TEORK BLG:

KROMATOGRAFK YNTEMLER VE HPLC YNTEM

KROMATOGRAF NEDR ?
Kromatografi, bir karmda bulunan bileenlerin birbirinden ayrlmasn
gerekletiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapld
yntemlerin genel addr [1]. Bu yntemlerde alma dzenei temel olarak
iki bileenden oluur. Bu bileenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli
faz ya da mobil faz (mobile phase) ad verilir. Mobil fazn ierisinde yer alan
bileenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkilemeleri sebebiyle, bir miktar
tutulurlar. Bu tutulma, rnekteki farkl bileenler iin farkl miktarlarda olur.
Bylece bileenler sabit fazn sonlarna doru, farkl hzlarda ilerledikleri iin,
birbirinden ayrlm vaziyette sabit faz farkl zamanlarda terkederler. Bu
ekilde sabit fazdan kan bileenlerin deriimleri uygun bir biimde llr
ve zamana veya mobil fazn kullanlan hacmine kar y-ekseninde
iaretlenerek kromatogram denilen grafikler elde edilir.
KROMATOGRAFNN TEMEL PRENSP VE TANIMLARI
Mobil faz (mobile phase): rnek Bileenlerini, sabit faz (kolon) boyunca tayan, eitli
fiziksel ve kimyasal zelliklere sahip zelti veya zc karmlar. Kullanlacak mobil
fazn seiminde, analizi yaplacak rnek madde bileenlerinin zellikleri, kullanlacak
sabit faz ve dedektrn zellikleri vb. birok parametreye dikkat edilmelidir.
Sabit faz (stationary phase): Mobil faz ierisinde gelen rnee ait bileenlerin
etkileime girdikleri ve belirli lde alkonulduklar fazdr. Kromatografi tekniinin
eidine gre tasarlanm ve ok deiik materyallerden ok farkl llerde imal edilmi
1

ve kolon olarak adlandrlm sabit fazlar mevcuttur. zellikle gaz ve sv

kromatografileri iin ticari boyutta olduka fazla marka ve boyutta kolon retimi
yaplmaktadr. Sv kromatografisinin bir eidi olan yksek performas sv kromatografisi
(HPLC) uygulamalarnda kullanlan kolonlar daha ok 30-300 mm uzunluunda yaklak
5 mm i apnda metalik boru eklinde olup i yzeyleri ok deiik zelliklerde kaplama
materyalleri ile kaplanarak, analizi yaplacak madde gruplar iin modifiye
edilebilmektedir.
Alkonma (retention): Mobil faz ierisinde gelen, analizi yaplacak maddeye ait
bileenlerin sabit faz ile etkileime girerek belirli oranda tutulmas daha dorusu
yavalatlmas ve bylece daha ge olarak sabit faz terk etmesi olaydr. Bu zellikten
yola klarak, belirli sabit analitik koullar altnda, her kimyasal madde iin parmak izi
nitelii tayan alkonma zaman (retention time-t R) tanm tretilmitir. Bu kavram belirli
sabit deneysel koullarda analizi yaplan maddenin sabit faz terketmesi iin geen sreyi
gstermektedir.
t0 = kolona ait l zaman (column dead time)
tR = alkonma zaman (retention time)
t'R = net alkonma zaman (net retention time)
tR = t0 + t'R
Pompa (pump): Sv kromatografisinde, zellikle de HPLC donanmnda temel bir
bileendir. HPLC uygulamalarnda mobil faz oluturan zc karmlarnn, enjektr,
kolon ve dedektr ierisinden belirli, sabit veya deigen bir hzda, belirli basn altnda
gemesini salar. Modern HPLC donanm pompalar bilgi ilemci kontroll olup, ok
eitli firma tarafndan deiik modellerde retilmektedir.
Dedektr (dedector): Kolonda ayrm yaplan analizlenecek maddeye ait bileenlerin
alkonma zamanlarna gre srayla ierisinden geerken miktar tayinlerinin yapld
2

HPLC donanmdr. Kullanlacak dedektrn tr analizlenecek maddenin fiziksel ve

kimyasal zelliklerine gre seilmelidir. Dedektrler lmn yaptklar, analizlenecek
maddeye ait, fiziksel zellie gre u ekilde snflandrlrlar :
Ultraviole/grnr blge dedektr (ultraviolet/visible dedector-UV/VIS)

Fotodiyot array dedektr (photodiode array dedector-DAD)

Floresans dedektr (fluorescence dedector-FLD

letkenlik dedektr (conductivity dedector-CDD)

Refraktif indeks dedektr (refreactive index dedector-RID)

Elektrokimyasal dedektr (electrochemical dedector-ECD)

Ktle dedektr (mass dedector-MS)

Evaporatif k datc dedektr (evaporative ligth scattering dedector-EL)

Kromatogram (chromotogram): Kromatografik analiz sonucunda elde edilen grafiktir.

Y-ekseni, kullanlan dedektrn lt fiziksel zellii (absorbans, fluoresans, iletkenlik,

akm, krlma indisi vb.), X-ekseni ise zaman gstermektedir (alkonma zaman iin
kolaylk olmas bakmndan genellikle dakika cinsinden). Zamana kar Y-ekseninde
llen fiziksel zelliin artp tekrar azalmas eklinde oluan pik eklindeki erilerin
herbiri analizlenen maddeye ait bir bileeni gstermektedir. Bu piklere ait deerler (pik
alan, ykseklii, vb.) kullanlarak kalitatif ve kantitatif analizler yapmak olasdr.
Hacim ak hz (volume flow rate): F ile sembolize edilir, birimi cm3/saniye veya
cm3/dakika olup, alkonma zamannn alkonma hacmine blnmesiyle hesaplanr: F=V R /
tR

Lineer ak hz (linear flow rate): U ile sembolize edilir, kolon uzunluunun (L) kolon
l zamanna (to) blnmesiyle hesaplanp birimi cm/saniyedir: U=L/t 0. Lineer ak hz,
kolonun enine kesitinden bamsz olup, zc molekllerinin kolon boyunca hareketleri
srasndaki ortalama hzlarn gsterir.
znrlk (resolution): R ile sembolize edilir. Birbirini takip eden 2 adet bileene ait
piklerin birbirinden ayrmlarnn baarsn (orann) gsterir. Takip eden piklere ait
maksimalar aras mesafenin 2 pike ait geniliklerin (birimi dakika) toplamna
blnmesiyle hesaplanr. R= [2(tR2-tR1)] / W1+W2. Takip eden pikler iin iyi bir
znrlkten bahsedebilmek iin hesaplanan R deerinin 1-1,5 civarnda olmas istenir.
KROMATOGRAFK YNTEMLERN TARHES
Sv bir mobil fazn kullanld kromatografik yntemlerin (Sv kromatografisi) tarihesi
Rus botaniki M. S. Twsettin 1906 ylnda yapt ve yaymlad almalarna kadar
uzanr [2]. nceleri dz yzlemsel yapda sabit fazlar kullanlm ve bu teknikler daha
sonra kat kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi olarak isimlendirilmitir [3].
Modern sv kolon kromatografisi ise 1969 ylnda HPLCnin kullanma girmeye
balamasyla gelime gstermitir [4].
KROMATOGRAFK YNTEMLERN SINIFLANDIRILMASI
Kromatografik yntemler kullanlan mobil fazn sv veya gaz olmasna gre; Sv
Kromatografisi ve Gaz Kromatografisi olmak zere balca 2 ana grupta snflandrlabilir.
Bunun haricinde kromatografik yntemler, alkonulma mekanizmas ve alma
metoduna gre de 2 ekilde snflandrlabilir:
ALIKONMA MEKANZMASINA GRE:
- Adsorpsiyon Kromatografisi (Analizlenecek madde hem mobil faz hem de sabit faz
oluturan molekllerle etkileim ierisindedir. Polar maddeler polar, apolar maddeler ise
apolar sabit faz tarafndan daha fazla tutulurlar)
4

- Partisyon (Dalm) Kromatografisi (Adsorpsiyon kromatografisinden farkl olarak bu

yntemde sabit fazda svdr. Sv sabit fazn getirdii zorluklar uygulama alann
kstlamaktadr)
- Size Exclusion Kromatografisi (Analizlenecek maddelere ait molekller boyutlarna gre
ayrlmaktadr. Bu ilem iin ok deiik por aplar ieren dolgu maddesiyle doldurulmu
kolonlar kullanlmaktadr. Bylece deiik aplardaki porlar birer elek gibi davranarak
maddeleri boyut-aplarna gre alkoymaktadr)
- Afinite Kromatografisi (Alkonma mekanizmas maddeye zgn olmakta ve anahtar-kilit
modeline uygun biyolojik materyaller dolgu malzemesi olarak kullanlmaktadr. Maliyetinin
ok yksek olmas uygulama alann kstlamaktadr)
- yon Deiim Kromatografisi (Ykl bir maddenin ters ykle yklenmi kat bir sabit
fazla tutulmas prensibine dayanr)
ALIMA METODUNA GRE (Daha az kullanlan, rnein kolondan uzaklatrlma
mekanizmasna gre yaplm bir snflandrmadr)
- Elsyon Olutumu Kromatografisi (Elution development chromatography)
-Yerdeitirme Oluumu Kromatografisi (Displacement Development Chromatography)
- Frontal Analiz Kromatografisi (Frontal Analysis Chromatography).
HPLC DONANIMI
Standart HPLC donanm temel olarak 4 bileenden olumaktadr. Bu bileenler srasyla
pompa, enjektr, kolon (sabit faz) ve dedektrdr.
Pompa
HPLC donanmnda yer alan pompalama sistemleri, ak hzna gre, pompann
yapmnda kullanlan malzemeye gre ve pompann mobil faz iletme mekanizmasna
gre olmak zere 3 farkl ekilde kategorize edilebilmektedir.

AKI HIZINA GRE

- Microbore Pompa Sistemleri: ap 2 mmye kadar olan kolonlar iin kullanlr ve 1-250
mL/dak aralnda ak hz salarlar.
- Standart Bore Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnda en sk kullanlan
pompa sistemi olup 100 mL 10 mL/dak aralnda ak hz salarlar. Yar preperatif
HPLC uygulamalarnda i ap 12 mmye kadar olan kolonlar iin tercih edilirler.
- Preperatif Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnn dndakir alma
alanlarnda kullanlr ve 10 mL/dakdan byk ak hz salarlar.
POMPANIN YAPILDII MALZEMEYE GRE
- Metalik: En ok tercih edilen metalik malzeme, mekanik dayankll, anma direnci ve
iyi termal stabilitesi nedeniyle 316 paslanmaz eliktir. Mobil fazn bileenlerinden ok az
(rn. Hidroklorik asit) 316 paslanmaz elie zarar verebilir. Bir dier metalik malzeme
alternatifi ise titanyumdur. Mekanik dayankllk zellikleri 316 paslanmaz elie
benzemekle birlikte, anma direnci ve kimyasallara kar inertlii daha fazladr. Titanyum
ve elik materyaller 6000 psi basnca kadar dayankldrlar. Metalik materyallerin
sakncalar olarak ise yksek maliyetleri, kuvetli asidik ortamlara dayankszlk, biyolojik
rneklerle geimsizlik saylabilir.
- Ametalik : Metalik pompalarn bahsedilen sakncalar sebebiyle ametalik materyaller de
pompa imalinde kullanlmaktadr. Bu amala en ok polietiletilketon (PEEK),
politetrafloroetilen (TEFLON) ve seramik mateyaller tercih edilmektedir. TEFLON biyolojik
rnekler ve asidik ortamlarla geimli olmakla birlikte 2000 psi basncn zerisi iin
dayankl deildir. PEEK ise 5000 psi basnca kadar dayankl olup 316 paslanmaz elie
zarar veren asidik zeltilere dayankldr. Ancak HPLC uygulamalarnda kullanlan bir
ok organik zclere dayankszdr. Seramik yap materyali olarak safir 20 yl akn
sredir pompalarda zellikle piston paralarnn imalatnda kullanlmaktadr. Bu tr

malzemeler iyi kimyasal stabiliteye sahip olmakla beraber ok yksek maliyetleri

uygulamalarnda kstlamalar getirmektedir.
MOBL FAZ LETME MEKANZMASINA GRE
- rnga Tip Pompalar: ok kullanlmamakla birlikte ak hznn 100mL/dakdan daha az
olduu uygulamalarda (rn. Kapiller sv kromatografisi uygulamalar) tercih
edilmektedirler. 10-50 mL hacminde bir rngaya pistonun elektrik motoruyla ittirilmesiyle
ak salanmaktadr. Salanabilecek mobil faz ak sresi rngann hacmi ile snrl
olup, yeniden dolum srasnda ak kesilmek zorundadr.
- Piston Pompalar: Modern HPLC donanmnn standart parasdr. Yaps 2 ksm
hareketli paradan oluur. Bunlar, check valveler ve pistondur.
Enjektr
HPLC donanmn oluturan enjektr rnein sabit faz (kolon) ncesinde mobil faza
enjekte edilmesi iin kullanlr. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandal otoenjektrler olmak zere 2 eidi bulunmaktadr.
- Manuel Enjektrler(Manuel Injector): rnein enjekte edilebilmesi iin enjektr nce
doldurma pozisyonuna (load position) getirilerek rnek, istee gre seilebilen sabit
hacimli, loop ierisine doldurulur. Loopa doldurulan rnek hacmi loop sabit hacmini
geerse, fazla olan ksm darya otomatik olarak atlr. Daha sonra enjektrn kolu
enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek rnek mobil faz ierisine enjekte
edilmi olur. Kullanlan loop hacimleri ok deiken olup genellikle 5 mL 5 mL
aralnda deiir. Loop hacmi kldke tekrarlanabilirlik adna yaplan hata oran da
bymektedir.
- Oto-enjektrler(Autosampler): 2 tip oto-enjektr mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel
tipidir. XY tipinde enjektr hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek rnei iesinden
ekmekte ve loop vastasyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun iin seilen rneklere
ait bilgilerin, gerekli yazlm kullanlarak, nceden bilgi ilemciye girilmesi gerekmektedir.
7

Carousel tipinde ise rnekler dnen, dairesel ekilli bir tayc vastasyla sabit bir
enjektrn altna tanmaktadr.
Kolon
Modern HPLC donanmnn 4 temel yap tandan birisi olan kolon, karmak rneklerde
bileenlerin birbirinden iyi znrlkle ayrmndan sorumlu sabit fazdr. Kolon
imalatnda yap materyali olarak 316 paslanmaz elik, TEFLON, cam veya PEEK en sk
tercih edilenlerdir. Kolonun ayrm gc ve performans yapld materyalden ok, i
yzeyine yaplan kaplamada kullanlan malzemenin kimyasal ve fiziksel zelliklerinden
etkilenmektedir. Kullanlan bu tr kaplama malzemeleri ok eitli olup, kullanlacak mobil
fazn ve uygulanacak HPLC metodunun zelliklerine ve analizi yaplacak rnein bilinen
kimyasal ve fiziksel zelliklerine gre seilmelidir. Seilecek kolonun HPLC
uygulamasnda kullanlacak ak hz ve dolaysyla oluacak basnca dayankl olmasna
dikkat edilmelidir. Birok analitik kolonun i ap 2-5 mm aralnda deimektedir. Kolon
i ap arttka ak hz ve i doldurma hacmi artmakta ama oluacak piklerin
znrl dolaysyla duyarllk azalmaktadr. Kolonlarn boylar (uzunluu) ok eitli
olup genellikle 30-300 mm aralnda deimektedir. Kolon uzunluu arttka rnek
bileenlerinin ayrm daha iyi olmakta fakat analiz sresi uzad iin daha fazla mobil faz
harcanmaktadr. Kolon boyutlarnn tanmlanmasna uluslararas standartlar getirilmitir.
Buna gre nce mm cinsinden uzunluk ve ap yazlmakta, bunu firma ad, sabit faz tr,
AO trnden poroz yzey ap ve mm cinsinden partikl bykl izlemektedir. rnein,
250/4,6 Nucleosil C18 100 5 yazldnda, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm i
apa sahip olduu anlalmaktadr. Kolonun firmas (markas) Nuclesoil olup, sabit faz
tr normal fazda kullanlan bir tr olan C18 dir. Poroz yzey ap 100 A O olup, dolgu
materyaline ait partikl bykl 5 mmdur.
Dedektr
HPLC donanmnda 4 temel bileenden birisi olan dedektrler, rnek bileenlerini tayin
ederken ltkleri fiziksel zelliklere gre, 8 eittir:

A)

ULTRAVOLE / GRNR BLGE DEDEKTR (Ultraviolet / Visible

dedector - UV/VIS): Absorbans llr. Lambert-Beer yasas geerlidir. Spektrum
taramas yapmak, farkl dalga boyunda almak veya dalga boyunu zamana
kar programlamak mmkndr.

B)

FOTODYOT ARRAY DEDEKTR (Photodiode array dedector-DAD): UV/VIS

dedektrden fark, 512 elementden oluan bir yzeyde, her elementin ayr bir
dalga buyundaki absorbans e zamanl olarak lebilmesidir. Bu sayede 3
boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin ok hzl spektrum taramasn
grebilmek olasdr. Ayrca istenilen dalga boyu aralnda allabilmesi bu
dedektrn salad bir dier nemli avantajdr. Kullanlan k kayna dteryum
veya tungsten lambadr.

C)

FLORESANS DEDEKTR (Fluorescence dedector-FLD): Organik maddelerin

yaklak %15I fluoresans oluturma yeteneine sahiptir. Oluan fluoresans
llmektedir. Kullanlan k kayna ksenon lamba olup, duyarll UV/VIS
dedektre gre yaklak 103 kat fazladr.

D)

LETKENLK DEDEKTR (Conductivity dedector-CDD): letkenlik llr.

Daha ok anyon ve katyon analizlerinde kullanlr. Scaklk kontrol ok nemlidir
bu sebeple kolon frn ierisinde allmaldr. Kullanlan mobil fazn iletkenlii ne
denli dk olursa oluan grlt de o denli dk olur.

E)

REFRAKTF NDEKS DEDEKTR (Refreactive index dedector-RID): Krlma

indisi llr. Scaklktan etkilenir. rnek bileenlerinin bulunduu ortamda
younluk artacandan gelen k krlarak hcreyi terkeder. In llen krlma
oranndan (krlma indisi) kantitatif tayin yaplr.

F)

ELEKTROKMYASAL

DEDEKTR

(Electrochemical

dedector-ECD):

Elektroaktif maddeler analizlenebilir. Yani bileenler , belirli potansiyel

deerlerinde ykseltgenebilir veya indirgenebilir olmaldr. llen fiziksel zellik

tayin srasnda oluan elektrik akmdr.
G)

KTLE DEDEKTR (Mass dedector-MS): rnek bileenlerine ait ok zgn

kromatogramlar elde edilir, dolaysyla zellikle kalitatif tayinlerde tehis amal
kullanmlarda ok nemli bir dedektrdr.

H)

EVAPORATF IIK DAITICI DEDEKTR (Evaporative ligth scattering

dedector-EL)

HPLC SSTEM TRLER

A)

Isocratic sistem (tek pompa, tek solvent, solvent karm olabilir, ayrm
yetersizdir)

B)

Dk basnl gradient sistem (tek pompa, max 4 farkl mobil faz, karma
pompadan nce)

C)

Yksek basnl gradient sistem (2 yada 3 pompa, 2 yada 3 farkl mobil faz,
karma pompadan sonra)

HPLCde AYIRMA TEKNKLER:

A)

Normal faz (Normal phase-NP) (ilk gelitirilen teknik, kolon polar, mobil faz
apolardr, kullanlan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlardr)

B)

Ters faz (Reverse phase-RP) (en sk kullanlan teknik, kolon apolar, mobil faz
polardr, kullanlan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyanodur)

C)

Ters faz iyon ifti (Reverse phase ion pairing-IP)

D)

yon deiim (Ion exchange-IC)

E)

Size exclusion SEC (GPC/GFC)

F)

Kiral ayrm (Chiral separation)

10

RNEK DENEY:

Farkl ay Ekstraktlarnn Antioksidan,

Antibakteriyal Etkileri ve Fenolik Madde
Daglmnn HPLC ile Belirlenmesi

SMGELER DZN
TY :Taze ay yaprag
Y: Yesil ay
HPLC: Yksek basnl sv kromatografisi
Na2CO3 :Sodyum karbonat
Abs :Absorbans
Dw :Dry weight (kuru agrlk)
Dk :Dakika

11

DENEYN AMACI VE KAPSAMI

Bu arastrmada ncelikle ay rneklerinin metanol, etanol ve su ile ekstraksiyonlarndan
elde edilen esitli fraksiyonlarn toplam fenolik madde ierigi spektrofotometrik olarak
belirlenmistir. Sz konusu solventler, gda maddelerinden polifenol bilesiklerin
ekstraksiyonu iin yaygn olarak kullanlmalarndan (Pinelo et al. 2004b) dolay
seilmistir. Daha sonra, en yksek polifenol verimi elde edilen fraksiyonlarn (etilasetat,
kloroform ve su) fenolik madde daglmnn HPLC yntemiyle belirlenmesi amalanmstr.
Ayn zamanda, farkl ekstraksiyon kosullar altnda fenolik madde bilesimi ile antioksidan
aktivite arasnda bir iliski olup olmadg da saptanms olacaktr.

YNTEM
Ekstraksiyon:
gtlms ay rnegi, ham ekstrakt elde etmek amacyla etanol, metanol ve saf su ile 3
tekerrrl olarak asagda belitildigi gibi ekstrakte edilmistir. Su ekstrakt iin; 1g
rnekzerine 50g taze olarak kaynatlms su eklenerek termos iinde 10 dk sreyle
infzyona (demleme) ugratlmstr. Elde edilen infzyon, pamuktan geirilerek filtre
edilmis ve sratle musluk suyu altnda sogutulmustur. Daha sonra bu ekstrakt liyofilizerde
kurutulmus ve ekstraksiyon verimini hesaplamak amacyla hassas terazide tartlmstr
Metanol ve etanol ekstraktlar iin de asagdaki yntem takip edilmistir: 1g rnek 50 ml
metanol veya etanol ile 2 saat sreyle orbital alkalayc ile oda scaklgnda, karanlkta
ekstrakte edilmistir. Karsm, Whatman No.1 filtre kagdndan filtre edildikten sonra berrak
filtrat rotary evaporatr kullanlarak 40 Cde vakum altnda kurutulmustur. Elde edilen
kuru ham ekstrakt ekstraksiyon verimini hesaplamak amacyla tartlmstr.

12

Fraksiyonlara ayrma:
Ham kuru ekstrakt 10 ml saf su ierisinde zndrlmstr. Sulu zelti, ay
bilesenlerini ayrmak iin yaygn olarak kullanlan solventlerden nce kloroform (kafein ve
pigmentleri uzaklastrmak iin) ile daha sonra etil asetat ile 1:1 (v/v) orannda sv-sv
ekstraksiyonuna tabi tutulmustur. Her bir sv-sv ekstraksiyonu, ayrma hunisi
kullanlarak 10ar dakikadan 2ser kez olmak zere, alkalayc zerinde
gereklestirilmistir ve elde edilen organik fazlar birlestirilmistir. Etil asetat fazlarnn suyu,
susuz sodyum slfat ile uzaklastrlms ve filtre edilmistir. Tm organik fazlar, vakum
altnda evapore edilerek kurutulmustur. Kuru ekstraktlar tartldktan sonra sulu etanol
(%50) iinde zndrlmstr. Geride kalan sulu
fazlar ise liyofilize edilerek kurutulmus, tartlms ve saf su iinde zndrlmstr

Ekstraksiyon veriminin hesaplanmas:

Evapore ya da liyofilize edilerek kurutulmus ekstraktlarn verimi (kuru agrlk baznda)
asagdaki esitlik kullanlarak hesaplanmstr.
% verim = (W1*100)/ W2
Formlde W1 solvent uzaklastrlarak kurutulmus ekstraktn agrlgn, W2 ise ay ya da
ay
yapragnn kuru agrlgn gstermektedir.

Toplam polifenol tayini:

Toplam polifenol analizi spektrofotometrik Folin-Ciocalteu yntemine gre (Obanda
veOwuor, 1997) yaplmstr. Bu analiz iin standart gallik asit zeltisinin 0.005-0.05
mg/mlaralgndaki 9 farkl konsantrasyonu ile bir kalibrasyon egrisi elde edilmistir
(R2=0.99).Sonular elde edilen egrinin regresyon esitliginden yararlanlarak hesaplanms
ve mg gallik asit esdegeri (GAE) olarak ifade edilmistir.Bu yntemde 100 g/mlye saf su
ile seyreltilmis 1 ml ay ekstrakt 1 ml (3 kez su ile seyreltilmis) Folin-Ciocalteu reaktifi ile
13

karstrlmstr. 5 dakika sonra bu karsma 2 ml (%35lik) doygun sodyum karbonat

zeltisi ilave edilerek iyice karstrlms ve 2 ml su ile 6
mlye seyreltilmistir. Elde edilen karsm 30 dakika karanlkta bekletildikten sonra olusan
mavi rengin absorbans spektrofotometrede 700 nmde okunmustur.

Antioksidan aktivite tayini:

ay rneklerinin antioksidan aktivitesi, DPPH yntemi (Katalinic et. al. 2004; Atoui,
2005)kullanlarak belirlenmistir. Bu amala, otomatik pipet yardmyla 50 l ay
ekstraktndan (200 g/ml) alnarak 1950 l 6x10-5 molar DPPH radikali (metanolde
hazrlanms) ile karstrlmstr. Kontrol olarak saf su kullanlmstr. Reaksiyon karsm
vorteks karstrcda karstrlp oda scaklgnda 60 dakika sreyle karanlkta
bekletilmistir. Srenin bitiminde 7 karsmn absorbans spektrofotometrede 517 nmde
metanole kars okunmustur. Antioksidan aktivite (% AA), (Yen and Duh, 1994) nn
eitliinden yararlanlarak hesaplanmstr. Ayn kosullar altnda referans antioksidan
olarak askorbik asit zeltisinin 0-150 g/ml aralgndaki farkl konsantrasyonlar ile bir
kalibrasyon egrisi elde edilmistir. rneklerin AAsi askorbik asit esdegerine
dnstrlerek g askorbik asit esdegeri (AEAA)/100 g kuru ekstrakt olarak aklanmstr.
Yksek AEAA degerleri rnek AAsinin yksekligini gstermektedir.
Antibakteriyel aktivite
Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesinde kullanlan bakteri kltrleri (Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes (ATCC 7644), E. coli O157:H7, Hafnia alvei, Salmonella
enteritidis (ATCC 13076), E. coli Type 1 and Bacillus cereus) Ankara niversitesi Gda
Mhendisligi Blm kltr koleksiyonundan temin edilmistir. Test bakterileri Tyriptic Soy
Broth (Merck, Germany) besiyerinde 37Cde 18-24 saat sreyle gelistirilmistir.

14

Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesinde kullanlan disk difzyon metodunda (Bauer et

al.,1966) 6 mm apnda standart bos diskler (Oxoid, Basinstoke, UK) kullanlmstr.
Disklerin her birine TY ve Y ekstraktlarndan (2 mg/mL) 200Ml emdirilmis ve laminar
aksl kabinde (Forma Scientific) kurutulmustur. Test bakterileri steril svab ile Nutrient
Agar (Merck, Germany) besiyerinin yzeyine ince bir film halinde yaylmstr. Qnokle
edilen ve disklere yerlestirilen petri plaklar 37 Cde 18-24 h inkbe edilmis ve
inkbasyon sresi sonunda disk evresindeki gelisme olmayan blgede inhibisyon zonu
llms ve mm olarak kaydedilmistir. Ayn islem kontrol amacyla % 50 etanol
zeltisine uygulanmstr.

HPLC ile fenolik madde analizi

Suda zndrlms olan ham ekstrakt saf su ile konsantrasyonu 10 mg/ml olacak
sekilde seyreltilmis ve 0,45 mlik membran filtreden geirilerek filtre edilmistir. Filtre
edilmisekstraktn 20 l si HPLC kolonuna enjekte edilmistir. HPLC analizinde uygulanan
kosullar
Aadaki izelgede verilmistir.
rnekteki fenolik bilesiklerin tanmlanmas, bilesiklerin kolondaki alkonma sresi ve UVspektrumlarnn ilgili standart maddelere ait sre ve spektrumlarla
karslastrlmasylayaplmstr. Fenolik bilesiklere ait piklerin tanmlanmas ve
miktarlarnn hesaplanmasbilesiklerin maksimum absorbans degeri verdigi dalga
boyunda gereklestirilmistir. Bunedenle, katesinler ve flavonol glikozidlerin analizi iin
270 nm dalga boyu seilmistir.Bilesiklerin miktarlarnn tespit edilmesinde bilesiklere ait
HPLC kromatogramlarndan elde edilmis entegre alanlar ve standart maddelerin ara stok
zeltileri ile hazrlanms kalibrasyon egrilerinden yararlanlmstr.

15

DENEYN ZET
Bu arastrmada ncelikle ay rneklerinin metanol, etanol ve su ile ekstraksiyonlarndan
elde edilen esitli fraksiyonlarn toplam fenolik madde ierigi spektrofotometrik olarak
belirlenmistir. Sz konusu solventler, gda maddelerinden polifenol bilesiklerin
ekstraksiyonu iin yaygn olarak kullanlmalarndan dolay seilmistir. Daha sonra, en
yksek polifenol verimi elde edilen fraksiyonlarn (etilasetat, kloroform ve su) fenolik
madde
daglmnn HPLC yntemiyle belirlenmesi amalanmstr. Ayn zamanda, farkl
ekstraksiyon kosullar altnda fenolik madde bilesimi ile antioksidan aktivite arasnda bir
iliski olup olmadg da saptanms olacaktr

16

HPLC alsma kosullar ve gradient elusyon program:

17

Taze ay yaprag (a) ve yesil ayn (b) metanol ekstraktlarna ait HPLC
kromatogramlar. 1-Teobromin, 2-EGC, 3-Kafein, 4-EC, 5- EGCG, 6-ECG,
7-Q3RG, 8-Q3G, 9-K3RG

18

KAYNAKLAR:
1.

Yldz, A., Gen, ., Enstrmenal Analiz, Hacettepe niversitesi Yaynlar A-64,

1993, ISBN : 975-491-028-6, sayfa 421-438.

2.

Tswett, M.S., Ber. Dtsch. Botan. Ges. 24,1906, 316, 384.

3.

Cramer, F., Papierchromatographie, Weinheim, Verlag Chemie, 1958.

4.

Snyder, L.R., Glacjch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC method development,
John Wiley & Sons, 1988, ISBN 0-471-62782-8, 1-15.

19