LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II

UJI AKTIVITAS PROTEASE

Rabu, 06 Mei 2015
Kelompok IV
Rabu, Pukul 13.00 16.00 WIB
Nama
Rani Sri Augusti
Anthonio L.R
Isma Roslianna
Wulan Hidayati
Marisa Dwi Ariani
Hanifah Nurrochmah K.

NPM
260110130081

Tugas
Editor, Abstak, Hasil,

260110130082
260110130083
260110130084
260110130085
260110130086

Kesimpulan
Pendahuluan
Pembahasan, Hasil
Pendahuluan
Metode
Pembahasan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015
I.

Pengujian Aktivasi Enzim Protease yang Terdapat di dalam

Kasein
dengan Menggunakan Fraksi Enzim dari Buah Tomat
(Solanum lycopersium)
Rani Sri Augusti, Anthonio Lumban Raja, Isma Roslianna,
Wulan Hidayati, Marisa Dwi Ariani, Hanifa Nurrochmah K.
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran

Abstrak
Uji aktivitas enzim protease dilakukan dari enzim yang ada didalam
kasein. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan
menentukan ativasi dari protease dari setiap fraksi protein tomat yang
digunakan. Fraksi protein yang digunakan memiliki nilai absorbansi
yang berbeda yaitu 1,9 ; 0,8 dan 0;4. Pengujian aktivasi dari enzim
protease akan dilihat dari dua aktor yaitu pH dan suhu. pH yang
digunkan yaitu 27oC dan 57oC, sedangkan variasi pH nya adalah 3,5 dan
5,6. Untuk masing-masing variasi ini dilakukan inkubasi selama 30
menit dan di ukur nilai absorbansinya menggunakan HPLC. Nilai
absorbansi menunjukkan banyaknya asam amino yang didegradasi dari
protein pada enzim. Nilai absorbansi terbesar ditunjukkan oleh variasi
suhu 57 oC untuk semua fraksi protein yaitu 1,023 ; 1,273 dan 1,438 ,
sedangan absorbansi terkecil yang berarti jumlah asam amino yang ada
sedikit ditunjukkan pada variasi pH 3,5 yaitu 0,306 ; 0,402 dan 0,533.
Kata kunci : Protease, Absorbansi, Inkubasi, Degradasi, Asam Amin

Protease Enzyme Activation Tests that are in Casein

by Using Enzyme Fraction of Fruit Tomato
(Solanum lycopersium)
Abstract
Protease enzyme activity test performed on the enzyme that is in casein.
The purpose of this experiment is to investigate and determine ativasi of
protease of each protein fraction tomatoes used. Protein fraction used has
a different absorbance values of 1.9; 0.8 and 0; 4. Testing the activation
of the protease enzyme would be of two actors, namely pH and
temperature. digunkan pH is 27oC and 57oC, while the pH variation
were 3.5 and 5.6. For each variation of incubation was conducted for 30
minutes and absorbance values measured using HPLC. Absorbance value
indicates the number of amino acids of the protein in the enzyme
degraded. The largest absorbance values indicated by variations in
temperature 57 C for all the protein fraction, namely 1.023; 1.273 and
1.438, the smallest absorbance sedangan means the number of amino
acids which there is little shown in the variation of pH 3.5 is 0.306; 0.402
and 0.533.
Keywords: Protease, Absorbance, Incubation, Degradation, Amino Acid
Pendahuluan

Enzim protease (proteolitik atau

proteinase) mengacu pada sekelom-pok
enzim yang berfungsi untuk
menghidrolisis protein men-jadi asam
amino dan gliserol. Protease
menguraikan protein menjadi molekul
yang lebih kecil, dimana setiap enzim
protease memiliki kemampuan berbeda
dalam meng-hidrolisis ikatan peptida. [3]
Protease disebut juga peptidase atau
proteinase merupakan enzim golongan
hidrolase yang akan memecah protein
menjadi molekul yang lebih sederhana,
seperti menjadi oligopeptida pendek
atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptida. Hidrolisis
protein dilakukan dengan bantuan
enzim protease. Enzim protease adalah
sekelompok enzim katalis yang
berfungsi untuk meng-hidrolisis atau
merusak protein. Enzim ini diperlukan
oleh semua makhluk hidup karena
bersifat esensial dalam metabolisme
protein. Enzim protease berperan besar
dalam proses-proses seluler akibat
kemampuan proteolitiknya yang
esensial. [6]
Aplikasi enzim protease dalam
bidang industri banyak di gunakan
antara lain industri detergen, pembuatan
keju, dan susu, serta dalam bidang
kesehatan, misalnya mengurangi
peradangan, member-sihkan sel mati,
mencegah peng-gumpalan darah,
memaksimal kan sistem imun, dan
menghilang kan bekas luka. [1]
Faktor-faktor utama yang
mempengaruhi aktivitas enzim ada-lah
konsentrasi enzim, substrat, senyawa
inhibitor dan aktivator, pH serta
temperatur lingkungan. [2]
Suhu mempengaruhi aktivitas
enzim. Pada suhu rendah, reaksi
enzimatis berlangsung lambat, kenaikan
temperatur akan memper-cepat reaksi,
hingga suhu optimum tercapai dan

reaksi enzimatis men-capai maksimum.

Kenaikan suhu melewati suhu optimum
akan me-nyebabkan enzim terdenaturasi
dan menurukan kecepatan reaksi
enzimatis. [6]
.
Penentuan aktivitas enzim
protease maksimum dilakukan pada
suhu optimum dan waktu optimum.
Pengaruh waktu inkubasi pada suhu 55
C. [4]
Peningkatan pH sebelum titik
optimum menyebabkan terus meningkatnya aktivitas enzim, sampai
seluruh tapak enzim berikatan de-ngan
substrat membentuk kompleks enzim
substrat. Sebaliknya pe-ningkatan pH di
atas batas optimum kerja enzim
menyebabkan kerja enzim menurun,
karena terjadi de-naturasi enzim atau
perubahan struktur tiga dimensi molekul
enzim. Denaturasi ini akan menyebabkan menurunnya fungsi katalitik
enzim karena struktur enzim tidak
sesuai lagi dengan molekul substrat. [5]
Metode
Alat
Gelas ukur, labu ukur 100 ml,
tabung reaksi, volume pipet, rak tabung
dan mikropipet.
Bahan
Fraksi enzim tomat, Tri Kloro Asetat
(TCA), kasein, aquades, larutan dapar
fosfat.
Pembuatan Kurva Standar
Dilarutan 50 mg kasein dengan
aquades dalam labu ukur 100 ml.
Dilakukan pengenceran untuk berbagai
macam konsentrasi yaitu 4, 8, 12, 16,
dan 20 mg/100mL. Di-ambil 0,6 ml
setiap larutan dan ditambahkan larutan
TCA 3,5%. Kemudian diukur
absorbansi masing masing larutan pada

spektrofoto-meter panjang gelombang

275 nm dan dibuat kurva standar.
Pengujian Aktivitas Protease pada
Variasi Suhu
Disiapkan 2 tabung untuk setiap
fraksi masing-masing berisi 0,5 mL
substrat kasein 0,5%. Tabung di
inkubasi selama 5 menit pada suhu 27oC
dan 57 oC. Ditambahkan 0,1 mL fraksi
protein pada setiap tabung. Dilakukan
inkubasi lanjut selama 30 menit pada
suhu yang sama. Setelah inkubasi
masing-masing tabung ditambahkan
TCA 3,5% sebanyak 5 mL. Lalu
diambil filtrat dan diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 280 nm.
Pengujian Aktivitas Protease pada
Variasi pH
Disiapkan 2 tabung untuk setiap
fraksi masing-masing berisi 0,5 mL
substrat kasein 0,5%. Tabung diinkubasi selama 5 menit pada suhu 27
o
C. Ditambahkan 0,1 mL fraksi protein
pada setiap tabung. Ditam-bahkan 0,1
mL fraksi protein pada setiap tabung
dan 1,4 mL larutan dapar fosfat dengan

pH 3,25 dan 6,5. Dilanjutkan inkubasi

pada pH 27 oC selama 30 menit. Setelah
inkubasi ditambahkan TCA 3,5% 5 mL
pada masing-masing tabung. Lalu
diambil filtrat dan diukur nilai
absorbansi pada panjang gelombang
280 nm.
Hasil
Sebelum mengukur nilai absorbansi
dari asam amino yang didegradasi di
dalam fraksi protein pada buah tomat,
terlebih dahulu dibuat kurva baku untuk
dapat mengetahui persamaan yang akan
digunakan untuk menghitung besarnya
konsentrasi dari asam amino tersebut.
Kurva baku dibuat dengan
menggunakan kasein sebagai sampel.
Tabel 1 menunjukkan nilai
absorbansi dari kasein pada variasi
konsentrasi. Pada tabel 2 menunjukkan
nilai absorbansi dari asam amino yang
didegradasi oleh enzim protease dari
protein yang terdapat di dalam fraksi
protein dari buah tomat dan diukur
dengan HPLC.

Konsentrasi

Absorbansi

kasein
4mg/100mL
8mg/100mL
12mg/100mL
16mg/100mL
20mg/100mL
Kontrol

0,035
0,048
0,052
0,060
0,076
0,043

Hubungan konsentrasi dengan nilai absorbansi asam amino

0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
Absorbansi Absorbansi
0.03

Linear (Absorbansi)

0.02
0.01
0
2

10

12

14

16

18

20

22

Konsentrasi

Gambar 1. Kurva baku kasein

Tabel 2. Nilai absorbansi asam amino yang terdegradasi
Absorbsans
No. Fraksi
Suhu 27oC Suhu 57oC
pH 3,5
i awal
I
1,999
0,730
1,438
0,533
II
0,789
0,437
1,273
0,420
III
0,541
0,373
1,023
0,306
3. Fraksi III
Nilai Konsentrasi Tirosin
y
= 0,025 +
0,373
= 0,025 +
Pengaruh Suhu I (27oC)
x
= 145,00
1. Fraksi I
y
= 0,025 + 0,0024 x
Pengaruh Suhu II (57oC)
0,730
= 0,025 + 0,0024 x
1. Fraksi I
x
= 293,75
y
= 0,025 +
2. Fraksi II
1,438
= 0,025 +
y
= 0,025 + 0,0024 x
x
= 588,75
0,437
= 0,025 + 0,0024 x
2. Fraksi II
x
= 171,70
y
= 0,025 +

pH 5,6
0,828
0,466
0,331
0,0024 x
0,0024 x

0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x

1,273
= 0,025 + 0,024 x
x
= 520,00
3. Fraksi III
y
= 0,025 + 0,0024 x
1,023
= 0,025 + 0,024 x
x
= 415,80
Pengaruh pH I (3,5)
1. Fraksi I
y
= 0,025 +
0,508
= 0,025 +
x
= 211,7
2. Fraksi II
y
= 0,025 +
0,420
= 0,025 +
x
= 164,40
3. Fraksi III
y
= 0,025 +
0,281
= 0,025 +
x
= 117,08
Pengaruh pH II (5,6)
1. Fraksi I
y
= 0,025 +
0,803
= 0,025 +
x
= 334,6
2. Fraksi II
y
= 0,025 +
0,441
= 0,025 +
x
= 183,75
3. Fraksi III
y
= 0,025 +
0,331
= 0,025 +
x
= 127,50

0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x
0,0024
0,0024 x
0,0024 x

0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x
0,0024 x

Nilai Aktivitas Protease

Tirosin }

Aktivitas enzim ( y )=
1. Fraksi I suhu 27oC
293,75 1,12 mL
y=

=3,026
181,19 0,02 30
2. Fraksi I suhu 57 oC

588,75 1,12 mL

=6,065
181,19 0,02 30
3. Fraksi I pH 3,5
211,7
1,12 mL
y=

=2,18
181,19 0,02 30
4. Fraksi I pH 5,6
334,6
1,12 mL
y=

=3,447
181,19 0,02 30
5. Fraksi II suhu 27oC
171,7
1,12 mL
y=

=1,769
181,19 0,02 30
6. Fraksi II suhu 57 oC
520
1,12 mL
y=

=5,357
181,19 0,02 30
7. Fraksi II pH 3,5
164,6
1,12 mL
y=

=1,696
181,19 0,02 30
8. Fraksi II pH 5,6
181,75 1,12 mL
y=

=1,872
181,19 0,02 30
9. Fraksi III suhu 27oC
145
1,12 mL
y=

=1,494
181,19 0,02 30
10. Fraksi III suhu 57oC
415,8
1,12 mL
y=

=4,283
181,19 0,02 30
11. Fraksi III pH 3,5
117,08 1,12 mL
y=

=1,206
181,19 0,02 30
12. Fraksi III pH 5,6
127,5
1,12 mL
y=

=1,313
181,19 0,02 30
y=

Pembahasan
Pembuatan Kurva Standar Kasein
Larutan standart yang diguna-kan
adalah larutan kasein dengan
bermacam-macam konsentrasi di
antaranya adalah 4, 8, 12, 16 dan 20
mg/100mL. Kasein digunakan pada
percobaan ini karena kasein dapat
terhidrolisis dan membebaskan tirosin
bebas yang dapat diukur secara
kuantitatif (baik untuk uji aktivitas

enzim maupun kinetika enzim). Agar

saat pengukuran konsentrasi tetap stabil
maka perlu dilakukan penghentian
reaksi yang dilakukan dengan cara
mende-naturasikan kasein, yang
dilakukan dengan cara menambah-kan
asam trikloroasetat (TCA) ke dalam
campuran reaksi, sehingga reaksi dapat
berhenti secara serentak.
Saat pengukuran aktivitas enzim,
untuk mengurangi adanya galat, maka
dibuatkan larutan kontrol. Larutan
kontrol dibuat untuk menghindari
kemungkinan adanya peptida bebas
(tirosin bebas) sebelum terjadinya reaksi
enzimatis. Keberadaan dari adanya
peptida bebas ini dapat terlihat dari
adanya serapan pada larutan kontrol.
Lalu mengukur larutan tersebut dengan
menggunakan HPLC pada panjang
gelombang 275 nm. Nilai 275 nm
merupakan panjang gelombang
maksimum untuk menyerapan sinar UV
oleh asam amino aromatik salah satunya
adalah tirosin. Pada pengukuran
absorbansi, nilai absor-bansi dengan
konsentrasi 4 mg/ 100mL adalah 0,034;
8 mg/100mL, 0,048; 12 mg/100mL,
0,052; 16 mg/100mL, 0,060; 20
mg/100mL, 0,076; kontrol, 0,043.
Kurva standart dibuat dengan
mengalurkan absorbansi sebagai ordinat
(sumbu Y) dan konsentrasi kasein
sebagai absis (sumbu X). Nilai
absorbansi mengalami kenaikan seriring
bertambahnya konsentrasi kasein
sehingga diperoleh persamaan garis
antara konsentrasi kasein dan
absorbansi sebagai berikut :
y = 0,025 + 0,0024 x
Uji Aktivitas Protease Pada Variasi
Suhu
Didalam tabung reaksi I
menyiapkan substrat kasein, dan
ditabung reaksi II berisi kontrol berupa

aquadest. Pada tabung berisi substrat

kasein diinkubasi pada variasi 270C
(triplo), dan 570C (triplo). Pada setiap
variasi suhu diinkubasi selama 5 menit.
Kemudian, ditambahkan fraksi protein,
dan diinkubasi kembali selama 30
menit. Perlakuan ini untuk menentukan
suhu optimum pada aktivitas protease.
Setelah itu, ditambahkan TCA pada
tabung bertujuan untuk menghentikan
reaksi hidrolisis.
Dilakukan pengukuran absor-bansi
dengan HPLC pada setiap larutan
dengan panjang gelombang 275 nm
dikarenakan panjang gelombang
maksimum untuk menyerapan sinar UV
oleh asam amino aromatik salah satunya
adalah tirosin. Sehingga mengha-silkan
absorbansi pada suhu 270C 0,373;
0,437; 0,730. Sedangkan, pada suhu
570C menghasilkan absorbansi 1,023;
1,273; 1,438.
Setiap enzim mempunyai suhu
optimum yaitu suhu dimana enzim
dapat bekerja dengan baik. Suhu
optimum untuk aktivitas protease adalah
pada suhu 500C. Semakin jauh dari suhu
optimum, kerja enzim semakin tidak
baik. Dengan melebihi suhu optimum
dari enzim dapat menyebabkan getaran
pada ikatan hidrogen dari rantai
polipeptida dan pada kondisi panas
tertentu ikatan hidrogen dapat putus.
Putusnya suatu ikatan hidrogen akan
menyebabkan mudahnya pemutusan
ikatan hidrogen selanjutnya dalam
rantai polipeptida tersebut sehingga
enzim mengalami denaturasi.
Sedangkan, pada suhu dibawah
optimum enzim tidak dapat bekerja,
atau bersifat inaktif.
Uji Aktivitas Protease Pada Variasi
pH
Didalam tabung reaksi I
menyiapkan substrat kasein, ditabung

reaksi II berisi kontrol berupa aquadest.

Semua tabung reaksi diinkubasi selama
5 menit pada suhu 37oC. Kemudian
ditambahkan fraksi protein dan
ditambahkan larutan dapar dengan pH
3,5 dan 5,6. Inkubasi selama 30 menit
pada suhu 37oC. Ditambahkan larutan
TCA pada semua tabung dan dilakukan
pengukuran absorbansi dengan HPLC
pada setiap larutan dengan panjang
gelombang 257 nm. Didapatkan hasil
pada pH 3,5 didapat absorbansi 0,306;
0,420; 0,533 dan pada pH 5,6 didapat
absorbansi 0,331; 0,466; 0,828. pH
optimum dari enzim protease adalah
pada pH 7,0.
Konsentrasi dan Aktivitas Tirosin
Konsentrasi dari tirosin
menunjukkan jumlah asam amino yang
telah terdegradasi di dalam sampel
fraksi buah tomat. Semakin besar nilai
absorbansi dari suatu fraksi yang
digunakan, maka konsentrasi tirosinnya
juga akan semakin besar. Sedangkan
nilai aktivitas tirosin merupakan
kemampuan dari suatu enzim protease
untuk mendegradasi suatu protein
menjadi asam amino dan gliserol.
Semakin besar konsentrasi dari tirosin,
maka aktivitas tirosin atau aktivitas
enzim proteasenya juga akan semakin
meningkan. Nilai aktivitas dari protease
menunjukkan hasil yang maksimal pada
suhu 57oC karena protease akan dapat
bekerja maksimal pada suhu yang
optimal yaitu pada suhu 50oC.
Kesimpulan
Enzim protease merupakan enzim
yang dapat mendegradasi suatu protein
menjadi bentuk yang lebih sederhana
yaitu asam amino dan gliserol. Kerja
dari enzim ini akan terhenti atau enzim
akan terdenaturasi ketika ditambahkan

suatu asam yaitu TCA. Nilai aktivitas

protease tertinggi terdapat pada
konsentrasi tirosin yang tertinggi yaitu
yang memiliki nilai absorbansi asam
amino yang paling besar dan yang
bekerja pada suhu optimal protease.
Daftar Pustaka
[1]

Fitriani. 2014. Eksplorasi Mikroba

Penghasil Enzim Protease Dari
Sumber Air Panas Lejja Kab. Soppeng
Sulawesi Selatan. Tersedia online di :
http://repository.unhas.ac.id/bitstream/handle/12345
6789/8801/fitriani
%20%28H31108275%29.pdf?
sequence=1 (Diakses 8 Mei 2015).
[2]
Muchtadi, D., S.R Palupi dan M.
Astawan . 1992. Enzim dalam Industri
Pangan, PAU Pangan dan Gizi IPB,
Bogor
[3]
Noviyanti, Tri. 2012. Pengaruh
Temperatur Terhadap Aktivi-tas
Enzim Protease dari Daun Sansakng
(Pycnarrhena cauli-flora Diels)
Tersedia
online http://download.portalgaruda.org/article.php
?article=32539&val=2315 (Diakses 8
Mei 2015).
[4]
Suntornsuk, W et al. 2004.
Purification and characte-rization of
keratinase from a thermotolerant
feather degrading bacterium.
[5]
Suri, Wilda Liona. 2013. OptimizaTion Of Protease Activity From
Lactic Acid Bacteria (Lab)
Pediococcus pentosaceus Isolated
From Soursop Fermentation
(Annona muri-cata L.). Tersedia
online :
http://jurnalsainunand-.com/FilesJurna
l/280916504Wilda%20Liona
%20Suri.pdf (Diakses 8 Mei 2015)
[6]
Wuryanti , 2004 . Isolasi Dan
Penentuan Aktivias Spesifik Enzim

Bromelin Dari Buah Nanas (Ananas

comosus L.). Tersedia online di :
http://ejournal.undip-.ac.id/index.php/

ksa/article/view/3327 (Diakses 8 Mei

2015).