de hexano y muele otra vez.

Por qu se extrae primero con metanol y

luego con hexano?

Con una pipeta Beral pasa el lquido a un embudo de

separacin chico, a travs de un embudo de vidrio con
un pedacito de algodn del tamao de un chcharo. Trata
de dejar el slido en el mortero.
Repite la molienda con otros 6 mL de hexano y renelos
con el primer extracto en el embudo de separacin.
Aade 10 mL de agua de la llave a la solucin de
hexano, tapa el embudo y agita. Deja separar las fases y
remueve la capa acuosa inferior, ponindola en un vaso
de precipitados.

Para qu se extrae con agua? Porqu es

mejor que sea de la llave y no destilada?

Repite el lavado del hexano con una segunda porcin de

10 mL de agua de la llave. Tapa, agita y deja separar
muy bien las fases.
Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo ms
posible toda el agua.
Rene esta segunda fase acuosa con la primera, para
posteriormente deschelas al drenaje.

Qu contiene este extracto y por qu puede

desecharse al drenaje?

A partir de este momento, todo el material debe de

estar bien seco. Lvalo slo si es necesario. Para
secarlo, escurre bien el agua, enjuaga con una cantidad
pequea de acetona, que puedes usar para varias piezas,
escurre nuevamente y termina de secar la pieza con
vaco.

Cmo afecta el agua a la cromatografa?

Transfiere la solucin de hexano a un matraz Erlenmeyer

de 25 mL. Aade a este matraz suficiente sulfato de
sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y
quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5 minutos
agitando de vez en cuando. Si no queda polvo fino de
sulfato anhidro, aade un poco ms del sufato y deja
reposar otros 5 min.

Si ya se separ el agua, por qu se necesita

el sulfato de sodio anhidro?

Con una pipeta Pasteur pasa la solucin colorida a otro

matraz Erlenmeyer de 25 mL. Enjuaga el sulfato de

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sodio con porciones de 0.2-0.3 mL de hexano. y con la

pipeta renelas al matraz con la solucin de los
pigmentos.
Marca el matraz con tu nmero de equipo, ponle unas
tres piedras de ebullicin y evapora la solucin, en una
parrilla en la campana, a un volumen aproximado de 2-3
mL. Ten cuidado de no evaporar todo el solvente para
evitar la descomposicin de los pigmentos.

Qu pasara si se omiten las piedras?

b) Preparacin de la columna de cromatografa:

Prepara la columna en una columna pequea con llave.
Si no dispones de estas columnas, puedes usar una pipeta
Pasteur corta, adptale en la punta un tubo capilar de
plstico obtenido de una pipeta Beral; esto te permite
tener un tamao de gota muy pequeo y tambin, si es
necesario, detener el flujo de la columna. En la parte
superior de la pipeta enrolla una liga, para poder sostener
la pipeta con una pinza, sin que se resbale.
Con la ayuda de un alambre de cobre, coloca un pedacito
de algodn, que no debe estar apretado, en la parte
donde la columna se angosta. Cubre el algodn con una
capa de arena de 3-4 mm de altura. Golpea ligeramente
la columna para que la superficie de la arena est bien
horizontal.

Para qu sirve la arena en la parte inferior

de la columna?

Aade en seco el adsorbente para cromatografa a la

columna, de preferencia slica gel (tambin puede ser
almina pero no es tan conveniente). Deja caer el
adsorbente dentro de la columna como un chorro muy
fino. La altura del adsorbente en la columna debe ser de
unos 10-12 cm (si es un pipeta de 6 a 8 cm) dejando
espacio adicional en la columna para permitir que haya
suficiente solvente arriba del adsorbente. Golpea muy
ligeramente la columna, para que el adsorbente quede
uniforme y su superficie horizontal. Evita golpearla
mucho para que no se compacte demasiado.

Por qu es importante que el adsorbente est

horizontal y que no tenga ni estratos ms
compactos, ni grietas, ni burbujas?

Arriba del adsorbente coloca una pequea capa de arena,

de 3 a 4 mm de altura.

Para qu sirve la arena en la parte superior

de la columna?

Sujeta con una pinza la columna ya preparada en un

soporte, a una altura adecuada para que puedas recoger
las fracciones en tubos de ensaye sostenidos en una
gradilla o un vaso y cambiar estos tubos con facilidad.
c) Cromatografa:
Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8
mm, marcndolos con masking tape. Acomdalos en
una gradilla.

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Con una pipeta Pasteur aade a la columna de

cromatografa parte del extracto en hexano de los
pigmentos de espinaca. Como la cantidad de adsorbente
en la columna es pequea, aade slo una pipeta del
extracto.

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Qu pasa si usas todo el extracto o si el

extracto est en un volumen grande de
solvente?

La muestra debe adsorberse en una zona de la columna

lo ms angosta posible, ya que las bandas se vuelven ms
difusas a medida que la columna se desarrolla.
Al llevar a cabo una cromatografa es importante
mantener siempre el nivel de solvente arriba de la
columna de adsorbente.

Por qu es importante que el solvente no

baje de la arena?

Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior

de la columna con cantidades muy pequeas de hexano
hasta que todo el pigmento haya entrado en la columna.
Contina aadiendo porciones de 2-3 mL del hexano y
anota todos los cambios en la apariencia de la columna.
Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en
la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos
separados en los tubos de ensaye numerados.

Por qu se separan en bandas los

componentes de la mezcla, en vez de bajar
todos juntos?

Cambia de tubo cuando est lleno hasta dos terceras

partes o antes, si notas un cambio de coloracin en el
eluyente.
Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una
velocidad apreciable, contina aadiendo porciones del
mismo solvente, no importa cual sea el volumen
utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo
eluyente.

Cmo notaras si una columna no estuvo

bien preparada?

Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empieza a

usar como eluyente el solvente puro o la mezcla de la
siguiente polaridad y contina con el mismo solvente
hasta que nuevamente ya no haya cambios.

Por qu todos los solventes deben de estar

bien secos?

Contina eluyendo los pigmentos con solventes y

mezclas de solventes de polaridad creciente. El orden de
solventes que debe seguirse, para esta prctica es el
siguiente:
Hexano,
Hexano con 10% de cloruro de metileno,
Cloruro de metileno puro,
Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo,
acetato de etilo puro,
acetato de etilo con 10% de metanol,
metanol puro.

Por qu es necesario hacer los cambios de

polaridad tan paulatinamente?

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Cuando se tienen mezclas muy complejas pueden

utilizarse, adems de stos, otros disolventes y hacer los
cambios aun ms paulatinamente, por ejemplo pueden
usarse secuencias de mezclas de 5%, 10% y 20%.

Qu pasara si los cambios se hicieran

solamente con solventes puros sin usar
mezclas?

Ve anotando tus resultados en la tabla: los colores de las

fracciones recolectadas, el solvente con el que se eluy
cada una de ellas y el volumen aproximado de cada
fraccin.

Cuntos componentes diferentes puedes

apreciar que se separaron?

Al terminar la cromatografa, observa los tubos y en base

a los colores determina cuales de ellos corresponden al
mismo pigmento. Antalo en la tabla asignndole el
mismo nmero de compuesto a las fracciones iguales.

Cuntas clorofilas y cuantos carotenos se

separaron?

De acuerdo con las profesoras, rene en los matraces que

se te indique el contenido de los tubos que correspondan
al mismo pigmento. Esto debe hacerse con especial
cuidado para no volver a mezclar los diferentes
componentes ya separados.

Cul fue la secuencia de clorofilas y de

carotenos de menor a mayor polaridad?

Al terminar la prctica, las maestras se encargarn de

evaporar en la campana el solvente de cada uno de los
componentes, hasta un volumen pequeo y con estas
muestras se obtendrn los espectros de ultravioleta
visible de cada una de los pigmentos separados.
Para en anlisis de resultados se usarn los espectros
obtenidos en semestres anteriores, que ya fueron
incluidos en el instructivo.

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Prctica 2. Cromatografa en columna.

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HOJA DE RESULTADOS
Nombres de los integrantes del equipo:

# de equipo:

Grupo:

1. TABLA DE RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA:

Nmero
de la
fraccin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Solvente

Color e
intensidad del color
de la fraccin

Volumen
aproximado
de la fraccin

Clase y nmero del compuesto

separado (clorofila 1, 2 o
caroteno 1, 2)

2. TABLA DE RESULTADOS DE LOS ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Anota las max, de mayor a menor, en los espectros de las pginas 32-34 del instructivo.
Fraccin
Cromatografa 1
1. polaridad baja
2. polaridad media
3. polaridad alta
Cromatografa 2
1. polaridad baja
2. polaridad media baja
2. polaridad media alta
3. polaridad alta

max 1

max 2

max 3

max 4

max 5

max 6

max 7

max 8

PREGUNTAS DE PRELABORATORIO
1.

El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta, explique porqu
la extraccin de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al hexano. Sera conveniente
extraer directamente con hexano?

2.

Cul sera el efecto en los resultados de la cromatografa en columna si ocurriera alguno de los
siguientes errores:
a) Al aadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente.
b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta.
c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la cromatografa.

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Prctica 2. Cromatografa en columna.

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3.

Diga cules son algunas de las aplicaciones ms importantes de la cromatografa en columna.

4.

Qu informacin, en general, nos da el espectro de absorcin en UV de un compuesto y para qu sirve

esta informacin?

5.

Responda a la pregunta 15-21 de la pgina 712 del captulo 15 del libro Qumica Orgnica de Wade.
(La copia de la informacin necesaria est incluida en el manual de este laboratorio).

PREGUNTAS DE POST LABORATORIO:

1.

El extracto de las plantas, adems de pigmentos contiene compuestos incoloros. Explique qu hara para
detectar estos compuestos y tener una buena separacin entre estos compuestos y los pigmentos.

2.

En un cromatograma de un extracto de hojas verdes, se separaron cuatro bandas coloridas en la siguiente

secuencia: 1:amarillo-naranja, 2:verde, 3:amarilla, 4: verde. Asumiendo que estas bandas corresponden a
los dos carotenos y a las dos clorofilas cuya estructura se da en este instructivo, indique cul compuesto
corresponde a cada una de las bandas 1 a 4 y explique su respuesta.

3.

Cree que la cromatografa que hizo podra optimizarse? Cmo?

4.

Existen otros tipos de cromatografa en las que tambin se utilizan columnas:

a) la cromatografa de intercambio inico;
b) la cromatografa de gases;
c) la cromatografa de lquidos de alta presin.
Diga cules son las principales caractersticas, las diferencias entre ellas y las aplicaciones de estas
tcnicas.

5.

Busque en el Merk Index u otro manual las max de los - y -carotenos y de las los - y -clorofilas.

6.

Qu informacin dan los datos espectroscpicos de los componentes separados en esta cromatografa?
Compara los datos experimentales de la tabla 2 con los valores reportados (pregunta 5)? Qu
conclusiones pueden sacarse de esta informacin respecto a la identidad y pureza de los compuestos
separados?

REPORTE
1.
2.
3.

Entrega la HOJA DE RESULTADOS con la informacin obtenida en la prctica.

Conclusiones de los datos obtenidos en la hoja de reporte.
Responde a las preguntas de postlaboratorio.

BIBLIOGRAFIA

Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach,
2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995. pp. 122-145 y UV 154-162.
Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and
Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994. pp. 97-101.
Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed., Heath and
Company, USA, 1994. pp. 170-182.
Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, 1989. pp. 127139.

Departamento de Ingeniera y Ciencias Qumicas. Universidad Iberoamericana.